CN118703497B - miR1868在调控水稻分蘖和抗病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR1868在调控水稻分蘖和抗病毒中的应用，本方案提供了基因Osa‑miR1868(简称miR1868)和Pre‑miR1868(miR1868前体)在调控植物分蘖和对病毒病抗性中的应用；本方案将编码Pre‑miR1868的DNA分子导入目的的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的分蘖少于受体植物，但是抗病性高于受体植物。说明Pre‑miR1868超量表达减少了植物分蘖，但是提高了植物对病毒病的耐受性。Pre‑miR1868具有调控植物分蘖和病毒抗性的功能，对于培育抗病毒植物，提高植物产量具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及miR1868在调控水稻分蘖和抗病毒中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)起源于热带亚热带地区，是世界上重要的粮食作物，为世界近一半人口的口粮。因此，水稻的高产和稳产事关国计民生。水稻的产量和水稻的株高、分蘖、穗型、籽粒大小和千粒重等农艺性状密切相关。其中，适中的分蘖数、合理的株高、大穗粒多是超级稻的高产优质理想属性，合理控制水稻分蘖数有利于提高水稻的有效穗数和穗粒重量，增加水稻的抗倒伏抗逆等性状，进而提高水稻的总体产量。水稻驯化经历了绿色革命、杂交水稻等过程，现进入了分子设计育种阶段，从遗传学和分子生物学实现培育分蘖适中的水稻是实现“理想株型”的一个重要指标。如在合理范围内提高SPL14蛋白的丰度，会导致水稻分蘖数稍低，但是增加了水稻的产量，还提高了水稻对逆境的耐性，也被称作理想株型基因IPA1，它也是培育超级稻的核心基因。因此，寻找和分离水稻种控制分蘖性状的基因，对于指导分子育种和品种改良具有重要意义。
水稻的稳产受多种生物和非生物胁迫的威胁，其中病虫害是影响水稻产量和质量的重要因素，而培育抗病虫害的水稻品种是从源头上控制病虫害的高效防控策略。水稻病毒病一旦爆发，几乎无有效措施防治，带来的危害巨大。其中大部分的病毒病经由传毒介体昆虫进行传播，这加剧了病毒病的防治难度。水稻锯齿叶矮缩病毒(rice ragged stuntvirus，RRSV)属于呼肠孤病毒科水稻病毒属，感染了RRSV的水稻矮缩、分蘖增多，叶色浓绿，叶片扭曲，呈现锯齿状缺刻，往往不能抽穗，造成水稻绝收，给水稻生产带来了极大威胁。迄今，农业生产中尚未见对RRSV显著抗性的水稻推广品种。有研究发现在水稻中表达RRSV的病毒组分，激活RNA干扰(RNA interfering,RNAi)的转基因水稻能够取得非常显著的抗病毒效果。
小分子RNA(microRNA，miRNA)是RNAi通路中的重要组分，它们与AGO蛋白结合，通过碱基互补配对的方式与靶标结合，调控靶标基因的转录，转录后mRNA的切割和翻译抑制。miRNA广泛调控了植物的生长发育、响应生物非生物胁迫的多个生理生化过程。在水稻的生长发育期中，无论是植株的形态建成，发育时期的转变，抗病抗逆等过程都受到miRNA的调控。目前针对物种和功能保守miRNA的研究较为深入，一些物种和功能特异性的miRNA研究相对滞后，在病毒与水稻互作中miRNA的功能研究报道较少。受病毒侵染诱导的miR1868在水稻与病毒互作中的功能研究尚未见报道。本发明在响应病毒侵染miRNA中筛选到miR1868，并进一步揭示了miR1868在水稻发育和抗病毒中的功能，这对于水稻分蘖和抗病毒性状的改良具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、应用灵活的miR1868在调控水稻分蘖和抗病毒中的应用。
为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种miRNA，设为miR1868，其具有如下a1)或a2)的miRNA：
a1)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的miRNA；
a2)将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的RNA分子具有相同功能或75％以上同一性的miRNA。
一种miRNA前体，设为miR1868前体，其具有如下b1)或b2)的miRNA前体序列：
b1)核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的miRNA前体序列；
b2)将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的RNA分子具有相同功能或75％以上同一性的miRNA前体序列。
基于上述，本方案还提供上调miRNA和/或miRNA前体表达量在降低植物分蘖和/或增强植物对锯齿叶矮缩病毒抗性中的应用，所述的植物为水稻，所述miRNA为如下a1)或a2)的miRNA：
a1)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的miRNA；
a2)将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过核苷酸的取代和/或缺失和或/添加得到的与a1)所示的RNA分子具有相同功能或75％以上同一性的miRNA；
所述miRNA前体具有如下b1)或b2)的miRNA前体序列：
b1)核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的miRNA前体序列；
b2)将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经过核苷酸的取代和/或缺失和或/添加得到的与b1)所示的RNA分子具有相同功能或75％以上同一性的miRNA前体序列。
基于上述，本方案还提供包含上述所述的miRNA或上述所述的miRNA前体的生物材料在调控植物分蘖和/或植物对锯齿叶矮缩病毒抗性中的应用。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，本方案所述生物材料为如下A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述所述miRNA或上述所述miRNA前体的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，本方案A1)所述的核酸分子为如下1)、2)或3)：
1)其前体序列是SEQ ID NO.3所示序列第129-297位所示的基因组DNA分子；
2)与1)限定的基因组DNA分子的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述所述的miRNA或上述所述的miRNA前体的基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的基因组DNA分子的核苷酸序列杂交，且编码上述所述的miRNA或上述所述miRNA前体的基因组DNA分子。
基于上述，本方案还提供上述所述的miRNA或上述所述的miRNA前体或包含上述所述的miRNA或上述所述的miRNA前体的生物材料在培育抗病植物或育种中的应用。
其中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如水稻品种“中花11，ZH11”
作为一种较优的选择实施方式，优选的，本方案所述培育抗病植物或育种为培育分蘖减少和对水稻锯齿叶矮缩病毒抗性增强的植物或植物种子。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，本方案所述分蘖减少是调查孕穗期有效分蘖的数量，经培育的转基因植物的对水稻锯齿叶矮缩病毒抗性增强的体现为如下(1)-(3)中的任一种高于受体植物的特性：
(1)感染病毒后所述转基因植物病毒积累量低于所述受体植物；
(2)所述转基因植物感染病毒后发病症状弱于所述受体植物；
(3)所述转基因植物感染病毒后发病率低于所述受体植物
基于上述，本方案还提供一种培育抗病毒转基因植物的方法，所述转基因植物含有上述所述miRNA和/或上述所述miRNA前体，所述方法包括提高受体植物中所述miRNA或所述miRNA前体的表达量；
其中，所述miRNA设为miR1868，其表达量上调通过向受体植物导入过表达Pre-miR1868的载体而实现；
所述过表达Pre-miR1868的载体是用组成型启动子ACTIN1驱动包含Pre-miR1868的序列表达实现，所述包含Pre-miR1868的序列是SEQ ID NO.3所示序列。
上述方法中，所述提高受体植物中Osa-miR1868(简称miR1868)或Osa-miR1868(简称miR1868)前体序列的表达量的方法是在受体植物中过表达Osa-miR1868前体序列；所述过表达的方法为将Osa-miR1868前体序列导入受体植物；所述Osa-miR1868前体序列是序列3第129-297位所示的基因组DNA分子。
在本方案的其中一实施例中，所述Osa-miR1868前体序列是通过重组载体pCAMBIA2300-ACTIN1-Pre-miR1868导入受体植物中，所述是重组载体重组载体pCAMBIA2300-ACTIN1-Pre-miR1868为在pCAMBIA2300-ACTIN1载体的XbaⅠ和PstⅠ两个限制性内切酶的酶切位点间插入序列4(SEQ ID NO.4)所示的DNA分子，且保持pCAMBIA2300-ACTIN1载体的其他序列不变后得到的载体。
采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案提供了基因Osa-miR1868(简称miR1868)和Pre-miR1868(miR1868前体)在调控植物分蘖和对病毒病抗性中的应用。本方案将编码Pre-miR1868的DNA分子导入目的的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的分蘖少于受体植物，但是抗病性高于受体植物。说明Pre-miR1868超量表达减少了植物分蘖，但是提高了植物对病毒病的耐受性。Pre-miR1868具有调控植物分蘖和病毒抗性的功能，对于培育抗病毒植物，提高植物产量具有重大价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为RRSV诱导miR1868的表达；其利用qRT-PCR分析感染RRSV后水稻中miR1868的积累量，和对照相比，感染了RRSV后，水稻中miR1868的积累量显著升高，表明RRSV的侵染诱导了miR1868的表达。
图2为qRT-PCR检测OX1868和MIM1868转基因水稻miR1868的积累量；其中，图2A显示在过量表达Pre-miR1868的转基因水稻中，miR1868的积累量显著升高；图2B显示在沉默miR1868的转基因水稻中，miR1868的积累量显著降低，结果表明转基因水稻的miR1868受到了调控。
图3为miR1868转基因水稻的发育表型和分蘖数统计；其中，图3A为野生型、OX1868和MIM1868在孕穗期的生长发育表型；图3B为野生型、OX1868和MIM1868的分蘖数统计结果；结果表明OX1868中分蘖数明显减少。
图4为miR1868转基因水稻的病毒病抗性分析；其中，图4A为野生型水稻、OXmiR1868和MIM1868感染RRSV后的发病症状比较；图4B为野生型、OX1868、MIM1868转基因水稻在感染了RRSV后地上部组织中病毒核酸的积累量；图4C为野生型、OX1868、MIM1868转基因水稻在感染了RRSV后地上部组织中病毒外壳蛋白积累量；图4D为野生型、OX1868、MIM1868转基因水稻感染了RRSV发病症状严重程度的比例统计。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。miRNA的MIM载体构建方法参照Yan,J.,Gu,Y.,Jia,X.,Kang,W.,Pan,S.,Tang,X.,Chen,X.,and Tang,G.(2012).Effective small RNA destruction by the expression of ashort tandemtarget mimic in Arabidopsis.Plant cell 24,415-427.
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Osa-miR1868(简称miR1868)的发现和验证
以感染了RRSV的中花11水稻地上部分的RNA样品提取总RNA，构建响应病毒侵染的小分子RNA的高通量测序库，分析和筛选到一个受RRSV诱导表达的miRNA，其名称为Osa-miR1868或简称为miR1868，该miRNA的成熟序列为序列1(SEQ ID NO.1)。以提取的总RNA为模板，在反转录试剂盒基础上，额外添加Osa-miR1868的特异性反转录引物miR1868-RT，利用颈环式反转录方法反转录获得cDNA，稀释5倍作为荧光定量PCR的cDNA模板。用荧光定量引物miR1868-qF和miR1868-qR荧光定量引物，以水稻中U6基因作为内参基因进行荧光定量PCR检测。检测所用引物序列如下：
miR1868-RT(SEQ ID NO.6)：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGCTGmiR1868-Qf(SEQ IDNO.7)：CGTCACGGAAAACGAGGGAG
miR1868-qR(SEQ ID NO.8)：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
U6-qF(SEQ ID NO.9)：CGATAAAATTGGAACGATACAGA
U6-qR(SEQ ID NO.10)：ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT
qRT-PCR结果如图1所示。结果表明：在感染了RRSV的水稻中成熟Osa-miR1868的积累量较对照升高，说明病毒侵染激活了Osa-miR1868的积累。
实施例2miR1868前体序列的克隆
引物的设计
在miRBase(https://www.mirbase.org/)网站搜索关键词Osa-miR1868(简称miR1868)，获得登录号为MI0008270，并获得其前体序列Pre-miR1868(如序列1(SEQ IDNO.1)所示)，前体序列大小是169bp。将Pre-miR1868的前体序列中碱基U替换成T，并以此为模板在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中使用BLAST功能，比对分析其在水稻中的位置，结果显示Pre-miR1868位于水稻品种日本晴的基因组第4号染色体19715448-19715616处，在该区间分别向上下游延伸200bp，得到Chr4:19715248-19715816范围的核酸序列，下载该区间的所有序列，以此作为模板用Primer Premier 5.0设计Pre-miR1868的克隆引物。最终选择了从Pre-miR1868的上游延伸128bp，向下游延伸132bp的区间。引物序列如下：
Pre-miR1868-F(SEQ ID NO.11)：GTTGCCTCCGTGGCTCTATT
Pre-miR1868-R(SEQ ID NO.12)：AATCAAAAGGTGGGCTGAGCT
Pre-miR1868的克隆
提取水稻品种日本晴的基因组，作为Pre-miR1868的扩增模板，用Pre-miR1868-F和Pre-miR1868-R引物，高保真酶进行PCR扩增反应，得到PCR产物。PCR扩增产物大小为429bp，测序证明该片段包含Osa-miR1868的前体序列Pre-miR1868(序列3(SEQ ID NO.3)第129-297位)。
实施例3、植物超量表达miR1868的载体构建
1.利用实施例2中的基因组模板，设计OXPre-miR1868-F和OXPre-miR1868-R引物，用于构建超量表达Pre-miR1868的载体，并分别在前后引物上添加XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点(小写字母)和对应的保护碱基(下划线)，获得引物序列如下：
OXPre-miR1868-F(SEQ ID NO.13):
GCtctagaGTTGCCTCCGTGGCTCTATT
OXPre-miR1868-R(SEQ ID NO.14):
AActgcagAATCAAAAGGTGGGCTGAGCT
2.用限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ对pCAMBIA2300-ACTIN1载体以及步骤1获得的Pre-miR1868片段进行双酶切，37℃充分孵育3小时，回收目标片段。将酶切后的载体和片段在含有T4连接酶的反应液中，16℃孵育8小时，热激转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选含有pCAMBIA2300-ACTIN1-Pre-miR1868的阳性单克隆，在摇菌扩增后，提取质粒，送测序。
3.测序结果显示，重组的双元表达载体pCAMBIA2300-ACTIN1-Pre-miR1868在XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点之间插入了序列3所示的DNA分子，且保持pCAMBIA2300-ACTIN1载体的其他序列不变。
实施例4沉默Osa-miR1868(简称miR1868)功能的载体构建
1.引物设计
以序列1(SEQ ID NO.1)所示的序列为模板，获得其反向互补序列，在反向互补序列中第14和15为核苷酸之间加入cta，并分别在前后引物中添加和48nt骨架序列重叠的接头序列以及限制性内切酶位点，前引物限制性内切酶XbaI(小写字母)，后向引物限制性内切酶为PstI(小写字母)，保护碱基(大写字母加下划线)，与通用骨架的重叠序列(小写字母斜体)。获得引物序列如下：
MIM1868-F(SEQ ID NO.15)：
GCtctagaTGGCTGCTCCCTCGctaTTTTCCGTGAgttgttgttgttatg
MIM1868-R(SEQ ID NO.16)：
AActgcagTCACGGAAAAtagCGAGGGAGCAGCCAattcttcttctttag
2.通过融合PCR扩增获得长度为118bp的骨架和miR1868不完全互补序列的片段，将PCR产物片段和pCAMBIA2300-ACTIN1载体用限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ进行双酶切，37℃充分孵育3小时，回收目标片段。将酶切后的载体和片段在含有T4连接酶的反应液中，16℃孵育8小时，热激转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选含有pCAMBIA2300-ACTIN1-Pre-miR1868的阳性单克隆，在摇菌扩增后，提取质粒，送测序。
3.测序结果显示，重组的双元表达载体pCAMBIA2300-ACTIN1-MIM1868在XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点之间插入了序列5(SEQ ID NO.5)所示的DNA分子，且保持pCAMBIA2300-ACTIN1载体的其他序列不变。
实施例5OX1868和MIM1868转基因水稻的获得和鉴定
1.由百格生物公司利用农杆菌(菌株EHA105)介导的遗传转化，获得T0代转基因株系20株以上。
2.提取T0代转基因水稻的总RNA，参照实施例1中的操作反转录合成cDNA，以cDNA作为模板，荧光定量检测成熟miR1868的积累量。
3.将OX1868和MIM1868的四个株系的阳性材料分别自交，单株收获T1代种子，按照步骤2的荧光定量PCR方法鉴定T1代种子阳性植株，并自交，单株收获T2代种子，按照步骤2的荧光定量PCR方法对T2代种子长成的植株鉴定，从纯合的T2代植株上收获T3代水稻种子，用于后续的抗病性分析。
荧光定量的结果如图3所示。从图中可以看出，两个OX1868株系(OX1868#3和OX1868#18)中Osa-miR1868(简称miR1868)的积累量显著高于野生型；两个MIM1868(MIM1868#15，MIM1868#23)的Osa-miR1868的积累量显著低于野生型。
实施例6miR1868转基因水稻的病毒抗性分析
1.选取饱满的野生型水稻中花11(WT)、T3代OX1868和MIM1868转基因水稻的纯合株系的种子，催芽后培养在光照12小时28℃，黑暗12小时25℃的温室中大约2周，此时水稻处于三叶期，用携带RRSV的带毒褐飞虱取食水稻后，培养8周的时间，前四周在温室中培养，观察到明显的发病症状之后移栽到大田，观察症状严重程度并统计水稻发病率；同时在第四周时选择不少于6个独立植株的地上部分组织，提取RNA和蛋白质，用来检测病毒外壳蛋白在RNA和蛋白质水平的积累量。
结果如图4所示。从图中可以看出：过量积累了Osa-miR1868(简称miR1868)的水稻发病症状更轻(图4A)，病毒积累量更少(图4B和C)，表现严重发病症状的比例更低(图4D)；而降低Osa-miR1868的积累量的转基因水稻发病症状更加严重(图4A)，病毒积累量更高(图4B和C)，表现严重发病症状的比例更高(图4D)；结果证明，超量表达Pre-miR1868增强了水稻对RRSV的抗性。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.上调miRNA和/或miRNA前体表达量在降低植物分蘖和/或增强植物对锯齿叶矮缩病毒抗性中的应用，其特征在于，所述的植物为水稻，所述miRNA为如下a1)的miRNA：
a1)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的miRNA；
所述miRNA前体具有如下b1)的miRNA前体序列：
b1)核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的miRNA前体序列。
2.miRNA或miRNA前体的生物材料在降低植物分蘖和/或增强植物对锯齿叶矮缩病毒抗性中的应用，其特征在于：所述的植物为水稻；
所述miRNA为如下a1)的miRNA：
a1)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的miRNA；
所述miRNA前体具有如下b1)的miRNA前体序列：
b1)核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的miRNA前体序列。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物材料为如下A1）至A12）中的任一种：
A1）编码权利要求1中所述miRNA或权利要求2中所述miRNA前体的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；
A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11）含有A3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12）含有A4）所述重组载体的转基因植物细胞系。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，A1）所述的核酸分子为如下1）：
1）其前体序列是SEQ ID NO.3所示序列第129-297位所示的基因组DNA分子。
5.miRNA或miRNA前体或包含miRNA或包含miRNA前体的生物材料在培育抗病水稻或水稻育种中的应用；
所述miRNA为如下a1)的miRNA：
a1)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的miRNA；
所述miRNA前体具有如下b1)的miRNA前体序列：
b1)核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的miRNA前体序列。
6.一种培育抗病毒转基因植物的方法，所述转基因植物含有核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示的miRNA和/或核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的miRNA前体，其特征在于：所述方法包括提高受体植物中所述miRNA或所述miRNA前体的表达量；
其中，所述miRNA设为miR1868，其表达量上调通过向受体植物导入过表达Pre-miR1868的载体而实现；
所述过表达Pre-miR1868的载体是用组成型启动子ACTIN1驱动包含Pre-miR1868的序列表达实现，所述包含Pre-miR1868的序列是SEQ ID NO.3所示序列；
所述的植物为水稻。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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