CN118717701A

CN118717701A - 细菌矿化金属纳米颗粒用于治疗肿瘤

Info

Publication number: CN118717701A
Application number: CN202310327618.8A
Authority: CN
Inventors: 聂广军; 赵瑞芳; 覃好
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2023-03-29
Filing date: 2023-03-29
Publication date: 2024-10-01
Also published as: CN120916784A; WO2024199265A1

Abstract

本发明提供了包含金属小体的药物组合物、免疫增强剂或免疫刺激剂，及其在免疫调控和肿瘤治疗中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分。

Description

细菌矿化金属纳米颗粒用于治疗肿瘤

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗，特别地，涉及细菌矿化金属产生的金属小体用于肿瘤治疗。

背景技术

细菌自然分泌的一些复杂结构，如细菌外膜囊泡(OMVs)等，是细菌细胞膜出芽产生的纳米尺寸的颗粒，常用于细菌与外界的物质交换及信息传递等。因此，这类纳米结构不仅具备脂蛋白，脂多糖(LPS)等细胞骨架成分，并且还有可能内包了核酸分子及代谢产物等，具备潜在的免疫刺激能力[Kulp A et al.,Biological Functions and Biogenesisof Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles.Annu rev microbiol:2010,64:163-184；Toyofuku M et al.,Types and origins of bacterial membrane vesicles.NatureRev Microbiol:2019,17:13-24和Haurat MF et al.Selective sorting of cargoproteins into bacterial membrane vesicles.J Biol Chem:2011,286:1269-1276]。最近，细菌来源纳米膜结构被证明可激活机体免疫系统引发基于IFN-γ的抗肿瘤作用，以及介导LPS引发细胞焦亡[Kim OY et al.,Bacterial outer membrane vesicles suppresstumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.Nat Commun:2017,8:626和Vanaja SK et al.,Bacterial outer membrane vesicles mediate cytosoliclocalization of LPS and caspase-11activation.Cell:2016,165:1106-1119]，是一种强力的多价免疫刺激剂。并且细菌膜可通过基因工程等手段表达修饰抗原，细胞因子等，也是良好的具有内在佐剂性质的载体[Chen DJ et al.,Delivery of foreign antigens byengineered outer membrane vesicle vaccines.Proc Natl Acad Sci U S A:2010,107:3099-3104和Kesty NC et al.,Incorporation of heterologous outer membrane andperiplasmic proteins into escherichia coli outer membrane vesicles.J BiolChem:2004,279:2069-2076]。

金纳米颗粒由于其良好的生物安全性及表面等离子光学共振特征，可将光能转化成热能，常被用于肿瘤光热治疗的研究[Liu Y et al.,Gold nanoparticles-mediatedphotothermal therapy and immunotherapy.Immunotherapy:2018,10:1175-1188；Wei Petal.,Dendrimer-stabilized gold nanostars as a multifunctional theranosticnanoplatform for ct imaging,photothermal therapy,and gene silencing oftumors.Adv Health Mater:2016,5:3203-3213和Zhang D et al.,Intracellularlygenerated immunological gold nanoparticles for combinatorial photothermaltherapy and immunotherapy against tumor.Nano Lett:2019,19:6635-6646]。

细菌生物矿化是利用生物过程中的氧化还原反应等，将金属离子在细胞内或者细胞提取物中还原成金属单质的过程，是一种非常温和且环境友好的金属还原方法[Jung JHet al.,In vivo synthesis of nanocomposites using the recombinant escherichiacoli.Small:2018,14和Reith F et al.，Biomineralization of gold:Biofilms onbacterioform gold.Science:2006,313:233-236]。目前人们已经探索了各种细菌在不同的金属离子还原中的应用，包括铁，锌，镉，银，金等，主要用于环境净化和重金属回收[GaddGM，Metals,minerals and microbes:Geomicrobiology andbioremediation.Microbiology:2010,156:609-643和Das SK et al.,A green chemicalapproach for the synthesis of gold nanoparticles:Characterization andmechanistic aspect.Rev Environ Sci Bio-Tech:2010,9:199-204]。

在肿瘤组织发生发展的过程中，为了逃避免疫系统的识别清除，肿瘤细胞通过阻断免疫反应或者激活免疫负调控通路抑制机体抗肿瘤免疫力，包括阻碍效应细胞的肿瘤组织浸润及其功能活性，上调免疫检查点表达以及促进抗原提呈向免疫耐受方向进行等[Whiteside TL，Immune suppression in cancer:Effects on immune cells,mechanismsand future therapeutic intervention.Semin Cancer Biol:2006,16:3-15；Marigo Iet al.,Tumor-induced tolerance and immune suppression by myeloid derivedsuppressor cells.Immunol Rev:2008,222:162-179；Vinay DS et al.,Immune evasionin cancer:Mechanistic basis and therapeutic strategies.Semin Cancer Biol:2015,35:S185-S198和Beatty GL et al.,Immune escape mechanisms as a guide forcancer immunotherapy.Clin Cancer Res:2015,21:687-692]。在这些免疫激活和免疫抑制的过程中，涉及到了大量分子模式，细胞因子及代谢产物等，它们作为重要的信号分子参与免疫响应，促进免疫细胞之间的交流，调节免疫方向。细胞因子作为免疫系统的主要信号分子，可直接作用于各种免疫细胞，如IL-2可促进自然杀伤细胞(NK)，T细胞等效应免疫细胞的增殖；干扰素-α(INF-α)在树突状细胞(DCs)成熟，抗肿瘤血管新生等方面发挥重要作用；以CTLA-4，PD-1为主的多种免疫检查点阻断被证明可以有效促进效应免疫细胞的产生及其对肿瘤细胞的识别，杀伤作用。但由于这些免疫调控剂作用靶点单一，使得其在临床响应率偏低，并伴有明显毒副作用，治疗效果也仍待提高。因此，需要继续探索新型的免疫调节剂，通过合理设计及多靶点同时作用，促进免疫系统的激活或者缓解肿瘤免疫抑制环境。

肿瘤过高热也是一种调控肿瘤局部免疫环境的策略，过高热可促进肿瘤细胞表达分泌热休克蛋白(HSPs)，将信号传递给各类免疫细胞，促进其向免疫表型分化，并分泌大量促炎细胞因子[Lee S et al.,Immunogenic effect of hyperthermia on enhancingradiotherapeutic efficacy.Int J Mol Sci:2018,19:2795；Wust P et al.,Hyperthermia in combined treatment of cancer.Lancet Oncol:2002,3:487-497和Zhang H-G et al.,Hyperthermia on immune regulation:A temperature'sstory.Cancer Lett:2008,271:191-204]。同时，过高热也会加速血液流动，增大血管内皮间隙，促进血液的组织灌注，增加免疫调控剂以及效应细胞的组织浸润[Kong G et al.,Hyperthermia enables tumor-specific nanoparticle delivery:Effect of particlesize.Cancer Res:2000,60:4440-4445和Zhao R et al.,Photothermal effect enhancedcascade targeting strategy for improved pancreatic cancer therapy by goldnanoshell@mesoporous silica nanorod.ACS Nano:2017,11:8103-8113]。

发明内容

本文利用大肠杆菌矿化还原金离子，并通过出芽的方式被细菌膜包裹分泌到细胞外，产生表面包被细菌膜的金纳米颗粒的金小体(Ausomes)。由于Ausomes包含大量细菌来源的分子，因此具备潜在的免疫刺激能力，可系统性激活免疫系统，产生活化的免疫细胞以及效应细胞。同时，金纳米颗粒也赋予了Ausomes光热转化能力，纳米尺寸下的Ausomes可在肿瘤部位富集，实现肿瘤局部过高热，增加组织的血液灌注，促进效应细胞的肿瘤浸润，缓解肿瘤免疫抑制微环境。本文的研究表明，Ausomes可激发强烈的系统性免疫反应，分泌大量的促炎细胞因子，产生CD8+T细胞及NK细胞等效应细胞；并且Ausomes介导的肿瘤局部过高热可增加血液灌注，进一步促进效应细胞的组织浸润，提高肿瘤内的免疫水平。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含金属小体(metalsomes)以及任选包含药学上可接受的载体，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。

在一个方面，本发明提供了金属小体在制备用于治疗对象中肿瘤的药物中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。

在一个方面，本发明提供了一种免疫增强剂或免疫刺激剂，其包含金属小体以及任选包含药学上可接受的载体，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。

在一个方面，本发明提供了金属小体在制备免疫增强剂或免疫刺激剂中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细菌内膜、细菌外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其组合。

在一个方面，本发明提供了一种膜囊泡的分离纯化方法，其中所述膜囊泡包含金属纳米颗粒和附于膜囊泡上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合，其中所述金属选自金、银、锰、钛和铁，优选金，所述方法包括：

(i)将细菌在含金属离子的溶液中培养，其中优选所述细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)，优选大肠杆菌(Escherichia coli)，例如DH5α株，

(ii)收获(i)获得的培养液，

(iii)从(ii)收获的培养液的培养上清收获膜囊泡，任选纯化。

附图简述

图1：大肠杆菌将Au3+矿化成金纳米颗粒的过程。大肠杆菌与Au3+共孵育，不同时间点下，细菌的SEM成像(A)，标尺：4μm/500nm；TEM成像(B)，标尺：1μm/200nm；以及细菌溶液的状态(C)。

图2：矿化的金纳米颗粒的细菌内分布。(A)已经矿化形成金纳米颗粒的细菌超薄切片的STEM成像。已经合成但还未分泌出来的含金纳米颗粒的大肠杆菌的SEM成像(B)和TEM成像(C)。标尺：50nm。

图3：Ausomes的提取与产率：(A)不同离心条件下收集到的Ausomes的TEM成像。(B)Ausomes产量随时间变化曲线；标尺：200nm。

图4：Ausomes理化性质的表征：(A)TEM和DLS表征Ausomes的粒径和分散性；标尺：100nm。(B)Ausomes的形貌和结构的TEM图；标尺：10nm。(C)Ausomes的高分辨TEM成像；标尺：5nm。(D)Ausomes的选区电子衍射环。AuNPs的TEM成像(E)；标尺：200nm，和DLS粒径测定(F)。

图5：Ausomes包含的脂质成分。

图6：Ausomes光热性质的表征：(A)Ausomes的紫外-可见吸收光谱。(B)Ausomes溶液浓度依赖，以及激光功率密度依赖的温度变化。(C)AuNPs的紫外-可见吸收光谱。(D)AuNPs的光热转化效果。

图7：Ausomes的细胞摄取：4T1在不同孵育时长下摄取Ausomes或者AuNPs的双光子成像(A)以及ICP-MS定量分析(B)。BMDCs在不同孵育时长下摄取Ausomes或者AuNPs的双光子成像(C)以及ICP-MS定量分析(D)。

图8：Ausomes体外刺激DCs成熟：(A,B)不同剂量的Ausomes与BMDCs孵育6小时或24小时后，流式细胞仪分析检测CD80+CD86+成熟DCs的比例。(C,D)相同剂量的Ausomes，AuNPs以及激光照射后的Ausomes与BMDCs孵育24小时后，流式细胞仪分析检测CD80+CD86+成熟DCs的比例。

图9：Ausomes可能引发的毒副作用：(A)不同剂量Ausomes的溶血率。(B,C)静脉注射不同剂量Ausomes引起的血清细胞因子水平变化。

图10：不同剂量Ausomes的肿瘤抑制效果：(A)Ausomes的抗肿瘤治疗程序示意图。(B)肿瘤生长曲线。(C)治疗过程中小鼠体重变化。

图11：Ausomes用于肿瘤治疗的安全性评价：(A)Ausomes静脉注射6小时或24小时后的体内分布。按抗肿瘤治疗免疫程序处理小鼠后，小鼠的血液生化检测(B)以及不同器官的H&E染色(C)；标尺：50μm。

图12：Ausomes的肿瘤聚集：(A,B)静脉注射Cy5.5标记的Ausomes，并于不同时间点进行活体成像，分析肿瘤荧光聚集强度。(C)静脉注射Ausomes，并于不同时间点利用ICP-MS定量肿瘤中金元素的含量。

图13：Ausomes介导的肿瘤局部过高热：(A)静脉注射Ausomes或者AuNPs后，荷瘤小鼠在激光注射(660nm，1.2W/cm2)下的红外热成像图像及肿瘤升温曲线。(C)过高热处理前后，小鼠肿瘤的实时MSOT成像。(D)过高热处理前后，FITC-右旋糖苷标记的小鼠血管的激光共聚焦3D重构成像。

图14：Ausomes联合肿瘤局部过高热的体内免疫响应：(A)Ausomes及Ausomes联合过高热免疫荷瘤小鼠示意图。(B)免疫后小鼠血清中和肿瘤组织中各细胞因子水平的变化倍数，大于3倍的按3倍处理。

图15：免疫细胞的肿瘤浸润：按图14A所示免疫程序处理荷瘤小鼠后6小时和24小时，流式分析肿瘤组织中各免疫细胞的浸润。

图16：Ausomes联合肿瘤局部过高热的抗肿瘤效果及安全性评价：(A)抗肿瘤免疫程序示意图。(B)肿瘤生长曲线及治疗后肿瘤的尺寸比较。(C)治疗过程中小鼠的体重变化。治疗结束后小鼠的血液生化分析(D)及主要脏器H&E染色的组织切片(E)；标尺：50μm。

具体实施方式

除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))和Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.,J.Wiley&Sons(NewYork,NY 1994)；Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。

本文实验结果表明，大肠杆菌将金离子还原成了金纳米颗粒，并被分泌到了细菌外，形成表面包被了细菌组分的金纳米颗粒，金小体(Ausomes)。本文所述的金属小体例如Ausomes具备细菌外膜组分，可发挥与OMVs相似的免疫学效应，同时还包载了金属纳米颗粒例如金纳米颗粒内核。金属纳米颗粒赋予了金属小体两个方面的优势：(1)在其他细菌来源用作免疫佐剂的纳米结构，如OMVs，的提取中，由于结构质量较轻，一般都需要超速离心才能实现纯化收集，产业化难以实现，金属纳米颗粒大大增加了金属小体的质量，在约5000-15000g例如约11000g的转速下也能将进行离心沉淀，这对工业生产意义重大；(2)金属纳米颗粒具备多种特殊性质，包括光热转换能力，放疗增敏能力等，赋予了金属小体更多的功能，联合这些功能可以多方面促进免疫响应的强度。

在本发明中，联合应用了金纳米颗粒的光热转化能力，产生肿瘤局部过高热，促进了肿瘤组织的血液灌注，显著增强了Ausomes的系统性免疫刺激效果，同时提升了肿瘤组织中的免疫反应，促进了效应细胞的组织浸润，进而产生了更强的肿瘤抑制作用。在Ausomes的免疫刺激下，机体调动了大量不同类型，不同功能的细胞因子，说明Ausomes可能激活了多条免疫通路，有很强的免疫刺激能力；同时肿瘤组织中促炎细胞因子的上调和抑炎细胞因子的下调也表明了肿瘤免疫抑制环境的缓解。

同时具备免疫刺激和光热转化能力的纳米免疫调控剂Ausomes，刺激系统性免疫反应的同时也能缓解肿瘤免疫抑制微环境，本身便可发挥较好的肿瘤抑制作用。除了良好的生物学效应，其结构组成也决定了Ausomes可通过合理设计作为一个多功能平台用于更好的肿瘤治疗策略的构建。

在第一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含金属小体以及任选包含药学上可接受的载体，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分。

如本文所用，金属小体是指由金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分组成的颗粒。

在一个实施方案中，所述金属可以选自金、银、锰、钛和铁，优选金。

在一个实施方案中，所述金属纳米颗粒是金属晶体纳米颗粒，例如金晶体。

如本文所用，金属纳米颗粒是由金属(优选金属原子或单质金属)形成的纳米级别大小的微粒。金属纳米颗粒是本领域已知的任何合适大小，例如粒径在几纳米至几百纳米之间。

在一个实施方案中，金属纳米颗粒的粒径为约X纳米至Y纳米之间，其中X是选自1-50之间的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，Y是选自50-500之间的整数，例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500。

在一个实施方案中，金属纳米颗粒的粒径为约5-500、5-450、5-400、5-350、5-300、5-250、5-240、5-230、5-220、5-210、5-200、10-500、10-450、10-400、10-350、10-300、10-250、10-240、10-230、10-220、10-210、10-200、20-500、20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-240、20-230、20-220、20-210、20-200、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-240、30-230、30-220、30-210、30-200、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-240、40-230、40-220、40-210、40-200、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-240、50-230、50-220、50-210或50-200nm。在一个实施方案中，金属纳米颗粒的粒径为约10-200nm，例如约10-40nm，约10-30nm或约20-30nm，特别地为约30nm。

如本文所用，金属是可以用于体内施用的任何合适金属，条件是其可以用于光热治疗。本文的金属可以选自金、银、锰、钛和铁，优选金。

在一个实施方案中，所述金属纳米颗粒为金属晶体。

如本文所用，金属晶体是金属原子以金属键相互作用、在晶格结点上排列形成的结构。金属晶体为本领域所熟知，例如高分辨晶格像和选取电子衍射图像可参见AmericanMineralogist Crystal Structure Database(arizona.edu)。

在一个实施方案中，所述金纳米颗粒为金晶体。

如本文所用，金晶体是单质金的晶体状态。金晶体的晶胞是面心立方体，在立方体的8个顶点各有一个金原子，各个面的中心有一个金原子，每个金原子被相邻的晶胞所共有。

在一个实施方案中，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。在一个实施方案中，附于金属纳米颗粒其上的细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸和磷脂来自于细菌(例如进行金属矿化的细菌)并且具有免疫原性。例如，所述细菌组分可以是在细菌矿化过程中包覆于金属纳米颗粒表面，或者通过提取或破碎细菌细胞获得、然后将其附于金属纳米颗粒表面。本领域已知各种将所需分子或化合物附于金属纳米颗粒表面的技术和手段。

在一个实施方案中，所述细菌组分通过共价或非共价方式与所述金属纳米颗粒直接或间接连接，或者所述细菌组分位于完全或部分包覆所述金属纳米颗粒的表面有机层中或其上。

如本文所述，完全包覆所述金属纳米颗粒是指所述有机层完全包围所述纳米颗粒，形成密闭类球形结构；部分包覆所述金属纳米颗粒是指所述有机层仅包覆所述纳米颗粒的部分外表面，其余部分可以是裸露的或者被其它物质包覆。

所述有机层可以是本领域已知的任何适于用于药用用途并且可以附于金属纳米颗粒表面的任何物质，例如脂质膜。本文所述细菌组分可以与膜连接或者插入膜中，从而附于金属纳米颗粒上。

在一个实施方案中，每个所述金属小体包含一个金属纳米颗粒。

在一个优选实施方案中，所述金属小体是细菌矿化金属产生的。细菌矿化是将细菌与含金属离子的溶液接触，从而将金属离子还原成金属单质的过程。

在一个优选实施方案中，用于金属矿化的细菌选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、博德特氏菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)和沙门氏菌属(Salmonella)。例如，奈瑟氏菌属可以选自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)和乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)，和/或博德特氏菌属可以选自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)和支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)。优选地，所述革兰氏阴性细菌选自脑膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌、大肠杆菌(Escherichia coli)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，最优选大肠杆菌，例如DH5α株。

在一个优选实施方案中，所述金属小体是细菌在矿化金属过程中通过膜囊泡包裹分泌产生的，其中所述膜囊泡包含所述金属纳米颗粒，并且膜囊泡含有细菌组分。

如本文所用，膜囊泡是磷脂双分子层结构，通常为球形，直径在约5-500nm的范围内。通常，膜囊泡是由细菌(例如革兰氏阴性细菌)释放的非复制结构，主要由脂质、LPS和外膜蛋白构成。膜囊泡可包含细菌表面成分，例如膜内部含有磷脂(PL)，外部含有脂多糖(LPS)和PL。膜囊泡的腔可以包含来自周质或细胞质的化合物，例如蛋白质、RNA/DNA和肽聚糖(PG)，但是膜囊泡缺乏自我复制能力。

在一个实施方案中，所述膜囊泡的膜包含磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、二酰基甘油(DG)、甘油三酯(TG)、神经酰胺(Cer)、脂质A、半乳糖神经酰胺(GalCer)、单硬脂酸甘油酯(MG)、鞘磷脂(SM)中的一或多种，优选全部，更优选地，CL为阴性离子和/或脂质A为阳性离子。

在一个实施方案中，所述膜囊泡的膜包含外膜蛋白C、外膜蛋白A、主要外膜脂蛋白Lpp、延伸因子Tu2/Tu1、D-甲硫氨酸结合脂蛋白MetQ、渗透诱导蛋白Y、可能的脂蛋白YiaD、麦芽糖孔蛋白、外膜蛋白组装因子BamB、果糖二磷酸醛缩酶类别2、伴侣蛋白DnaK、外膜脂蛋白RcsF、可能的磷脂结合蛋白MlaC、多药抗性蛋白MdtE、长链脂肪酸转运蛋白、伴侣蛋白HtpG、外膜蛋白组装因子BamA、蛋白外运膜蛋白SecG中的一或多种，优选全部。

在一个实施方案中，所述膜囊泡的粒径为约5-500nm，例如粒径为约5-500、5-450、5-400、5-350、5-300、5-250、5-240、5-230、5-220、5-210、5-200、10-500、10-450、10-400、10-350、10-300、10-250、10-240、10-230、10-220、10-210、10-200、20-500、20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-240、20-230、20-220、20-210、20-200、30-500、30-450、30-400、30-350、30-300、30-250、30-240、30-230、30-220、30-210、30-200、40-500、40-450、40-400、40-350、40-300、40-250、40-240、40-230、40-220、40-210、40-200、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-240、50-230、50-220、50-210或50-200nm。在一个实施方案中，所述膜囊泡的粒径为约10-200nm。

在一个实施方案中，所述膜囊泡的直径小于约450、440、430、420、410、400、350、300、250、220、210、200nm或更小。在一个实施方案中，所述膜囊泡的直径小于450nm。在一个实施方案中，所述膜囊泡的直径小于220nm。

在一个实施方案中，所述膜囊泡的粒径为约10-200nm，例如约10-150、10-100、10-50、10-40、10-30、20-150、20-100、20-50、20-40、20-30nm。

本文所述的包含金属纳米颗粒的膜囊泡可以通过本领域已知的任何合适方法形成，例如将含有金属离子的溶液与可以产生膜囊泡的细菌(例如革兰氏阴性细菌)接触，通过细菌矿化，产生包含金属纳米颗粒的膜囊泡。

本文所述的膜囊泡可以通过本领域已知的任何合适方法分离或获得，例如通过洗涤剂(例如脱氧胆酸盐)自细胞提取获得或由可以产生膜囊泡的细菌天然产生(例如细菌出芽形成膜囊泡并脱落至介质中)。

在一个实施方案中，本文所述膜囊泡由革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌产生的。

在一个实施方案中，本文所述膜囊泡是由革兰氏阴性细菌自发产生的天然膜囊泡。

在一个实施方案中，本文所述膜囊泡获自革兰氏阴性细菌，例如选自奈瑟氏菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌属。例如，奈瑟氏菌属可以选自脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌和乳糖奈瑟氏菌，和/或博德特氏菌属可以选自百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌。优选地，所述革兰氏阴性细菌选自脑膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌，最优选大肠杆菌。

特别地，产生本文所述膜囊泡的细菌可以具有包含一或多个遗传修饰，例如去除可能对所述膜囊泡施用的对象产生毒性或其他不利效果的因子例如蛋白或毒素如内毒素，或者利于膜囊泡产生的遗传修饰。

特别地，所述药物组合物用于肿瘤光热治疗或者放疗。在一个实施方案中，所述肿瘤优选为实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是指有助于活性物质给予对象且对象吸收的物质，其可以包括在本发明组合物中而不引起患者的显著毒副作用。适用于本发明中的药学上可接受的载体是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy,TheUniversity of the Sciences in Philadelphia,编者Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,第21版(2005)描述适用于药物递送的组合物和配制物。

药学上可接受的载体的非限制性例子包括水、NaCl、生理盐水、蔗糖、葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香味剂、盐溶液、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸脂、羟甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮和着色剂等。本领域技术人员理解其它药物载体可以用于本发明。

本文所述的“药物组合物”是指为适应治疗或预防疾病的需要，按照一定的剂型要求所制成的可提供给用药对象使用的药品。所述的药物组合物中可以含有本发明所述的金属小体，同时也可以含有其他药用辅料和工具。

本文所述的“辅料”即药用辅料，是指生产药品和调配处方时使用的除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质，其目的除赋形、充当载体或提高稳定性外，还可以具有增溶、助溶、缓控释等重要功能。本文的药物或药物组合物可以配制为适合任何合适给予途径例如静脉内、皮下、胃肠外、口服、腹膜内、肌肉内、鼻内、动脉内或病灶内等的剂型，例如片剂、粉剂、溶液等。在一个实施方案中，本发明所述药物或药物组合物可以配制为适合用于静脉内施用的形式。

由于金属纳米颗粒具有光热转化性质和射线增敏性质，所以可以用于光热治疗和放射治疗。在一个实施方案中，所述药物组合物用于肿瘤光热治疗和放疗。

在第二方面，本发明提供了金属小体在制备用于治疗对象中肿瘤的药物中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分。所述金属小体、金属纳米颗粒和细菌组分如上文第一方面所描述或限定。

在一个实施方案中，所述药物以适合于通过光热或者放疗治疗肿瘤的剂型。

在一个实施方案中，所述肿瘤优选为实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌。

在一个实施方案中，所述对象选自人和其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛和鹿，优选人。

在第三方面，本发明提供了一种免疫增强剂或免疫刺激剂，其包含金属小体以及任选包含药学上可接受的载体，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分。在第四方面，本发明提供了金属小体在制备免疫增强剂或免疫刺激剂中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分。所述金属小体、金属纳米颗粒和细菌组分如第一方面所描述或限定。

如本文所用，免疫增强剂或免疫刺激剂是指具备免疫刺激能力，可系统性激活免疫系统，分泌大量的促炎细胞因子并产生活化的免疫细胞如抗原提呈细胞，CD8+T细胞及NK细胞。免疫增强剂或免疫刺激剂可以与其他药物联合施用，以增强治疗效果。例如，免疫增强剂可以与肿瘤治疗剂共同施用，可以增强机体的免疫活性，达到更好的肿瘤治疗效果。

本文所述金属小体不但包含多种细菌组分，而且含有金属纳米颗粒核心，可用于肿瘤光热治疗。光热治疗是将具有光热转换效率的材料聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源(例如近红外光)的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞。

例如，包含金属纳米颗粒的金属小体可在肿瘤部位富集，在适当照射时(例如以660nm激光照射金纳米颗粒时)实现肿瘤局部过高热，增加组织的血液灌注，促进效应细胞的肿瘤浸润，缓解肿瘤免疫抑制微环境。所述过高热效应是指一种调控肿瘤局部免疫环境的策略，过高热可促进肿瘤细胞表达分泌热休克蛋白，将信号传递给各类免疫细胞，促进其向免疫表型分化，并分泌大量促炎细胞因子；同时，过高热也会加速血液流动，增大血管内皮间隙，促进血液的组织灌注，增加免疫调控剂以及效应细胞的组织浸润。另外，由于金属纳米颗粒具有射线增敏性质，所以可以用于放射治疗。

在一个实施方案中，本文提供了所述金属小体在制备用于肿瘤光热治疗或放疗的免疫增强剂或免疫刺激剂中的用途或者用作肿瘤光热治疗或放疗的免疫增强剂或免疫刺激剂。

在一个实施方案中，本文提供了一种用于肿瘤放疗的免疫增强剂或免疫刺激剂，其包含本文第一方面的金属小体。

在一个实施方案中，本文提供了一种用于肿瘤光热治疗的免疫增强剂或免疫刺激剂，其包含本文第一方面的金属小体。

本文中，根据金属小体中包含的金属纳米颗粒可以选择合适的外部光源进行照射。例如，对于金，可以使用发射波长为约500-850nm例如约660nm的光源进行照射。

在第五方面，本发明提供了生产金属小体的方法，所述金属小体包含所述金属纳米颗粒和包覆所述金属纳米颗粒的膜囊泡，以及附于膜囊泡上的细菌组分(所述金属纳米颗粒和膜囊泡和附于膜囊泡上的细菌组分如前文所述或定义)，所述方法包括：

(i)将能够进行金属矿化的细菌在含金属离子的溶液中培养，

(ii)收获(i)获得的培养液，

(iii)从(ii)的培养液的培养上清分离、任选纯化以收获上清中的金属小体。

本领域已知能够进行金属矿化的细菌包括那些细菌，所述细菌可以是革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。在一个实施方案中，所述能够进行金属矿化的细菌包括但不限于奈瑟氏菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌属，如奈瑟氏菌属可以选自脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌和乳糖奈瑟氏菌，和/或博德特氏菌属可以选自百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌。优选地，所述细菌选自脑膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌，最优选大肠杆菌，例如DH5α株。

本文中，所述细菌在含金属离子的溶液中培养之前，可以预先在合适的培养基中培养合适状态，例如至对数生长期。对于任意细菌，本领域已知合适的培养和收集条件，如温度、时间、培养基等。

本文中，含金属离子的溶液是指溶液中含有的金属离子可以被细菌矿化从而包被在膜囊泡内。可被细菌矿化的金属离子是本领域已知的。在一个实施方案中，所述金属可以选自金、银、锰、钛和铁，优选金。在一个实施方案中，所述含金离子的溶液可以选自氯金酸。

在一个实施方案中，所述细菌在含金属离子的溶液中培养至少约0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时、72小时、96小时、120小时、至少6天、7天、8天、9天、10天。任选地，所述培养可以在振荡条件下进行，和/或可以在合适的温度例如室温下进行。

在一个实施方案中，所述培养于室温例如约25-37℃振荡培养。

本文中，收获培养液可以使用任何合适的方法或技术进行。特别地，可以去除培养液中包含的细胞等杂质，例如通过离心(条件是离心速度不会将显著量的金属小体沉淀下来)或过滤(例如使用无菌滤膜，条件是滤膜的孔径小于细胞而大于所需金属小体的粒径，例如使用约0.45μm和0.22μm孔径的滤膜)手段获得培养上清，其中含有本文所述的金属小体。特别地，以约5000-15000g例如约11000g离心培养液约至少10-30分钟例如至少10分钟、20分钟或者30分钟以从培养液中去除细胞，获得培养上清。

本文中，从培养上清中获得金属小体可以使用本领域已知的任何合适方法和手段，例如通过分离或过滤。

特别地，由于本文所述金属小体包含金属纳米颗粒，因此在以离心从培养上清收获金属小体时可以不使用超速离心，例如以约5000-15000g如约11000g离心即可。

在一个实施方案中，将培养上清离心，例如以约5000-15000g如约11000g离心至少10分钟、20分钟或者30分钟。

在一个实施方案中，本文所述金属小体通过如下方法产生：

-将大肠杆菌、优选对数生长期的大肠杆菌加入含金离子的溶液例如氯金酸，并在室温振荡培养例如约0.5、1、2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、48、60、72、96、120小时、6天、7天、8天、9天、10天，优选至少48小时、更优选至少72小时，

-将培养液离心以除去细胞，获得上清液，

-将上清液过滤，例如用约0.45μm和/或0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，

-将过滤后的上清液以至少约5000-15000g例如11000g离心至少10-30分钟，以及

-收获沉淀，获得金属小体。

在第六方面，本发明提供了通过光热治疗法或放疗治疗对象中肿瘤的方法，包括给对象施用治疗有效量的本文第一方面的药物组合物、第三方面的免疫增强剂或免疫刺激剂、或通过第五方面的方法制备的金属小体，并且照射对象例如肿瘤部位，任选包括施用其它肿瘤治疗药物如肿瘤抗原或免疫检查点抑制剂。

所述施用可以通过，包括但不限于口服、鼻、胃肠外、静脉内、肌内、皮内、皮下、口腔、吸入或粘膜内。在一个实施方案中，所述施用为通过静脉内施用。

如本文所用，本发明药物组合物、免疫增强剂/免疫刺激剂、金属小体和其它肿瘤治疗药物可以以任何合适途径给予需要其的对象，包括但不限于静脉内、皮下、胃肠外、口服、腹膜内、肌肉内、鼻内、动脉内或病灶内途径。在一个实施方案中，所述药物组合物、免疫增强剂/免疫刺激剂、金属小体通过静脉内施用。

如本文所用，所述照射是使用合适的源对对象肿瘤进行辐照，由于本文所述金属小体例如所述金小体在肿瘤部位聚集，因此可以介导肿瘤局部过高热或射线增敏作用。

在一个实施方案中，使用约500-850nm例如约660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射30分钟。

本文所述的“其它肿瘤治疗药物”是指用于抗肿瘤治疗的任何物质或化合物，包括单独使用或与其它化合物或治疗组合使用时可缓和、减少、减轻或预防与肿瘤性疾病、肿瘤和癌症相关的临床症状或诊断标志物的缓解的任何物质，并且可以与本文所述金属小体联合施用或用于本文的组合物中，包括但不限于毒素、烷基化剂、抗生素、细胞因子、激素、光敏剂、信号传导调节剂、抗体、阿霉素、紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、丝裂霉素、放线菌素D、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、肿瘤抗原和免疫检查点抑制剂及其组合。

本文所述的“肿瘤抗原”是指与正常或非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞上唯一或差异表达的抗原(例如多肽)。例如，肿瘤抗原包括但不限于：癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1(MUC1)、前列腺特异性抗原(PSA)、NEU原癌基因、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、端粒酶相关蛋白2、前列腺酸磷酸酶(PAP)、E-钙粘素、叶酸受体α或c-Met。

特别地，所述肿瘤抗原可以与本文的金属小体缀合。抗原与金属小体上细菌膜组分的缀合可以使用本领域已知的任何常规方法进行，例如通过抗微生物肽。例如，可以将抗微生物肽与抗原连接(共价或非共价结合)，然后通过细菌膜上的多肽或蛋白等与抗微生物肽连接从而与与肽连接的抗原复合。这在本领域技术人员的技术知识和能力范围内。

免疫检查点是一类免疫抑制性分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。本文所述的“免疫检查点抑制剂”是指适合针对免疫检查点分子作用的任何物质或药剂。通过免疫检查点抑制剂，促进T细胞活性和免疫应答。特别地，免疫检查点包括但不限于PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、PD-L1(程序性细胞死亡配体1)、PD-L2(程序性细胞死亡配体2)等。免疫检查点抑制剂包括针对免疫检查点的抗体，例如抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2或抗CTLA-4抗体。

所述施用其它肿瘤治疗药物于照射可以先后或同时进行，例如先施用其它肿瘤治疗药物、然后照射，或者先照射、然后施用其它肿瘤治疗药物，或者同时施用其它肿瘤治疗药物并照射，这可以取决于临床医生根据治疗方案和/或患者具体情况而确定。

如本文所用，“治疗有效量”是指至少足以在对象中产生治疗作用的剂量配制品中的药剂、化合物、材料的量。精确量取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；and Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。

如本文所用，所述肿瘤是可以通过过高热效应获益的任何肿瘤，优选实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌。在一个实施方案中，所述肿瘤选自乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、卵巢癌或食道癌。

如本文所用，“对象”是指患有可以通过给予本文提供的金属小体、免疫增强剂/免疫刺激剂、金属小体或药物组合物治疗的肿瘤的生物体。非限制性例子包括人和其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿。在一些实施方案中，所述对象是人。

如本文所用，“治疗”患有肿瘤的对象是指对象的肿瘤部分或完全消除，或者在治疗后保持稳定不再进展或者减缓进展。

如本文所用，所述药物或药物组合物包括本文所定义的金属小体和药学上可接受赋形剂。所述组合物优选包括药学上可接受载体、介质或递送载剂，如本领域常规已知(参见例如“药用赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)”,Rowe等编.第7版,2012,www.pharmpress.com)。

除非上下文另有指示，词语“或”旨在包括“和”。

如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。

如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在某些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。例如，在某些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％或5％。

本文公开的范围应该认为也具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开了从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3至6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度均适用这点。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

材料与方法

1.试剂

氯金酸(HAuCl4)(货号：10010711)购于上海沪试化工公司(中国)。RPMI 1640培养基，胎牛血清(FBS)，青霉素/链霉素双抗溶液，磷酸缓冲液(PBS)，红细胞裂解液均购于Wisent公司(加拿大)。L-谷氨酰胺，β-巯基乙醇购于Gibco公司(美国)。IL-4，GM-CSF细胞因子购于ProSpec公司(以色列)。荧光分子标记的抗体，异硫氰酸荧光素(FITC)-抗小鼠-CD11c、藻红蛋白-青色素-7(PE-Cy-7)-抗小鼠CD80、别藻蓝素(APC)-抗小鼠CD86、FITC-抗小鼠CD3、PE-抗小鼠CD4、PE-Cy7-抗小鼠CD8、APC-抗小鼠CD19、FITC-抗小鼠CD49、PE-Cy7-抗小鼠CD69、PE-Cy7-抗小鼠CD25、Alexa Fluor 647-抗小鼠Foxp 3、FITC-抗小鼠F4/80、PE-抗小鼠CD11b、Alexa Fluor 595-抗小鼠Gr1均购自Biolegend公司(美国)。细胞因子定量试剂盒，LEGENDPlex辅助T细胞因子多因子检测试剂盒(货号：740005)，LEGENDPlex炎症因子多因子检测试剂盒(货号：740446)，LEGENDPlex促炎趋化因子多因子检测试剂盒(货号：740451)均购自Biolegend公司(美国)。

2.仪器

表1：实验所用仪器列表

3.细胞与动物

4T1小鼠乳腺癌细胞从ATCC(美国)购买，在37℃，含5％二氧化碳的环境中培养于加了10％ FBS、100μg/mL双抗的RPMI1640培养基中。提取诱导培养骨髓来源DCs。6-8周周龄的雌性Balb/c小鼠购于维通利华实验动物技术公司(中国)，培养于无病原体的环境中，并持续提供充足的食物和水分。所有动物相关的实验操作均按照国家纳米科学中心动物管理与福利委员会批准的程序和实验方案进行。

实施例1：大肠杆菌合成Ausomes

1.1：大肠杆菌合成Ausomes的过程

将大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α培养至对数生长期。离心收集细菌并重悬于PBS中，加入1％氯金酸溶液，37℃环境下200rpm振荡培养。

为了追踪大肠杆菌合成Ausomes并分泌至细胞外的过程，加入氯金酸后，分别在0.5，2，4，8，12小时，以及1，2，3，4，5，6，7，8，10天取少量细菌培养液，6000rpm离心10分钟收集沉淀。用2.5％戊二醛过夜固定细菌，滴加到包被了碳支持膜的铜网和硅片上，室温静置干燥后，分别用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)进行观察。另将细菌制备成超薄切片，观察细菌内部的Ausomes生成。取少量细菌培养液6000rpm、10分钟离心后收集2-3mm³大小的细胞团，立即加入2.5％戊二醛固定液中，4℃过夜固定。PBS洗三次，每次10分钟，然后用0.1％锇酸室温固定2小时。PBS充分洗涤后，50％，70％，80％，90％，100％乙醇梯度脱水，每个浓度10分钟，100％乙醇脱水3次。然后用100％丙酮置换2次，每次10分钟。接着用包埋剂浸透样品，丙酮，包埋剂以1:1，1:2体积比配好后，加入样品中，室温各浸透1小时，加入纯包埋剂过夜。然后将样品挑出放入包埋板中，37℃放置过夜，60℃聚合48小时至硬化。将包埋好的样品用超薄切片机切成70nm厚度的切片，置于包被了碳支持膜的铜网上，用醋酸双氧铀染色15-30分钟，三次水冲洗干燥后再用柠檬酸铅染色5-10分钟，冲洗干净，烘干水分。然后在扫描电子显微镜的STEM模式下进行观察。

1.2：Ausomes的提取条件

在氯金酸与大肠杆菌共培养72小时后，取细菌培养液，6000rpm、30分钟离心分离细菌，上清溶液先后用0.45μm和0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，以进一步除去上清中残余的大肠杆菌。然后分别在8000rpm、10000rpm、12000rpm、13000rpm，4种转速分别离心10分钟或者30分钟。取少量Ausomes溶液滴加到包被了碳支持膜的铜网上，待水分蒸发完全后，TEM下观察Ausomes的形貌。评价8种离心条件下收集到的Ausomes的整体粒径和均一性。

1.3：Ausomes的产量随孵育时长的变化

接下来我们检测了金纳米颗粒的生成速率。在以上时间点(0.5，2，4，8，12小时，以及1，2，3，4，5，6，7，8，10天)分别取1毫升细菌培养液，6000rpm离心10分钟，弃去细菌。上清先后用0.45μm和0.22μm孔径的无菌滤膜过滤进一步除去上清中残余的大肠杆菌。然后13000rpm离心30分钟，弃去还可能残留未还原的金离子的上清，收集沉淀，用过电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)进行定量检测，分析金纳米颗粒的生成随时间的变化。

1.4：Ausomes的提取及表征

1.4.1Ausomes的形貌及结构

将提取的Ausomes分散到PBS中，通过动态光散射(DLS)分析Ausomes的水合粒径。

另取少量Ausomes溶液滴加到包被了碳支持膜的铜网上，待水分蒸发完全后，TEM下观察Ausomes的形貌。并通过高分辨成像以及选区电子衍射(SAED)分析Ausomes的晶体结构和晶格常数。

1.4.2Ausomes表面有机层的成分分析

我们通过蛋白质组学和脂质定性组学分析了Ausomes包含的蛋白组分和脂质组分。

在进行蛋白质组学的分析过程中，首先将Ausomes包含的蛋白提取出来，对浓度进行定量分析，然后经过还原烷基化，FASP酶解等过程后，通过液相串联质谱仪进行多肽段的分析检测。通过MaxQuant软件包对质谱结果进行解析，得到Ausomes的蛋白质组学数据。

Ausomes脂质定性检测是通过甲醇和甲基叔丁基醚以体积比3:10混合的有机溶剂沉淀蛋白，12000rpm离心10分钟后，取上清挥干溶剂。然后将脂质复溶在异丙醇和乙腈1:1混合的溶剂中，然后用超快速液相色谱-质谱联用仪器进行分析，用XCalibur进行质谱数据采集，然后通过Progenesis QI软件以及Lipidmaps数据库对质谱数据进行分析，得到Ausomes的定性脂质组学。

1.4.3Ausomes光热性质的表征

将Ausomes溶液置于两面透的石英比色皿中，用紫外-可见分光光度计检测Ausomes在400-900nm波长范围内的吸收。

取200μL 250μg/mL的Ausomes溶液(以ICP-MS检测的金元素浓度为标准衡量本研究中各实验所用Ausomes的量)置于可拆卸板条的96孔酶标板的孔中。用660nm的激光器分别在0.5W/cm²，1.0W/cm²，1.5W/cm²，2.5W/cm²的激光功率密度下照射样品，激光的功率密度是通过检测激光的实际功率及光斑的面积计算所得。然后用红外热成像仪对溶液温度进行监测，记录其随激光照射时长的变化情况。

将660nm激光的功率密度固定在1.5W/cm²，取不同浓度的Ausomes溶液(500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，63μg/mL，31μg/mL，15μg/mL)置于酶标板中，用激光对其进行照射，并用红外热成像仪对溶液温度进行监测，记录其随激光照射时长的变化情况。

1.4.4Ausomes对照金纳米颗粒的合成及表征

将1mL 1％氯金酸溶液加入到100mL三次水中，120℃油浴加热，400rpm转子转速下搅拌5分钟。然后加入1mL的10mg/mL的柠檬酸三钠溶液，120℃油浴加热，400rpm搅拌15分钟。将溶液转移到室温，1100rpm转速下搅拌20分钟降温，然后加入10mg HS-聚乙二醇(PEG)(3500)-NH2，搅拌过夜。13000rpm离心，三次水洗两次，最后分散到PBS中，4℃避光保存。

通过DLS，TEM对金纳米颗粒(AuNPs)的粒径和形貌进行表征。测定其紫外-可见吸收光谱，按上述步骤进行激光功率密度及金纳米颗粒浓度相关的光热性质表征。

结果：

大肠杆菌是一种被FDA批准的蛋白表达系统，具备良好的安全性，广泛用于生物制药工业[Marisch K et al.,Evaluation of three industrial Escherichia colistrains in fed-batch cultivations during high-level sod proteinproduction.Microb Cell Fact:2013,12:58]。除此之外，大肠杆菌被证明可以将三价的金离子(Au³⁺)还原成零价的金纳米颗粒，并且有报导将大肠杆菌的OMVs用于体内激活免疫系统治疗肿瘤[Kim OY et al.,Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor byinterferon-gamma-mediated antitumor response.Nat Commun:2017,8:626；NarayananKB et al.,Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes.Adv ColloidInterface Sci:2010,156:1-13和Du L et al.,Biosynthesis of gold nanoparticlesassisted by escherichia coli DH5 alpha and its application on directelectrochemistry of hemoglobin.Electrochem Commun:2007,9:1165-1170]。因此大肠杆菌被选择作为我们的生物工厂合成生产具有内在免疫刺激能力的金纳米颗粒。首先将DH5α大肠杆菌培养到对数生长期，然后弃去培养基，分散到PBS中，与1mM的氯金酸在37℃下共孵育。为了监控合成过程，我们在不同时间点下通过TEM和SEM来观察细菌的形貌和状态。从图1A-C可以看出，在没有加入Au³⁺之前，细菌结构完整且表面光滑，可以明显观察到清晰的荚膜层和菌毛结构。在细菌和Au³⁺共孵育30分钟后，大肠杆菌的荚膜层变得比较模糊，并且其中出现了许多超小纳米颗粒。这种现象与细菌在外界重金属离子压力下的前期保护机制是一致的，Au³⁺首先被吸附到胞外基质(EPS)层，然后被其中的还原物质，如一些酶或者特殊的蛋白结构等，还原成超小金纳米颗粒，嵌在EPS中[Kang F et al.,Extracellularsaccharide-mediated reduction of Au3+to gold nanoparticles:New insights forheavy metals biomineralization on microbial surfaces.Environ Sci Tech:2017,51:2776-2785]。在大肠杆菌与Au³⁺共培养4小时后，我们在细菌内部发现了30nm大小的纳米颗粒，从衬度上来看，我们认为就是金纳米颗粒。然后到了12小时，在细菌边缘观察到更多的纳米颗粒。细菌培养液在8小时的时候由Au³⁺的浅黄色变成了淡淡的粉红色，然后随着培养时间的延长，红色逐渐加深，由于30nm金纳米颗粒溶液的颜色就是红色，因此也说明了培养液中越来越多金纳米颗粒的生成。当孵育至48小时，大量的金纳米颗粒聚集在细菌的边缘，并且表现出向外分泌的趋势，细菌培养液也变成了更深的红色。

在与Au³⁺的孵育过程中，我们观察到了细菌荚膜层的破坏，这可能为Au³⁺扩散到细胞内并还原成金纳米颗粒提供了路径。为了研究Au³⁺在细菌内还原的具体位置，共孵育48小时后，我们将细菌处理成70nm的超薄切片，负染后用STEM观察细菌内部的结构和金纳米颗粒的分布。由图2A可以看出，少量合成好的金纳米颗粒分布在大肠杆菌边缘，细菌内膜与细菌外膜之间的周质空间区域，这与一些金属离子体内还原机制的研究中的结论一致[Deplanche K et al.,Biorecovery of gold by escherichia coli and desulfovibriodesulfuricans.Biotechnol Bioeng:2008,99:1055-1064]。周质空间嵌插的30nm尺寸的金纳米颗粒导致了空间的扩张，内膜与外膜均有形变，这与其中OMVs发生的机制之一类似，即周质空间中蛋白聚集引起的局部压力改变，导致细菌外膜曲率的变化因而引发OMVs产生[Kulp A et al.,Biological Functions and Biogenesis of Secreted BacterialOuter Membrane Vesicles.Annu rev microbiol:2010,64:163-184]，因此我们猜想金纳米颗粒的形成促进了OMVs的发生。我们从大肠杆菌的SEM成像中可以看出，在经过12小时或者更长的孵育时间后，细菌表面变得更皱(图1A)，为周质空间中金纳米颗粒的形成而导致细菌外膜出芽提供了证据。同时，在24小时和48小时时间点大肠杆菌的TEM成像中，我们在胞外区域观察到了散落的纳米颗粒，说明金纳米颗粒在周质空间合成后被分泌到了细胞外。为了进一步证明金纳米颗粒的分泌方式，我们在孵育48小时时间点的TEM和SEM成像中找到了一些处在分泌金纳米颗粒过程中的大肠杆菌，如图2B、C所示。分布在细菌边缘的金纳米颗粒已经明显向外突出，但未完全脱离菌体，突起的表面可观察到一层明显的薄层，从TEM的衬度可将其判断为有机物。结合以上实验现象可合理设想，大肠杆菌周质空间还原产生的金纳米颗粒可被包载到细菌膜中，随着膜囊泡的发生被分泌到细胞外，形成表面包裹着细菌外膜的金纳米颗粒，我们将其命名为Ausomes。

然后我们评估了不同孵育时长下，大肠杆菌合成Ausomes的产量。我们用两步离心程序提取了胞外游离的Ausomes，首先通过低速离心将细菌与培养上清分离；然后用高速离心将金纳米颗粒与培养液中的蛋白，细菌囊泡以及未反应的金离子分离，沉淀用PBS洗一遍，离心收集得到Ausomes。在第二步离心中，我们分别用了4种不用的离心速率离心10分钟或者30分钟，优化最后收集产物的均一性。如图3A所示，8种离心条件下均得到了比较纯净的Ausomes，没有观察到其他有机杂质。通过对比可以看出，离心速率越大，时间越长，收集到的产物中小尺寸的Ausomes(10-20nm)就越多，其中离心速率对产物尺寸的影响更大。在用8000rpm的离心速率离心10分钟或者30分钟收集到的Ausomes平均粒径更大，且尺寸更均一；但离心后的上清残留了一点红色，说明在这个离心速率下会损失一部分Ausomes产物。然后我们在大肠杆菌与Au³⁺不同反应时长下，13000rpm离心30分钟，收集了所有尺寸的Ausomes，通过ICP-MS检测Ausomes的产量。如图3B所示，随着反应时间的延长，Ausomes的产量是逐渐累积增加的，且一直保持了比较平稳的产出速率。

我们采用TEM和DLS对Ausomes的尺寸和分散性进行了表征，从图4A可以看出，Ausomes尺寸均一，且分散性良好，没有出现聚集现象。DLS表征其平均水合粒径在60nm左右。放大TEM的倍数，可以明显观察到Ausomes是由一个高衬度的无机内核和低衬度的表面有机层组成的核壳结构，有机层的厚度在TEM下显示为3-4nm左右(图4B)。高分辨成像显示出了内核的多个晶面，如图4C所示；通过软件测量，我们鉴定出了其中两种条纹间的间距，约为0.204nm和0.235nm，与金晶体的d(111)和d(200)两个晶面的晶格常数一致。Ausomes的选区电子衍射显示的衍射环也与金晶体的(111),(200),(220),(311)一致(图4D)，进一步验证了Ausomes内核为金晶体。作为对照，我们也通过化学方法合成了与Ausomes相似粒径的表面修饰了PEG的金纳米颗粒(AuNPs)，如图4E、F所示。

然后我们通过蛋白质组学和脂质组学研究了Ausomes的表面有机层的成分。脂质组学分析通过点喷雾正离子和点喷雾负离子两种模式鉴定表明，Ausomes中含有大量的脂质，表2和图5总结了其中丰度比较高的几类磷脂以及不含磷酸基团的脂质，这些都是磷脂双分子层生物膜的重要组成成分，为Ausomes表明膜结构提供了证据。除了大肠杆菌细胞膜的主要脂质，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰甘油(PG)和心磷脂(CL)、磷脂酸(PA)和二酰基甘油(DG)也被检测出较高的丰度，且PE，PG和CL的相对比例也与正常的大肠杆菌不一样。这种异常的脂质构成与细菌的自噬和细菌膜重排有关，可能原因包括极度营养缺乏的培养环境以及重金属离子压力和大量的膜囊泡发生。同时，在电喷雾正离子模式下，Ausomes中还检测出了Lipid A；Lipid A是细菌外膜重要成分脂多糖(LPS)的磷脂部分，主要功能是将LPS固定在细胞外膜上，暗示了Ausomes中外膜的存在。以上数据验证了我们之前的设想，细菌生物合成的金纳米颗粒随着膜囊泡发生被分泌到细胞外，形成表面细菌外膜修饰的金纳米颗粒。另外我们还通过蛋白组学分析了Ausomes中的蛋白组成，表3总结了鉴定出的一些丰度比较高或者比较特殊的蛋白。可以看出，Ausomes中存在大量的定位在细菌外膜的蛋白，以及细菌内膜定居的蛋白。这些细菌外膜蛋白(OMPs)或者脂蛋白暗示了Ausomes的免疫刺激能力。蛋白转运内膜蛋白SecG和外膜蛋白组装蛋白BamA分别定位于细菌的内膜和外膜，曾被用于区分细菌的内/外膜。经蛋白组学分析，Ausomes中BamA的存在和SecG的缺失进一步为Ausomes表面外膜覆盖提供了证据。

表2：脂质组学分析Ausomes中丰度较高的脂质

表3：蛋白质组学鉴定出的部分Ausomes包含的蛋白

基于表面等离子体共振现象，金纳米颗粒可以将吸收的光能转化成各种的物理化学效应，如光热，光声，光电等。光热转换是金纳米材料生物应用的主要方向之一，因此我们对Ausomes的光热转化能力也进行了验证。紫外-可见吸收光谱显示，Ausomes的最大吸收峰在535nm处(图6A)。为了保证良好的组织穿透性，我们选择了更偏红光，但又能检测到明显吸收的激光波长(660nm)来激发Ausomes。如图6B所示，不同浓度的Ausomes溶液，经过1.5W/cm²功率密度的660nm激光的照射，均表现出了迅速的升温，大约3分钟左右达到了最大温度并维持形成了平台区，各溶液平台区的温度与Ausomes的浓度表现出了正相关关系。类似的，我们将溶液浓度固定为250μg/mL，用不用功率密度的激光照射，不同处理的Ausomes溶液均迅速升温形成平台区，平台区的温度与功率密度成正相关关系。通过紫外-可见分光光度计的检测和光热转化实验，验证化学合成的AuNPs与Ausomes相似的吸收峰和光热转化能力(图6C、D)，可用作Ausomes的对照进行相关实验。以上结果表明，Ausomes可以将吸收的光能转化成热能，由于金纳米颗粒的球形形貌且尺寸较小，光热转换效率比较低，但其转化的热能足够达到过高热的温度范围(39-42℃)，因此我们期望Ausomes在肿瘤部位能够产生局部过高热介导的免疫调控效果。

实施例2：Ausomes的细胞摄取及体外免疫刺激研究

2.1Ausomes的细胞摄取

将4T1肿瘤细胞和BMDCs分别接种到共聚焦皿中，用添加了10％ FBS的RPMI 1640培养基在37℃下含5％二氧化碳的环境中进行培养。24小时后，加入50μg Ausomes与细胞进行共孵育，培养6小时和24小时后分别弃去培养上清，PBS洗三遍后用双光子共聚焦显微镜检测细胞中的金信号。

将4T1肿瘤细胞和BMDCs分别接种到24孔板中，培养24小时后，加入50μgAusomes与细胞进行共孵育。分别在培养6小时和24小时的时间点，弃去培养上清，PBS洗三遍后，将细胞进行消解，除去有机质成分，并用ICP-MS进行金元素的定量检测。

2.2Ausomes刺激BMDCs成熟

将10万个BMDCs培养于添加了10％ FBS的RPMI 1640培养基中，与一系列不同浓度的Ausomes(0.3μg/mL，0.6μg/mL，1.3μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL)共孵育，然后在6小时和24小时时间点，用流式细胞分析仪检测CD80+CD86+的成熟DCs的比例。

将10万个BMDCs培养于添加了10％ FBS的RPMI 1640培养基中，分别与5μg/mL的AuNPs，5μg/mL的Ausomes，以及5μg/mL经过660nm激光在1.5W/cm²的功率密度下照射了30分钟后的Ausomes共孵育24小时，然后用流式细胞分析仪检测CD80+CD86+的成熟DCs的比例。

结果：

为了研究Ausomes的免疫刺激能力，我们首先检测了Ausomes与细胞之间的相互作用。将Ausomes与BMDCs或者4T1肿瘤细胞共孵育，然后用双光子激光扫描显微镜进行成像，并用ICP-MS定量检测了Ausomes的细胞摄取。由图7A、B可以看出，Ausomes和AuNPs均可被肿瘤细胞摄取，约15％的投料量，且没有表现出明显的选择性，延长孵育时间也没有进一步促进Ausomes或者AuNPs的肿瘤细胞富集。在与Ausomes或者AuNPs孵育了6小时的BMDCs细胞中(图7C、D)，均检测到了明显的金纳米颗粒的双光子信号(Two-photo luminescence)，30％左右的Ausomes被摄取。随着孵育时间的延长，24小时的时候，BMDCs中检测到了更强的Ausomes的TPL信号，摄取量增加了40％左右。相比之下，BMDCs对AuNPs的摄取量少了60％左右，且不随孵育时长进一步增加，说明了BMDCs可选择性识别Ausomes，暗示了其良好的免疫原性。

在机体发生突变或者外源性病原体入侵的过程中，DCs是最先做出反应的免疫细胞之一，在识别摄取刺激物后，分化出成熟表型，然后促进抗原提呈以及细胞因子的分泌，启动机体产生固有免疫和适应性免疫反应。因此我们通过检测Ausomes介导的DCs成熟来评价其免疫刺激能力。在与不同剂量的Ausomes共孵育后，通过流式细胞分析仪筛选出了共刺激因子CD80和CD86高表达的成熟DCs。如图8A、B所示，较低剂量的Ausomes刺激6小时就能产生大量的成熟DCs，剂量的增加或者刺激时间的延长也会进一步增加成熟DCs的比例。10μgAusomes刺激24小时能产生高达85％以上的成熟DCs。低剂量便可引发的快速高效的免疫响应，反映了Ausomes良好的免疫刺激能力。另外，我们还评价了激光照射后的Ausomes的免疫刺激能力，从图8C、D可以看出，激光照射或者加热并不影响Ausomes刺激BMDCs成熟。

实施例3：Ausomes的体内用量的研究

3.1Ausomes引发体内细胞因子分泌

将不同剂量的Ausomes(5mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg)静脉注射到Balb/c小鼠体内，6小时后，取小鼠血清用多因子检测试剂盒检测细胞因子水平。首先将修饰了各细胞因子捕获抗体的微球分别与标准样品及血清样品混合加到1.5mL离心管中，1000rpm振荡，室温避光孵育2小时。随后1000g离心5分钟，弃去上清；加入300μL洗涤液洗一次。然后加入检测抗体，1000rpm振荡，室温避光孵育1小时。将PE标记的链霉亲和素加入反应体系，1000rpm振荡，室温避光孵育30分钟，洗涤液洗一次，重悬后用流式细胞仪分析检测。然后用LEGENDplex v8.0软件对流式数据进行处理，计算出各细胞因子的血清浓度。

3.2不同剂量Ausomes的肿瘤治疗效果

将4T1乳腺癌细胞接种到6-8周的雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中，待肿瘤长到50mm³左右，分别静脉注射5mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg剂量的Ausomes，每三天注射一次。隔天对小鼠的肿瘤体积及体重进行测量，肿瘤体积计算公式：V＝ab²/2，a和b分别代表小鼠肿瘤的长轴和短轴。当肿瘤体积达到1000mm³终止实验。

3.3Ausomes的体内分布

给6-8周的雌性Balb/c小鼠乳腺脂肪垫接种4T1肿瘤细胞，待肿瘤体积长至200mm³左右，静脉注射250μg Ausomes或者AuNPs，在6小时和24小时分别取出小鼠的心，肝，脾，肺，肾，胸腺，淋巴结，肠。称重后用双氧水和浓硝酸加热消解掉有机分子，通过ICP-MS检测各脏器中金元素的含量。

3.4Ausomes体内毒副作用评价

给无肿瘤负担的6-8周的雌性Balb/c小鼠分别静脉注射5mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg剂量的Ausomes，每三天注射一次，共免疫三次。然后取出小鼠的心，肝，脾，肺，肾制作成组织切片并进行苏木精-伊红(H&E)染色，分析主要脏器是否有病理损伤。同时取小鼠血清检测ALT(谷丙转氨酶)，AST(天冬氨酸转氨酶)，BUN(尿素氮)，CREA(肌酐)等生化指标的血清水平，对不同Ausomes体内注射剂量下，小鼠的肝功能和肾功能进行评价。

结果：

当我们考虑将Ausomes应用于体内，在一个完整的免疫系统中激发免疫反应，Ausomes包含的大量细菌来源的分子暗示了潜在的安全性隐患，因此我们研究了Ausomes的体内应用剂量，在保证免疫刺激效果的同时，不会引发明显的毒副作用。静脉给药方式首先考虑到的是药物可能引发的溶血作用，将不同剂量的Ausomes与小鼠全血共孵育可以看出，各种浓度的Ausomes均不会破坏血细胞(图9A)。Ausomes中大量细菌来源的分子是其免疫刺激能力的分子机制，但也可能引发免疫系统细胞因子风暴损伤机体。因此，我们将不同剂量的Ausomes，5mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg，分别静脉注射给健康小鼠，然后通过多因子试剂盒检测血清中多种细胞因子的水平，评价系统性免疫反应的程度。图9B展示了各细胞因子的小鼠血清浓度与未经任何处理的对照组相比增长的倍数。可以看出，在所有给药剂量下，Ausomes对IL-10，IL-1α，IL-12和IFN-β的血清浓度均未造成很大的影响；显著上调的细胞因子包括IFN-γ，TNF-α和IL-6。如图9C所示，各个剂量的Ausomes均能刺激机体产生了大量IFN-γ，TNF-α和IL-6，其血液浓度与给药剂量之间没有明显的相关关系，可能是由于免疫系统复杂的调控机制导致的，但不同剂量处理组之间存在显著性差异，说明Ausomes刺激的免疫反应程度可以通过调整给药剂量进行控制。

随后我们评价了不同剂量Ausomes产生的抗肿瘤效果，为其体内用量提供指导。将4T1肿瘤细胞原位接种到了雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫内，当小鼠肿瘤体积达到50mm³的时候，静脉注射不同剂量的Ausomes(5mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg)对小鼠肿瘤进行治疗，每三天注射一次，如图10A所示。免疫的同时隔天记录小鼠的体重和肿瘤体积。由于静脉注射Ausomes引起了小鼠体重的下降(图10B)，我们将给药次数控制在了3次。在第18天的时候，由于未进行任何处理对照组的小鼠肿瘤体积超过1000mm³，实验终止。从小鼠的肿瘤生长曲线可以看出，15mg/kg的剂量引起了最好的肿瘤抑制效果(图10C)。

小鼠体重下降暗示Ausomes引发了一些副作用，因此我们进行了一些实验来判断不同剂量的Ausomes在进行肿瘤治疗的过程中会不会对其他脏器造成损伤。首先我们通过ICP-MS定量分析了静脉注射后，Ausomes在各脏器或组织中的分布。如图11A所示，给药6小时后，肝脏，脾脏以及淋巴结中均检测出了较高金元素含量，它们都是免疫系统直接相关或者具备固有免疫性质的脏器或组织，说明机体对外源性的纳米颗粒作出了系统性的免疫响应。24小时后，Ausomes在肝脏和脾脏中的聚集进一步增多。同时我们也观察到了相比于AuNPs，更多的Ausomes聚集在了肺部，可能与肺的黏膜免疫对免疫原性更高的Ausomes的相互作用有关。然后我们按肿瘤治疗的免疫程序给健康小鼠注射了不同剂量的Ausomes，通过血液生化分析评价了不同剂量Ausomes处理小鼠的肝功能和肾功能，如图11B所示，在20mg/kg的剂量下，AST的血液水平明显上升，可能与Ausomes在肝脏的大量聚集引发的局部炎症相关。其他剂量的Ausomes没有引起这些指标的明显的变化，说明对肝肾功能没有造成影响。由于Ausomes在肝脏和脾脏有大量聚集，我们通过H&E染色的组织切片对脏器的损伤进行了分析。从图11C可以看出，各剂量的Ausomes均未给肝和脾造成明显的病理学变化，其他Ausomes聚集相对较少的心，肺，肾也没有明显的组织损伤。结合不同剂量的安全性以及肿瘤治疗效果，15mg/kg被选择作为体内研究的给药剂量。

实施例4：Ausomes肿瘤局部过高热研究

4.1Ausomes在肿瘤部位的富集

将Cy5.5-NHS荧光分子加入到Ausomes溶液中，pH调至7.2，室温反应过夜。然后13000rpm离心30分钟，弃去上清，PBS洗一遍。然后将标记了Cy5.5荧光分子的Ausomes重悬，静脉注射到4T1荷瘤小鼠中(250μg/鼠)。然后在不同时间点用活体成像系统(In vivospectrum imaging system,IVIS)对小鼠进行成像，定量分析小鼠肿瘤部位的荧光强度。

另外将AuNPs和Ausomes分别注射到荷瘤小鼠静脉中，在不同的时间点将肿瘤取出，消解后通过ICP-MS检测肿瘤中金元素的含量。

4.2Ausomes介导的肿瘤局部过高热

将Ausomes与AuNPs分别以15mg/kg的剂量静脉注射到4T1荷瘤小鼠中。6小时后，用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射小鼠肿瘤，通过红外热成像仪对肿瘤温度进行测量，成像；并以30秒的间隔记录肿瘤温度。

4.3局部过高热促进肿瘤血液灌注

给6-8周的雌性Balb/c小鼠腋下接种4T1肿瘤细胞，2周后，将Ausomes与AuNPs分别以15mg/kg的剂量静脉注射给小鼠。6小时后，将肿瘤用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射30分钟，通过实时的多光谱光声断层扫描成像(Multispectral photoacoustictomography,MSOT)检测含氧血红蛋白(Oxyhemoglobin)和血红蛋白(Hemoglobin)的信号，以此评价肿瘤血流。

肿瘤血管荧光成像也被用于评价过高热对血管的作用。给6-8周的雌性Balb/c小鼠乳腺脂肪垫下接种4T1肿瘤细胞，2周后，将Ausomes与AuNPs分别以15mg/kg的剂量静脉注射给小鼠。用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射30分钟，然后静脉注射FITC标记的右旋糖苷溶液(3mg/鼠)标记血管。15分钟后，将小鼠安乐死，取出肿瘤，用PBS仔细洗净表面的血液，然后放入组织固定液中固定过夜。用激光共聚焦显微镜以5μm的步长进行层扫，然后三维重构肿瘤组织血管。

4.4局部过高热促进Ausomes的免疫刺激效果

4.4.1局部过高热促进细胞因子的分泌水平

将4T1肿瘤细胞接种到6-8周的雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫下，待肿瘤长到100mm³，分别给小鼠静脉注射15mg/kg的Ausomes或者AuNPs；6小时后，将肿瘤用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射30分钟。然后在第一次免疫6天后，再次将Ausomes与AuNPs分别以15mg/kg的剂量静脉注射给小鼠；6小时后，用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射肿瘤30分钟，照射完6小时取小鼠血清和肿瘤。取少量肿瘤组织碎块，加入含1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用冷冻组织研磨仪将组织磨碎，然后12000rpm离心15分钟，取上清。按上述操作用多因子检测试剂盒定量组织裂解液和血清中的各种细胞因子和趋化因子水平。

4.4.2局部过高热促进免疫细胞浸润

将上述处理后6小时及24小时的肿瘤组织用70μm孔径的滤网研磨分散成单细胞悬液，分别加入荧光标记的抗体4℃染色20分钟，用含2％ FBS的RPMI1640培养基洗一遍，重悬后，通过流式细胞分析仪检测各免疫细胞CD4+T细胞(anti-CD3抗体+anti-CD4抗体)，CD8+T细胞(anti-CD3抗体+antiCD8抗体)，B细胞(anti-CD19抗体)，NK细胞(anti-CD49抗体)，活化的NK细胞(anti-CD49抗体+anti-CD69抗体)，巨噬细胞(anti-F4/80抗体)，DCs(antiCD11c抗体)，Tregs(anti-CD4抗体+anti-C25抗体+anti-Foxp3抗体)及髓系抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs；anti-CD11b抗体+anti-Gr1抗体)的肿瘤组织含量。

4.5局部过高热促进Ausomes的肿瘤治疗效果

将4T1肿瘤细胞接种到6-8周的雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫下，待肿瘤长到50mm³，分别给小鼠静脉注射15mg/kg的Ausomes或者AuNPs；6小时后，将肿瘤用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射30分钟，以3天的间隔免疫/过高热处理三次，隔天对小鼠肿瘤体积进行测量。肿瘤体积计算公式与上述一致：V＝ab²/2，a和b分别代表小鼠肿瘤的长轴和短轴。当肿瘤体积达到1000mm³终止实验。

4.6Ausomes免疫刺激联合局部过高热的体内安全性评价

在肿瘤治疗的过程中，隔天对小鼠的体重进行测量，记录小鼠的体重变化曲线。实验结束后，对小鼠实行安乐死，取出的心，肝，脾，肺，肾制作成组织切片并用H&E染色，分析各种处理是否会产生主要脏器的病理损伤。同时取小鼠血清，检测ALT，AST，BUN，CREA等生化指标的血清水平，对小鼠的肝功能和肾功能进行评价。

结果：

已经验证了Ausomes的光热转化能力，接下来检测Ausomes介导的肿瘤局部过高热。我们首先测试了Ausomes在肿瘤部位最大聚集的时间点，将250μg标记了Cy5.5荧光分子的Ausomes静脉注射到小鼠体内，在不同时间点下通过IVIS进行肿瘤部位荧光积累的观测。从图12A,B可以看出，肿瘤中Cy5.5的信号随着时间积累越来越多，在注射后12小时达到巅峰，然后缓慢衰减，72小时后肿瘤部位仍能观察到Cy5.5荧光。为了定量检测肿瘤部位的金元素积累，我们将250μg Ausomes或者金纳米颗粒静脉注射到4T1荷瘤小鼠中，在不同时间点下将小鼠肿瘤分离出来消解成金离子，然后通过ICP-MS进行定量检测。如图12C所示，在注射后2-12小时，肿瘤部位聚集了较高水平的Ausomes，然后缓慢减少，趋势和体内荧光标记的检测相似。与Ausomes不同，AuNPs在静脉注射后12小时达到最大聚集，并维持到24小时，并且直到72小时都维持着相对较高的水平，可能是由于Ausomes较高的免疫原性促进了肿瘤部位抗原提呈细胞的摄取和清除。

基于以上结果，给原位荷瘤小鼠静脉注射15mg/kg的Ausomes后，在肿瘤聚集最大的6小时，用660nm的激光以1.2W/cm²的功率密度照射肿瘤，并通过红外热成像仪对肿瘤温度进行测量。如图13A,B所示，在激光的照射下，肿瘤快速升温，在2分钟左右达到平台期，最高温度达到41℃左右。静脉注射AuNPs的小鼠的肿瘤也有相似的局部过高热效果，但PBS处理组的肿瘤在激光的照射下没有明显的温度变化。然后我们利用实时多光谱光声层析成像(MSOT)检测了激光照射前后肿瘤中血红蛋白(HbO2)和缺氧血红蛋白(Hb)的组织分布，以此作为血液灌注的标志。将4T1肿瘤细胞接种到小鼠腋下，2周后，静脉注射15mg/kg的Ausomes或者AuNPs，6小时后用660nm的激光以1.2W/cm²的功率密度照射肿瘤30分钟，然后用MSOT进行断层扫描。如图13C所示，相对于未经任何处理的ctrl对照组和未经激光照射的Ausomes处理组，我们在激光照射后的AuNPs组和Ausomes组的肿瘤组织更深层的部分观察到了HbO2和Hb的信号，表明过高热处理后，血液内容物可以更好地浸润到肿瘤组织中。另外，我们用FITC标记的右旋糖苷对血管进行荧光标记，通过激光共聚焦成像直观地观察肿瘤血管的变化。将15mg/kg的Ausomes或者AuNPs静脉注射到原位荷瘤的小鼠中，6小时后用上述条件进行激光照射。然后静脉注射3mg FITC-右旋糖苷，10分钟后取出肿瘤固定后成像。如图13D所示，与未经激光照射的肿瘤相比，过高热处理的肿瘤血管中的荧光信号更多，更强，表明了肿瘤部位的血流增加了；在血管外的组织中也观察到了很多明显的荧光信号，说明右旋糖苷从肿瘤血管中泄露到了肿瘤组织中。以上结果证明，静脉注射的Ausomes可在激光的照射下介导肿瘤局部过高热，促进肿瘤部位的血液灌注以及血液内容物的肿瘤组织浸润。

由金纳米颗粒内核和细菌膜外壳组成的Ausomes，是同时具备光热转换和免疫刺激的多功能纳米免疫调节剂。我们在前面分别验证了Ausomes的免疫激活效果和介导肿瘤局部过高热的能力，接下来我们检测同时利用Ausomes的两种功能刺激的免疫反应和抗肿瘤效果。首先我们通过在雌性Balb/c小鼠乳腺脂肪垫接种4T1细胞，构建了原位的乳腺癌模型。为了同时检测先天性免疫反应和适应性免疫反应，荷瘤小鼠进行了两次免疫，如图14A所示。在肿瘤体积达到100mm³的时候，静脉注射15mg/kg的Ausomes或者AuNPs，6小时后用660nm的激光在1.2W/cm²的功率密度下照射30分钟；7天后，进行相同的免疫操作，在照完激光6小时后分别取小鼠肿瘤和血液，通过基于Luminex微球的多因子检测试剂盒测定组织和血清中各细胞因子的浓度。如图14B所示，热图表示各处理组细胞因子和趋化因子相对于未经任何处理的Ctrl对照组增加的倍数，增加了3倍及以上都按3倍统计。经过Ausomes免疫刺激的小鼠，提高了大量促炎相关细胞因子的血清水平，如IFN-γ,TNF-α,IL-17F,IL-17A,IL-22,IL-13,IL-21,IL-2,IL-9以及T细胞和NK细胞等效应细胞招募相关的趋化因子，如CCL3,CXCL9,CXCL10,CCL20,CCL5以及CCL4等，表明了系统性免疫反应的激活。联合肿瘤局部过高热，进一步增加了这些细胞因子和趋化因子的血液浓度。AuNPs介导的肿瘤局部过高热促进了IL-6的表达，下调了CM-CSF，IL-1α，IL-1β，IL-5，IL-27和CCL22等细胞因子的表达；这些具有免疫抑制功能的细胞因子在Ausomes处理组以及Ausomes联合局部过高热处理组也观察到了下调，说明免疫负调控机制在一定程度上被抑制了。在肿瘤组织中，AuNPs介导的单独的局部过高热处理也激发了一定程度的免疫反应，IL-2和IL-6的组织水平都有上调。Ausomes单独刺激引发了肿瘤组织中TNF-α，IL-6，IL-2和IL-1α的上调，联合局部过高热，除了进一步促进以上细胞因子的分泌，IL-22,IL-1β,IL-17A,IL-17F,IL-23,IL-27,IFN-β等促炎细胞因子水平也明显提高，同时我们还观察到抗炎细胞因子IL-10升高了表达，这可能是过强的免疫反应触发的负反馈调节机制。另外，Ausomes的刺激提升了肿瘤组织中T细胞招募相关的趋化因子的浓度，如CCL3,CCL4,CCL20；也降低了Tregs和MDSCs相关的CCL22和CCL17。联合肿瘤局部过高热进一步促进了这些可以增强肿瘤组织免疫反应的效应。以上实验现象表明，Ausomes具备诱导系统性免疫反应的能力，其介导的肿瘤局部过高热可进一步加强系统以及肿瘤局部的免疫响应。

按上述免疫程序对荷瘤小鼠进行免疫，激光照射肿瘤之后的6小时和24小时，分别取肿瘤分散成单细胞通过荧光标记抗体进行细胞的染色标记，然后用流式细胞分析仪检测肿瘤组织中各免疫细胞的浸润。从图15可以看出，AuNPs介导的单纯的肿瘤局部过高热引起了肿瘤组织F4/80+巨噬细胞的增加。经过Ausomes免疫的小鼠，肿瘤组织中检测出了明显增多的CD3+CD8+T细胞，CD49+NK细胞以及CD49+CD69+活化的NK细胞；而联合局部过高热进一步促进了CD3+CD4+T细胞，CD49+NK细胞以及CD49+CD69+活化的NK细胞的组织浸润，且随着时间延长，浸润的细胞进一步增多。其他免疫细胞的含量，如B细胞，DCs，Tregs及MDSCs，没有明显变化。

接下来我们在4T1乳腺癌原位模型中验证了过高热，Ausomes以及Ausomes联合过高热的肿瘤抑制效果。当肿瘤体积达到50mm³的时候，皮下注射15mg/kg的Ausomes或者AuNPs，6小时后用660nm激光在1.2W/cm²的激光密度下照射30分钟，每三天处理一次共给药三次，如图16A所示。隔天测量肿瘤体积，在尺寸达到1000mm³，终止实验。从肿瘤生长曲线和实验结束时肿瘤的尺寸可以看出，在Ausomes的肿瘤治疗基础上，过高热进一步增强了抑制效果(图16B)。在肿瘤的治疗过程中，隔天对小鼠的体重进行测量记录，从图16C可以看出，Ausomes引起了一定程度的体重下降，但额外的过高热处理并没有进一步促进小鼠体重的减轻。在试验结束后，分别取各处理组的小鼠血清进行血液生化检测，评价肝肾功能；并将主要脏器切片进行H&E染色，进行病理学分析。如图16D,E所示，Ausomes联合过高热引起了AST的上升，暗示了肝脏炎症的发生，但肝的组织形貌并没有明显病理学变化。其他处理组和脏器也没有观察到明显损伤，说明在实验所用的剂量及免疫程序下，Ausomes或者Ausomes联合过高热不会引发明显的毒副作用。

Claims

1.一种药物组合物，其包含金属小体以及任选包含药学上可接受的载体，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。

2.权利要求1的药物组合物，其中：

-所述金属纳米颗粒是金属晶体，和/或所述金属选自金、银、锰、钛和铁，优选金；和/或

-所述细菌组分通过共价或非共价方式与所述金属纳米颗粒直接或间接连接，或者所述细菌组分位于完全或部分包覆所述金属纳米颗粒的有机层之中或之上；和/或

-所述金属纳米颗粒的粒径为约5-500nm，例如约10-200nm；和/或

-所述金属小体是由细菌来源组分完全包覆的金属纳米颗粒；和/或

-所述药物组合物用于肿瘤光热治疗或者放疗，任选地，所述药物组合物还包含其它肿瘤治疗药物如免疫检查点抑制剂。

3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述金属小体是细菌矿化金属产生的，其中优选所述细菌选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、博德特氏菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)和沙门氏菌属(Salmonella)，优选埃希氏菌属(Escherichia)，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)，例如DH5α株。

4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗对象中的肿瘤，优选实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌，和/或，所述对象选自人和其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛和鹿，优选人。

5.金属小体在制备用于治疗对象中肿瘤的药物中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。

6.权利要求5的用途，其中：

-所述金属纳米颗粒的粒径为约5-500nm，例如约10-200nm；和/或

-所述金属小体是由细菌来源组分完全包覆的金属纳米颗粒，其中细菌来源组分位于包覆金属纳米颗粒的有机层上；和/或

-所述药物用于肿瘤光热治疗或者放疗，任选地，所述药物还包含其它肿瘤治疗药物如免疫检查点抑制剂。

7.权利要求5或6的用途，其中所述金属小体是细菌矿化金属产生的，其中优选所述细菌选自奈瑟氏菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌属，优选埃希氏菌属，更优选大肠杆菌，例如DH5α株。

8.权利要求5-7任一项的用途，其中所述药物用于治疗对象中的肿瘤，优选实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌，和/或，所述对象选自人和其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛和鹿，优选人。

9.一种免疫增强剂或免疫刺激剂，其包含金属小体以及任选包含药学上可接受的载体，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细胞内膜、细胞外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其任意组合。

10.权利要求9的免疫增强剂或免疫刺激剂，其中：

-所述金属纳米颗粒的粒径为约5-500nm，例如约10-200nm；和/或

-所述免疫增强剂或免疫刺激剂用于肿瘤光热治疗或者放疗。

11.权利要求9或10的免疫增强剂或免疫刺激剂，其中所述金属小体是细菌矿化金属产生的，其中优选所述细菌选自奈瑟氏菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌属，优选埃希氏菌属，更优选大肠杆菌，例如DH5α株。

12.权利要求9-11任一项的免疫增强剂或免疫刺激剂，其中所述免疫增强剂或免疫刺激剂用于对象的肿瘤治疗中，优选地，所述肿瘤是实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌，和/或，所述对象选自人和其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛和鹿，优选人。

13.金属小体在制备免疫增强剂或免疫刺激剂中的用途，其中所述金属小体包含金属纳米颗粒和附于其上的细菌组分，优选地，所述细菌组分选自细菌内膜、细菌外膜、蛋白质、糖类、核酸、磷脂和其组合。

14.权利要求13的用途，其中：

-所述金属纳米颗粒的粒径为约5-500nm，例如约10-200nm；和/或

-所述免疫增强剂或免疫刺激剂用于肿瘤光热治疗或者放疗。

15.权利要求13或14的用途，其中所述金属小体是细菌矿化金属产生的，其中优选所述细菌选自奈瑟氏菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌属，优选埃希氏菌属，更优选大肠杆菌，例如DH5α株。

16.权利要求13-15任一项的用途，其中所述免疫增强剂或免疫刺激剂用于对象的肿瘤治疗中，优选地，所述肿瘤选自实体瘤，例如选自胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、食道癌和前列腺癌，和/或，所述对象选自人和其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛和鹿，优选人。

17.一种制备金属小体的方法，包括：

(i)将能够进行金属矿化的细菌在含金属离子的溶液中培养，

(ii)收获(i)获得的培养液，

(iii)从(ii)收获的培养液的培养上清收获金属小体，任选纯化。

18.权利要求17的方法，其中：

(a)所述金属是金，任选所述含金属离子的溶液是氯金酸；和/或

(b)所述细菌培养至少约0.5、1、2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、48、60、72、96、120小时、6天、7天、8天、9天、10天；和/或

(c)所述培养于室温例如约25-37℃，任选振荡培养；和/或

(d)从培养液获得包含金属小体的培养上清，例如通过离心，任选地，进一步将培养上清过滤，例如通过无菌滤膜；和/或

(e)将包含金属小体的培养上清离心，例如以约5000-15000g例如约11000g离心至少10分钟、20分钟或者30分钟。

19.权利要求17或18的方法，其中所述细菌选自奈瑟氏菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌属，优选埃希氏菌属，更优选大肠杆菌，例如DH5α株。

20.权利要求17-19任一项的方法，其中所述金属小体如下制备：

-在含大肠杆菌、优选对数生长期的大肠杆菌的培养基中加入含金离子的溶液例如氯金酸，并室温振荡培养至少12小时、优选至少48小时、更优选至少72小时，获得培养液，

-将培养液离心，获得含有金属小体的上清液，

-将含有金属小体的上清液过滤，例如用约0.45μm和/或0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，

-将过滤后的上清液以约5000-15000g例如11000g离心至少10分钟、优选至少30分钟，以及

-收获沉淀，获得金属小体。