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CN118718020A - 含有表达细胞外基质的降解因子的重组腺病毒的抗癌组合物 - Google Patents

含有表达细胞外基质的降解因子的重组腺病毒的抗癌组合物 Download PDF

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CN118718020A
CN118718020A CN202410812035.9A CN202410812035A CN118718020A CN 118718020 A CN118718020 A CN 118718020A CN 202410812035 A CN202410812035 A CN 202410812035A CN 118718020 A CN118718020 A CN 118718020A
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cancer
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immune checkpoint
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尹彩钰
安孝敏
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Original Assignee
Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
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Abstract

本发明涉及一种抗癌组合物，其包含表达细胞外基质降解因子的重组腺病毒。根据本发明的重组腺病毒通过显著减少肿瘤组织中细胞外基质的主要结构组分(包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、纤连蛋白、弹性蛋白等)，并通过病毒增殖仅在肿瘤细胞中选择性地高效表达治疗基因而表现出优异的抗肿瘤效果。特别地，当与治疗剂如抗癌剂或免疫检查点抑制剂组合给药时，该重组腺病毒显著增加共同给药的治疗物质在肿瘤组织中的扩散和分布，同时允许发挥原有的抗癌作用，从而进一步改善抗肿瘤作用。因此，本发明可以作为癌症治疗领域的核心技术。

Description

含有表达细胞外基质的降解因子的重组腺病毒的抗癌组合物
技术领域
本发明涉及一种抗癌组合物，其包含表达细胞外基质降解因子的重组腺病毒。
本发明在韩国科学部、ICT和未来规划部的支持下以项目编号20160000002116进行，并且上述项目的研究管理机构是韩国国家研究基金会，研究业务的名称是科学与工程领域的基础研究业务/资深研究员支持业务/加速研究(战略后续研究支持)，该研究项目的名称是用于选择性肿瘤控制的纳米材料杂合基因载体的开发。本发明在韩国科学部、ICT和未来规划部的支持下以项目编号20160000002536进行，并且上述项目的研究管理机构是韩国国家研究基金会，研究业务的名称是源技术开发业务/生物医学技术开发业务/基于下一代新药的技术开发业务，该研究项目的名称是用于治疗胰腺癌的肿瘤杀伤性腺病毒候选材料的开发和实际应用的研究。
本专利申请要求2016年12月9日提交的韩国专利申请号10-2016-0167265的优先权和权益，其公开内容通过整体引用并入本文。
背景技术
癌症是全世界疾病死亡的主要原因的一种疾病，并且是一种难治性疾病，尽管使用复杂的治疗方法例如手术、放射治疗和化学疗法，仍有50％或更多的患者死亡(WHO:World Health Report,2001)。癌症治疗是以手术、放射治疗和抗癌剂治疗的顺序开发的。手术对于早期癌症是有效的，但是大多数已经转移的癌症除了手术之外还需要放射治疗或抗癌治疗的组合。特别地，由于这些治疗方法对正常细胞具有显著的副作用，并且由于对多种癌细胞药物的抗性而具有低治愈率，因此迫切需要开发新的抗癌治疗方法。特别地，迫切需要开发与癌症复发或转移相关的难治性(耐药)癌症的治疗剂。由于这种实际需要，在基于2016年的总共2,356个基因治疗临床试验中，约64.4％的临床试验以癌症作为目标疾病进行，并且在各种疾病中进行了频率最高的临床试验。
如上所述，目前用于癌症的标准治疗方法的实例包括手术、放射治疗和抗癌剂治疗。在早期阶段，也就是说，当癌症仅转移到局部或外周淋巴腺时，该癌症可以仅通过手术完全治愈，但是当其转移进一步发展时，治疗受到限制，所以只有少数癌症患者可以通过手术治愈。因此，除手术外，大多数癌症应联合放射和抗癌剂治疗进行治疗。然而，由于放射和抗癌剂治疗都不是靶向治疗方法，它们无法将待治疗的癌细胞与正常细胞区分开来，因此在治疗期间一些正常细胞也受损。在正常细胞中，快速分裂和增殖的细胞(即在骨髓中形成的血细胞、包括口腔在内的胃肠道的上皮细胞、毛细胞、产生精子和卵子的生殖细胞等)受到显著影响。由于对正常细胞的副作用大，因此实际肿瘤的治愈率极低。
理想的抗癌剂应能够在不损害正常细胞的情况下去除癌细胞。遗憾的是，到目前为止没有开发出满足上述条件的药物，并且毒性仅仅能与优选治疗的效果相比。当最近已经深入研究的化学治疗剂被分类时，第一种是分化衍生物，其能够通过消除新细胞的增殖能力或允许新细胞成为末期细胞来阻断肿瘤细胞的成熟；第二种是抗转移药物，其能够通过改变恶性肿瘤细胞的表面特征来破坏侵袭和转移的能力；第三种是缺氧肝细胞肿瘤特异性药物，其诱导实体癌细胞中缺氧状态的还原反应；第四种是肿瘤细胞特异性放射药物等。
与先前存在的抗癌疗法相比，如上所述的新治疗物质具有增强的抗癌作用。特别地，显示出更好潜力的药物的实例包括紫杉烷衍生物(例如，多西紫杉醇)、喜树碱衍生物、胸苷酸合成酶抑制剂(例如，雷替曲塞)、核苷衍生物(吉西他滨)、5-FU口服衍生物等。然而，这些化学治疗剂的毒性仍然是待解决的问题。
最近，由于已经阐明了癌症的许多分子生物学特征，已经开发了仅攻击特定癌细胞的靶向治疗剂。靶向的癌症治疗是指通过干扰参与癌症生长和发作的特定分子的活性来阻断癌症生长和增殖的药物的使用。当关注于分子和细胞的变化时，靶向治疗的优点在于可以最小化副作用，因为靶向治疗选择性地仅攻击癌细胞，同时相对最小化地损害正常细胞。制备靶向治疗剂以靶向具有大多数癌细胞特征的分子并显示其效果。作为分子靶标，已经使用了参与癌细胞的信号转导途径、血管生成、基质、细胞周期调节、细胞凋亡等的分子，但在它们进行临床应用之前还需要进行其他研究。
此外，作为治疗癌症的新方法，已经进行了使用身体的肿瘤特异性免疫活性的免疫疗法的研究。然而，很难进行免疫治疗，因为癌症不仅能够巧妙地躲避和破坏各种宿主的免疫应答，因而通过诱导免疫抑制肿瘤微环境可持续地维持肿瘤的存活，而且即使免疫系统被激活，癌症也可以逃避激活的抗肿瘤免疫应答。因此，为了通过改善免疫抑制肿瘤微环境来增强对癌细胞的免疫应答，已经在各个方向上进行了使用细胞因子基因如IL-12、IL-18、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，共刺激因子如B7分子、直接作为抗原呈递细胞(APC)的树突状细胞(DC)、肿瘤抗原激活的T细胞、自然杀伤细胞(NKC)等的研究。特别地，IL-12通常从诸如单核细胞、巨噬细胞和DC的APC中分泌，并且已知直接作用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞，其能够有效去除癌细胞以活化这些细胞，诱导IFN-γ分泌并增强杀死癌细胞的能力。此外，IL-12通过作用于原始的CD4+淋巴细胞而在促进分化为T辅助细胞1(TH1)中发挥重要作用，并因此通过诱导和增强细胞介导的免疫应答(其在抗癌免疫应答中起关键作用)来激活抗癌免疫应答。
基于该技术背景，本发明人报道了YKL-1(Ad-E1B-55k)作为E1B-55k基因缺失的肿瘤选择性杀伤腺病毒的抗肿瘤作用，并且还报道了使用具有比YKL-1更强的肿瘤选择性杀伤能力的RdB腺病毒的GM-CSF的抗肿瘤作用，这是由于E1B基因的缺失和E1A的Rb结合位点的修饰(韩国专利申请公开号10-2012-0010697)。然而，尽管免疫抑制肿瘤微环境得到改善，但由于肿瘤的免疫原性低，完全治愈癌症仍有许多局限性。
技术问题
由于对开发能够改善抗癌作用的新治疗方法的深入研究，本发明人制备了一种肿瘤选择性杀伤重组腺病毒，其表达细胞外基质的降解因子，并克服了先前存在的抗癌剂治疗的局限性，同时通过重组腺病毒与原有的抗癌剂或免疫检查点抑制剂的组合显示出非常显著的抗肿瘤作用，从而基于此完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于辅助抗癌剂的药物组合物，其包含表达细胞外基质的降解因子的重组腺病毒。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其与免疫检查点抑制剂组合给药，并且该药物组合物包含表达细胞外基质的降解因子的重组腺病毒。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员从以下描述中可以清楚地理解未提及的其他问题。
技术方案
为了实现如上所述的本发明的目的，提供了一种用于辅助抗癌剂的药物组合物，其包含含有编码白细胞介素12(IL-12)的基因和编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因的重组腺病毒。
作为本发明的一个实施方案，该重组腺病毒可以缺失E1和/或E3区域。
作为本发明的另一个实施方案，可以将编码IL-12的基因插入到重组腺病毒的E1区域，并将编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因插入到腺病毒的E1或E3区域。
作为本发明的另一个实施方案，该组合物可以与免疫检查点抑制剂同时、分开或顺序给药，并且该免疫检查点抑制剂可以是选自下列的任一个：PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、PD-L2拮抗剂、CD27拮抗剂、CD28拮抗剂、CD70拮抗剂、CD80拮抗剂、CD86拮抗剂、CD137拮抗剂、CD276拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TNFRSF4拮抗剂、GITR拮抗剂、GITRL拮抗剂、4-1BBL拮抗剂及其组合。
作为本发明的另一个实施方案，该癌症可以是选自下列的任一个：胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、骨癌、非小细胞骨癌、恶性血液病、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、结直肠癌、肛门附近的癌症(anal near cancer)、结肠癌、输卵管肿瘤、子宫内膜癌症、阴道癌症、外阴肿瘤、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌症、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾脏或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、涎腺癌、肉瘤癌、腹膜假粘液瘤、肝母细胞瘤、睾丸癌症、胶质母细胞瘤、唇癌、卵巢生殖细胞肿瘤、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、胆囊癌、脉络膜黑素瘤、肝胰管壶腹癌、腹膜癌、舌癌、小细胞癌、小儿淋巴瘤、成神经细胞瘤、十二指肠癌、输尿管癌、星形细胞瘤、脑膜瘤、肾盂癌、阴部癌、胸腺癌、中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤，并且可以是复发性癌症或抗癌剂抗性癌症。
作为本发明的另一个实施方案，该组合物可以增强抗肿瘤免疫力。
此外，本发明提供增强抗癌剂治疗功效的方法，所述方法包括：向个体给药包含编码IL-12的基因和编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因的重组腺病毒。
此外，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向个体给药包含编码IL-12的基因和编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因的重组腺病毒。
有益效果
根据本发明的重组腺病毒通过显著减少肿瘤组织中细胞外基质的主要结构组分(包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、纤连蛋白、弹性蛋白等)，并通过病毒增殖仅在肿瘤细胞中选择性地高效表达治疗基因而表现出优异的抗肿瘤效果。特别地，当与原有的抗癌剂或免疫检查点抑制剂组合给药时，该重组腺病毒显著增加共同给药的治疗物质在肿瘤组织中的扩散和分布，同时允许发挥原有的抗癌作用，从而进一步改善抗肿瘤作用。因此，本发明可用作癌症治疗领域的核心技术。
附图说明
图1是图示说明根据本发明的肿瘤选择性杀伤腺病毒的肿瘤细胞特异性作用机制的示意图。
图2是图示说明根据本发明的肿瘤选择性杀伤腺病毒的细胞外基质(ECM)降解机制的示意图。
图3图示说明了根据本发明的肿瘤选择性杀伤腺病毒的遗传结构，图3A说明了肿瘤选择性杀伤腺病毒(RdB/IL-12/DCN)的遗传结构，其同时表达IL-12和核心蛋白聚糖(DCN)，并且图3B说明了肿瘤选择性杀伤腺病毒(RdB/IL-12/RLX)的遗传结构，其同时表达IL-12和松弛素(RLX)。特别地，RdB包含修饰的E1A(开星形-Rb蛋白结合位点的突变)，并且E1B-19k和E1B-55k(E1B)以及E3区域(E3)缺失；并且IL-12和DCN/RLX分别插入到腺病毒基因组的E1和/或E3位点。
图4是通过MTT测定确认通过共同给药RdB/IL-12/DCN和吉西他滨来杀死胰腺癌细胞系(PANC-1、MIA PaCa-2或AsPC-1)的能力的结果。
图5是通过共同给药RdB/IL-12/DCN和吉西他滨，通过在原位胰腺癌动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图6是对共同给药RdB/IL-12/DCN和吉西他滨的抗肿瘤作用的组织学评价，其是分别进行苏木精-曙红(H&E)染色、PCNA免疫组织化学染色、使用E1A蛋白抗体的免疫组织化学染色和TUNEL测定的结果。
图7是通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗PD-L1)，通过在黑素瘤皮下动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图8是通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗PD-L1)，通过黑素瘤皮下动物模型的存活率的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图9是通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗PD-L1、抗PD-L1或抗CTLA-4)，通过在仓鼠皮下胰腺癌动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图10是通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗PD-L1、抗PD-L1或抗CTLA-4)，通过在仓鼠皮下胰腺癌动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认记忆免疫应答(治疗复发性癌症的作用)的结果。.
图11是通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗PD-L1)，通过在具有抗癌剂诱导抗性的动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图12通过MTT测定确认通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨来杀死胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2或PANC-1)的能力的结果。
图13通过TUNEL测定确认通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的抗肿瘤作用的结果。
图14是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨，通过胶原蛋白I或胶原蛋白III的表达水平的变化来确认细胞外基质降解作用的结果。
图15A和15B是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨，通过胶原蛋白I、胶原蛋白III、纤连蛋白或弹性蛋白的表达水平的变化来确认细胞外基质降解作用的结果。
图16A和16B是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的抗肿瘤作用的组织学评估，并且是分别进行MT染色、天狼猩红染色和TUNEL测定的结果。
图17A、17B和17C是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨，通过在胰腺癌皮下动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图18是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨，通过在胰腺癌异种移植动物模型中形成的肿瘤组织中的胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤连蛋白或弹性蛋白的表达水平的变化来确认细胞外基质降解作用的结果。
图19是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的抗肿瘤作用的组织学评估，并且是分别进行苏木精-曙红(H&E)染色、TUNEL测定和裂解的半胱天冬酶(caspase)3免疫染色的结果。
图20是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)，通过在黑素瘤皮下动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图21是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)，通过黑素瘤皮下动物模型的生存率的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图22是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)，通过在黑素瘤皮下动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图23是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)，通过黑素瘤皮下动物模型的生存率的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图24是通过共同给药RdB/IL-12/RLX(1×109VP)和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)，通过在黑素瘤皮下动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图25是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1或抗-PD-L1)，通过在黑素瘤皮下动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认记忆免疫应答(治疗复发性癌症的作用)的结果。
图26是通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)，通过在具有对抗癌剂诱导抗性的动物模型中形成的肿瘤大小的变化来确认抗肿瘤作用的结果。
图27是通过共同给药RdB/IL-12/RLX通过曲妥珠单抗作为抗癌剂并进行免疫荧光染色，证实了增强抗癌剂在胃肿瘤组织中的渗透作用的结果。
图28A、28B和28C通过共同给药RdB/IL-12/RLX评估抗癌剂在胃肿瘤组织中的分布，并且通过放大图27中所示的区域来确认基于肿瘤组织的边缘部位的抗癌剂的分布。
图29A、29B和29C通过共同给药RdB/IL-12/RLX评估抗癌剂在胃肿瘤组织中的分布，并确认基于肿瘤组织中的血管的抗癌剂的分布。
图30A和30B通过共同给药RdB/IL-12/RLX评估抗癌剂在胃肿瘤组织中的停留时间，并且是进行PET成像的结果。
发明的具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供用于辅助抗癌剂的药物组合物，该药物组合物包含含有编码白细胞介素12(IL-12)的基因和编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因的重组腺病毒；该组合物用于增强抗癌剂治疗功效的用途；和治疗癌症的方法，该方法包括给药治疗有效量的该组合物和抗癌剂的组合的步骤。
如本文所用，术语“治疗”是指通过给药根据本发明的药物组合物改善或有益地改变症状(肿瘤)的所有行为。
在本发明中，“个体”是指需要疾病治疗的受试者，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、啮齿类动物(大鼠、小鼠、豚鼠等)、狗、猫、马、牛、羊、猪、山羊、骆驼和羚羊。
“癌症”是由本发明的药物组合物治疗的疾病，其统称为由细胞引起的疾病，其中该细胞具有侵袭性特征(其中细胞忽略正常生长限制并分裂和生长)、侵入周围组织的侵入特征，以及扩散至体内其他部位的转移特征。在本发明中，癌症以与恶性肿瘤或肿瘤相同的含义使用，并且可以包括实体瘤和血源性肿瘤。例如，当根据病变的部位分类时，该癌症可以是选自以下的任一个：胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、骨癌、非小细胞骨癌、恶性血液病、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、结直肠癌、肛门附近的癌症、结肠癌、输卵管肿瘤、子宫内膜癌症、阴道癌症、外阴肿瘤、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌症、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾脏或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、涎腺癌、肉瘤癌、腹膜假粘液瘤、肝母细胞瘤、睾丸癌症、胶质母细胞瘤、唇癌、卵巢生殖细胞肿瘤、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、胆囊癌、脉络膜黑素瘤、肝胰管壶腹癌、腹膜癌、舌癌、小细胞癌、小儿淋巴瘤、成神经细胞瘤、十二指肠癌、输尿管癌、星形细胞瘤、脑膜瘤、肾盂癌、阴部癌、胸腺癌、中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤，并且当根据病理特征分类时，该癌症可以是复发性癌症或抗癌剂抗性癌症，但不限于此。
如本文所用，术语用于辅助抗癌剂的药物组合物是指通过与原有的癌症治疗物质组合使用来改善癌症治疗功效。例如，用于辅助抗癌剂的药物组合物表示通过降低抗癌剂的治疗有效剂量或显著抑制肿瘤生长来最小化由抗癌剂引起的副作用。用于辅助抗癌剂的药物组合物可与抗癌佐剂、抗癌治疗佐剂等互换使用。
在本发明的具体实例中，抗癌剂可以是抗代谢物、烷化剂、拓扑异构酶拮抗剂、微管拮抗剂、抗癌抗生素、植物来源的生物碱、抗体抗癌剂或分子靶向的癌症剂，更具体地，可以是紫杉醇、氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌氮芥、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗、庚铂(heptaplatin)、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、丙卡巴肼、前列地尔、去氧氟尿苷、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉西、奥替拉西、阿扎胞苷、氨甲蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依诺他滨、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西紫杉醇、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊甙、长春新碱、长春碱、替尼泊甙、多柔比星、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺(altretamine)、达卡巴嗪、塞替派(thiotepa)、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇(mitolactol)、洛莫司汀和卡莫司汀、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、曲妥珠单抗(tristuzumab)、洛奇替尼(rociletinib)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、依维莫司、雷莫芦单抗(ramucirumab)、达克替尼(dacomitinib)、foretinib、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、欧狄沃(nivolumab)、达拉非尼(dabrafenib)、维利帕尼(veliparib)、色瑞替尼(ceritinib)、卡莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、伊沙匹隆、美法仑、巯嘌呤、米托蒽醌或TS-1，但不限于此。
包含在本发明的药物组合物中的肿瘤选择性杀伤重组腺病毒的特征在于包括：编码IL-12的基因；和编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因，其是细胞外基质的降解因子。
作为本发明的重组腺病毒，可以使用本领域公知的溶瘤腺病毒。作为具体实例，该重组腺病毒包含活化的E1A基因和失活的E1B-19k基因、E1B-55k基因或E1B-19k/E1B-55k基因。在本说明书中，与基因结合使用的术语失活意味着通常不进行基因的转录和/或翻译，并且没有表现出由该基因编码的正常蛋白质的功能。例如，失活的E1B-19k基因是不能通过基因中的修饰(取代、加成以及部分或完全缺失)产生活化的E1B-19k蛋白的基因。EIB-19k的缺失可能增加杀死细胞的能力，并且E1B-55k基因的缺失使得重组腺病毒具有肿瘤特异性(参见韩国专利申请号2002-23760和图1)。特别地，如上所述的肿瘤选择性杀伤腺病毒对原代感染细胞显示出治疗效果，增殖的病毒以顺序方式通过周围肿瘤细胞的二次和三次感染杀死肿瘤细胞，使得其治疗效果可以像多米诺骨牌现象一样继续扩散，结果抗肿瘤效果可以显著增加。在本说明书中与病毒基因组序列结合使用的术语“缺失”具有包括相应序列的完全缺失和部分缺失的含义。
根据本发明的实施方案，该重组腺病毒包括E1A区域，具有E1B区域，即E1B-19k和E1B-55k(E1B)缺失，和/或E3区域(E3)缺失。包含E1A基因的重组腺病毒具有可复制的特征。编码IL-12的基因插入重组腺病毒的缺失的E1区域，编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因可插入到E1或E3区域，但上述基因的插入位点可适当改变。同时，在编码位于E1A基因序列中的Rb结合位点的核苷酸序列中，E1A位点具有其中Glu 45残基被Gly取代的修饰和其中氨基酸121至127的序列完全被Gly取代的修饰。
同时，腺病毒以外的病毒也可用于本发明。可用于本发明的病毒可以优选是腺相关病毒(AAV)(Lashford LS.,等人,Gene Therapy Technologies,Applications andRegulations Ed.A.Meager(1999))、反转录病毒(Gunzburg WH,等人,Gene TherapyTechnologies,Applications and Regulations Ed.A.Meager,(1999))、慢病毒(Wang G.等人,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(Chamber R.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))、痘苗病毒(Puhlmann M.等人,HumanGene Therapy10:649-657(1999))、呼吸道肠道病毒、痘病毒(GCE,NJL,Krupa M,EstebanM.,The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems forvaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008))、西门利克森林病毒，并且可以应用于聚合物(Hwang等人,In vitro and In vivoTransfection Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral PolymerCarriers.,Korean J.Bone Metab.13(2):119-128(2006))、脂质体(Methods inMolecular Biology,Vol 199,S.C.Basu and M.Basu(Eds.),Human Press 2002)、纳米材料或泡囊(niosomes)，但不限于此。
用于本发明的重组腺病毒包括可在动物细胞、优选哺乳动物细胞中起作用的启动子。适用于本发明的启动子包括衍生自哺乳动物病毒的启动子和衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子，并包括例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、U6启动子和H1启动子、鼠白血病病毒(MLV)长末端重复(LTR)启动子、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白(methallothionin)启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、人GM-CSF基因启动子、诱导型启动子、癌细胞特异性启动子(例如TERT启动子、修饰的TERT启动子、PSA启动子、PSMA启动子、CEA启动子、生存素启动子、E2F启动子、修饰的E2F启动子、AFP启动子、修饰的AFP启动子、E2F-AFP杂合启动子和E2F-TERT杂合启动子)、组织特异性启动子(例如白蛋白启动子)、人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，但不限于此。最优选地，启动子是CMV启动子。优选地，在用于表达反式基因的表达构建体中，多聚腺苷酸化序列结合反式基因的下游。该多聚腺苷酸化序列包括牛生长激素终止子(Gimmi,E.R.,等人,Nucleic Acids Res.17:6983-6998(1989))、SV40-衍生的多聚腺苷酸化序列(Schek,N,等人,Mol.Cell Biol.12:5386-5393(1992))、HIV-1polyA(Klasens,B.I.F.,等人,Nucleic Acids Res.26:1870-1876(1998))、β-珠蛋白polyA(Gil,A.,等人,Cell 49:399-406(1987))、HSV TK polyA(Cole,C.N.andT.P.Stacy,Mol.Cell.Biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒polyA(Batt,D.BandG.G.Biol.15:4783-4790(1995))，但不限于此。
在本发明中所用的重组腺病毒中，IL-12基因序列和核心蛋白聚糖或松弛素基因序列与启动子可操作地连接。如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列(例如：启动子阵列、信号序列和转录调节因子结合位点)与不同核酸序列之间的功能性结合，因此，该调控序列调节不同核酸序列的转录和/或翻译。
本发明的重组腺病毒还可以包括抗生素抗性基因和报告基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶和β-葡糖醛酸糖苷酶)作为选择性标记物。抗生素抗性基因包括本领域常用的抗生素抗性基因，例如对氨苄西林、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因，优选为新霉素抗性基因。甚至在通过单独的启动子或内核糖体进入位点(IRES)连接的表达系统中也可以表达上述选择性标记物，可用于本发明的IRES是在某些类型的病毒和细胞的RNA中发现的调节序列。
用于本发明的“编码IL-12的基因”包括IL-12A(p35)基因序列和IL-12B(p40)基因序列，并且可以包括IL-12A(p35)基因序列和IL-12B(p40)基因序列之间的IRES序列，其用于有效翻译病毒蛋白。优选地，IL-12A(p35)基因序列、IL-12B(p40)基因序列和IRES序列可分别由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3组成。IL-12通过诱导T辅助细胞1的分化并激活细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性来增加抗肿瘤免疫力。
对于本发明中使用的“编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因”，优选地，该核心蛋白聚糖基因序列和松弛素基因序列可分别由SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5组成。对于显示相对低治疗效果的大多数肿瘤，由于细胞外基质(ECM)的发展，腺病毒在肿瘤组织中不均匀扩散，并且在频繁的病例中腺病毒保持在局部给药部位。通过降解细胞外基质(例如胶原蛋白I、胶原蛋白III、纤连蛋白、弹性蛋白等)的组成成分，该核心蛋白聚糖或松弛素增加治疗物质在肿瘤组织中的扩散和分布(参见图2)，此外，核心蛋白聚糖有其自身的抗肿瘤作用。特别地，上述作用还可以影响肿瘤选择性杀伤重组腺病毒本身和共同给药的物质的扩散和分布，从而通过与原有的癌症治疗物质共同给药而有助于最大化抗肿瘤作用。
也就是说，本发明的药物组合物具有通过下列方式最大化癌症治疗作用的技术特征：包含这种组合的(integrated)组合物以在肿瘤组织中可持续地改善由重组腺病毒本身和与该组合物共同给药的抗癌剂的渗透引起的肿瘤选择性杀伤功效。换句话说，通过显著提高相关技术中抗癌剂的治疗功效，同时保持基因治疗本身的功效，可以最终获得接近完美治愈的治疗功效。
据解释该基因序列还包括表现出基本同一性或基本相似性的基因序列。上述基本同一性是指当将它与对应于本发明的序列尽可能比对时，与本发明的序列不同并且与本发明的序列具有至少80％同源性，更优选90％同源性，最优选95％同源性的随机序列，并且使用本领域通常使用的算法分析比对序列。上述基本相似性统称为基因序列中的所有变化(例如一个或多个碱基的缺失或插入)，这些变化不影响最小化与重组腺病毒载体的同源重组的本发明的目的。因此，本发明的基因序列不限于示例性的SEQ ID NOS.1至5的序列，并且只要该序列基本上不影响本发明所需的最终产物的活性即可被解释为包括在本发明权利的范围内。
此外，本发明的药物组合物可以与免疫检查点抑制剂组合，按照同时、分开或顺序给药。
如本文所用，术语“免疫检查点”统称为参与引起刺激或抑制免疫细胞表面上的免疫应答信号的蛋白质，并且癌细胞通过被操纵而逃避免疫系统的监视网络，使得免疫应答的刺激和由此产生的癌细胞的抑制不能通过免疫检查点合适地进行，即抗肿瘤免疫应答被中和。优选地，该免疫检查点蛋白可以是程序性细胞死亡-1(PD-1)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、程序性细胞死亡-配体2(PD-L2)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、分化簇70(CD70)、分化簇80(CD80、也称为B7-1)、分化簇86(CD86、也称为B7-2)、分化簇137(CD137)、分化簇276(CD276)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4、也称为CD134)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)、4-1BB配体(4-1BBL)或细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)，但不限于此。
该免疫检查点抑制剂是靶向免疫检查点蛋白的拮抗剂或抗体，并通过增强刺激免疫应答的蛋白或阻断抑制免疫应答的蛋白，表现出由免疫应答引起的抗肿瘤作用。除了具有比一般细胞毒性抗癌剂更少的副作用(例如呕吐或脱发)和较大的治疗效果的优点之外，由于该免疫检查点抑制剂使用具有优异记忆能力的免疫应答系统，即使停止给药后，治疗效果也可持续很长一段时间。然而，据报道该免疫检查点抑制剂在免疫抑制微环境(特别是在一些患者中的肿瘤复发)中的治疗效果显著降低。
同时，在过去的几十年里，肿瘤的免疫基因治疗已经发展成为一种有前景的方法，但肿瘤也创造了许多其他策略来逃避免疫监视系统。为了克服这些障碍并增强抗肿瘤免疫效果，本发明构建了包含如上所述的IL-12和细胞外基质的降解因子的肿瘤选择性杀伤腺病毒系统(RdB/IL12/DCN、RdB/IL12/RLX)，并提供了一种环境，其中根据本发明的系统可以通过组合免疫检查点抑制剂使用肿瘤选择性杀伤腺病毒系统更有效地起作用。也就是说，通过阻断中和抗肿瘤免疫应答的肿瘤细胞的逃避机制，使免疫基因治疗的作用最大化。根据显著的效果，本发明的药物组合物不仅对原发性癌症显示出有效的治疗作用，而且对复发性癌症或已被指出作为现有技术中抗癌剂限制的抗癌剂抗性癌症也显示出有效的治疗作用。
除活性成分外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。在这种情况下，该药学上可接受的载体通常在配制过程中使用，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。此外，除了上述成分之外，药学上可接受的载体还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂详细描述在Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版，1995)中。
本发明的药物组合物可以口服或肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肺泡内或局部施用)给药，并且根据本发明的一个实施方案，本发明的药物组合物可以优选直接在肿瘤内给药。剂量根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径和持续时间而变化，但可由本领域技术人员适当选择。
本发明的药物组合物以药学有效量给药。在本发明中，“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据因素包括患者疾病类型、疾病严重程度、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物以及医学领域众所周知的其他因素确定。根据本发明的另一种药物组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂组合给药，可以与现有技术中的治疗剂顺序或同时给药，并且可以以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是以最小量施用该组合物，其可以获得最大效果而没有任何副作用，并且该量可以由本领域技术人员容易地确定。
同时，作为本发明的另一方面，本发明提供：用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含含有编码白细胞介素12(IL-12)的基因和编码核心蛋白聚糖或松弛素的基因的重组腺病毒，并与免疫检查点抑制剂组合给药；该组合物在治疗癌症中的用途；以及治疗癌症的方法，该方法包括将该组合物和免疫检查点抑制剂共同给药于个体的步骤。
由于根据本发明的用于治疗癌症的药物组合物等使用上述用于辅助抗癌剂的药物组合物中描述的技术配置，因此将省略对两者之间共同的内容的描述，以避免本说明书的过度复杂性。
在下文中，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
[实施例]
实施例1.肿瘤选择性杀伤腺病毒的制备
1-1.RdB/IL-12/DCN和RdB/IL-12/RLX的制备
为了构建在腺病毒E3位点表达核心蛋白聚糖或松弛素的腺病毒穿梭载体，pSP72E3/DCN和pSP72 E3/RLX E3穿梭载体通过在pSP72 E3/CMV-polA腺病毒E3穿梭载体中克隆编码核心蛋白聚糖或松弛素的序列来制备(Yun CO.等人,Cancer Gene Ther,2005.12(1):第61-71页)。对于同源重组，通过用pSP72E3/DCN和pSP72 E3/RLX以及每种腺病毒总载体pdE1同时转化大肠杆菌BJ5183来制备pdE1/DCN和pdE1/RLX腺病毒质粒。
为了构建表达IL-12的Ad E1穿梭载体，pXC1RdB/IL12 E1穿梭载体通过从pCA14/IL12中切除小鼠IL-12基因(Lee YS.等人,Clin Cancer Res,2006.12(19):第5859-68页)，并将该基因亚克隆到pXC1RdB E1穿梭载体中来制备。对于同源重组，将大肠杆菌BJ5183与pXC1RdB/IL12 E1穿梭载体和pdE1/DCN或pdE1/RLX同时转化，从而制备pRdB/IL12/DCN和pRdB/IL12/RLX Ad载体。根据现有技术进行腺病毒的纯化、滴定和质量分析(Lee YS.等人,Clin Cancer Res,2006.12(19):第5859-68页,Choi KJ.等人,Gene Ther,2012.19(7):第711-23页)。
实施例2.表达核心蛋白聚糖的肿瘤选择性杀伤腺病毒与抗癌剂组合的用途
2-1.杀死胰腺癌细胞的能力的确认
当表达松弛素的肿瘤选择性杀伤腺病毒(在下文中称为RdB/IL-12/DCN)和作为胰腺癌的标准治疗剂的吉西他滨共同给药时，其旨在验证是否可以显著增加杀死胰腺癌细胞的能力。为此，用MOI为0.5或2的本发明的RdB/IL-12/DCN感染人胰腺癌细胞系PANC-1、MIAPaCa-2和AsPC-1，并用吉西他滨(0.05、0.2、1、2、5、20或100μg/ml)一起治疗，然后通过MTT测定观察细胞凋亡程度。
如图4所示，当单独使用吉西他滨治疗时，即使在100μg/ml的高浓度下，所有PANC-1、MIA PaCa-2和AsPC-1都显示出杀死至多30％的胰腺癌细胞系的能力，但当RdB/IL-12/DCN与吉西他滨组合给药时，即使在0.2μg/ml的低吉西他滨浓度下，杀死胰腺癌细胞系的能力也显著增加。特别地，与单独给药RdB/IL-12/DCN的情况相比，该效果优异，并且重组腺病毒的浓度越高(2MOI)，效果越显著。因此，实验结果表明，共同给药原有的抗癌剂和根据本发明的RdB/IL-12/DCN不仅可以降低用于抗肿瘤治疗的抗癌剂的给药剂量，而且还可能表现出更强的抗肿瘤作用。
2-2.原位胰腺癌动物模型中的抗肿瘤作用的确认
(1)确认肿瘤大小的变化
为了构建原位胰腺癌动物模型，选择人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2-Fluc并用于实验。将肿瘤细胞注射到小鼠胰腺中，两周后，通过IVIS成像仪确认肿瘤的产生。此后，将RdB/IL-12/DCN每隔一天以2×1010VP/500μL腹膜内给药三次，并将吉西他滨每周两次以100mg/kg给药，共3周。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。在给药RdB/IL-12/DCN之前，使用IVIS成像仪确认肿瘤的大小和光子值，并在给药后第1、2和3周，定量比较肿瘤大小的变化。
如图5所示，可以证实在阴性对照(PBS)和仅给药吉西他滨的组(吉西他滨)中观察到肿瘤大小的急剧增加，而在共同给药组(Ad+吉西他滨)中，肿瘤的生长减慢(第1周和第2周)，此外，肿瘤的大小在第3周相当显著地减少。实验结果表明，与各自单独给药相比，通过共同给药原有的抗癌剂和RdB/IL-12/DCN所引起的抗肿瘤作用非常显著。
(2)抗肿瘤作用的组织学评价
旨在组织学评估上述实验的抗肿瘤作用。首先，通过将人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2-Fluc注射到小鼠胰腺中来诱导肿瘤的形成，然后向其中分别给药PBS、吉西他滨、RdB/IL-12/DCN或吉西他滨+RdB/IL-12/DCN。此后，在收集肿瘤组织后进行苏木精-曙红(H&E)染色和PCNA免疫组织化学染色。此外，进行TUNEL测定以确认肿瘤细胞的凋亡程度，并且使用针对腺病毒的E1A蛋白的抗体进行免疫组织化学染色以确认抗肿瘤作用是否是由肿瘤组织中存在的腺病毒的复制引起的。
如图6所示，在仅给药PBS或吉西他滨的组中，几乎没有观察到坏死，然而当单独给药RdB/IL-12/DCN或共同给药吉西他滨+RdB/IL-12/DCN时，肿瘤细胞的坏死非常活跃。特别地，证实了在共同给药吉西他滨和RdB/IL-12/DCN的组中，在大多数肿瘤中发生坏死。另外，如上述结果，通过PCNA免疫组织化学染色观察到，在单独给药RdB/IL-12/DCN或给药吉西他滨+RdB/IL-12/DCN的组中，肿瘤细胞的增殖与单独给药PBS或吉西他滨的组相比显著降低，并且在共同给药吉西他滨和RdB/IL-12/DCN的组中效果最显著。此外，就细胞凋亡程度而言，在单独给药RdB/IL-12/DCN或给药吉西他滨+RdB/IL-12/DCN的组，特别是共同给药吉西他滨和RdB/IL-12/DCN的组中也证实了高水平的细胞凋亡。最后，使用针对腺病毒的E1A蛋白的抗体进行免疫组织化学染色的结果可以证实与仅给药PBS或吉西他滨的小鼠的肿瘤相比，在单独给药RdB/IL-12/DCN或给药吉西他滨+RdB/IL-12/DCN的小鼠肿瘤中的腺病毒的E1A蛋白显著增加。
当这些结果一起考虑时，核心蛋白聚糖增加了肿瘤组织中RdB/IL-12/DCN的分布，因此，诱导了肿瘤选择性杀伤腺病毒的活跃复制和肿瘤细胞的杀伤。此外，可以看出由于核心蛋白聚糖基因通过分布于肿瘤组织中的RdB/IL-12/DCN的活跃增殖高水平表达，再次促进了肿瘤细胞的凋亡，并且通过增强共同给药的抗癌剂的功效引起强烈的抗肿瘤作用。
实施例3.表达核心蛋白聚糖的肿瘤选择性杀伤腺病毒与免疫检查点抑制剂组合 的用途
3-1.黑素瘤皮下动物模型中的抗肿瘤作用的确认
将黑素瘤细胞系B16-F10以每只动物5x 105个细胞/50μL皮下注射到小鼠中后，约10天后，当肿瘤大小达到约100mm3时，当将5x 109VP的RdB/IL-12/DCN单独给药或与效力为200μg的免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1)组合给药时，观察肿瘤大小的变化。在共同给药期间，将RdB/IL-12/DCN在第1、3和5天进行肿瘤内给药(共计3次)，并将免疫检查点抑制剂在第3、6和9天进行腹膜内给药(共计3次)。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图7和8所示，证实当肿瘤选择性杀伤腺病毒(RdB/IL-12/DCN)与免疫检查点抑制剂组合给药时，与仅给药RdB/IL-12/DCN或免疫检查点抑制剂的组相比，肿瘤大小的增加显著减少，并且黑素瘤皮下动物模型的生存率显著提高。因此，实验结果表明，根据本发明的RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂的共同给药可以用作更强和更有效的抗癌治疗剂。
3-2.仓鼠皮下胰腺癌动物模型中抗肿瘤作用的确认
旨在使用能够体内复制重组病毒同时具有体内免疫功能的仓鼠模型通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂来确认抗肿瘤免疫应答。将仓鼠胰腺癌细胞系Hap-T1皮下注射到仓鼠中后，当肿瘤大小达到约100mm3时，当将2x 109VP的RdB/IL-12/DCN单独给药或与效力为700μg的免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)组合给药时，观察肿瘤大小的变化。在共同给药期间，将RdB/IL-12/DCN以2天的间隔肿瘤内给药总共三次，并将免疫检查点抑制剂腹膜内给药总共三次。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图9所示，由于将肿瘤选择性杀伤腺病毒(RdB/IL-12/DCN)与免疫检查点抑制剂组合给药，与仅给药RdB/IL-12/DCN或免疫检查点抑制剂的组相比，肿瘤大小的增加显著减少，并且这一趋势在所有三种免疫检查点抑制剂(抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)中同样表现出来。特别地，在给药21天后，与阴性对照相比，该免疫检查点抑制剂(抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)抑制肿瘤生长分别仅为约35.4％、38.8％或7.2％，但仅给药RdB/IL-12/DCN的组可分别抑制肿瘤生长约89.8％、57.7％或48.2％。特别地，与阴性对照相比，共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂可以分别抑制肿瘤生长95.7％、82.1％或78.1％，从而可以再次验证上述抗肿瘤作用。
3-3.仓鼠皮下胰腺癌动物模型中记忆免疫应答的确认
旨在通过共同给药肿瘤选择性杀伤腺病毒和免疫检查点抑制剂来验证抗肿瘤记忆免疫应答。在产生第一个肿瘤后49天，在与先前条件相同的条件下，通过将Hap-T1细胞注射到小鼠中，在肿瘤完全消失的小鼠中再次形成肿瘤(仅给药RdB/IL-12/DCN的组，或共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂的组)。此后，当单独给药RdB/IL-12/DCN或将RdB/IL-12/DCN与免疫检查点抑制剂(抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)组合给药时，以与先前情况相同的方式观察肿瘤的生长。
如图10所示，确认在单独用RdB/IL-12/DCN治疗的组中，再次攻击的肿瘤再次快速生长，而当共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)时，肿瘤的生长仍被抑制。因此，实验结果表明，共同给药根据本发明的RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂也可通过诱导强烈的抗肿瘤记忆免疫应答而有效治疗复发性癌症。
3-4.在具有抗癌剂诱导抗性的动物模型中抗肿瘤作用的确认
由于抗癌剂抗性等在由抗癌剂引起的抗肿瘤作用不明显的条件下，旨在通过共同给药RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂(抗PD-1抗体；αPD-1)来验证体内抗肿瘤作用。将B16-F10小鼠黑色瘤细胞系皮下注射(5x 105细胞)到C57BL/6小鼠的侧腹后，将紫杉醇(第1、2和3天；10mg/kg)腹膜内注射到所形成的肿瘤(第1天，约50mm3)中，在单独给药RdB/IL-12/DCN(第3、5、7和9天；5×105VP)后，单独给药αPD-1(第4、7、8和10天；200μg)或共同给药RdB/IL-12/DCN和αPD-1(分别在相同的条件下)，观察肿瘤的生长。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图11所示，在第一次给药抗癌剂后15天(即第16天)，当单独给药PBS、紫杉醇或αPD-1时，肿瘤的大小分别为7649.0±798.5mm3、5394.5±288.2mm3或5814.2±471.6mm3，证实了肿瘤的快速生长，而在仅给药RdB/IL-12/DCN的组或共同给药RdB/IL-12/DCN和αPD-1的组中，肿瘤的大小分别为2374.0±776.2mm3或669.8±335.2mm3，其表现出显著的抗肿瘤作用。特别地，在共同给药RdB/IL-12/DCN和αPD-1的组中，与仅给药RdB/IL-12/DCN的组相比，肿瘤的大小减少了约71.8％，因此该效果非常显著(P<0.01)。这些实验结果显示出显著的效果，即共同给药根据本发明的RdB/IL-12/DCN和免疫检查点抑制剂不仅比原有的抗癌剂更能改善抗肿瘤效果，而且甚至当抗癌剂的作用由于体内因素如抗癌剂抗性而不显著时，其也会产生显著的抗肿瘤作用。
实施例4.表达松弛素的肿瘤选择性杀伤腺病毒与抗癌剂组合的用途
4-1.确认杀死胰腺癌细胞的能力
当共同给药表达松弛素的肿瘤选择性杀伤腺病毒和胰腺癌标准治疗剂吉西他滨时，旨在验证是否能够显著增加杀死胰腺癌细胞的能力。为此，在用MOI为0.1、0.5、1或2的RdB/IL-12/RLX感染胰腺癌细胞系MIA PaCa-2和PANC-1，并同时用0.01μM或0.05μM的吉西他滨治疗后，通过MTT测定观察细胞凋亡程度。同时，非治疗组用作阴性对照。
如图12所示，与仅用吉西他滨治疗的情况相比，当将RdB/IL-12/RLX(YDC002)与吉西他滨组合给药时，杀死胰腺癌细胞系的能力显著增加。特别地，与单独给药RdB/IL-12/RLX的情况相比，该效果优异，并且重组腺病毒的浓度越高(2MOI)，效果越显著。因此，实验结果表明，共同给药原有的抗癌剂和根据本发明的RdB/IL-12/RLX不仅可以减少用于抗肿瘤治疗的抗癌剂的给药剂量，而且还可以表现出更强的抗肿瘤作用。
4-2.抗肿瘤作用的组织学评价
旨在组织学评估上述实验的抗肿瘤效果。首先，在单独给药RdB/IL-12/RLX(0.5或1MOI)后，单独给药吉西他滨(0.02或0.05μM)，或将RdB/IL-12/RLX和吉西他滨共同给药于胰腺癌细胞系MIA PaCa-2或PANC-1，为了证实肿瘤细胞的凋亡程度，进行TIAEL试验。同时，非治疗组用作阴性对照。此外，旨在确认胰腺癌细胞系中RdB/IL-12/RLX对细胞外基质(ECM)的改变。为了证实胶原蛋白I和胶原蛋白III的mRNA在肿瘤细胞中的表达水平，进行了qPCR，并通过免疫组织化学染色、MT染色、天狼猩红染色等确认胰腺癌组织(球状体)中细胞外基质的变化及该变化引起的细胞凋亡作用。
如图13所示，在MIA PaCa-2和PANC-1细胞中，与对照或仅给药吉西他滨的组相比，观察到仅给药RdB/IL-12/RLX的组或共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中肿瘤细胞的凋亡显著增加，并且在共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中效果最显著。如图14所示，在人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2和PANC-1用MOI为1的RdB/IL-12/RLX感染后72小时比较胶原蛋白I和胶原蛋白III的mRNA表达水平的结果，与其他组相比，仅给药RdB/IL-12/RLX的组或共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中的mRNA表达水平显著降低。同样地，如图15A、15B、16A和16B所示，证实在仅给药RdB/IL-12/RLX的组或共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中，胶原蛋白I、胶原蛋白III、纤连蛋白和弹性蛋白的表达水平大大降低，因此证实肿瘤细胞的凋亡大大改善。
当这些结果一起考虑时，可以看出松弛素降低了细胞外基质蛋白的表达，因此，通过增强癌症选择性杀伤腺病毒和共同给药的抗癌药的功效，使抗肿瘤作用最大化。
4-3.胰腺癌皮下动物模型中抗肿瘤作用的确认
旨在通过在胰腺癌皮下动物模型中共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨来验证抗肿瘤作用。通过将PANC-1、MIA PaCa-2或BxPC-3细胞皮下注射到小鼠中诱导肿瘤的形成，当将RdB/IL-12/RLX单独给药或将RdB/IL-12/RLX与吉西他滨(10mg/kg)组合给药(肿瘤内给药)时，观察肿瘤大小的变化。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图17A至17C所示，通常在所有胰腺癌皮下动物模型(PANC-1、MIA PaCa-2或BxPC-3)中，在阴性对照(PBS)和仅给药吉西他滨的组(吉西他滨)中观察到肿瘤大小的急剧增加，然而确认在仅给药RdB/IL-12/RLX的组或共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中，肿瘤的生长大大减慢，并且特别地，在共同给药的情况下，该效果非常显著。实验结果表明，与各自单独给药相比，由共同给药原有的抗癌剂和RdB/IL-12/RLX所引起的抗肿瘤效果非常显著。
4-4.胰腺癌异种移植动物模型中抗肿瘤作用的确认
为了构建胰腺癌异种移植动物模型，将5x 105的MIA PaCa-2皮下注射到小鼠中，然后当肿瘤大小达到50至100mm3时，当单独给药2x 106pfu的RdB/IL-12/RLX或与1.5mg/kg吉西他滨组合给药时，观察细胞外基质的变化和凋亡作用。在共同给药期间，将RdB/IL-12/RLX以2天的间隔肿瘤内给药总共三次，并将吉西他滨腹膜内给药一次。随后，进行免疫组织化学染色和苏木精-曙红(H&E)染色，并且为了确定细胞凋亡程度，进行TUNEL测定和裂解的半胱天冬酶(caspase)3免疫染色。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图18所示，在共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中，与共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的其他组相比，MIA PaCa-2肿瘤组织中的所有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤连蛋白和弹性蛋白均显著降低。此外，如图19所示，可以看出在阴性对照和仅给药吉西他滨或RdB/IL-12/RLX的组中，肿瘤中细胞的坏死或凋亡几乎不进行或不显著，然而在共同给药RdB/IL-12/RLX和吉西他滨的组中坏死或凋亡是活跃的。也就是说，实验结果再次证实了由抗癌剂和根据本发明的RdB/IL-12/RLX的共同给药所引起的抗肿瘤作用。
实施例5.表达松弛素的肿瘤选择性杀伤腺病毒与免疫检查点抑制剂组合的用途
5-1.黑素瘤皮下动物模型中抗肿瘤作用的确认
将黑素瘤细胞系B16-F10以每只动物5x 105细胞/50μL皮下注射到小鼠中，约7至14天后，当肿瘤大小达到约100至150mm3时，当单独给药5x 109VP的RdB/IL-12/RLX或与效力为200μg的免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1或抗-PD1)组合给药时，评估肿瘤大小的变化和动物模型的生存率。在共同给药期间，将RdB/IL-12/RLX在第1、3和5天进行三次(总共次数)肿瘤内给药，并且将免疫检查点抑制剂在第3、6和9天腹膜内给药(总共三次)。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图20至图23所示，确认了共同给药肿瘤选择性杀伤腺病毒(RdB/IL-12/RLX)和免疫检查点抑制剂(抗-PD-L1或抗-PD1)的结果，与仅给药RdB/IL-12/RLX或免疫检查点抑制剂的组相比，肿瘤大小的增加显著减少，并且黑素瘤皮下动物模型的生存率显著提高。此外，在上述实验中，由单独给药肿瘤选择性杀伤腺病毒RdB/IL-12/RLX引起的抗肿瘤效果是如此强烈以至于难以证明共同给药的优异效果。因此，如图24所示，通过将RdB/IL-12/RLX的给药浓度降低5倍(1×109VP)进行再试验的结果，可以证实与仅给药RdB/IL-12/RLX的组相比，共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD1)的组的抗肿瘤作用显著。因此，实验结果表明，根据本发明的RdB/IL-12/IL和免疫检查点抑制剂的共同给药可以用作更强和更有效的抗癌治疗剂。
5-2.黑素瘤皮下动物模型中记忆免疫应答的确认
旨在通过共同给药肿瘤选择性杀伤腺病毒和免疫检查点抑制剂来验证抗肿瘤记忆免疫应答。在产生第一个肿瘤后50天，在与先前条件相同的条件下，通过将B16-F10细胞注射到小鼠中，在肿瘤完全消失的小鼠中再次形成肿瘤(共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂的组)。此后，当单独给药RdB/IL-12/RLX或将RdB/IL-12/RLX与免疫检查点抑制剂(抗-PD-1和抗-PD-L1)组合给药时，以与先前情况相同的方式观察肿瘤的生长。
如图25所示，证实当共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗-PD-1和抗-PD-L1)时，肿瘤的生长急剧减少。因此，实验结果表明，共同给药根据本发明的RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂也可通过诱导强烈的抗肿瘤记忆免疫应答而有效治疗复发性癌症。
5-3.在具有抗癌剂诱导抗性的动物模型中抗肿瘤作用的确认
由于抗癌剂抗性等在由抗癌剂引起的抗肿瘤作用不明显的条件下，旨在通过共同给药RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂(抗PD-1抗体；αPD-1)来验证体内抗肿瘤作用。在将B16-F10小鼠黑色瘤细胞系皮下注射(5x 105细胞)到C57BL/6小鼠的侧腹后，将紫杉醇(第1、2和3天；10mg/kg)腹膜内注射到所形成的肿瘤(第1天，约50mm3)中，在单独给药RdB/IL-12/DCN(第3、5、7和9天；5×105VP)后，单独给药αPD-1(第4、7、8和10天；200μg)或共同给药RdB/IL-12/DCN和αPD-1(分别在相同的条件下)，观察肿瘤的生长。同时，将仅给药PBS的组用作阴性对照。
如图26所示，在第一次给药抗癌剂后15天(即第16天)，当单独给药PBS、紫杉醇或αPD-1时，肿瘤的大小分别为7649.0±798.5mm3、5394.5±288.2mm3或5814.2±471.6mm3，证实了肿瘤的快速生长，而在仅给药RdB/IL-12/RLX的组或共同给药RdB/IL-12/RLX和αPD-1的组中，肿瘤的大小分别为2817.1±776.2mm3或633.9±141.9mm3，其表现出显著的抗肿瘤作用。特别地，在共同给药RdB/IL-12/RLX和αPD-1的组中，与仅给药RdB/IL-12/RLX的组相比，肿瘤的大小减少了约77.5％，因此效果非常显著(P<0.01)。这些实验结果显示出显著的效果，即共同给药根据本发明的RdB/IL-12/RLX和免疫检查点抑制剂不仅比原有的抗癌剂更能改善抗肿瘤效果，而且甚至当抗癌剂的作用由于体内因素如抗癌剂抗性而不显著时，其也会产生显著的抗肿瘤作用。
实施例6.确认表达松弛素的肿瘤选择性杀伤腺病毒对肿瘤组织浸润的影响
旨在通过进行免疫荧光染色来确认治疗物质渗入和扩散到肿瘤组织中的程度。单独给药PBS后，将PBS和曲妥珠单抗(150μg/小鼠)或RdB/IL-12/RLX(2.5×1010VP)和曲妥珠单抗共同给药于NCIN87胃肿瘤组织，比较了Alexa488标记的曲妥珠单抗在肿瘤组织中的浸润和分布情况。
如图27所示，证实在向肿瘤组织给药PBS和曲妥珠单抗的情况下，曲妥珠单抗更集中地分布在肿瘤组织的周围而不是肿瘤组织的中心，而当共同给药RdB/IL-12/RLX和曲妥珠单抗时，曲妥珠单抗在整个肿瘤中均匀分布，特别地，可以看出曲妥珠单抗扩散到肿瘤组织的中心。此外，当图27中标记的区域被放大并观察时，如图28A至28C所示，在向肿瘤组织给药PBS和曲妥珠单抗的情况下，与阴性对照相比，曲妥珠单抗的浸润增加，但随着该区域进一步远离肿瘤组织的边缘部位，曲妥珠单抗的荧光降低至阴性对照的水平。然而，证实了在向肿瘤组织共同给药RdB/IL-12/RLX和曲妥珠单抗的情况下，曲妥珠单抗的渗透不仅在边缘位置保持高水平，而且在远离边缘位置的中心也保持高水平。此外，当肿瘤组织的血管被集中放大并观察时，如图29A至29C所示，证实在向肿瘤组织给药PBS和曲妥珠单抗的情况下，曲妥珠单抗仅在血管周围增加，而在向肿瘤组织共同给药RdB/IL-12/RLX和曲妥珠单抗的情况下，曲妥珠单抗不仅渗透到血管周围的区域，而且渗透到远离血管的区域。最后，为了检查曲妥珠单抗与肿瘤组织中的靶标一起存在的时间，用64Cu-DOTA标记曲妥珠单抗，然后进行PET成像。结果如图30A和30B所示，与给药PBS和曲妥珠单抗(150μg/小鼠)的情况相比，证实当共同给药RdB/IL-12/RLX(2.5×1010VP)和曲妥珠单抗时，在体内分布的曲妥珠单抗集中在肿瘤组织中，而在给药后15小时开始消逝，并且直至给药后60小时曲妥珠单抗仍然保留在肿瘤组织中。
当这些结果一起考虑时，通过RdB/IL-12/RLX抑制肿瘤组织中细胞外基质蛋白的表达可以通过更大程度地增强曲妥珠单抗在肿瘤中的浸润和扩散作用来改善抗肿瘤作用，因此，RdB/IL-12/RLX以与原有的抗癌剂等组合给药的形式使用，从而提供更强的抗肿瘤效果。
提供本发明的上述描述是为了说明的目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应该理解上述实施例在所有方面仅是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.重组腺病毒在制备用于辅助抗癌剂或免疫检查点抑制剂的药物上的用途，所述重组腺病毒含有能够表达的编码白细胞介素12(IL-12)的基因和能够表达的编码核心糖蛋白聚糖的基因，
其中所述重组腺病毒包含E1区域中E1B-19k基因的缺失和E3区域的缺失，
其中编码IL-12的基因插入到E1区域中并且编码核心糖蛋白聚糖的基因插入到缺失的E3区域中，
其中所述免疫检查点抑制剂为选自程序性细胞死亡-1(PD-1)免疫检查点抑制剂、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)免疫检查点抑制剂和细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)拮抗剂中的任何一种，并且
其中所述抗癌剂为选自紫杉醇、吉西他滨、卡培他滨和曲妥珠单抗中的任何一种。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于，该重组腺病毒还包括E1B-55k基因的缺失。
3.根据权利要求1的用途，其特征在于，将该重组腺病毒与抗癌剂或免疫检查点抑制剂同时、分开或顺序给药。
4.根据权利要求1的用途，其特征在于，该重组腺病毒增强抗肿瘤免疫力。
5.重组腺病毒在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述重组腺病毒含有能够表达的编码白细胞介素12(IL-12)的基因和能够表达的编码核心糖蛋白聚糖的基因，所述药物与抗癌剂或免疫检查点抑制剂联合使用，其中所述重组腺病毒包含E1区域中E1B-19k基因的缺失和E3区域的缺失，
其中编码IL-12的基因插入到E1区域中并且编码核心糖蛋白聚糖的基因插入到缺失的E3区域中，
其中所述免疫检查点抑制剂为选自程序性细胞死亡-1(PD-1)免疫检查点抑制剂、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)免疫检查点抑制剂、细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)拮抗剂中的任何一种，
其中所述抗癌剂为选自紫杉醇、吉西他滨、卡培他滨和曲妥珠单抗中的任何一种，并且
其中所述癌症为选自胃癌、胰腺癌和黑色素瘤中的任何一种。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于，所述癌症为复发性癌症或抗癌剂抗性癌症。
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