CN118703515A - GhVdR1基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开GhVdR1基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，属于生物技术应用领域。本发明涉及的GhVdR1基因，其编码细胞色素b561蛋白。该基因在棉花茎、胚珠与纤维中表达量较高，受黄萎病菌诱导显著下调表达，主要定位于高尔基体上，细胞膜和内质网上也有信号。干扰表达GhVdR1植株通过降低抗坏血酸再生关键基因表达量，降低抗坏血酸含量和抗坏血酸氧化还原效率，增加H₂O₂的含量，增强植株抗病性。同时植株生长发育和纤维品质相关性状表型调查结果显示，干扰表达GhVdR1对植株生长发育影响较小，与对照相比，纤维品质显著改良，具有较好的生产利用潜力。

Description

GhVdR1基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种棉花GhVdR1基因在提高棉花抗病性中的应用。该基因ORF全长为1197bp，编码398个氨基酸。结构域分析发现其编码细胞色素b561蛋白(CYB561)。GhVdR1基因通过调控抗坏血酸再生在棉花中参与调控棉花抗病性。在棉花中该基因功能未有相关文献报道。本发明分析GhVdR1在陆地棉不同组织器官和受黄萎病菌诱导后不同时间点棉花根部中的表达水平，发现GhVdR1是棉花细胞色素b561家族基因中唯一一个在各组织中呈组成性表达且受黄萎病菌诱导后显著下调表达的基因。通过对不同植物中GhVdR1同源基因序列比对和进化分析，发现该基因结构在各个物种中非常保守。亚细胞定位结果证明GhVdR1主要定位于高尔基体膜，在内质网和细胞膜也有定位。在棉花中抑制GhVdR1基因表达，植株对黄萎病菌的抗性显著提高，而过量表达几乎无影响。进一步对RNAi干扰植株进行转录组测序分析，与对照相比，GhVdR1转录水平的抑制影响了植株体内氧化还原反应相关通路和抗坏血酸再生途径关键基因的表达量。生化检测结果显示，干扰GhVdR1降低了植株中AsA的含量和AsA氧化还原效率，而H₂O₂含量显著增加。上述结果表明GhVdR1通过参与植株抗坏血酸再生来调节ROS含量，影响棉花黄萎病抗性。外施AsA降低了植株抗病性的实验结果为GhVdR1抗病机理解析提供进一步补充。转基因株系的产量和纤维品质相关性状表型调查结果显示，与受体相比，干扰GhVdR1对植株产量和纤维品质影响较小。本发明利用生物技术明确了GhVdR1调控棉花黄萎病抗病性的作用，提出通过抑制GhVdR1表达调控棉花抗病性的育种利用价值。

背景技术

缺失免疫细胞的植物在应对复杂生存环境中的多种胁迫时不断进化，逐渐在体内形成由多种防御手段组成的较为完整的免疫体系，目前对植物免疫机制已经有了一定的研究。高等植物细胞表面和细胞内部拥有大量的免疫受体，可以感知病原菌感染相关的各种信号(Kourelis and van der Hoorn,2018；Van de Weyer et al.,2019)。细胞表面免疫受体称为模式识别受体(PRRs)，识别由病原菌释放的相对保守的微生物相关分子模式(MAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)，例如：脂多糖、肽聚糖、真菌几丁质和源自植物的寡半乳糖醛苷等，启动PAMPs触发的免疫反应(PTI)(Zhu et al.,2022)。Ve1是典型的PRR，帮助番茄、拟南芥、烟草和棉花抗黄萎病(Fradin et al.,2011；Song et al.,2018)；Ve同源基因GbVe1、GbaVd1、GbaVd2、Gbvdr3、Gbvdr5和Gbvdr6同样正调控拟南芥和棉花抗黄萎病过程(Li et al.,2015；Chen et al.,2016；Chen et al.,2017；Yang et al.,2017)。在细胞内或跨膜的免疫受体是富含亮氨酸重复受体蛋白(NLR)，通过特异性感知进入到植物细胞内的病原菌效应蛋白，启动效应器触发的免疫(ETI)(Ramirez-Prado et al.,2018)。蛋白CNL、RPM1和RPS2与质膜相关宿主蛋白RIN4结合监测丁香假单胞菌效应子AvrRpm1、AvrB和AvrRpt2，是NLR帮助植物抗病的经典例子(Axtell and Staskawicz,2003；Mackey et al.,2002)。

PTI和ETI共同组成植物先天免疫系统，这一系统的工作模式最初被形象概括为“Z模型”。PTI作为第一层免疫反应发挥作用，部分病原菌为侵入植物细胞产生干扰PTI扰乱植物免疫的效应因子，引起效应子触发的感病性(ETS)，植物细胞随即进化出能够识别效应因子的NLR，启动ETI释放R蛋白阻止病原菌进一步扩繁(Jones and Dangl,2006)。植物在经典免疫模型中PTI和ETI一直被认为是相互独立的，但越来越多证据表明两者在信号级联和信号组分上存在潜在的联系。磷酸化蛋白质组学研究发现PTI和ETI的早期信号感知过程存在协同磷酸化现象(Kadota et al.,2019)；另一研究表明，在PRR未被激活的情况下，激活NLR仅能诱导部分防御反应启动(Ngou et al.,2020；Yuan et al.,2020)，而同时刺激PRR和NLR才能完全激活防御，该实验还发现NLR的预激活也引起了PRR介导的防御；还有研究表明两者在信号转导中会相互增强(Ngou et al.,2020)。这些研究表明PTI和ETI之间存在信号串扰，具体原因还有待进一步研究。

尽管PTI和ETI的触发机制不同，但它们触发后启动的下游反应是相似的，包括：果胶积累、木质素和胼胝质沉积，抗菌毒素、酚类和黄酮类化合物等物质的积累，中继和放大下游信号的MAPK信号级联途径，Ca²⁺的内流，ROS爆发，感知和传递信号的多种植物激素的生物合成，细胞程序性死亡(PCD)的发生，免疫相关基因的转录重编程，抗病基因的表达等(Billah and Yang,2021)。以上由病原菌激活的免疫反应可称为诱导免疫反应，系统获得性抗性(SAR)是诱导免疫反应中的一种，指植株某部分产生对某种病原物的抗性后，将抗性传递给植株其他部位，使未受侵染的组织器官拥有同样或者更高的抗性。经研究，大多数SAR关键信号分子是水杨酸(SA)，当植株在自身体内积累到足够多SA，SAR就会发生，ROS也是启动SAR必不可少的信号分子(王钧和金巧玲，1998)。由此可见，ROS在植物免疫中非常重要。各种激素信号之间相互联系，相互作用，在正常野生型中研究十分困难，利用突变体可加速抗病机制研究进程。

ROS在植物非生物和生物应激感应的初始阶段起重要作用，组织内ROS的产生往往是植物受到胁迫的标志，而ROS的产生也有利于植物建立后续防御，比如：改变细胞壁结构、启动激素信号转导通路、启动SAR、诱发超敏反应(HR)等(Qi et al.,2017；Mittler etal.,2022)。ROS主要在叶绿体、线粒体、质膜、过氧化物酶体中产生(Elstner,1982；Sharmaet al.,2012)。分子氧(O₂)发生有氧代谢，形成具有高反应性的ROS，包括含自由基的ROS：羟基自由基(·OH)、超氧化物(O2·^-)、有机烷氧基(RO·)和有机过氧自由基(ROO·)，和非自由基ROS：过氧化氢(H₂O₂)、和单线态氧(¹O₂)和臭氧(O₃)(Dumont and Rivoal,2019)。其中H₂O₂半衰期最长，扩散距离最远，反应具有高度选择性，是研究中最重要的ROS之一(Mittler,2017)。

活性氧的功能是依赖剂量效应的，低浓度下，ROS作为体内生长和发育信号，激活基本发育过程，如根毛生长、根伸长和向性(借助生长素)、气孔闭合(借助ABA)、木质素合成(借助JA)、叶形、毛状体发育、种子萌发等(Suzuki et al.,2011；Morales and Munné-Bosch,2016)，同时也对植物免疫相关的信号转导过程进行微调，启动SAR以促进植物防御反应发生。植物NADPH氧化酶(NOX)，也称呼吸爆裂氧化酶同源物(RBOHs)，是ROS代谢中重要的调控因子。据报道，GbRboh5/18和GhRbohD可激活ROS产生，增强棉花对黄萎病的抗性(Chang et al.,2020；Huang et al.,2021)。ROS过度积累则会导致氧化应激，本质上来讲氧化应激是指氧化剂和抗氧化剂之间的氧化还原反应被打破，植物体内氧化还原信号紊乱、细胞结构遭到破坏的现象(Sies,2018)。有研究发现过量的ROS通过改变多种蛋白质的结构和功能导致DNA、RNA和膜脂质发生氧化损伤，进而损害细胞功能(Phua et al.,2021；Mittler etal.,2022)。过表达microRNAmiR398b后调控ROS稳态的基因被切割，棉花体内ROS过度积累，对黄萎病菌的抗性降低(Miao et al.,2022)。

为了应对氧化应激，植物已经进化出一套较为完整的由两种抗氧化剂合作清除体内多余ROS维持植物氧化还原稳态的保护机制，即酶促抗氧化剂和非酶抗氧化剂(Foyerand Noctor,2005)。非酶抗氧化剂由低分子量化合物组成，抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)是其中最重要的两种，两者相较而言AsA更为重要，AsA的浓度通常比GSH的浓度高一千倍。非酶促抗氧化剂可以直接与ROS发生反应，但在酶促抗氧化剂介导下其清除ROS的效率更高。酶促抗氧化剂主要有：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、和硫氧还蛋白(TRX)等(Shaban et al.,2018；Phua et al.,2021)。抗氧化剂通过调控ROS的含量参与植物免疫反应，GST、POD和SOD被证明参与棉花感染黄萎病菌期间ROS稳态的调控，因此棉花在启动防御时可以避免由ROS过度积累造成的受损(Li et al.,2019a；Li et al.,2019b；Pei et al.,2019)。目前研究发现ROS水平过高或过低都不利于植物生长和抗病，找到ROS最佳浓度、明确ROS调控机制、把握精确调控ROS水平的方法对ROS在植物中更好地发挥作用至关重要。发掘调控ROS的关键基因，利用生物技术精确调控该基因在棉花中表达剂量，使ROS含量保持在既有利于植株生长发育又有助于抗病的范围，是抗病育种的思路之一。

抗坏血酸(AsA)，即维生素C，是一种多功能的还原剂，它包含还原型抗坏血酸(AsA)、半还原型抗坏血酸(MDHA)、氧化型抗坏血酸(DHA)三种形式，还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸合称为总抗坏血酸(Total-AsA)。我们目前报道的植物合成抗坏血酸的途径主要有四条：L-半乳糖途径、L-古洛糖途径、肌醇途径和D-半乳糖醛酸途径(Ishikawa etal.,2018；Yoshimura and Ishikawa,2017)它们都以一种醛糖内酯作为抗坏血酸直接合成前体。除上述从头合成途径外，还原型抗坏血酸还通过再循环系统产生。AsA是APX特定的电子供体，两个AsA分子在APX催化下，将H₂O₂转化为H₂O的同时被氧化成不稳定的单脱氢抗坏血酸(MDHA)。MDHA既可以自发地迅速转化为AsA和DHA，也可以在NAD(P)H依赖性单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)催化下被还原成AsA(Foyer and Shigeoka,2011)。MDAR主要存在于胞质、叶绿体、过氧化物酶体、线粒体和质膜中(Noctor and Foyer,1998)。DHA不具有抗氧化能力，以GSH为电子供体在氧化型抗坏血酸还原酶(DHAR)的作用下得到电子，转化为AsA(Nimse and Pal,2015)。GSH依赖型DHAR在叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中表达(Noctorand Foyer,2016)。如果不再循环，DHA则发生不可逆水解，生成2,3-二酮古龙酸(Moller etal.,2007)。

抗坏血酸在植物中主要作为抗氧化剂和酶的辅助因子发挥作用。抗坏血酸是植物最丰富的水溶性抗氧化剂(Sirikhachornkit and Niyogi,2010)，植物过氧化物酶体、胞质溶胶、细胞核、叶绿体和线粒体中均存在较高浓度的抗坏血酸。在氧化应激中，抗坏血酸既可以直接清除体内多余的ROS，又可通过AsA-GSH循环帮助细胞解毒。AsA-GSH循环是植物细胞主要抗氧化系统，GSH作为AsA再生循环过程中DHA的电子供体，在DHAR催化下转化为氧化型谷胱甘肽(GSSH)，GSSH在谷胱甘肽还原酶(GR)的催化下利用NAD(P)H提供的电子可再生为GSH，不断为AsA再生循环助力(Foyer and Noctor,2011；Smirnoff and Wheeler,2000)。抗坏血酸在植物应对由非生物胁迫产生的氧化应激中的作用被广泛研究。烟草和加杨的叶片因含有较多的AsA，对氧化应激更耐受(Foyor et al.,1995；Aono et al.,1993)。镉胁迫下，多棱大麦体内的DHA含量显著升高(Demirevska-Kepova et al.,2006)。强光照和干旱使粗枝云杉幼苗中的AsA显著增加(Yang et al.,2008)。紫外胁迫显著增加了金合欢幼苗的AsA和DHA的含量和GSH/GSSG比率(Agarwal et al.,2007)。有趣的是，一些研究与上述结果相反，镉胁迫下大豆根和根瘤中的AsA降低(Balestrasse et al.,2001)；镉胁迫还分别降低了拟南芥、黄瓜和豌豆叶片中的AsA含量(Skorzynska-Polit et al.,2003；Zhang etal.,2003；Romero-Puertas et al.,2007)，而加杨根中AsA含量不受胁迫影响(Romero-Puertas et al.,2007)。除了对非生物胁迫下植物体内的抗坏血酸含量变化关注外，许多研究围绕AsA-GSH循环过程中的APX、MDAR、DHAR、GR的变化展开，大部分结果认为酶反应的活跃有助于植物抵御逆境(Chen etal.,2005；Ushimaru et al.,2006)。总结来讲，目前多数研究认为抗坏血酸含量增加有利于植物应对氧化应激，但抗坏血酸在植物氧化应激中更全面的研究还待继续展开。另外抗坏血酸在植物应对生物胁迫时也可能发挥一定的作用，目前相关报道较少。除了作为抗氧化剂，抗坏血酸还作为辅助因子参与多个反应，例如：作为多种生物合成途径和叶黄素循环中的辅助因子，保护植物免受过量激发能量的负面影响、维持能量耗散、调节气孔功能等(Niyogi,1999；Smirnoff,2000)。

细胞色素b561(Cytochrome B561,CYB561/CYB561A1)是一类包含CYB561核心结构域的跨膜家族蛋白(Asard et al.,2001)。CYB561结构域由四个跨膜α-螺旋束组成，结构域内含有4个保守His残基和两个分别位于膜两侧的血红素基团，它们在细胞色素b561行使功能时发挥重要作用，家族基本结构特征保守表明这些蛋白的作用模式和生理功能可能非常相似(Asard et al.,2013)。CYB561家族根据是否含有多巴胺β-单加氧酶N-末端(DOMON)额外结构域，分为简单CYB561s成员和CYBDOMs成员(Tsubaki et al.,2005；Asard et al.,2013)。CYB561s最初在哺乳动物分泌儿茶酚胺的囊泡中发现，后被发现在植物中广泛存在(Flatmark and Terland,1971；Asard et al.,1989；Askerlund et al.,1989；Asard etal.,2000)。在植物中目前鉴定到拟南芥基因组中存在16个CYB561家族成员，二倍体雷蒙德氏棉中有20个CYB561家族成员，四倍体陆地棉中有CYB561家族成员34个，水稻中有11个CYBDOM家族成员(Tsubaki et al.,2005；曾建国，2019；Deng et al.,2023)。CYB561家族基因在植物中的数量远多于在动物，暗示着CYB561家族基因可能在植物体内有着重要且广泛的功能。

在动物中，CYB561s主要作为跨膜电子传递体帮助AsA跨膜传递电子，促进膜另一侧MDHA再生为AsA以及为Fe³⁺跨膜还原传递电子等(Vargas et al.,2003；Bérczi et al.,2005；Bérczi et al.,2013)。牛嗜铬颗粒膜中的CYB561参与跨膜AsA再生，维持AsA依赖的儿茶酚胺生物合成(Njus et al.,1987)。小鼠十二指肠上皮细胞细胞膜中CYB561，响应缺氧和缺铁(Su and Asard,2006)。植物中的CYB561s有着与动物CYB561s相似的功能(Asardet al.,1989；Askerlund et al.,1989)。拟南芥液泡膜上的TCytb/CYB561B1具有与动物CYB561s相似的结构特征和生理生化特征，经预测其内部含有AsA结合位点，同时具有降低液泡腔中Fe³⁺浓度的功能(Asard et al.,2013)；拟南芥液泡膜上的CYB561A可作为AsA依赖性可逆跨膜MDHA氧化还原酶发挥作用(Gradogna et al.,2023)；菜豆CYB561s可能是位于质膜(PM)的跨膜电子传递体，协助胞外AsA再生，帮助植物应对气态氧化剂(臭氧、NOx)造成的氧化应激(Asard et al.,1992)；关于大豆中CYB561s和玉米CYB561B1的研究认为，结构域内血红素附近带正电荷的残基可能促进AsA和MDHA的相互作用(Bursey and Poulos,2000；Lad et al.,2002；Nakanishi et al.,2009)。大豆PM上的CYBDOM介导电子从细胞内电子供体AsA到细胞外电子受体FeCN或铁螯合物FeNTA(Picco et al.,2015)。植物蛋白质组学认为质膜CYBDOMs蛋白在某些情况下与脂筏相关(Sun et al.,2008；Lefebvre etal.,2007)。综上，大多数研究认为植物细胞色素b561家族基因主要功能与动物细胞色素b561家族基因相同，均为参与AsA跨膜电子传递、参与MDHA再生AsA过程和参与Fe³⁺跨膜转运，但该家族基因在棉花中的功能未见报道。

植物细胞色素b561家族基因参与植物应对非生物胁迫的报道较少，西瓜质膜上CYB561B在干旱和高光胁迫下上调表达(Nanasato et al.,2005)；水稻中位于PM和内质网的OsCYBDOMG1在水稻耐盐、植株生长和产量的调节中发挥着重要作用，突变该基因使植物体内AsA含量和脱氢抗坏血酸比率(AsA/DHA)降低，进而导致H₂O₂积累、植物耐盐性降低、植物生长和粮食产量严重受到影响(Deng et al.,2023)，细胞色素b561家族基因参与植物应对生物胁迫未见报道。

本实验室通过黄萎病菌诱导后棉花根部转录组测序结果，发现参与抗坏血酸再生过程的基因GhVdR1，受黄萎病菌诱导后表达水平显著下调；而在棉花中瞬时沉默该基因后，植株的抗病性显著增强。进一步以异源四倍体陆地棉材料W0为受体创制了稳定的GhVdR1下调表达材料和过表达材料。该基因干扰表达和过表达对棉花的纤维产量和品质没有显著影响。GhVdR1基因编码细胞色素b561蛋白(CYB561)，位于棉花第11号部分同源染色体上，A/D亚组各一个拷贝，分别为GH_A11G1488和GH_D11G1514，同源性高。通过接菌黄萎病抗性鉴定，结果表明，GhVdR1干扰植株具有显著提高的黄萎病抗性，过表达对棉花抗病性没有显著影响。

棉花黄萎病危害巨大，治理困难，而占全球种植面积90％以上的陆地棉抗源匮乏。鉴于此，GhVdR1的发现及抗病分子机理研究，可以拓宽对棉花黄萎病抗性的认识。通过调控目标基因的表达，实现精确调控棉花生长和抗病之间的平衡，培育抗性显著提高的新种质并在生产上应用，为棉花抗黄萎病育种提供理论和材料基础。

发明内容

本发明的目的是提供棉花GhVdR1基因或与GhVdR1基因相关的生物材料在提高棉花黄萎病抗病性或培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质中的应用。以此基因为靶基因，通过RNAi干扰技术证明了干扰表达GhVdR1可以显著提高植株对黄萎病的抗性。以此基因为靶基因，培育生长发育正常，棉纤维产量、品质与对照无显著差异的沉默、干扰或抑制所述棉花GhVdR1基因表达的生物材料，实现其在提高棉花抗病性或培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种提高棉花抗黄萎病的方法。

本发明的又一目的在于提供一种棉花GhVdR1基因，并提供该基因在陆地棉品种TM-1的中的全长cDNA ORF核苷酸序列及编码的氨基酸序列。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明请求保护如SEQ ID NO.1所示的棉花CYB561家族GhVdR1基因或与GhVdR1基因相关的生物材料在如下(a1)或(a2)中的应用：

(a1)提高棉花黄萎病抗病性；

(a2)培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质。

进一步，所述的与GhVdR1基因相关的生物材料为如下(b1)或(b2)或(b3)所述的生物材料：

(b1)所述GhVdR1基因编码的蛋白GhVdR1；

(b2)含有所述GhVdR1基因的生物材料；

(b3)用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR1基因的生物材料。

更进一步，(b1)中所述GhVdR1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

更进一步，(b2)中所述的含有所述GhVdR1基因的生物材料为如下(c1)～(c6)中的至少一种：

(c1)含有所述GhVdR1基因的表达盒；

(c2)含有所述GhVdR1基因的重组载体、或含有(c1)所述表达盒的重组载体；

(c3)含有所述GhVdR1基因的重组微生物、或含有(c1)所述表达盒的重组微生物、或含有(c2)所述重组载体的重组微生物；

(c4)含有所述GhVdR1基因的转基因植物细胞系、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

(c5)含有所述GhVdR1基因的转基因植物组织、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物组织；

(c6)含有所述GhVdR1基因的转基因植物器官、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物器官。

更进一步，(b3)中所述用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR1基因的生物材料为如下(d1)～(d4)中的至少一种：

(d1)所述GhVdR1基因的干扰片段或沉默片段；

(d2)用于扩增(d1)所述GhVdR1基因干扰片段或沉默片段的引物；

(d3)所述GhVdR1基因的干扰表达载体或沉默载体；

(d4)含有如(d3)所述干扰表达载体或沉默载体的重组微生物。

进一步，上述的应用为通过抑制棉花GhVdR1基因的表达量或降低棉花GhVdR1基因编码的蛋白GhVdR1的水平(活性或含量)提高棉花抗病性。更进一步，所述的抑制棉花GhVdR1基因的表达量的过程为：构建该基因的干扰表达载体，通过农杆菌介导法将构建的干扰表达载体转化棉花，获得GhVdR1基因表达显著降低的棉花材料。

第二方面，本发明请求保护一种提高棉花抗病性的方法，通过抑制所述棉花GhVdR1基因的表达量或降低由棉花GhVdR1基因编码的蛋白GhVdR1的水平(活性或含量)提高棉花黄萎病抗病性。

第三方面，本发明请求保护一种棉花细胞色素b561家族的GhVdR1基因，该基因具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

第四方面，本发明请求保护由所述的GhVdR1基因编码的蛋白，该蛋白具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

第五方面，本发明请求保护与所述棉花GhVdR1基因相关的生物材料，该生物材料为含有所述GhVdR1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌；或用于沉默、干扰或抑制所述棉花GhVdR1基因的生物材料；具体为含有所述棉花GhVdR1基因的干扰或沉默特异性片段的重组载体、表达盒和重组菌。

本发明克隆一种棉花细胞色素b561家族的GhVdR1基因，该基因的ORF序列如SEQID NO.1所示。该基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。研究发现，抑制所述GhVdR1基因的表达能显著提高棉花对黄萎病的抗性。将目标基因的干扰或沉默表达载体导入现有的推广品种中，对推广品种进行棉花抗病性改良。本发明的具体实施方式中，以所述的棉花GhVdR1基因为靶基因，通过基因干扰方法，抑制GhVdR1基因表达，培育棉花抗病性显著改良的新种质并在生产上应用。

本发明的优点表现在：

(1)首次对棉花中的GhVdR1基因进行系统的序列结构、表达模式及功能分析，明确GhVdR1在棉花生长发育及抗病性中的重要作用。

细胞色素b561在植物基因功能研究中被广泛报道参与抗坏血酸再生和Fe³⁺还原，有报道称其可以通过调节抗坏血酸的含量影响植株体内ROS，进而参与植物抵御非生物胁迫，其在植物抗病中未见报道。本发明所克隆的GhVdR1基因，前人未曾研究过其在棉花中功能。我们通过系统的分子生物学实验证实了棉花中GhVdR1表达水平的下降对植株产量和纤维品质影响较小。干扰表达GhVdR1植株通过降低抗坏血酸再生关键基因表达量，降低抗坏血酸含量和抗坏血酸氧化还原效率，增加H₂O₂的含量，增强植株抗病性。研究结果揭示了棉花中GhVdR1调控植物生长发育及黄萎病抗性的分子机制，也为进一步探究植物如何精准平衡生长-免疫的研究方向提供了新思路与参考。

(2)首次对喷施抗坏血酸的植株进行抗病性鉴定，明确抗坏血酸在棉花抗病性中的重要作用。

外施抗坏血酸后野生型陆地棉W0和与野生型相比具有较强抗病性的干扰表达GhVdR1植株的抗病性，与喷施水的植株相比显著增强，表明抗坏血酸外施降低植株抗病性。这一结果既为GhVdR1抗病机理解析提供进一步补充，又为棉花抗病分子育种提供新思路。

附图说明

图1GhVdR1相关的GhB561s家族成员表达特征分析

a：GhB561s在TM-1不同组织器官中的表达特征分析：棉花TM-1中根、茎、叶、花瓣、雄蕊，-3、0和3DPA胚珠，5、10、20和25dpa纤维取样用于转录组分析，用log₂(FPKM)值表示GhB561s基因表达水平，基因表达水平高低参照比例尺。b：GhB561s在黄萎病菌诱导后的表达特征分析：棉花TM-1根部受黄萎病菌处理后0h、6h、12h、24h、48h和72h，取样用于转录组分析。图中数据以0h为标准，在6h、12h、24h、48h和72h分别计算相对表达差异倍数，基因表达水平高低参照比例尺。

图2GhVdR1结构分析和表达特征分析

a：GhVdR1基因结构分析。b：GhVdR1在TM-1中不同组织和器官中的表达特征分析：棉花TM-1根、茎、叶、花瓣、雄蕊，-3，0，3DPA胚珠，5，10，20，25和25dpa纤维取样用于转录组分析，基因表达水平参照比例尺。c：GhVdR1在黄萎病菌诱导下的表达特征，误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表其他时期基因的表达水平与0h相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。

图3GhVdR1相关的CYB561s结构域和跨膜结构域在各个物种中高度保守

单子叶植物：Si:谷子；Sb:高梁；Bd:二穗短柄草；Os:水稻；Zm:玉米。双子叶植物：Tc:可可；Gh:陆地棉；At:拟南芥；Pt:杨树；Vv:葡萄；Gm:大豆。

a：CYB561s进化分析。b：CYB561s结构域。c：CYB561s序列比对。

图4GhVdR1主要定位于高尔基体膜，内质网和细胞膜也有定位

GmMan1是高尔基体标记蛋白，HDEL:RFP是内质网标记蛋白，AtPIP2A是细胞膜标记蛋白。a：GhVdR1与内质网Marker共定位。b：GhVdR1与高尔基体Marker共定位。c：GhVdR1与膜Marker蛋白共定位。通过在800mmol/L甘露醇中孵育2.5小时对烟草表皮细胞进行质壁分离，白色箭头标记质壁分离后的细胞膜。

图5GhVdR1转基因纯系材料鉴定

a：pART27-pKANNIBAL-GhVdR1和pCAMBIA2301-GhVdR1转基因材料部分PCR鉴定结果。b：GhVdR1转基因纯系材料基因表达量。误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表其他材料中基因的表达水平与W0相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。

图6干扰表达GhVdR1显著提高棉花抗病性

a：接菌后15天和20天GhVdR1转基因植株和W0植株发病表型。b：接菌后11天、15天、20天和25天GhVdR1转基因植株和W0植株病叶发病率统计。c：茎部真菌积累观察。d：转基因植株茎部真菌恢复分析。e：转基因植株根部真菌生物量。误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表每个时期其他材料与W0相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。

图7GhVdR1在调控植物氧化还原反应中发挥重要作用

a：GhVdR1干扰株系RNAi1701和W0在水处理和病处理下差异基因数目统计。b：GhVdR1干扰株系RNAi1701和W0在水处理和病处理下差异基因数目韦恩图。c：RNAi1701-R-WvsW0-R-W上调差异表达基因GO富集分析。d：RNAi1701-R-WvsW0-R-W下调差异表达基因GO富集分析。e：RNAi1701-L-WvsW0-L-W上调差异表达基因GO富集分析。f：RNAi1701-L-WvsW0-L-W下调差异表达基因GO富集。

图8GhVdR1参与调控棉花抗坏血酸再生过程

a：AsA-GSH循环和抗坏血酸合成途径中关键基因模式图。b：干扰表达GhVdR1转录组中AsA-GSH循环和抗坏血酸合成途径中关键基因表达量分析，FPKM值代表基因的表达水平，基因表达水平高低参照比例尺。c：GhVdR1转基因植株和W0植株叶片还原型抗坏血酸(AsA)含量。d：GhVdR1转基因植株和W0植株叶片氧化型抗坏血酸(DHA)含量。e：GhVdR1转基因植株和W0植株叶片还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸的比率(AsA/DHA)含量。f：GhVdR1转基因植株和W0植株叶片H₂O₂含量。误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表其他材料与W0相比有显著性差异，小写字母代表材料相互间有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，a,b,c为显著性等级，t检验)。

图9外施抗坏血酸和谷胱甘肽降低GhVdR1干扰植株抗病性

a：外施AsA、GSH和ddH₂O的GhVdR1转基因植株和W0植株发病表型。b：外施AsA、GSH和ddH₂O的GhVdR1转基因植株和W0植株病叶发病率统计。c：外施AsA、GSH和ddH₂O的GhVdR1转基因植株和W0植株茎部真菌的积累观察。误差线表示30个生物学重复平均值±标准误。小写字母代表材料相互间有显著性差异(a,b,c为显著性等级，t检验)

图10干扰表达GhVdR1对棉花生长发育无负面影响

a：GhVdR1转基因植株株高。b：GhVdR1转基因植株株型。

具体实施方式

实施例1

(一)棉花细胞色素b561家族基因鉴定及表达模式分析

细胞色素b561家族基因具有保守的B561(PF03188)结构域，据此在Pfam蛋白数据库(http://pfam.xfam.org/)进行检索，使用HMMER 3.0和SeqHunter 1.0软件在已经释放的棉花基因组数据库：二倍体雷蒙德氏棉(DD,G.raimondii)和四倍体陆地棉(AADD,G.hirsutum acc.TM-1)中提取并注释CYB561s基因，雷蒙德氏棉基因数据来源于https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#，陆地棉基因数据来源于http://mascotton.njau.edu.cn。使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)、NCBI网站(https://bl ast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/smartBlast.cgi？CMD＝Web)对CYB561s基因核心结构域进行验证，最终在雷蒙德氏棉和陆地棉TM-1中分别鉴定到25和47个CYB561s基因，基因数目整体符合二倍体和四倍体间倍数关系(表1)。对雷蒙德氏棉中25个CYB561s基因命名，并使用MEGA 5.2(http://www.megasoftware.net/)采用最大似然法构建系统进化树。依进化树顺序根据实验室已有的陆地棉TM-1组织器官转录组数据和植物根部受黄萎病诱导后转录组数据，使用MEV4.9(http://en.bio-soft.net/chip/MeV.html)分析CYB561s基因在陆地棉TM-1不同组织器官中的表达情况。选取营养器官(根、茎和叶)、花组织(花瓣和雌蕊)、胚珠(-3、0和3dpa)和纤维组织(5、10、20和25dpa)的转录组数据进行组织器官表达特征分析，结果显示CYB561s表达模式大致分两类，一类呈组成性表达，另一类是在各组织中均不表达(图1a)。进一步分析CYB561s在黄萎病菌诱导后的表达模式，在黄萎病菌诱导后0h、6h、12h、24h、48h和72h的陆地棉TM-1根部转录组数据中，受诱导的CYB561s基因较少(图1b)。其中仅有GhVdR1在各组织器官中表达量比较高且受黄萎病菌诱导显著下调表达，其在棉花对黄萎病菌的抗性中可能发挥重要作用。

表1棉花CYB561s基因名称与编号对应信息表

(二)GhVdR1的表达特征和进化分析

GhVdR1基因位于棉花第11号部分同源染色体上，A/D亚组各一个拷贝，同源性高。该基因ORF全长为1197bp，含有2个内含子，编码398个氨基酸(图2a)。对GhVdR1的黄萎病诱导表达特征及在棉花各个组织器官中的表达特征进行分析，发现GhVdR1在茎、胚珠与纤维中表达量较高，且GhVdR1显著受黄萎病诱导(图2b,c)(引物序列见表3)。

通过结构域验证，GhVdR1属于细胞色素b561家族。根据GhVdR1蛋白序列，在几种研究较为深入的植物基因组中及与棉花同源性较高的植物释放到NCBI网站上的基因组数据中检索GhVdR1直系同源蛋白(表2)，发现GhB561s广泛存在于各个植物中，进化分析结果显示与棉花GhVdR1同源性最高的是可可和拟南芥中的CYB561s(图3a)。对10个物种中检索到的CYB561s和GhVdR1进行同源比对，发现B561结构域和跨膜结构域在各个物种中高度保守(图3b,c)，说明GhVdR1在功能上可能与其他植物存在相似性，如拟南芥中CYB561s的功能报道可作为研究的重要参考。

表2GhVdR1Dt同源CYB561s基因名称与对应编号信息

表3实验所用引物

(三)GhVdR1亚细胞定位

去除目的基因GhVdR1 ORF的终止密码子后，在CE Design V1.03软件中设计重组引物，以陆地棉遗传标准系TM-1的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增反应结束后加入10×Loading buffer 2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶回收，具体步骤参见胶回收试剂盒说明书。将pBINGFP4载体质粒进行酶切，之后与目标片段置于PCR仪中37℃反应30min进行重组反应。30min后立即取出放于冰上，将重组产物转化大肠杆菌感受态，涂平板后放置于37℃培养箱倒置培养12h。从平板上挑取单克隆，放入含有700μL对应抗生素的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养5-6h。以菌液为模板，载体上的通用引物进行PCR扩增，跑胶后，将阳性菌液进行测序，测序序列正确的菌液提取质粒，并转入LBA3101农杆菌中。将混合好的菌液从烟草叶片的背面进行注射，烟草暗培养12-16h后正常培养2-3天，用激光共聚焦显微镜(Zeiss,LSM780,德国)对目标蛋白的定位进行观察，空pBin-GFP做对照。

GhVdR1表达的绿色荧光与高尔基体定位的Marker基因(GmMan1)表达的红色荧光能够较好重叠，与膜Marker基因(AtPIP2A)、内质网Marker基因(HDEL:RFP)表达的红色荧光也能够部分重叠。结果表明GhVdR1主要定位在高尔基体膜上，细胞膜和内质网上的信号可能因高尔基体运动而存在。对质壁分离后的细胞进行荧光信号观察，观察到GhVdR1绿色信号主要分布在胞内，说明GhVdR1不具有分泌特性(图4)(引物序列见表4)。

表4实验所用引物

(四)干扰表达GhVdR1显著提高棉花抗病性

我们构建了包含GhVdR1特异的339bp片段正向序列和反向序列插入的干扰载体pART27-pKANNIBAL-GhVdR1，包含GhVdR1全长CDS的序列插入过量表达载体pCAMBIA2301-GhVdR1，转入农杆菌并侵染棉花，经过多年鉴定和自交繁种，最终获得RNAi1701、RNAi1704和RNAi1705三个纯合的GhVdR1干扰表达株系和OE1601和OE1611两个纯合的GhVdR1过表达株系(图5a)。为检测GhVdR1在体内的表达水平，对这五个株系T5代的叶片进行取样提取RNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR实验。结果显示GhVdR1在三个干扰表达株系中的表达量与对照植株W0相比显著降低，在两个过表达株系中的表达量显著升高(图5b)(引物序列见表5)。

表5实验所用引物

靶标片段(339bp)序列：

TCCCTCACCTGTTCCTCCCAGAAGTTTACGAAAAACCAAGTTTACTCCAACTGCCTCGACCTTCCTTCTCTCGCCTCTTACCTCCACTTCACTTACGACCCTTCTAACACTACTCTCTCCGTCGCCTTCATCTCTACTTCTTCCAAACCCGGCGGATGGATTTCCTGGGCCATAAATCCCAACGCCACAGGCATGGCCGGTTCCCAAGCACTCGTTGTGTACAAAAACTCCACCACCGGCGTTGCCGTCGTGCATACTTTTGACATCAGCTCTTATTCTTCAATTGTGCCGAAGGATTTGTCGTTCGAAGTTCCAGATAAAACGGCGGAGACTAGAAGC(SEQ ID NO.3)

为探究GhVdR1在棉花抗黄萎病菌中的作用，对获得的转基因材料进行抗病性鉴定。棉花幼苗培养于同一温室，使用营养土培养，温室光温条件设置：光照培养28℃、16h，黑暗培养25℃、8h，湿度70％。黄萎病菌V991孢子悬浮液通常保存在-80℃冰箱，使用时先在土豆培养基(PDA)上活化并置于25℃培养7天，再在超净台中将菌落切入液体察氏培养基中25℃、180rpm震荡培养7天(CPK培养基：1000mL ddH₂O中加2g NaNO₃、0.5g KCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、1.31g K₂HPO₄·3H₂O、0.1g FeSO₄·7H₂O和30g Sucrose，调pH至7.2，高压蒸汽锅灭菌121℃，20min)，通过孢子计数法确定菌液浓度，最终将菌液精确稀释至1×10⁷孢子/毫升用于接种棉花(Gao et al.,2013)。当棉花植株生长至“两叶一心”期时采用伤根法接种黄萎病菌，每株接30mL菌液(Wang et al.,2011)，病叶率调查时以接种黄萎病菌当日为0d，接菌第11d、15d、20d和25d进行发病情况统计，计算病叶发病率并拍照记录。具体调查方法为：统计材料每株病叶数和叶片总数，按照发病率＝发病叶片数/总叶片数计算每株发病率，据此拍照记录植株表型。结果显示在接菌后第15天，对照W0植株叶片出现明显黄化表型，病叶率为58％；过表达GhVdR1转基因株系OE1603和OE1611植株叶片均出现明显黄化表型，发病率分别为46％和47％；而GhVdR1干扰株系RNAi1701和RNAi1705植株叶片仅出现少许黄斑，发病率分别为16％和26％。在接菌后第20天，对照W0植株只剩不到10片叶片，发病率为87％；过表达GhVdR1转基因株系OE1603和OE1611植株叶片大部分枯萎，剩余叶片均出现明显黄化表型，发病率分别为78％和72％；而GhVdR1干扰株系RNAi1701和RNAi1705植株枯萎叶片较少，大部分叶片出现明显黄斑，发病率分别为42％和53％。且GhVdR1干扰植株病叶率在各个时间段均显著低于对照植株，GhVdR1过表达植株病叶率与对照相比均没有显著差异，说明干扰表达GhVdR1显著提高了陆地棉抗病性，过表达GhVdR1对陆地棉抗病性没有影响(图6a,b)。

进一步对病原菌处理后第15天GhVdR1干扰株系RNAi1701和RNAi1705的植株和过表达GhVdR1转基因株系OE1603和OE1611的植株进行维管组织真菌积累观察实验、真菌复苏实验和真菌含量测定实验，观察和检测棉花植株茎部和根部微菌核积累情况。实验操作具体如下：(1)维管组织真菌积累观察：棉花接菌后观察棉花发病情况，在棉花发病率差异较大的时期(一般为接菌后15d)取棉花幼苗子叶节以上茎段，在距子叶节1cm位置对新鲜茎段进行斜切，尽量保证切口平滑，对切口用超景深体视镜(Olympus MVX10，日本东京)观察拍照，维管柱中黑色素沉积多少代表黄萎病菌侵入植株量多少，这一结果可佐证抗病性鉴定结果；(2)真菌复苏实验：棉花接菌后根据棉花发病情况，在植株发病率差异较大的时期(一般为接菌后15d)取棉花幼苗子叶节以上茎段，将其横切后得到长度约为1.5cm的新鲜茎段，茎段用70％酒精消毒2次，用灭菌水清洗5次，置于加入34mg/L氯霉素的PDA培养基培养5d，观察茎段两端黄萎病菌复苏情况，若菌落较多较大说明该植株中定殖的黄萎病菌较多，这一结果可佐证抗病性鉴定结果；(3)真菌含量测定：棉花接菌后根据棉花发病情况，在植株发病率差异较大的时期(一般为接菌后15d)取棉花幼苗根，提取样品DNA，以此DNA为模板通过qRT-PCR检测根部病原菌含量，黄萎病菌测定片段为核糖体DNA的内部转录间隔区(ITS)，内标基因为棉花基因GbHis3。结果显示，GhVdR1干扰植株茎部积累的微菌核和黑色素较少，GhVdR1过表达植株和对照W0植株茎部积累了大量微菌核和黑色素(图6c)；GhVdR1干扰植株茎段两端在PDA培养基上仅生长出少量黄萎病菌菌落，过表达GhVdR1植株和对照W0植株茎段两端均生长出大量菌落(图6d)；GhVdR1干扰植株根部真菌含量与对照相比显著减少，GhVdR1过表达植株根部真菌生物量与对照相比没有显著差异(图6e)。以上结果再次证明，干扰表达GhVdR1显著提高植株抗病性，过表达GhVdR1对植株抗病性并无影响。

(五)GhVdR1参与调控棉花抗坏血酸再生过程

为了进一步揭示GhVdR1调节棉花抗病性的分子机制，分别取病原菌处理3天和同时期水处理下GhVdR1干扰株系RNAi1701植株和对照W0植株根部以及同时期未经病处理的RNAi1701和W0植株叶片，提取RNA进行转录组测序。测序时3个单株的混样为一个样品，设置五个生物学重复；提取样品RNA后，RNA浓度及质量用“one drop spectrophotometer OD-1000+”分光光度计检测，RNA完整性用琼脂糖凝胶电泳检测，最终挑选质量较好的RNA送至诺禾致远公司进行转录组测序。测序结果返回后使用NGS QC工具对数据进行预处理，删去低质量和污染序列；使用带有默认参数的Hisat2将处理后的序列回帖到陆地棉W0基因组，得到不同处理的TPM值和reads数(Hu et al.,2019)；使用网站https://www.omicshare.com/对所有的测序数据进行差异基因挖掘，以表达倍数≥1.5倍且FDR(false discovery rate)多重校验值q-value≤0.05两个参数来判定差异表达基因；病挑选差异表达基因进行qRT-PCR验证，以log₂Fold change(qRT-PCR)为横坐标，log₂Foldchange(RNA-seq)为纵坐标，作线性回归方程。根据线性回归方程R²值判断转录组数据是否真实可靠。得到以下转录组数据，分别为RNAi1701-R-W(根、H₂O)、RNAi1701-R-V(根、V991)、W0-R-W(根、H₂O)、W0-R-V(根、V991)、RNAi1701-L-W(叶、H₂O)和W0-L-W(叶、H₂O)。结果显示RNAi1701植株受病诱导的差异基因数目少，且水处理条件下RNAi1701和W0植株便表现出明显的差异，差异基因数目与病处理下差异基因数目大部分相同(图7a,b)。说明干扰表达GhVdR1棉花抗病是因为干扰材料基础抗性增加，而不是诱导抗性变强。

对水处理下RNAi1701和W0植株根和叶的差异基因中上调表达和下调表达的基因分别进行GO富集分析。结果显示：根和叶中上调表达和下调表达的差异基因均显著富集到与氧化还原反应相关的功能条目，如：铁离子结合、血红素结合、单加氧酶活性、氧化还原酶活性、双加氧酶活性、有机环化合物结合等(图7c～f)。说明GhVdR1在调控植物氧化还原反应中发挥重要作用。

GhVdR1在拟南芥中的同源基因CYB561s被报道参与AsA再生，抗坏血酸再生以及抗坏血酸与谷胱甘肽组成的AsA-GSH循环在氧化还原反应中发挥重要作用，因此棉花中的GhVdR1可能参与调控植物体内抗坏血酸再生，并通过调控抗坏血酸含量调控棉花体内的氧化还原反应。为了探索GhVdR1与抗坏血酸可能的联系，在GhVdR1干扰株系RNAi1701植株和对照W0植株叶片转录组中(叶片为植物抗坏血酸合成及再生的主要器官)，对AsA再生途径中关键基因、AsA-GSH循环途径关键基因和AsA合成途径关键基因的表达进行了分析(图8a)，结果显示大多数AsA再生途径中关键基因在干扰表达GhVdR1后下调表达，而大多数AsA合成途径关键基因表达量并没有受到GhVdR1表达量降低的影响(图8b)。说明棉花中的GhVdR1可能会通过影响AsA的再生途径来调控植株体内的抗坏血酸含量。

基于以上分析，为验证GhVdR1是否影响了植株体内抗坏血酸的水平，对对照W0、GhVdR1干扰株系RNAi1701、RNAi1704、RNAi1705和过表达GhVdR1转基因株系OE1603和OE1611的棉花叶片分别进行取样，采用高效液相色谱法(HPLC)(李妍，2006)测定还原型抗坏血酸(AsA)含量和氧化型抗坏血酸(DHA)含量以及还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸的比率(AsA/DHA)。实验操作如下：取“两叶一心”期棉花的第二片真叶，在液氮中充分研磨后快速称取0.2-0.5g粉末于1.5mL体积分数为0.1％的草酸中，称好的样品需充分混匀并置于冰上；离心后使用0.22μM的有机滤液过滤器将上清液加入新离心管中，并定容至2mL待用；取100μL备好的液体和100μL ddH₂O混匀后加入到液相小棕瓶中测定样品中AsA含量；取100μL滤液和100μL的20mg/mL DTT溶液混匀，暗处理15min后加入到液相小棕瓶中测定样品中Total-AsA含量；实验仪器使用的液相色谱流动相为0.1％乙酸，流速1mL/min，进样20μL柱温30℃，检测波长245nm；标样浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。结果显示GhVdR1干扰株系RNAi1701、RNAi1704、RNAi1705的AsA含量和AsA/DHA比率与对照相比显著降低，DHA含量与对照相比没有显著差异，而过表达GhVdR1的转基因株系OE1603和OE1611中AsA含量、DHA含量和AsA/DHA比率与对照相比均无显著差异(图8c～e)。综上结果表明GhVdR1参与调控植株AsA再生途径和抗坏血酸氧化还原效率。

抗坏血酸是植物体内最重要的抗氧化物质之一，主要清除植物体内多余的H₂O₂。因此对对照W0、GhVdR1干扰株系RNAi1701和RNAi1705和过表达GhVdR1转基因株系OE1603和OE1611的棉花叶片取样并测定H₂O₂含量。H₂O₂含量测定采用分光光度法：取“两叶一心”期棉花的第二片真叶，在液氮中充分研磨，快速称取0.1g植物组织粉末使用过氧化氢检测试剂盒测定含量，试剂盒购于南京建成生物工程研究所(A064-1-1)，具体操作方法见使用说明书。结果显示GhVdR1干扰株系RNAi1701和RNAi1705中的H₂O₂含量与对照相比显著提高，过表达GhVdR1的转基因株系OE1603和OE1611中的H₂O₂含量与对照相比无显著差异。表明，GhVdR1参与调控植物体内H₂O₂含量(图8f)。

过表达植株抗病性、抗坏血酸含量和H₂O₂含量与对照相比均无显著差异，可能与GhVdR1以电子传递体形式参与抗坏血酸再生过程有关，其过表达不影响上游电子供体的含量，故不影响抗病性。

综上，GhVdR1参与调控棉花中抗坏血酸再生过程，干扰GhVdR1后植株体内抗坏血酸再生途径关键基因下调表达，抗坏血酸含量降低，H₂O₂含量升高，植物抗病性提高。

(六)外施抗坏血酸和谷胱甘肽降低GhVdR1干扰植株抗病性

抗坏血酸再生途径与谷胱甘肽循环途径共同组成的AsA-GSH循环是植物中主要的抗氧化系统。为明确AsA和GSH在棉花黄萎病抗性中的作用，完善GhVdR1抗病机理，我们分别对接菌后的GhVdR1干扰株系RNAi1701和对照W0外施AsA和GSH，分别以外施水的RNAi1701和W0为对照进行抗病性鉴定。实验具体操作为：在W0和转基因植株接菌后3d、7d、11d和15d，向叶片分别喷施200μmol/L GSH和50mg/L AsA，以水处理为对照在接菌后第11天、15天、20天、25天对植株进行发病表型观察与病叶率统计。结果显示在接菌后第20天，对照W0植株、外施GSH的W0植株和外施AsA的W0植株绝大部分叶片枯萎脱落，剩余叶片均出现明显黄化表型，病叶率分别为88％、88％和86％；对照RNAi1701植株少量叶片枯萎，剩余叶片出现明显黄斑，发病率为57％；外施GSH的RNAi1701植株大部分叶片枯萎，剩余叶片均出现明显黄化表型，发病率为73％；外施AsA的RNAi1701植株绝大部分叶片枯萎，剩余叶片均出现明显萎蔫，发病率为91％。且在各个时间段外施AsA的RNAi1701植株和外施GSH的RNAi1701植株病叶率均显著高于对照RNAi1701，在接菌后第11天、第15天和第25天，外施AsA的RNAi1701植株的病叶率显著高于外施GSH的RNAi1701植株(图9a,b)。这些结果共同说明AsA和GSH外施显著降低GhVdR1干扰植株对黄萎病菌的抗病性，其中AsA对植株抗病性的影响比GSH对植株抗病性的影响更大。另外接菌后第11天的病叶率统计结果显示，外施AsA和GSH显著提高W0植株的发病率，说明AsA和GSH外施显著降低植株抗病性。

进一步对病原菌处理后第15天的对照W0植株、外施GSH的W0植株、外施AsA的W0植株、对照RNAi1701植株、外施AsA的RNAi1701植株和外施GSH的RNAi1701植株进行劈秆实验，观察棉花植株茎部微菌核积累情况。结果显示对照W0植株、外施GSH的W0植株、外施AsA的W0植株茎部积累了大量微菌核和黑色素，对照RNAi1701植株茎部积累的微菌核和黑色素较少，外施AsA的RNAi1701植株茎部也积累了大量微菌核和黑色素，外施GSH的RNAi1701植株微菌核和黑色素积累量介于对照RNAi1701植株茎部积累量和外施AsA的RNAi1701植株茎部积累量之间(图9c)。以上结果再次证明，AsA和GSH均降低GhVdR1干扰植株抗病性。AsA负调控植株抗病性这一结论，为GhVdR1干扰植株通过降低AsA含量提高植株抗病性这一结论提供了进一步证据。

(七)GhVdR1转基因材料表型性状调查

田间测量生长至80d时对植株株高进行测量，每个克隆测量20株，取平均值作为该克隆株高，结果显示GhVdR1干扰植株和GhVdR1过表达植株株高与对照W0相比均没有显著差异(图10a)。

成熟期在田间观察植株株型，结果显示GhVdR1过表达植株株型与对照W0相比没有明显差异，GhVdR1干扰植株与对照W0相比株型更加紧凑，GhVdR1干扰植株的果枝和叶枝集中生长在主茎上部，生长状况更好(图10b)。

在棉铃成熟吐絮后，对GhVdR1转基因株系和对照W0纤维品质相关性状表型进行调查，每个克隆取25个完整的大小相当的成熟铃中的纤维进行成熟纤维品质检测，样品至少设置三个生物学重复；测定指标为纤维长度、纤维强度、整齐度、马克隆值以及伸长率；纤维质量参数由农业农村部纤维质量检验检测中心(中国农业科学院棉花研究所，河南省安阳市)检测；数据测定使用大容量纤维测试系统(Premier HFT 9000，Premier Evolvics PvtLtd，Coimbatore，India)。纤维品质调查结果如下表(表6)。结果显示GhVdR1干扰植株和GhVdR1过表达植株的成熟纤维长度均显著长于W0，干扰表达GhVdR1株系RNAi1704和RNAi1705成熟纤维强度也显著强于W0，GhVdR1干扰植株RNAi1701和RNAi1705以及GhVdR1过表达植株的马克隆值与对照W0相比显著降低，其他纤维品质相关性状没有显著变化。

表6GhB561-11转基因株系与对照W0成熟纤维品质检测

星号代表转基因材料与W0相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)

综上，干扰GhVdR1株系与对照相比株高没有差异，株型更加紧凑，纤维品质明显改良，具有较好的生产利用前景。

Claims (10)

1.如SEQ ID NO.1所示的GhVdR1基因或与GhVdR1基因相关的生物材料在如下(a1)或(a2)中的应用：

(a1)提高棉花黄萎病抗病性；

(a2)培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的与GhVdR1基因相关的生物材料为如下(b1)或(b2)或(b3)所述的生物材料：

(b1)所述GhVdR1基因编码的蛋白GhVdR1；

(b2)含有所述GhVdR1基因的生物材料；

(b3)用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR1基因的生物材料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，(b1)中所述GhVdR1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，(b2)中所述的含有所述GhVdR1基因的生物材料为如下(c1)～(c6)中的至少一种：

(c1)含有所述GhVdR1基因的表达盒；

(c2)含有所述GhVdR1基因的重组载体、或含有(c1)所述表达盒的重组载体；

(c3)含有所述GhVdR1基因的重组微生物、或含有(c1)所述表达盒的重组微生物、或含有(c2)所述重组载体的重组微生物；

(c4)含有所述GhVdR1基因的转基因植物细胞系、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

(c5)含有所述GhVdR1基因的转基因植物组织、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物组织；

(c6)含有所述GhVdR1基因的转基因植物器官、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物器官。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，(b3)中所述用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR1基因的生物材料为如下(d1)～(d4)中的至少一种：

(d1)所述GhVdR1基因的干扰片段或沉默片段；

(d2)用于扩增(d1)所述GhVdR1基因干扰片段或沉默片段的引物；

(d3)所述GhVdR1基因的干扰表达载体或沉默载体；

(d4)含有如(d3)所述干扰表达载体或沉默载体的重组微生物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制棉花GhVdR1基因的表达量或降低棉花GhVdR1基因编码的蛋白GhVdR1的水平提高棉花抗病性。

7.一种提高棉花抗病性的方法，其特征在于，通过抑制权利要求1中所述棉花GhVdR1基因的表达量或降低由棉花GhVdR1基因编码的蛋白GhVdR1的水平提高棉花黄萎病抗病性。

8.一种棉花GhVdR1基因，该基因具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

9.由权利要求8所述的GhVdR1基因编码的蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

10.与权利要求1所述棉花GhVdR1基因相关的生物材料，其特征在于，该生物材料为含有权利要求8所述GhVdR1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌；或用于沉默、干扰或抑制所述棉花GhVdR1基因的生物材料。