CN118726326B - 一种酚酸脱羧酶突变体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酚酸脱羧酶突变体及其制备和应用，所述突变体是将SEQ IDNo.1所示氨基酸序列第40位、第92位、第131位这三个位点中至少有一个氨基酸进行突变；第40位异亮氨酸Ile突变为缬氨酸Val；第92位异亮氨酸Ile突变为苏氨酸Thr、缬氨酸Val、中的任意一种；第131位缬氨酸Val突变为亮氨酸Leu。本发明所述酚酸脱羧酶突变体，通过定点突变的方法进行改造，从而改变氨基酸序列，实现蛋白结构和功能的改变，酶活性提高，对阿魏酸的催化活性相对于原始酶大幅提高。

Description

一种酚酸脱羧酶突变体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及酶工程和基因工程技术领域，特别涉及一种酚酸脱羧酶突变体及其制备和应用。

背景技术

4-乙烯基愈创木酚(4-vinylguaiacol，4VG)化学名为2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，具有挥发性，有独特发酵香气且嗅觉识别度较高，是酱油、白酒、葡萄酒和啤酒中的重要风味物质。GB 2760--1996规定4VG为允许使用的食品用香料，同时天然4VG也被用作生产天然香兰素的中间体。

现有的4-乙烯基愈创木酚的生产方法有化学法和生物转化法。例如，公告号为CN101885669A的中国专利，公开了“一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法”，其在阻断剂对二苯酚的存在下通过高温使喹啉和阿魏酸反应，然后使用盐酸和苯反复进行洗料，最后精制使苯挥发得到4-乙烯基愈创木酚。此种化学法步骤较为复杂，过程涉及众多有机溶剂，并且化学法生产的4-乙烯基愈创木酚不能用于生产下游高附加值天然香料。例如，公告号为CN110184315B的中国专利，公开了“一种制备高浓度2-甲氧基-4乙烯基苯酚的方法”，其将含有来源于萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶BaPAD的重组大肠杆菌为催化剂，在水/正辛醇两相的存在下通过非氧化脱羧将阿魏酸转化为4-乙烯基苯酚，解决了酚酸脱羧酶在较高浓度的4-乙烯基愈创木酚存在下活性低的问题。该生物转化法生产4-乙烯基愈创木酚需要大量的有机溶剂进行萃取，会提高生产的成本，并且生产和产物纯化过程中会产生大量的废液。

天然4-乙烯基愈创木酚是生产高附加值天然化合物香兰素的前体物质，因此需要提升生物法在常规水相中生产天然4-乙烯基愈创木酚的产量以满足工业生产。常规反应条件下酶活性低，转化率低是限制天然4-乙烯基愈创木酚生产的重要因素。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的为提供一种酚酸脱羧酶突变体，通过定点突变提升酚酸脱羧酶的催化活性，在常规反应条件下满足4-乙烯基愈创木酚的工业生产需求；本发明的第二目的为提供所述酚酸脱羧酶突变体的制备方法；本发明的第三目的为提供所述酚酸脱羧酶突变体在催化制备4-乙烯基愈创木酚中的应用。

技术方案：本发明所述的酚酸脱羧酶突变体，所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列第40位、第92位、第131位这三个位点中至少有一个氨基酸进行置换；第40位异亮氨酸Ile突变为缬氨酸Val；第92位异亮氨酸Ile突变为苏氨酸Thr、缬氨酸Val、中的任意一种；第131位缬氨酸Val突变为亮氨酸Leu。

本发明通过对来源于“Lactiplantibacillus plantarum(strain ATCC BAA-793/NCIMB 8826/WCFS1)”的酚酸脱羧酶活性中心的氨基酸进行定点突变，重组构建了具有高活性的酚酸脱羧酶突变体。

优选的，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID No.2～5所示序列中的任意一种。

本发明所述的编码上述酚酸脱羧酶突变体蛋白的基因。

优选的，所述编码酚酸脱羧酶突变体蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.7～10所示。

本发明所述的含有上述基因的克隆载体或表达载体。

本发明还涉及所述酚酸脱羧酶突变体编码基因的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选以pET22b(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主(大肠杆菌C43细胞或大肠杆菌BL21)。

本发明所述酚酸脱羧酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计点突变引物，以带有酚酸脱羧酶野生型基因的质粒为模板，采用点突变引物分别进行PCR反应，经纯化后得到突变基因片段和线性化质粒；

(2)将突变基因片段与线性化质粒连接构建表达载体，将表达载体转入宿主菌后进行诱导表达；

(3)收集表达酚酸脱羧酶突变体的宿主菌，重悬菌体后破碎细胞，离心取上清即得含有酚酸脱羧酶突变体的粗酶液。

优选的，所述点突变引物为：

优选的，所述PCR反应体系为：

本发明所述的酚酸脱羧酶突变体在催化制备4-乙烯基愈创木酚中的应用。

本发明还提供一种所述酚酸脱羧酶突变体在催化阿魏酸合成4-乙烯基愈创木酚中的应用方法，优选的，所述应用方法为：以含有酚酸脱羧酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导表达后的湿菌体作为催化剂，在以阿魏酸为底物，以pH＝5.8～6.8(优选为6.75)的磷酸钾缓冲溶液构成的反应体系中，在300～500rmp(优选为400rpm)，15～20℃条件下反应至少8小时，反应结束后获得含4-乙烯基愈创木酚的反应液，将反应液分离纯化，获得4-乙烯基愈创木酚。

所述磷酸钾缓冲溶液体系是由1M的磷酸氢二甲和磷酸二氢钾构成的pH为7.5的水溶液，按照底物浓度/缓冲溶液浓度＝3/5加入底物后pH为6.75。本发明所反应体系可以通过缓冲溶液将pH控制在6.75，也可以通过持续调节pH使反应体系pH稳定在6.75。

优选的，所述催化剂用量以湿菌体的在反应液中的OD600＝20，所述底物初始加入浓度为400-800(优选600mM)。

优选的，所述湿菌体按如下方法制备：将含有酚酸脱羧酶突变体编码基因的重组工程菌接种到含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素钠的液体LB培养基中，在37℃条件下培养8h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种到灭菌后含有终浓度100ug/L氨苄青霉素的TB培养基中，在37℃条件下培养约8-12h，菌体OD600为0.6时向培养基中加入终浓度为0.1～1.0mM(优选0.5mM)的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，18℃诱导表达16～24h后，4℃、4000rpm离心10～20min，使用反应的缓冲液将湿菌体重悬；

本发明所述的酚酸脱羧酶突变体可以以全细胞形式完成催化，也可以通过细胞破碎的粗酶液或者完全破碎的纯酶进行催化。此外，还可以利用特定的固定化技术将酚酸脱羧酶制备成固定化酶或者固定化细胞形式的酶。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)所述酚酸脱羧酶突变体是在SEQ ID NO.1所示的酚酸脱羧酶氨基酸基础上，通过定点突变的方法进行改造的，从而改变氨基酸序列，实现蛋白结构和功能的改变，得到有上述突变的酚酸脱羧酶突变体，酶活性提高，对阿魏酸的催化活性相对于原始酶大幅提高；(2)突变体I40V/I92T/V131L，获得的酚酸脱羧酶突变体能够在水相常温条件下催化底物阿魏酸，在OD600＝20，底物浓度为600mM的条件下反应10h产率达到69.4％，是亲本酶的5.61倍；(3)酚酸脱羧酶突变体酶活性高，用于催化阿魏酸合成4-乙烯基愈创木酚，生产工艺简单，反应条件温和，生产过程环保从而更有利于实现工业化生产。

附图说明

图1不同温度下OD₆₀₀＝20的实施例3突变体I40V/I92T/V131L全细胞催化剂对600mM阿魏酸的转化量图；

图2不同pH下OD₆₀₀＝20的实施例3突变体I40V/I92T/V131L全细胞催化剂对600mM阿魏酸的转化量图；

图3为OD₆₀₀＝20的原始2GC9菌株、实施例1突变体I40V、实施例2突变体I40V/I92T、实施例3突变体I40V/I92V、实施例4突变体I40V/I92T/V131L全细胞催化剂对600mM阿魏酸的转化量图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

本发明所述的酚酸脱羧酶突变体，如SEQ ID No.2所示序列的酚酸脱羧酶突变体I40V，该突变体是将如SEQ ID No.1所示的酚酸脱羧酶原始酶序列的第40位异亮氨酸突变为缬氨酸(I40V)；

突变体I40V的制备方法如下：

1、重组质粒构建

质粒pET-22b(+)、E.coli BL21(DE3)均由申请人保藏，均来源于商业途径。来自Lactiplantibacillus plantarum(strain ATCC BAA-793/NCIMB 8826/WCFS1)的酚酸脱羧酶野生型基因是由金唯智(苏州)公司合成的。该酶的定点突变序列通过PCR方法进行，由申请人构建。用于引入突变位点的引物如表1所示。点突变PCR的模板为带有酚酸脱羧酶野生型基因序列的pET-22b(+)质粒。

表1突变基因片段引物和线性化质粒引物

注：引物中下划线标记的为突变位点，“F”代表上游引物，“R”代表下游引物。

表2PCR反应体系

表3PCR反应条件

PCR产物经核酸电泳验证后，使用DNA胶回收试剂盒纯化。配制如表4反应体系，其中突变基因片段为第40位异亮氨酸突变为缬氨酸的基因片段，线性化质粒为包含第40位异亮氨酸突变为缬氨酸的基因片段的线性化质粒。并在37℃反应1h进行一步克隆，构建突变酶的表达质粒。突变酶的基因序列如SEQ ID No.2所示。

表4一步克隆体系

2、重组菌株构建和粗酶液制备

将重组质粒转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12h。将平板培养基表面生长的所有单菌落刮至于装有5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，在37℃、200rmp震荡培养12h。用质粒提取试剂盒提取质粒，重组质粒保存于-20℃冰箱。突变体的基因序列如SEQ ID No.7示。

将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌，并涂布于在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养8h。挑取单独的大肠杆菌菌落接种于3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜培养，作为种子液。将种子液按5％接种量，接至装有50mL TB培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、200rpm培养。TB液体培养基成分为酵母粉12g/L、胰蛋白胨12g/L、甘油4ml/L、磷酸氢二钾12.5g/L、磷酸二氢钾2.3g/L。当培养到8h时，添加IPTG至终浓度为0.5mM，设置培养温度为18℃，继续培养16h。将发酵液离心，收集菌体，用pH7.5的1M磷酸盐缓冲液重悬，作为突变体I40V的全细胞催化剂。

实施例2

本发明所述的酚酸脱羧酶突变体，如SEQ ID No.3所示序列的酚酸脱羧酶突变体I40V/I92T，该突变体是将如SEQ ID No.1所示的酚酸脱羧酶原始酶序列的第40位异亮氨酸突变为缬氨酸(I40V)和第92位异亮氨酸突变为苏氨酸(I92T)。

突变体I40V/I92T的制备方法如下：

其余均与实施例1相同，不同之处在于，PCR模板为实施例1的I40V的突变体，突变基因引物如下：

表5突变基因片段引物和线性化质粒引物

实施例3

本发明所述的酚酸脱羧酶突变体，如SEQ ID No.4所示序列的酚酸脱羧酶突变体I40V/I92V，该突变体是将如SEQ ID No.1所示的酚酸脱羧酶原始酶序列的第40位异亮氨酸突变为缬氨酸(I40V)和第92位异亮氨酸突变为缬氨酸(I92V)。

突变体I40V/I92V的制备方法如下：

其余均与实施例1相同，不同之处在于，PCR模板为实施例1的I40V的突变体，突变基因引物如下：

表6突变基因片段引物和线性化质粒引物

实施例4

本发明所述的酚酸脱羧酶突变体，如SEQ ID No.5所示序列的酚酸脱羧酶突变体I40V/I92T/V131L，该突变体是将SEQ ID.1所示氨基酸序列第40位异亮氨酸突变为缬氨酸(I40V)、第92位异亮氨酸突变为苏氨酸(I92T)、第131位缬氨酸突变为亮氨酸(V131L)。

突变体I40V/I92T/V131L的制备方法如下：

其余均与实施例1相同，不同之处在于，PCR模板为实施例2的I40V/I92T的突变体,突变基因引物如下：

表7突变基因片段引物和线性化质粒引物

将含有酚酸脱羧酶I40V/I92T/V131L突变体编码基因的重组工程菌接种到含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素钠的液体LB培养基中，在37℃条件下培养8h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种到灭菌后含有终浓度100ug/L氨苄青霉素的TB培养基中，在37℃条件下培养12h，菌体OD600为0.6时向培养基中加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，18℃诱导表达16h后，4℃、4000rpm离心10min，使用反应的缓冲液将湿菌体重悬作为全细胞催化剂。

实施例5催化性能测试

1、实施例4中制得的酚酸脱羧酶突变酶I40V/I92T/V131L的催化性能测试

将实施例4中制得的酚酸脱羧酶突变酶I40V/I92T/V131L全细胞催化剂在不同温度下催化的产量测定

将实例4中获得的含有酚酸脱羧酶突变体I40V/I92T/V131L编码基因的重组工程湿菌体作为催化剂，在催化剂OD₆₀₀＝20，底物阿魏酸浓度为600mM，在pH＝6.75的磷酸钾缓冲溶液构成的反应体系中，400rpm下分别在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃和35℃下过夜反应(>8h)，反应结束后获得含4-乙烯基愈创木酚的反应液，反应结束后取500ul反应液用500μL乙酸乙酯萃取，后于1,2000rpm下离心1min，取300μL上清液用气相色谱检测。

气相分析条件：安捷伦HP-5色谱柱，气相程序是60℃2min，55℃/min程序升温至250℃，45℃/min程序升温至300℃，持续2min。4-乙烯基愈创木酚保留时间＝3.40min。

测试结果如图1所示，该酶在15～20℃范围内具有较好催化效率。

2、实施例4中制得的酚酸脱羧酶突变酶在不同pH条件下的酶活性验测定

将实例4中获得的含有酚酸脱羧酶突变体I40V/I92T/V131L编码基因的重组工程湿菌体作为催化剂，在催化剂OD₆₀₀＝20，底物阿魏酸浓度为600mM，分别在pH等于5.25，5.75，6.25，6.75和7.75的磷酸钾缓冲溶液构成的反应体系中，400rpm下在15℃下过夜反应(>8h)，反应结束后获得含4-乙烯基愈创木酚的反应液，反应结束后取500ul反应液用500μL乙酸乙酯萃取，后于1,2000rpm下离心1min，取300μL上清液用气相色谱检测，气相色谱检测条件同上述。

测试结果如图2所示。该酶在范围内具有较pH＝5.75～6.75范围内具有较好的催化效率。

3、酚酸脱羧酶突变酶性能测试

将酚酸脱羧酶原始酶2GC9菌株和实施例1突变体I40V、实施例2突变体I40V/I92T、实施例3突变体I40V/I92V、实施例4突变体I40V/I92T/V131L在全细胞催化条件下，OD₆₀₀＝20，底物浓度为600mM，Ph为6.75，温度为15℃条件下测试和比较对阿魏酸的催化效率。

结果显示，突变体I40V/I92T/V131L相较于原始菌株的催化效率提升了4～5倍，在600Mm的底物条件下，能够催化生成425mM的香兰素，具备极高的工业应用前景。

Claims (9)

1.一种酚酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2~5所示序列中的任意一种。

2.一种编码权利要求1所述酚酸脱羧酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述编码酚酸脱羧酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7~10所示序列中的任意一种。

4.一种含有权利要求2所述基因的克隆载体。

5.一种含有权利要求2所述基因的表达载体。

6.根据权利要求1所述酚酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）设计点突变引物，以带有酚酸脱羧酶野生型基因SEQ ID No.6的质粒为模板，采用点突变引物分别进行PCR反应，经纯化后得到突变基因片段和线性化质粒；

（2）将突变基因片段与线性化质粒连接构建表达载体，将表达载体转入宿主菌后进行诱导表达；

（3）收集表达酚酸脱羧酶突变体的宿主菌，重悬菌体后破碎细胞，离心取上清即得含有酚酸脱羧酶突变体的粗酶液；

所述点突变引物为：

I40V_F gattatcgcGTTcatggcggcatggtggcgggccgc；

I40V_R gccgccatgAACgcgataatccacggtatgatcgtttttc；

I92T_F CATGGCACCACTTTTTTTCCG；

I92T_R CGGAAAAAAAGTGGTGCCATG；

V131L_F GAAACTGGTGCTGCCGGAATTTG；

V131L_R CAAATTCCGGCAGCACCAGTTTC；

I92V_F ctgcatggcaccGTTttttttccgaaatgggtggaagaacatc；

I92V_R ggaaaaaaAACggtgccatgcagttttttttcgttcggcataaaatc。

7.根据权利要求6所述酚酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：10×Buffer for KOD-Plus- 2.5 μL、2 mM dNTP 2.5 μL、25 mM MgSO₄ 1.5 μL、DMSO 1μL、10 pmol/μL Forward Primer 0.75 μL、10 pmol/μL Reverse Primer 0.75 μL、DNA模板50~100 ng、KOD-Plus- 1 μL和ddH₂O up to 25 μL 。

8.一种权利要求1所述的酚酸脱羧酶突变体在催化制备4-乙烯基愈创木酚中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：以含有酚酸脱羧酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导表达后的湿菌体作为催化剂，在以阿魏酸为底物，以pH=5.8~6.8的磷酸钾缓冲溶液构成的反应体系中，15~20℃条件下反应至少8小时，反应结束后获得含4-乙烯基愈创木酚的反应液，将反应液分离纯化，获得4-乙烯基愈创木酚。