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CN118703618A - 肠道巨单胞菌在评估肥胖风险中的应用 - Google Patents

肠道巨单胞菌在评估肥胖风险中的应用 Download PDF

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CN118703618A CN202410835611.1A CN202410835611A CN118703618A CN 118703618 A CN118703618 A CN 118703618A CN 202410835611 A CN202410835611 A CN 202410835611A CN 118703618 A CN118703618 A CN 118703618A
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刘瑞欣
王计秋
王卫庆
洪洁
吴超
钟焕姿
杨芳明
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Abstract

本发明提供了肠道巨单胞菌在评估肥胖风险中的应用。所述巨单胞菌选自如下三种巨单胞菌中的任意一种，或任意两种或三种间的组合：Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis。本发明进一步基于上述菌种，提供了肥胖风险早期评估试剂盒，通过检测上述三种菌的表达丰度，实现肥胖风险早期评估。本发明研究成果揭示了肠道巨单胞菌与肥胖的强烈相关性，可以作为生物标志物评估肥胖发生风险。

Description

肠道巨单胞菌在评估肥胖风险中的应用
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，涉及肠道巨单胞菌作为肥胖风险的生物标志物的应用。具体涉及肠道巨单胞菌在评估肥胖风险中的应用。
背景技术
肥胖症已成为全球面临的重要公共卫生问题。国际通常采用体重指数(Body MassIndex，BMI)为标准判断肥胖程度，18.5≤BMI≤24.9时属正常范围，BMI≥25为超重，BMI≥30为肥胖。肥胖症在我国的情况也不容乐观，2020年我国成人超重和肥胖的患病率分别达到34.3％和16.4％[1]，且还在逐年攀升。肥胖症是2型糖尿病、心脑血管疾病以及肿瘤的重要危险因素，已成为慢性病早期防治的重要关口，据估计2019年全球范围内超重肥胖导致500万人死于糖尿病、心血管疾病、肿瘤等慢性非传染性疾病[2]。肥胖症的防控形势十分严峻，早发现、早干预是防控的重要措施。
肥胖症的基本特征是能量摄入和消耗的失衡，其发生目前认为是遗传和环境因素共同导致。除了少数几个遗传位点的突变，如MC4R等可以直接导致严重肥胖，大多数的肥胖都是由于多个肥胖相关的遗传风险位点突变的叠加以及环境因素，例如高热量饮食、缺乏运动、肠道菌群的改变等诸多因素的累积效应导致的。然而目前尚缺乏对于个体肥胖发生倾向的早期评估的有效手段。
大量研究揭示了肥胖人群肠道菌群紊乱，表现为一系列菌种的缺失与异常富集，肠道菌群失衡被认为是肥胖症的新病因[3-5]。基于目前研究的局限性，我们提出，能否通过分析肠道菌群的组成，探寻与肥胖强烈临床相关性的菌株，在早期阶段评估个体发生肥胖症的风险从而进行针对性的干预以达到预防肥胖发生的目的，为肥胖的早期防控提供新的思路和方向。
发明内容
本发明旨在提供评估肥胖风险的新生物标志物。本发明目的在于提供巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂盒中的用途及对应的肥胖症早期评估试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：收集1005例人群(631例肥胖患者和374例正常体重人群)的粪便样本提取DNA，采用宏基因组测序，去除人源测序数据及低质量测序数据后，使用MetaPhlAn2实现细菌属及物种的分类和定量；而后通过聚类分析发现巨单胞菌Megamonas为核心的人群有更高的肥胖表型；Megamonas属及物种Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis均显著富集于肥胖人群的粪便中，是肥胖的生物标志物；进一步分析发现，肥胖人群中，相较于不携带巨单胞菌的人群，携带该菌的人群显示了更差的代谢指征。进一步，将M.rupellensis定植在动物模型中，显示M.rupellensis具有促进肥胖以及糖脂代谢紊乱的作用。这提示了Megamonas可以作为肥胖的风险标志物，通过检测Megamonas丰度早期评估肥胖风险并进行早期防控。
基于上述发现，本发明采用的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供了巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂盒中的用途，所述巨单胞菌选自如下任意情形：(1)Megamonas rupellensis；(2)(2)Megamonashypermegale；(3)Megamonasfuniformis；(4)Megamonas rupellensis和Megamonashypermegale组合；(5)Megamonas rupellensis和Megamonasfuniformis组合；(6)Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis组合；(7)Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis的组合。
巨单胞菌Megamonas目前共有3个种，分别为Megamonas rupellensis、Megamonashypermegale以及Megamonasfuniformis，在人体肠道中均有分布。在本发明的1005例人群队列中，这3个种在肥胖人群中的出现率以及在肥胖人群中的丰度都显著高于对照人群，并且这3个种都与BMI呈现显著正相关。因此，该三个种的任意一种以及相互之间的任意组合，均可作为肥胖风险的诊断标志物。
本发明进一步选择Megamonas rupellensis为实验菌种，揭示了Megamonasrupellensis可以促进高脂小鼠肥胖及糖脂代谢紊乱。因此，本发明重点保护包含Megamonas rupellensis的上述三种菌组合作为肥胖症早期评估标志物的用途。所述巨单胞菌选自如下任意情形：(1)Megamonas rupellensis；(2)Megamonas rupellensis和Megamonas hypermegale组合；(3)Megamonas rupellensis和Megamonasfuniformis组合；(4)Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis的组合。
优选的，所述试剂盒包含了检测生物样本中巨单胞菌丰度的试剂。本发明具体实施方式部分中，采用宏基因组测序结合MetaPhlAn2分析确定丰度异常的细菌属及种，所以，本发明提供的试剂盒中包含对从生物样本中提取的DNA进行宏基因组测序的试剂。宏基因组测序完毕后，采用SOAP2去除低质量测序数据及人源序列，最后使用MetaPhlAn2实现细菌门、属及物种的分类和定量。
不同细菌种、属的鉴定也可以通过16s rDNA的序列不同来区分，巨单胞菌属Megamonas目前三个种的16s rDNA序列很相近，可以通过PCR的方式，实现Megamonas属的丰度检测。实现三个菌种PCR扩增的引物序列如下：
正向序列：AACACTTCGAAAGGGGTGCT(SEQ ID NO.1)；
反向序列：CAGACCGGCTACTGATCGTC(SEQ ID NO.2)；
提取粪便总的细菌DNA后，用Megamonas菌的引物进行实时荧光定量qPCR测定丰度即可。
因此，本发明的试剂盒中也可以包含对所述巨单胞菌进行特异性检测的PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。实时荧光定量qPCR扩增完毕后，通过扩增循环数CT值计算细菌丰度。
进一步优选，本发明所述的生物样本选自粪便，其内容物与肠道菌群的代谢息息相关且获取方便。
本发明第二方面，提供了一种肥胖症早期评估试剂盒，对生物样本中的如下任意巨单胞菌的丰度进行检测，(1)Megamonas rupellensis；(2)(2)Megamonas hypermegale；(3)Megamonasfuniformis；(4)Megamonas rupellensis和Megamonas hypermegale组合；(5)Megamonas rupellensis和Megamonasfuniformis组合；(6)Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis组合；(7)Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis的组合。
优选如下组合：(1)Megamonas rupellensis；(2)Megamonas rupellensis和Megamonas hypermegale组合；(3)Megamonas rupellensis和Megamonasfuniformis组合；(4)Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis的组合。
其中，该试剂盒中包含了检测生物样本中所述巨单胞菌丰度的试剂。根据上述描述可知，所述试剂优选自对从生物样本中提取的DNA进行宏基因组测序的试剂，或者对所述巨单胞菌进行特异性检测的PCR引物，所述引物序列如上SEQ ID NO.1～2所示。
本发明的有益保障及效果如下：
本发明通过大量肥胖-正常对照大样本临床队列宏基因组测序，并且与临床指标联合分析，验证了巨单胞菌Megamonas及其3个种与肥胖及代谢性并发症的高度相关性，并且在外部人群队列中进一步验证，揭示了巨单胞菌可以作为肥胖发生风险的标志物。进一步在小鼠模型上验证了M.rupellensis促进高脂小鼠的肥胖发生、血糖升高以及肝脏脂质沉积。
本发明研究成果显示了巨单胞菌是肥胖的重要风险标志物，可以通过检测肠道巨单胞菌丰度进行肥胖风险的早期评估，从而实现早期防控。
附图说明
图1显示了肥胖对照人群的肠道菌群组成改变：A.肥胖对照人群的BMI以及α多样性；B.肥胖对照人群肠道菌群的属水平组成差异(展示丰度排名前10位属)。
图2显示了K-Means聚类算法结果：A.1005例人群根据K-Means算法聚类成3簇；B.不同簇人群中的肥胖患者比例；C.不同簇人群的BMI。
图3显示了JSD聚类算法结果：A.1005例人群根据JSD算法聚类成3簇；B.K-Means算法与JSD算法一致性；C.不同簇人群中的肥胖患者比例；D.不同簇人群的BMI。
图4显示了外部队列中国儿童青少年人群(58例)中验证结果：A.Zhou等人发表的58例儿童青少年NAFLD人群宏基因组数据，利用我们的分析聚类模型的聚类结果；B.M簇和B/P簇的体重异常的比例；C.体重异常和对照人群的巨单胞菌丰度。
图5显示了外部队列以色列人群(870例)中验证结果：A.携带有巨单胞菌(252例)和不携带巨单胞菌(618例)人群的BMI；B.870例人群的巨单胞菌丰度与BMI的相关性。
图6显示了巨单胞菌3个种与肥胖的相关性：A.3个种在肥胖和对照人群中的出现率；B.3个种在肥胖和对照人群中的丰度；C.在631例肥胖人群中3个种分别与BMI的相关性。
图7显示了在631例肥胖人群中，携带(449例)或者不携带(182例)巨单胞菌的人群不同临床代谢指标。
图8显示M.rupellensis定植促进高脂SPF小鼠体重增长：A.实验设计；B.小鼠粪便M.rupellensis菌定量；C.小鼠进食量；D.小鼠的体重增长率。图中，PBS为对照小鼠；MR,M.rupellensis定植小鼠。
图9显示了M.rupellensis定植促进高脂SPF小鼠脂肪堆积：A.两组小鼠的体脂率；B.两组小鼠的皮下脂肪(iWAT，腹股沟皮下脂肪)和内脏脂肪(eWAT，附睾内脏脂肪)的重量；C.两组小鼠脂肪的HE染色组织形态学切片；D.两组小鼠内脏脂肪大小的统计定量。
图10显示了M.rupellensis定植促进高脂SPF小鼠糖脂代谢紊乱：A.两组小鼠的空腹血糖水平；B.两组小鼠肝脏组织的HE染色组织形态学切片；C.两组小鼠的肝脏甘油三酯定量。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、肥胖风险标志物筛选
依托上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢病科，收集了631例肥胖患者(BMI，35.68±4.58kg/m2；年龄26.19±7.54岁)，以及374例正常体重人群(BMI，21.32±1.91kg/m2；年龄31.06±9.85岁)(人群排除标准：继发性肥胖、肿瘤、胃肠道感染性疾病、代谢性疾病药物使用、采集样本前一个月内抗生素使用)。我们对这1005例人群收集了粪便样本，并收集了基本信息，包括性别、年龄、体重、BMI、体脂率、腰围、臀围、血压、空腹血糖及胰岛素、餐后2小时血糖及胰岛素，具体参见下表1：
表1 1005例人群的基本信息
其中，a，卡方检验；b，体重指数；c，腰臀比；d，空腹胰岛素；e，餐后2h胰岛素；f，空腹血糖；g，餐后2h血糖。
使用MagPure Stool DNA KF Kit试剂盒进行了1005例粪便DNA提取，并采用MGI-2000平台进行了鸟枪法宏基因组测序，然后利用SOAP2去除低质量数据及人源序列，最后使用MetaPhlAn2比对到细菌门、细菌属及细菌种。我们发现相较正常体重人群，肥胖患者肠道微生物α多样性显著降低(图1A)，并且菌群结构存在显著改变，具体表现为拟杆菌属(Bacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、另枝菌属(Alistipes)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、副拟杆菌属(Parabacteroides)的显著降低，以及巨单胞菌属(Megamonas)的显著升高(图1B)。
进一步，使用K-Means算法进行了聚类分析，结果参见图2，将1005例样本聚类成了3簇(图2A)，并且分别以拟杆菌属(Bacteroides，B簇)、普氏菌属(Prevotella，P簇)、巨单胞菌属(Megamonas，M簇)为核心菌属。值得注意的是，以巨单胞菌属为核心的M簇人群肥胖比例为79％，而B簇和P簇人群肥胖比例仅为59％(图2B)，并且M簇也具有显著更高的BMI(图2C)。
随后采用了不同算法模型——JSD聚类方法进行验证，结果参见图3，也聚类出分别以拟杆菌、普氏菌、巨单胞菌属为核心的簇，即B、P、M三簇(图3A)。我们发现，两种聚类的结果具有高度一致性(图3B)，并且JSD聚类方法下，M簇也具有更高的肥胖比例(84％)以及更高的BMI(图3C和3D)。这些结果提示了巨单胞菌Megamonas与BMI的显著相关性，是肥胖的生物标志物。
为了进一步验证巨单胞菌Megamonas与肥胖的关系，我们在外部人群中进行了验证。利用我们的分析聚类模型，进一步分析了Zhou等人2022年发表的中国儿童青少年非酒精性脂肪肝人群[6](15例正常对照，43例体重异常)宏基因组数据(图4A)，其中32例归为B簇，7例归为P簇，19例归为M簇，而M簇也同样具有更高的体重异常比例(图4B)。并且，高BMI人群相比正常对照也具有更高的Megamonas丰度(图4C)。
此外，我们在一项以色列的人群中也进一步验证了我们的结果。我们分析了Zeevi等人发表的870例以色列人群的肠道宏基因组数据[7]。结果参见图5，发现携带有巨单胞菌Megamonas的人群(252例)相较不携带巨单胞菌的人群(618例)具有更高的BMI(图5A)，并且巨单胞菌Megamonas的丰度与BMI呈显著正相关(图5B)。
以上数据在不同队列中充分验证了我们的发现，即巨单胞菌Megamonas与肥胖呈现高度相关性，是肥胖的生物标志物。巨单胞菌目前共有3个种，分别为Megamonasrupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis(图6A)。在我们的1005例人群队列中，这3个种在肥胖人群中的出现率以及在肥胖人群中的丰度都显著高于对照人群(图6B)，并且这3个种都与BMI呈现显著正相关(图6C)。
进一步验证了临床代谢指标与巨单胞菌的关系。我们发现，在631例肥胖人群中，相较于不携带巨单胞菌人群(182例)，携带有巨单胞菌的人群(449例)具有更高的BMI、体重、腰围、臀围、体脂率、餐后两小时血糖及餐后两小时胰岛素，这些结果提示，巨单胞菌不仅与肥胖相关，也可能提示了更差的临床代谢指标及代谢性并发症(图7)。
综上，通过1005例肥胖-正常对照大样本临床队列宏基因组测序，并且与临床指标联合分析，验证了巨单胞菌Megamonas及其3个种与肥胖及代谢性并发症的高度相关性，并且在外部人群队列中进一步验证，揭示了巨单胞菌可以作为肥胖发生风险的标志物。
二、小鼠定植实验
为了探究Megamonas与肥胖发生的关系，我们给予9周龄C57BL/6SPF小鼠高脂饮食(HFD)喂养，并给小鼠灌胃M.rupellensis菌悬液(2×108CFU)，对照组小鼠灌胃无菌PBS(图8A)。我们发现M.rupellensis可以在小鼠肠道内有效定植(图8B)，并且与对照小鼠相比，M.rupellensis定植的小鼠进食量不变(图8C)，但是具有更高的体重增长率(图8D)。
与此一致的，我们发现M.rupellensis定植小鼠体脂率更高(图9A)，并且皮下脂肪组织(腹股沟脂肪)以及内脏脂肪组织(附睾脂肪)重量都更高(图9B)。进一步HE染色组织形态学也显示M.rupellensis定植小鼠脂肪细胞更大(图9C，图9D)，提示M.rupellensis定植可以导致高脂喂养小鼠的脂肪堆积。
接下来我们探究了小鼠糖脂代谢的改变，我们发现与对照小鼠相比M.rupellensis定植小鼠的血糖升高(图10A)，并且肝脏组织的HE染色组织形态学以及肝脏的甘油三酯定量也显示更高的肝脏脂质沉积(图10B和C)；这些数据表明了M.rupellensis定植可以显著促进高脂喂养小鼠的体重增长、脂肪堆积，以及糖代谢紊乱、肝脏脂肪沉积。
综上，此研究基于大样本人群宏基因组筛选出巨单胞菌在肥胖患者中富集，并进一步通过小鼠模型，验证了巨单胞菌物种M.rupellensis促进小鼠的肥胖发生以及糖代谢紊乱。这一研究揭示了巨单胞菌是肥胖的重要致病菌，是肥胖发生的新病因，可以作为肥胖治疗的靶点。调控肠道菌群，靶向抑制巨单胞菌丰度将是肥胖治疗的新方向。
本发明背景技术采用的参考文献如下：
1.Pan,X.F.,Wang,L.,and Pan,A.(2021).Epidemiology and determinantsofobesity inChina.Lancet Diabetes Endocrinol 9,373-392.10.1016/S2213-8587(21)00045-0.
2.Collaborators,G.B.D.R.F.(2020).Global burden of 87risk factors in204countriesand territories,1990-2019:a systematic analysis for the GlobalBurden of DiseaseStudy 2019.Lancet 396,1223-1249.10.1016/S0140-6736(20)30752-2.
3.Fan,Y.,and Pedersen,O.(2021).Gut microbiota in human metabolichealth anddisease.Nat Rev Microbiol 19,55-71.10.1038/s41579-020-0433-9.
4.Ridaura,V.K.,Faith,J.J.,Rey,F.E.,Cheng,J.,Duncan,A.E.,Kau,A.L.,Griffin,N.W.,Lombard,V.,Henrissat,B.,Bain,J.R.,et al.(2013).Gut microbiotafrom twinsdiscordant for obesity modulate metabolismin mice.Science 341,1241214.
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5.Turnbaugh,P.J.,Ley,R.E.,Mahowald,M.A.,Magrini,V.,Mardis,E.R.,andGordon,J.I.(2006).An obesity-associated gut microbiome with increasedcapacity for energyharvest.Nature 444,1027-1031.10.1038/nature05414.
以上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述巨单胞菌选自如下三种巨单胞菌中的任意一种，或任意两种或三种间的组合：Megamonasrupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis。
2.根据权利要求1所述的巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述巨单胞菌选自如下任意情形：(1)Megamonas rupellensis；(2)Megamonasrupellensis和Megamonas hypermegale组合；(3)Megamonas rupellensis和Megamonasfuniformis组合；(4)Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis的组合。
3.根据权利要求1所述的巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含了检测生物样本中所述巨单胞菌丰度的试剂，所述试剂选自对从生物样本中提取的DNA进行宏基因组测序的试剂，或者对所述巨单胞菌进行特异性检测的PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
4.根据权利要求1所述的巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，宏基因组测序完毕或PCR扩增完毕后，通过MetaPhlAn2或16s rDNA的序列进行菌种鉴定。
5.根据权利要求1所述的巨单胞菌在制备肥胖症早期评估试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物样本选自粪便。
6.一种肥胖症早期评估试剂盒，其特征在于，包含对生物样本中的Megamonasrupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis任意一组或多组巨单胞菌组合的丰度进行检测的试剂。
7.根据权利要求6所述的肥胖症早期评估试剂盒，其特征在于，对生物样本中的如下(1)至(3)任意一组巨单胞菌的丰度进行检测，(1)Megamonas rupellensis；(2)Megamonasrupellensis和Megamonas hypermegale组合；(3)Megamonas rupellensis和Megamonasfuniformis组合；(4)Megamonas rupellensis、Megamonas hypermegale以及Megamonasfuniformis的组合，
所述试剂盒中包含了检测生物样本中所述巨单胞菌丰度的试剂。
8.根据权利要求6或7所述的肥胖症早期评估试剂盒，其特征在于：
其中，所述试剂选自对从生物样本中提取的DNA进行宏基因组测序的试剂，或者
对所述巨单胞菌进行特异性检测的PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119506419A (zh) * 2024-12-17 2025-02-25 成都市第三人民医院 一种用于评估内脏型肥胖的微生物标志物及其应用

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CN119506419A (zh) * 2024-12-17 2025-02-25 成都市第三人民医院 一种用于评估内脏型肥胖的微生物标志物及其应用

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