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CN118696130A - 用于实时细胞药物-靶标接合的系统和方法 - Google Patents

用于实时细胞药物-靶标接合的系统和方法 Download PDF

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CN118696130A
CN118696130A CN202280076880.3A CN202280076880A CN118696130A CN 118696130 A CN118696130 A CN 118696130A CN 202280076880 A CN202280076880 A CN 202280076880A CN 118696130 A CN118696130 A CN 118696130A
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protein
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CN202280076880.3A
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伊凡·巴比克
埃尔马·努尔曼马多夫
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Nard Biology Co ltd
Original Assignee
Nard Biology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本文提供了允许实时测量细胞药物‑靶标接合的方法和系统。基于荧光的细胞靶标接合技术与实时基因表达机械的使用提供了优于现有技术系统的若干个优点。提供了不偏向于任何特定设计或品牌的与实时基因表达机械的整合。提供了细胞靶标接合方法的可编程性，使得实时基因表达机器中的任何软件都可以无缝地用于编程。提供了用于细胞靶标接合技术的单或多机器整合。提供了与多个多孔板设置的兼容性。提供了用于检测实时细胞药物‑靶标接合以与现有基因表达机械高效地一起工作的实时(定量)基因表达软件的独特修改的开发。

Description

用于实时细胞药物-靶标接合的系统和方法
相关申请交叉引用
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对电子序列表的引用
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技术领域
本发明的实施例涉及用于实时细胞药物-靶标接合的系统和方法。
发明内容
本文提供的方法和系统部分地基于需要组装两种组分，即核酸酶受体和核酸酶供体的酶互补测定的修饰类型，所述两种组分可以组装成能够切割所标记的核酸底物的功能核酸酶复合物。在一些实施例中，本文提供的方法和系统包括受体肽和供体蛋白，所述受体肽和所述供体蛋白可以组装成能够切割所标记的核酸底物的功能性RNA酶复合物。所述受体肽以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白包括受体肽(S标签受体肽)和所关注的靶多肽(例如，病毒包衣蛋白)。在某些实施例中，所述测定在存在测试化合物和变性剂(例如，热)的情况下进行，所述变性剂使所述融合蛋白变性并防止活性RNA酶复合物组装。在测试化合物与所述靶多肽相互作用和/或结合并抑制所述融合蛋白的变性的情况下，会形成活性RNA酶复合物，并且可以检测到所述所标记的底物的切割，由此鉴定与所述靶多肽(例如，病毒包衣蛋白)相互作用的潜在药物候选物(即，测试化合物)。
本公开的一个方面涉及一种确定测试化合物是否可以与靶多肽相互作用的方法。所述方法包括(a)使融合蛋白与(i)测试化合物、(ii)变性剂、(iii)核糖核酸酶(RNA酶)受体和(iv)核酸底物接触；以及(b)检测所述核酸底物的切割产物的量；其中所述融合蛋白包括靶多肽和S标签受体肽。在某些实施例中，(a)的所述接触包括使一种或多种细胞与(i)-(iv)中的一者或多者接触。在某些实施例中，(a)的所述接触包括使细胞裂解物与(i)-(iv)中的一者或多者接触。在一些实施例中，所述细胞或所述裂解物包括所述融合蛋白。在一些实施例中，所述底物是FRET标记的核酸底物。在一些实施例中，所述核酸底物包括FRET标记对。在一些实施例中，所述切割产物的所述量包括检测从所述切割产物发出的荧光信号的量并获得数据点，并且所述荧光信号允许鉴定所述靶多肽与所述测试化合物之间的靶饱和剂量、表观平衡解离常数(KD)、靶标接合的半最大有效浓度(EC50)。
在一些实施例中，所述方法是基本上同时在至少100个单独容器中进行的，其中所述单独容器中的每个容器中的所述测试化合物是不同的测试化合物。
本公开的另一个方面涉及一种确定测试化合物是否可以与靶多肽相互作用的方法。所述方法包括：(a)制备使得融合蛋白能够在系统内接触的反应溶液，所述系统包括：(i)测试化合物或媒剂，(ii)变性剂，(iii)核酸酶供体，(iv)核酸底物，和/或(v)信号控制器；以及(b)通过使用被配置成检测荧光、所产生的光或其衍生物的机器来实时检测所述核酸底物的切割产物的量和速度。
在一些实施例中，所述机器是能够测量光、荧光或其衍生物的机器。在一些实施例中，所述机器是定量聚合酶链反应(qPCR)或定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)机器。在一些实施例中，所述qPCR或RT-qPCR机器被编程为混合、发起、放大信号、寄存信号、使数据解卷积、分析实时从所述反应溶液中获得的数据，其中程序包括以下中的任一项：a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分在不同时间添加；b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据可以自动地定义下一个模块的命令；c)运行单重或多重反应；d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以鉴定信号图案。
在一些实施例中，所述机器生成靶标接合数据，所述靶标接合数据被配置成促进所述测试化合物与所述靶多肽之间的接合的多维确定和定量。在一些实施例中，所述靶标接合数据被配置成促进结合化学计量、靶标占有率、停留时间、KD、K-on、K-off和EC50的鉴定。在一些实施例中，所述机器被编程为生成所述靶标接合数据，并且程序包括以下中的任一项：a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分单独地和/或在不同时间添加；b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据可以自动地定义下一个模块的命令；c)运行单重或多重反应；d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以找到信号图案。
在一些实施例中，所述融合蛋白包括：(a)所述靶多肽和核酸酶受体结构域，(b)所述靶多肽和核酸酶，或(c)所述靶多肽、核酸酶的N末端结构域和第一结构域，所述第一结构域允许所述N末端结构域与同一核酸酶的C末端结构域二聚化，所述C末端结构域与第二结构域融合，所述第二结构域与所述允许二聚化的结构域互补。在一些实施例中，(a)的所述核酸酶受体结构域是S标签受体肽，并且其中所述核酸酶是S蛋白。在一些实施例中，设计了split-Cas9系统，在所述系统中，核酸酶结构域和螺旋结构域被克隆并独立地表达，然后在受控反应中进行互补。这使得Cas9酶的核酸酶活性能够更受控。这些结构域或其子结构域中的任一者可以与靶多肽融合，然后与酶的其余部分在细胞靶标接合系统中进行互补(Wright AV等人“split-Cas9酶复合物的合理设计(Rational design of a split-Cas9enzyme complex.)”《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America)》第112，10卷(2015)：2984-9.doi：10.1073/pnas.1501698112)。在一些实施例中，(b)的所述核酸酶选自由以下组成的组：Cas9、微球菌核酸酶、RNA酶H、非天然核酸酶混合物，如Cas9-Fok1和Cpf1/Cas12a。在一些实施例中，(c)的所述核酸酶是Cas9，所述允许二聚化的第一结构域是Coh2，并且所述第二结构域是DocS。Coh2和DocS是两种以高亲和力相互作用的热纤梭菌(C.thermocellum)蛋白。可以设计Coh2-DocS互补系统，在所述系统中，这些蛋白质或其结构域或子结构域中的任一者与靶多肽融合，然后与Coh2-DocS复合物的其余部分在细胞靶标接合系统中互补(Yu Y等人针对内部器官和肿瘤的远程控制的基因组编辑对远红光激活的split-Cas9系统进行工程化(Engineering a far-red light-activated split-Cas9 system for remote-controlled genome editing of internal organs and tumors).《科学进展(Sci Adv.)》2020；6(28)：eabb1777.2020年7月10日发布.doi：10.1126/sciadv.abb1777)。
在一些实施例中，所述信号控制器是可以控制互补的活性酶的酶促活性、控制靶标接合反应的开始、控制此反应的速度和/或控制反应的持续时间/成熟度的任何任选化合物或刺激剂。在一些实施例中，所述信号控制器是抗体、化学品、肽、温度、UV、微波或光。在一些实施例中，所述信号控制器是远红光。在一些实施例中，所述Coh2结构域与所述DocS结构域的结合由信号控制器实现，其中所述信号控制器是远红光。
在一些实施例中，反应溶液的部分或整体在所述机器外部或内部制备，使得：反应的整体在所述机器内部制备；反应的部分在所述机器外部制备，然后转移到所述机器中；和/或某些反应组分被一次或依序注入到所述机器中。
在一些实施例中，所述机器在回路中与本地或远程连接的其它机器通信。
在一些实施例中，将溶液保持在与实时荧光测量兼容的容器(container或vessel)内，并且其中所述机器被编程为实时读取来自所述反应溶液的荧光信号。
在一些实施例中，所述容器(container或vessel)是与实时荧光测量兼容的管或多孔板。
在一些实施例中，所述多孔板包括使得反应能够多重化的微流控芯片。在一些实施例中，多重化是用微流控芯片实现的，所述微流控芯片将来自两个液体组的所有或仅期望组合混合。在一些实施例中，第一液体组是各种带标签的靶多肽的套组，并且第二液体组是各种药物或其剂量的套组。在一些实施例中，多重化是在没有微流控芯片的情况下实现的，在这种情况下，在上载或以其它方式输入到检测器或qPCR机器中之前或在所述机器内，借助于差分液体分配来实现组合能力。在一些实施例中，液体分配器能够将各种剂量从药物套组分配到微孔板中，所述微孔板包括超过一千个孔，承载各种靶多肽，由此产生多种组合。此类芯片非依赖性多重化限于微孔板的反应和/或微孔板承载此类组合的孔容量。
本公开的另一方面涉及一种非暂时性计算机可读介质，其上具有指令。所述指令在由计算机、处理器、包含所述计算机和/或所述处理器的机器和/或其它系统执行时，使所述计算机、所述处理器、所述机器和/或其它系统执行以上所描述的方法中的操作中的任何操作。
本公开的另一方面涉及一种机器，其被配置成确定测试化合物是否可以与靶多肽相互作用。所述机器可以包括一个或多个处理器，所述一个或多个处理器由机器可读指令配置以：(a)促进制备使得融合蛋白能够在系统内接触的反应溶液，所述系统包括：(i)测试化合物或媒剂，(ii)变性剂，(iii)核酸酶受体，(iv)核酸酶受体，(v)核酸底物，和/或(vi)信号控制器；以及(b)通过使用被配置成检测荧光、所产生的光或其衍生物的机器来实时检测所述核酸底物的切割产物的量和速度。
在一些实施例中，所述机器是能够测量光、荧光或其衍生物的机器。在一些实施例中，所述机器是qPCR或RT-qPCR机器。在一些实施例中，所述qPCR或RT-qPCR机器被编程为混合、发起、放大信号、寄存信号、使数据解卷积、分析实时从所述反应溶液中获得的数据，其中程序包括以下中的任一项：a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分在不同时间添加；b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据可以自动地定义下一个模块的命令；c)运行单重或多重反应；d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以鉴定信号图案。
在一些实施例中，所述机器生成靶标接合数据，所述靶标接合数据被配置成促进所述测试化合物与所述靶多肽之间的接合的多维确定和定量。在一些实施例中，所述靶标接合数据被配置成促进结合化学计量、靶标占有率、停留时间、KD、K-on、K-off和EC50的鉴定。
在一些实施例中，所述机器被编程为生成所述靶标接合数据，并且程序包括以下中的任一项：a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分单独地和/或在不同时间添加；b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据可以自动地定义下一个模块的命令；c)运行单重或多重反应；d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以找到信号图案。
在一些实施例中，所述融合蛋白包括所述靶多肽和S标签受体肽。
在一些实施例中，反应溶液的部分或整体在所述机器外部或内部制备，使得：反应的整体在所述机器内部制备；反应的部分在所述机器外部制备，然后转移到所述机器中；和/或某些反应组分被一次或依序注入到所述机器中。
在一些实施例中，所述机器在回路中与本地或远程连接的其它机器通信。在一些实施例中，将溶液保持在与实时荧光测量兼容的容器(container或vessel)内，并且其中所述机器被编程为实时读取来自所述反应溶液的荧光信号。
在一些实施例中，所述容器(container或vessel)是与实时荧光测量兼容的管或多孔板。
在一些实施例中，所述多孔板包括使得反应能够多重化的微流控芯片。
在以下描述、实例、权利要求书和附图中进一步描述了技术的某些方面。
在一些实施例中，所述核酸底物的长度包括多于一个核苷酸。在一些实施例中，所述核酸底物包括天然和/或非天然核苷酸。在一些实施例中，所述核酸底物包括通过切割型键连接的核苷酸。
在一些实施例中，核酸底物包括合适的荧光能量转移(FRET)标记。FRET标记的核酸的一个优点在于，其可以容易地进入完整细胞，由此允许检测整个细胞中的底物的切割。在某些实施例中，核酸底物包括FRET标记，所述FRET标记包括合适的荧光供体/受体对，所述荧光供体/受体对被包括核酸酶切割型序列的多核苷酸分离，使得所述供体的荧光发射在所述底物被核酸酶或经组装的核酸酶复合物切割之前被淬灭。
在一些实施例中，所述核酸底物进一步包括适于FRET标记的荧光团。在一些实施例中，所述核酸底物包括两个荧光团(荧光标记)，一个位于所述核酸的每个端部处(即，第一荧光团位于其3′端处，并且第二荧光团位于其5′端处)。荧光标记的非限制性实例包含荧光素、罗丹明(rhodamine)、德州红(Texas Red)、藻红蛋白、别藻青素、6-羧基荧光素(6-FAM)、2，7-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，7，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、氰染料，如Cy3、Cy5、Alexa 542、Bodipy 630/650、荧光颗粒、荧光半导体纳米晶体等以及其组合。在一些实施例中，所述两个荧光团是FAM和TAMRA，其中FAM与所述核酸的3′端连接，并且TAMRA与所述核酸的5′端连接。
附图说明
附图示出了技术的实施例，并且不是限制性的。为了清楚和易于说明，附图未按比例绘制，并且在一些情况下，各个方面可以夸大或放大示出，以促进对特定实施例的理解。
图1示出了用于实时或近实时细胞药物-靶标接合的方法的一系列操作。
图2示出了用于实时或近实时细胞药物-靶标接合的系统。
图3示出了可以用于执行本文所描述的操作中的一个或多个操作的示例计算机系统。
图4示出了S标签互补策略的实施例的示意说明。
图5示出了HEK293细胞的荧光的示例性时间过程信号产生，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，然后裂解并与核酸酶底物和S蛋白进行互补，其中荧光在裂解和互补时立即测量。
图6示出了HEK293细胞的荧光的示例性时间过程信号产生，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，然后裂解并与核酸酶底物和S蛋白进行互补，其中荧光在裂解和互补后24小时测量。
图7示出了HEK293细胞的荧光的示例性时间过程信号产生，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，裂解并与核酸酶底物和S蛋白进行互补，其中荧光在裂解和互补时立即测量，并且与空白缓冲液的荧光进行比较。
图8示出了HEK293细胞的荧光的示例性实时过程信号产生，所述细胞用编码具有S标签融合体的指定蛋白质的DNA转染，然后在跨越38℃至62℃的指定温度下裂解和加热，然后与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。
图9示出了来自图8的具有S标签融合体的每种指定蛋白质的热谱。将在来自图8的在曲线的线性部分处检测到的荧光相对于38℃至62℃的温度进行绘制，以生成鉴定聚集温度(Tagg)的热谱。
图10示出了HEK293细胞的荧光的示例性时间过程信号产生，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，然后裂解并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。温度以3℃增量从25℃斜升到83℃。
图11示出了HEK293细胞的荧光的示例性时间过程信号产生，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，然后裂解并与核酸酶底物和S蛋白进行互补，其中荧光在裂解和互补时立即测量。将完全反应(表达MTH1_S标签的细胞裂解物+S蛋白+底物)的信号与几种对照的信号进行比较：仅MTH1-S标签、仅底物、仅S蛋白、仅底物+S蛋白、仅MTH1-S标签+底物、仅裂解物+S蛋白。
图12示出了HEK293细胞的示例性温度激发，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，然后裂解并与核酸酶底物和S蛋白进行互补，其中荧光在裂解和互补时立即测量。将完全反应(表达MTH1_S标签的细胞裂解物+S蛋白+底物)的信号与几种对照的信号进行比较：仅MTH1-S标签、仅底物、仅S蛋白、仅底物+S蛋白、仅MTH1-S标签+底物、仅裂解物+S蛋白。温度以5℃增量从25℃斜升到83℃。
图13示出了HEK293细胞的示例性温度激发，所述细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染，然后裂解并与核酸酶底物和S蛋白进行互补，其中荧光在裂解和互补时立即测量。25℃温育随后是在3℃增量下从25℃至81℃的温度斜升。
图14示出了克唑替尼剂量范围内的荧光和温度激发的示例性时间过程信号产生。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。25℃温育随后是在3℃增量下从25℃至81℃的温度斜升。
图15示出了克唑替尼剂量范围内的荧光的示例性时间过程信号产生。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。使反应经受59℃的温度激发。
图16示出了克唑替尼剂量范围内的荧光的示例性时间过程信号产生。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应通过25℃温育混合，随后是在2℃增量下的25℃-82℃温度激发后立即开始。
图17示出了示例性时间过程，HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应通过25℃温育混合，随后是在5℃温度增量下的45℃-70℃温度激发，随后在25℃下温育后立即开始。
图18示出了使用温度斜升和克唑替尼剂量范围的示例性时间过程。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合，然后温度以2℃斜升从25℃斜升到83℃，以在单次运行中获得信号高分辨率，随后以25℃温育后立即开始。
图19示出了HEK293细胞的荧光的示例性实时过程信号产生，所述细胞用编码MTH1S标签融合体的DNA转染，然后裂解并用(S)或(R)克唑替尼以在2000nM至0.1nM的范围内的指定浓度进行处理，并且立即在54℃下加热。从实时曲线的线性部分检测到的荧光相对于半对数和非线性回归分析上的药物的浓度进行绘制，所述半对数和非线性回归分析用于拟合S形剂量应答曲线，以鉴定靶标接合的EC50。
图20示出了经优化的荧光底物6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA的一个实施例的化学结构，其中6-FAM是指6-羧基荧光素，并且6-TAMRA是指6-羧基-四甲基罗丹明。鉴定了在与S标签进行互补时由活性RNA酶S切割的“剪切键”。
图21示出了由于经组装的RNA酶供体(A)蛋白-S标签受体肽(D)复合物对荧光底物的切割引起的荧光发射的示意说明。
图22示出了免疫印迹，其示出了HEK-293细胞中的实例的表达，其中融合蛋白包括具有或不具有任选的3个氨基酸接头(3aa)或10个氨基酸接头(10aa)的S标签受体肽(S标签)和靶多肽(MTH1)。
图23示出了随温度(x轴)变化的由不具有接头(MTH1-S标签)或具有不同大小的接头(MTH1-3aa-S标签或MTH1-10aa-S标签)的融合蛋白产生的荧光信号(y轴)的比较。在此测定中，单独的S标签(即，未掺入到融合蛋白中的S标签)未能产生任何信号。不受理论的束缚，可能S标签肽是热力学上不稳定的，并且因此在未掺入到融合蛋白中时在热激发下缺乏热熔融谱。此特性使得S标签对融合的靶蛋白的贡献最小，并且还使其成为靶标接合研究的理想选择。
图24示出了不同融合蛋白构建体的RNA供体的量(S蛋白，x轴)与荧光信号(y轴)之间的关系。
图25示出了不同细胞数量(图例)的稀释测试的结果，其示出了荧光信号(Y轴)随时间的变化(x轴)。
图26示出了增加的温度(x轴)对荧光信号(y轴)的影响的结果，所述结果用于鉴定聚集温度(Tagg)。
图27示出了增加的抑制剂(测试化合物)浓度(x轴)对荧光信号(y轴)的影响的结果。
图28示出了在50℃下增加的抑制剂浓度(y轴)对蛋白质稳定化(y轴)的影响的结果。
图29示出了随着温度的变化(x轴)温育时间(图例)对信号分离的影响。
图30示出了使用50ug裂解物，随着抑制剂(测试化合物)浓度(x轴)的变化，温育时间(图例)对荧光信号(y轴)的影响。
图31示出了使用10ug裂解物，随着抑制剂(测试化合物)浓度(x轴)的变化，温育时间(图例)对荧光信号(y轴)的影响。
图32示出了随着0.5分钟温育的抑制剂(测试化合物)浓度(x轴)的变化，裂解物(图例)的量对荧光信号(y轴)的影响。
图33示出了随着5分钟温育的抑制剂(测试化合物)浓度(x轴)的变化，裂解物(图例)的量对荧光信号(y轴)的影响。
图34示出了随着10分钟温育的抑制剂(测试化合物)浓度(x轴)的变化，裂解物(图例)的量对荧光信号(y轴)的影响。
图35示出了测定的对随时间推移的荧光信号产生的示例性实时监测。S标签(Micro标签)荧光信号在20分钟的过程内产生的动力学迹线。信号的动力学是在核酸酶供体(S蛋白)和与核酸酶受体(S标签)融合的靶多肽(MTH1)进行酶互补之后切割FRET标记的底物的酶催化的反应的结果。
图36A-36C示出了若干个带micro标签的(S标签)融合蛋白构建体的示例性热谱，其揭示了这些带标签的蛋白质的独特热特征。图36A示出了热激发中的EGFR带micro标签的蛋白，其鉴定出最大信号温度(Tmax)为59℃。图36B示出了热激发中的MTH1带micro标签的蛋白，其鉴定出聚集温度(Tagg)为55℃。图36C示出了热激发中的BCL6带micro标签的蛋白，其鉴定出最小信号温度(Tmin)为46.5℃。
图37示出了在Tagg温度下加热或未加热的MTH1 micro标签的(S标签)融合蛋白的随时间推移的示例性荧光信号(相对光单位(RLU)/分钟)。未加热的样品的荧光信号快速产生，所述荧光信号在前3分钟内达到峰值，随后荧光信号产生由于FRET标记的底物的耗竭(通过切割)而减少。经加热的样品具有较少的micro标签蛋白(MTH1-3aa-S标签融合蛋白)，并且显示出底物耗竭(切割)较慢。
图38A-38B示出了使用BI-3812和BI-5273抑制剂的BCL6-Micro标签(BCL6-S标签融合蛋白)的示例性测试。带Micro标签的BCL6在HEK293细胞中表达，并且来自这些细胞的裂解物用抑制剂(图38A)BI-3812和非活性类似物(图38B)BI-5273处理。样品在Tmin下加热，并且荧光信号(相对光单位)在与S蛋白(核酸酶供体)和FRET标记的底物一起温育4分钟后被检测到。
图39A-39C显示出，15分钟后，荧光的峰鉴定出靶饱和剂量。图39A示出了15分钟后对图38A中示出的反应的检查，所述检查用于鉴定靶饱和剂量。图39B示出了去除高于饱和剂量的数据点允许S形剂量-应答曲线拟合，以鉴定与在早期时间点时鉴定的靶标接合相同的靶标接合的EC50(在图38A-38C中)。图39C示出了可观察到的荧光信号数据还可以使用GraphPad Prism来拟合到饱和结合方程(单位点总数)，以鉴定与蛋白质靶标的药物结合的表观平衡解离常数(表观KD)。
图40A-40E示出了靶饱和剂量、Emax(最大效应(最大荧光信号))、靶标接合的EC50和表观KD的示例性鉴定。图40A示出了动力学迹线，其示出了所测试的抑制剂的每种浓度的随时间推移的荧光。图40B示出了在较高药物浓度下，较晚时间点(5分钟)的信号低于早期时间点(0分钟，在动力学迹线开始时的首次检测)的信号。较高药物浓度下的这种信号降低产生钟形状的曲线。图40C示出了钟形状的曲线，其鉴定了产生最大效应(Emax)的药物的饱和浓度(靶饱和剂量)。图40D示出了靶标接合的EC50可以通过将S形剂量应答曲线拟合到早期时间点数据来确定。图40E示出了饱和结合曲线可以通过鉴定靶饱和剂量来生成，并且曲线拟合的非线性回归分析可以鉴定表观平衡解离常数KD。靶标接合的EC50和表观KD是相同的，这表明荧光读数与药物结合直接成比例，并且可以用于确定表观亲和力结合常数。
图41A-41C示出了对与MTH1带Micro标签的蛋白结合的(S)克唑替尼的靶饱和剂量、Emax、靶标接合的EC50和表观KD的示例性鉴定。图41A示出了来自在MTH1带micro标签的蛋白(MTH1-3aa-S标签融合蛋白)在存在增加浓度的抑制剂(S)克唑替尼的情况下在55℃下加热之后的酶互补反应2分钟后的荧光检测的靶标接合的EC50。图41B示出了反应10分钟后的荧光检测和钟形状的曲线拟合，其用于鉴定靶饱和剂量和Emax。图41C示出了使用GraphPadPrism拟合(单位点总数)的饱和结合曲线，其用于确定表观KD。
具体实施方式
描述了用于在实时基因表达读取器中，具体地qPCR/RT-qPCR机器中对细胞药物-靶标接合进行实时测量的Micro标签细胞靶标接合技术。利用基于荧光的S标签/S蛋白(Micro标签)细胞靶标接合方法。使用本发明的系统和方法，Micro标签细胞靶标接合方法能够实现灵敏度和数据提取的增强，使得高效地检测和记录药物-靶标接合的早期时间点信号。先前在标准板读取器中由于快速信号产生的性质而错过了细胞靶标接合的早期点；即，用户的手动干预足够慢，以至于错过细胞靶标接合的这些早期点。本发明的系统和方法使得能够从早期时刻直至其饱和/完成高效地捕获和测量细胞靶标接合信号。
由于细胞中的药物-靶标接合而生成的荧光信号的性质(其半衰期、衰减速率和靶标饱和的水平/速度)使得能够测量实时细胞药物-靶标接合动力学。动力学响应于靶标的丰度、药物的剂量和反应的持续时间。因此，可以提取重要的动力学数据，例如KD、K-on、K-off和EC50。
基于荧光的细胞靶标接合技术与实时基因表达机械的使用提供了优于现有技术系统的若干个优点(此实例列表并非详尽的)。提供了不偏向于任何特定设计或品牌的与实时(定量)基因表达机械的整合。提供了使得实时基因表达机器中的任何软件都可以无缝地用于编程的细胞靶标接合方法的可编程性，这还使得能够测量重要的动力学数据，如KD、K-on、K-off和EC50。提供了用于细胞靶标接合技术的单或多机器整合。例如，与化合物固定、液体分配等机器的整合是可能的。这增强了工作流可扩展性和高通量药物筛选。与富鲁达公司的多重化的实时基因表达设置和/或其它类似设置的整合是可能的。这使得能够在单个板中测量各种铺板的药物相对于靶标的组合。提供了与多个多孔板设置的兼容性，特别是与富鲁达公司的板和/或其它类似板的兼容性。这使得能够在单个板中测量各种铺板的药物相对于靶标的组合。提供了用于检测实时细胞药物-靶标接合以与现有基因表达机械高效地一起工作的实时(定量)基因表达软件的独特修改的开发。这使得能够高效测量实时细胞药物-靶标接合动力学。
因此，图1示出了用于实时或近实时细胞药物-靶标接合的方法100。方法100可以用于确定测试化合物是否可以与靶多肽相互作用。方法100中的一些或全部可以基本上实时地执行。方法100可以由机器和/或系统，如图2中所示的机器22和/或系统10和/或其它机器和/或系统执行。机器22和/或系统10包括由机器可读指令15配置的一个或多个处理器14和/或其它组件。一个或多个处理器14被配置成执行计算机程序组成部分(由机器可读指令形成)，所述计算机程序组成部分执行方法100的一个或多个操作。下面呈现的方法100的操作旨在是说明性的。在一些实施例中，方法100可以使用未描述的一个或多个另外的操作和/或不使用所讨论的操作中的一个或多个操作来完成。另外，方法100的操作在图1中示出并且在下文描述的顺序不旨在是限制性的。
在一些实施例中，方法100可以至少部分地在一个或多个处理装置，如本文所描述的机器22的一个或多个处理器14(图2，例如，数字处理器、模拟处理器、被设计成处理信息的数字电路、被设计成处理信息的模拟电路、状态机和/或用于电子地处理信息的其它机制)中实施。一个或多个处理装置可以包含响应于电子地存储在电子存储介质(例如，系统10的数据存储区30)上的指令(例如，机器可读指令15)而执行方法100的操作中的一些或全部操作的一个或多个装置。一个或多个处理装置可以包含通过硬件、固件和/或软件配置的一个或多个装置，所述一个或多个装置被专门设计成用于执行方法100的操作中的一个或多个操作。
在操作102处，制备反应溶液。反应溶液使得融合蛋白能够在反应系统中接触。反应系统包括测试化合物或媒剂、变性剂、核酸酶受体、核酸底物、信号控制器和/或其它组成部分。
在一些实施例中，所述信号控制器是可以控制互补的活性酶的酶促活性、控制靶标接合反应的开始、控制此反应的速度和/或控制反应的持续时间/成熟度的任何任选化合物或刺激剂。在一些实施例中，信号控制器是抗体、化学品、肽、UV、微波或光。在一些实施例中，所述信号控制器是远红光。
融合蛋白包括：(a)所述靶多肽和核酸酶受体结构域，(b)所述靶多肽和核酸酶，或(c)所述靶多肽、核酸酶的N末端结构域和第一结构域，所述第一结构域允许所述N末端结构域与同一核酸酶的C末端结构域二聚化，所述C末端结构域与第二结构域融合，所述第二结构域与所述允许二聚化的结构域互补。在一些实施例中，(a)的所述核酸酶受体结构域是S标签受体肽，并且其中所述核酸酶是S蛋白。在一些实施例中，(b)的所述核酸酶是核糖核酸酶。在一些实施例中，(b)的所述核酸酶可以是Cas9、微球菌核酸酶、RNA酶H、非天然核酸酶混合物，如Cas9-Fok1或Cpf1/Cas12a。在一些实施例中，(c)的所述核酸酶是核糖核酸酶，所述允许二聚化的第一结构域是Coh2，并且所述第二结构域是DocS。在一些实施例中，(c)的所述核酸酶是Cas9，所述允许二聚化的第一结构域是Coh2，并且所述第二结构域是DocS。在一些实施例中，所述Coh2结构域与所述DocS结构域的结合由信号控制器实现，其中所述信号控制器是远红光。
在一些实施例中，所述信号控制器是可以控制互补的活性酶的酶促活性、控制靶标接合反应的开始、控制此反应的速度和/或控制反应的持续时间/成熟度的任何任选化合物或刺激剂。在一些实施例中，信号控制器是抗体、化学品、肽、UV、微波或光。在一些实施例中，所述信号控制器是远红光。在一些实施例中，所述信号控制器是远红光。
在一些实施例中，反应溶液的部分或整体在机器外部或内部制备，使得：反应的整体在机器内部制备；如下面的实例1中例示的，反应的部分在机器外部制备，然后被转移到机器中；和/或某些反应组分被一次或依序注入到机器中。
在一些实施例中，将溶液保持在与实时荧光测量兼容的容器(container或vessel)，如与实施荧光测量兼容的管或多孔板内，并且其中机器被编程为实时读取来自反应溶液的荧光信号。在一些实施例中，容器是不透明的，以防止来自任何其它反应的光污染。如下面的实例1中所描述的，将溶液保持在黑色96孔板内。在一些实施例中，所述多孔板包括使得反应能够多重化的微流控芯片。在一些实施例中，多重反应包括两个或更多个不同的可检测标记。在一些实施例中，多重反应包括两个或更多个不同的荧光标记。
在操作104处，执行实时或近实时处理操作。操作104可以通过使用机器(例如，图2中所示的机器22)实时或近实时地执行。
在一些实施例中，所述机器是能够测量光、荧光或其衍生物的机器。在一些实施例中，所述机器是qPCR或RT-qPCR机器。在一些实施例中，机器是富鲁达公司BioMark HD。在一些实施例中，机器是伯乐公司CFX96/384实时PCR(BioRad CFX96/384Real-Time PCR)机。在一些实施例中，机器是荧光板读取器，如Omega 96孔板读取器，如实例1中所例示的。
在一些实施例中，所述机器在回路中与本地或远程连接的其它机器通信。
在一些实施例中，qPCR或RT-qPCR机器被编程为混合、发起、放大信号、寄存信号、使数据解卷积、分析实时从反应溶液中获得的数据。程序包括以下中的任一项：a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分在不同时间添加；b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据可以自动地定义下一个模块的命令；c)运行单重或多重反应；d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；i)在本地或远程机器回路内传送数据；j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以鉴定信号图案；和/或其它操作。
在一些实施例中，所述机器生成靶标接合数据，所述靶标接合数据被配置成促进所述测试化合物与所述靶多肽之间的接合的多维确定和定量。多维是指若干个组成部分，如温度范围、剂量范围、荧光团等以及其各种组合全部在一种设置中的细胞靶标接合数据的类型。
在一些实施例中，靶标接合数据被配置成促进结合化学计量、靶标占有率、靶标竞争、停留时间、KD、K-on、K-off和/或EC50的鉴定。下面的实例1提供了此类接合数据以及对此EC50和KD的鉴定的非限制性实例。
在操作106处，检测核酸底物的切割产物的量和速度。这可以通过使用被配置成检测荧光、所产生的光或其衍生物的机器(例如，图2中所示的机器22)实时或近实时地检测。
在一些实施例中，本文提供了与以上描述的方法相关联或作为所述方法的一部分的用于监测细胞内的药物-靶标接合的靶标非依赖性平台。在一些实施例中，平台基于这样的前提来利用对细胞-热漂移测定(CTSA)的修改：在加热时，蛋白质将在埋藏的疏水性位点暴露时开始展开、变性并形成不溶性聚集体。蛋白质熔融和聚集发生的平均温度、均值温度或绝对温度通常被描述为Tagg(或Tm)。热诱导的聚集有时由于小分子而改变，所述小分子可以间接地与多肽相互作用或直接地与多肽结合，从而引起Tagg的可检测到的漂移(被称为热漂移)。对于一些CTSA测定，不溶性聚集的蛋白质通过离心去除，并且通过小分子的相互作用或结合而稳定化的可溶性蛋白质保持处于可溶性级分内。其余可溶性蛋白质的量可以通过各种蛋白质检测方法，如蛋白质印迹来确定。此类方法通常耗时、费用高昂且繁琐；需要特殊训练才能进行；并且因此不适于高通量药物筛选方法。高通量药物发现需要快速且费用低廉的方法，所述方法可以用于在相对短的时间量内筛选大量化学化合物，以鉴定新的药物候选物。
本文提供了一种经修改的酶互补测定，其可以用于在暴露于热(例如，CTSA)或另一种变性剂(例如，紫外光、微波、辐射或化学变性剂)时使所选靶多肽稳定化的化合物的高通量筛选。本文所利用的经修改的酶互补测定部分地基于(i)核糖核酸酶(RNA酶)供体和(ii)S标签受体肽的组装，所述核糖核酸酶供体和所述S标签受体肽在组装时形成能够切割RNA底物(例如，FRET标记的RNA底物)的功能性RNA酶复合物。测定通过检测所切割的RNA底物的存在或量来监测(图4)，所述RNA底物在切割时提供可检测信号。所述S标签受体肽以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白包括S标签受体肽和所关注的靶多肽。如果靶多肽由于变性剂的存在而变性并聚集，则聚集的融合蛋白的S标签受体肽部分不能与RNA酶受体缔合。因此，当靶多肽变性时，不形成活性RNA酶复合物，并且未检测到切割产物。如果测试化合物与靶多肽相互作用，并且由于所述相互作用，组织靶多肽的变性，则形成功能性RNA酶复合物，并且检测到RNA底物的切割。例如，使用此方法，可以鉴定与所关注的靶多肽，如致病菌的蛋白质相互作用的测试化合物，以鉴定药物候选物。本文呈现的测定方法可以用作用于以快速且高效的方式筛选测试化合物文库的高通量平台。
在一些实施例中，测定的融合蛋白可以使用合适的方法由细胞表达。然后，可以使包括融合蛋白的细胞与测试化合物在存在变性剂(例如，热)的情况下接触，以确定测试化合物是否可以防止靶多肽的变性。相较于传统的筛选方法，本文呈现的测定方法有许多优点。例如，(i)本文的测定方法非常快速，使得可以在数秒至数分钟内检测到所切割的RNA底物，(ii)S标签受体肽相对小，并且如本文所确定的，不干扰融合蛋白的较大靶多肽部分的变性，(iii)所述测定消除了进行蛋白质印迹分析的需要，(iv)所述测定相对费用低廉，(v)所述测定可以以多重测定的形式实施，以筛选数百种或甚至数千种测试化合物，以及(vi)所述测定适于自动化。
融合蛋白
在一些实施例中，方法包括使融合蛋白与测试化合物、变性剂、核酸酶供体和核酸底物中的一种或多种接触。在一些实施例中，所述方法包括使融合蛋白与测试化合物、变性剂、RNA酶供体和侧接有一对FRET标记的核酸底物(例如，FRET标记的RNA底物)中的一种或多种接触。在某些实施例中，融合蛋白包括靶多肽和核酸酶受体。在一些实施例中，核酸酶受体是S标签受体结构域。在一些实施例中，融合蛋白包括靶多肽和S标签受体肽。
融合蛋白可以包括一种或多种或两种或更多种核酸酶受体。在一些实施例中，融合蛋白可以包括一个或多个或两个或更多个S标签。任何合适的所关注的靶多肽可用于本文的方法。靶多肽和核酸酶受体(例如，S标签受体肽)可以通过合适的共价键或接头附接。接头的非限制性实例包含一个或多个氨基酸、肽接头、烷烃、PEG、任选地经取代的C1-C50烷基、任选地经取代的C2-C50烯基、炔基、酰基、酰氧基、烷氧基、芳氧基、环烷基、环烯基、环烷氧基、芳基、氨基羰基、叠氮基、羧基、硅烷、硫醇、亚砜、砜、磺酸酯、氰基、酰胺、氨基、酯、膦酸、其它合适的聚合物、其衍生物等以及其组合。在一些实施例中，接头包括肽，所述肽包括两个或更多个氨基酸、2个至100个氨基酸、5个至100个氨基酸、2个至50个氨基酸、5个至50个氨基酸、2个至25个氨基酸、5个至25个氨基酸、2个至20个氨基酸、5个至20个氨基酸、2个至10个氨基酸或5个至10个氨基酸。在一些实施例中，接头包括由1个至20个、1个至10个或1个至5个氨基酸构成的肽。在一些实施例中，融合蛋白通过例如通过使用合适的连接化学将靶多肽附接到核酸酶受体(例如，S标签受体肽)来组装。在一些实施例中，融合蛋白使用合适的表达系统表达为包括核酸酶受体(例如，S标签受体肽)和靶多肽的单个连续多肽。在一些实施例中，靶多肽附接到核酸酶受体(例如，S标签受体肽)的C末端。在一些实施例中，靶多肽附接到核酸酶受体(例如，S标签受体肽)的N末端。
在一些实施例中，融合蛋白包括靶多肽和核酸酶受体。在一些实施例中，融合蛋白包括靶多肽和核酸酶。在一些实施例中，融合蛋白包括靶多肽、核酸酶的N末端结构域和第一结构域，所述第一结构域允许所述N末端结构域与同一核酸酶的C末端结构域二聚化，所述C末端结构域与第二结构域融合，所述第二结构域与所述允许二聚化的结构域互补。在一些实施例中，核酸酶受体是S标签供体肽，并且核酸酶是S蛋白。在一些实施例中，设计了split-Cas9系统，在所述系统中，核酸酶结构域和螺旋结构域被克隆并独立地表达，然后在受控反应中进行互补。这使得Cas9酶的核酸酶活性能够更受控。这些结构域或其子结构域中的任一者可以与靶多肽融合，然后与酶的其余部分在细胞靶标接合系统中进行互补(WrightAV等人“split-Cas9酶复合物的合理设计”.《美国国家科学院院刊》第112，10卷(2015)：2984-9.doi：10.1073/pnas.1501698112)。在一些实施例中，核酸酶选自由以下组成的组：Cas9、微球菌核酸酶、RNA酶H、非天然核酸酶混合物，如Cas9-Fok1和Cpf1/Cas12a。在一些实施例中，核酸酶是Cas9，允许二聚化的第一结构域是Coh2，并且第二结构域是DocS。Coh2和DocS是两种以高亲和力相互作用的热纤梭菌蛋白。可以设计Coh2-DocS互补系统，在所述系统中，这些蛋白质或其结构域或子结构域中的任一者与靶多肽融合，然后与Coh2-DocS复合物的其余部分在细胞靶标接合系统中互补(Yu Y等人针对内部器官和肿瘤的远程控制的基因组编辑对远红光激活的split-Cas9系统进行工程化.《科学进展》2020；6(28)：eabb1777.2020年7月10日发布.doi：10.1126/sciadv.abb1777)。
在一些实施例中，所述信号控制器是可以控制互补的活性酶的酶促活性、控制靶标接合反应的开始、控制此反应的速度和/或控制反应的持续时间/成熟度的任何任选化合物或刺激剂。在一些实施例中，所述信号控制器是抗体、化学品、肽、温度、UV、微波或光。在一些实施例中，所述信号控制器是远红光。在一些实施例中，所述Coh2结构域与所述DocS结构域的结合由信号控制器实现，其中所述信号控制器是远红光。
融合蛋白可以包括一个或多个接头。在一些实施例中，融合蛋白包括一个或多个位于靶多肽与核酸酶受体结构域之间的接头。在一些实施例中，融合蛋白包括一个或多个位于靶多肽与核酸酶之间的接头。在一些实施例中，融合蛋白包括一个或多个位于靶多肽和核酸酶的N末端结构域与第一结构域之间的接头，所述第一结构域允许所述N末端结构域与同一核酸酶的C末端结构域二聚化，所述C末端结构域与第二结构域融合，所述第二结构域与所述允许二聚化的结构域互补。
核酸酶
本文的方法部分地依赖于功能性核酸酶复合物的组装，其中第一核酸酶的N末端结构域与第二核酸酶的C末端结构域组装，以形成能够切割核酸底物的活性酶复合物。本文的方法部分地依赖于功能性RNA酶复合物的组装，其中第一RNA酶的N末端结构域与第二RNA酶的C末端结构域组装，以形成能够切割FRET标记的RNA或DNA/RNA底物的活性酶复合物。在一些实施例中，合适的RNA酶具有结构域结构，使得(i)蛋白质的N末端部分可以与蛋白质的C末端部分分离，(ii)分离的N末端部分和C末端部分没有酶促活性，并且(iii)RNA酶的分离的N末端部分和分离的C末端部分可以以非共价方式自组装，以形成功能性RNA酶。可以用于本文的方法的合适的RNA酶蛋白的非限制性实例包含牛RNA酶A(登录AAB35594；UniprotKBP61823))；人RNA酶A(NCBI登录NP_002924.1)；黑猩猩RNA酶A(NCBI登录XP_520673.1)；犬RNA酶A(NCBI登录号XP_532618.2)；小鼠RNA酶A(NCBI登录号NP_035401.2)；大鼠RNA酶A(NCBI登录号XP_223969.2)；其同源物等以及其具有RNA酶活性的衍生物。在一些实施例中，RNA酶是具有以下序列的成熟蛋白(SEQ ID NO：21)的牛胰腺RNA酶A(例如，UniProtKBP61823)或其衍生物KETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTMSITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASV，其中加下划线的部分表示蛋白质的S标签肽序列。
在一些实施例中，核酸酶是核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶。在一些实施例中，核酸酶是核糖核酸酶。在一些实施例中，核酸酶是脱氧核糖核酸酶。
在一些实施例中，核酸酶是序列特异性核酸酶。在一些实施例中，核酸酶是成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(即，Cas蛋白)。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9(Csn1)、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas13a(C2c2)、Cas13b(C2c6)或Cas13c(C2c7)。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9。
在一些实施例中，核酸酶是非天然核酸酶混合物。在一些实施例中，非天然核酸酶混合物是Cas9-Fok1。
在一些实施例中，核酸酶是RNA酶。在一些实施例中，RNA酶是RNA酶A、RNA酶H或RNA酶S。
在一些实施例中，核酸酶是微球菌核酸酶。
RNA酶供体
在一些实施例中，RNA酶供体包括合适的RNA酶的C末端部分或由其组成。在一些实施例中，RNA酶供体是RNA酶S蛋白。RNA酶供体(例如，RNA酶S蛋白)可以使用合适的方法制备。在一个非限制性实例中，RNA酶供体通过用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)处理RNA酶A来制备，所述枯草杆菌蛋白酶在适当条件下切割RNA酶的单个肽键，由此提供N末端部分(即，S肽，例如，约15-25个氨基酸)和C末端部分(即，S蛋白，例如约90个至120个氨基酸)。在另一个非限制性实例中，RNA酶供体使用重组技术制备，使得使用合适的表达系统表达RNA酶的C末端(S蛋白)部分。分离的RNA酶供体在其接触合适的S标签受体肽之前基本上没有酶促活性(例如，RNA酶活性)。
在一些实施例中，RNA酶供体包括与氨基酸序列MSSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHESLADVQAVCSQKNVACKN GQTNCYQSYSTMSITDCRETGS SKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASV(SEQ ID NO：19)或MS S SNYCNQMMKSRNLTKDRCKPV NTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTMSITDCRETGS SKY PNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFD(SEQ ID NO：20)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％或至少100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，RNA酶供体包括多肽，所述多肽包括SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列中的至少85个、至少90个、至少95个或至少100个连续氨基酸。RNA酶供体的衍生物可以包括保守氨基酸取代或氨基酸类似物。在一些实施例中，RNA酶供体包括合适的氨基酸标签(例如，组氨酸标签、flag标签等)。
核酸酶受体
在一些实施例中，核酸酶受体或核酸酶受体结构域是允许功能性核酸酶复合物组装的结构域，其中第一核酸酶的N末端结构域与第二核酸酶或同一第一核酸酶的C末端结构域组装，以形成能够切割核酸底物的活性酶复合物。在一些实施例中，核酸酶受体是包括合适的S标签的受体肽。核酸酶受体肽通常包括核酸酶蛋白的相对小的N末端部分或由其组成。S标签受体肽通常包括RNA酶蛋白的相对小的N末端部分或由其组成。当S标签肽与RNA酶供体(例如，S蛋白)非共价缔合时，S标签肽赋予RNA酶酶促活性。任何合适的S标签受体肽和RNA酶供体组合可以用于本文的方法。可以容易地测试S标签受体肽和RNA酶供体的各种组合在不需要过度实验的情况下在本文的方法中的用途。通常，源自一种物种的S标签受体肽将与源自另一种物种的RNA酶供体缔合，以形成功能性酶复合物。在一些实施例中，S标签肽的衍生物和/或RNA酶供体的衍生物可以用于本文的方法。
在一些实施例中，核酸酶受体肽的长度在10个至60个氨基酸、10个至40个氨基酸、15个至30个氨基酸、15个至25个氨基酸、10个至25个氨基酸或8个至25个氨基酸的范围内。在一些实施例中，核酸酶受体肽包括约15个至25个氨基酸、由其组成或基本上由其组成。在某些实施例中，核酸酶受体肽不具有可检测到的次级结构。在某些实施例中，核酸酶受体肽是高度可溶性的。在某些实施例中，核酸酶受体肽在中性pH下不具有净电荷。
在一些实施例中，S标签受体肽的长度在10个至60个氨基酸、10个至40个氨基酸、15个至30个氨基酸、15个至25个氨基酸、10个至25个氨基酸或8个至25个氨基酸的范围内。在一些实施例中，S标签受体肽包括约15个至25个氨基酸、由其组成或基本上由其组成。在某些实施例中，S标签受体肽不具有可检测到的次级结构。在某些实施例中，S标签受体肽是高度可溶性的。在某些实施例中，S标签受体肽在中性pH下不具有净电荷。
在一些实施例中，S标签受体肽包括具有与选自以下的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的肽以及其衍生物：KETAAAKFERQHMDSSTSAA(SEQ ID NO：1)、KETNWAWFWDQHMDSSTSA(SEQ ID NO：2)、KETGWALFVQQHMDSSTSA(SEQ ID NO：3)、KETVMANFQMQHMDSSTSA(SEQ ID NO：4)、KETGDAVFARQHMDSSTSA(SEQ ID NO：5)、KETGWAAFVKQHMDSSTSA(SEQ ID NO：6)、KETGWATFVEQHMDSSTSA(SEQ ID NO：7)、KETKLAFFLKQHMDSSTSA(SEQ ID NO：8)、KETWWAWFFGQHMDSSTSA(SEQ ID NO：9)；KETTWAEFTWQHMDSSTSA(SEQ ID NO：10)、KETPWASFNKQHMDSSTSA(SEQ ID NO：11)、KETAMAMFVTQHMDSSTSA(SEQ ID NO：12)、KETLWAWFMWQHMDSSTSA(SEQ ID NO：13)、KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO：14)、KETAAAKFERQHMNS(SEQ ID NO：15)、NRAWSEFLWQHLAPV(SEQ ID NO：16)、NRGWSEFLWQHHAPV(SEQ ID NO：17)和NRAWSVFQWQHIAPA(SEQ ID NO：18)。在一些实施例中，S标签受体肽包括选自以下的氨基酸序列中的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续氨基酸以及其衍生物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。在一些实施例中，S标签受体肽是以下中公开的S肽：Backer等人(2002)《蛋白质表达和纯化(Protein Expression andPurification)》26：455-461；Dwyer等人(2001)《生物化学(Biochemistry)》40(45)：13491-500；Kim和Raines(1993)《蛋白质科学(Protein Science)》2：348-356；以及Beintema，J.J.(1987)《生命化学报告(Life Chem.Rep.)》4：333-389，所述文献通过引用并入本文。S标签受体肽的衍生物可以包括保守氨基酸取代或氨基酸类似物。在某些实施例中，S标签受体肽可以针对以下中描述的使用方法制备和/或选择：Yu和Smith(1996)《酶学方法(Methods inEnzymology)》267，3-27；以及Goldberg等人(1999)《美国国家科学院院刊(PNAS)》96：2019-2024。
靶多肽
融合蛋白可以包括合适的所关注的靶多肽。在一些实施例中，靶多肽的长度在10个至1000个、10个至500个、10个至250个、10个至125个或10个至50个氨基酸的范围内。在某些实施例中，靶多肽包括衍生自合适的致病菌的多肽或其一部分，所述致病菌的非限制性实例包含病毒、细菌、真菌和寄生虫。病毒的非限制性实例包含腺病毒科(Adenoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、指环病毒科(Anelloviridae)、多形性包膜病毒科(Pleolipoviridae)、呼肠病毒科(Reoviridae)、微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒(Influenzavirus))、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，SARS、SARS-CoV-2、MERS、HKU1)、星状病毒科(Astroviridae)、玻那病毒科(Bornaviridae)、动脉病毒科(Arteriviridae)、轮状病毒(Rotavirus)和肝炎病毒科(Hepeviridae)的病毒。在某些实施例中，病毒是SARS-Cov2冠状病毒。在某些实施例中，病毒是流感病毒。在某些实施例中，病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施例中，病毒是疱疹病毒。在一些实施例中，致病菌是细菌。在某些实施例中，细菌是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或分支杆菌(Mycobacterium)。
在一些实施例中，靶多肽是经修饰的。多肽修饰的非限制性实例包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。例如，在一些实施例中，本文的方法使用多个容器(例如，微量滴定孔)以多重测定或高通量测定的形式进行，其中每个孔包括不同的融合蛋白，每个融合蛋白包括不同的靶多肽。不同的靶多肽可以是靶多肽的不同蛋白质和/或修饰。在一个非限制性实例中，靶多肽是病毒衣壳蛋白(例如，SARS-Cov2的刺突蛋白或流感病毒的血凝素蛋白)，并且容器或微量滴定孔中的每一者包含病毒衣壳蛋白的不同修饰(例如，随机或计算机生成的突变)。
在一些实施例中，靶多肽是天然存在的多肽或其一部分。在一些实施例中，靶多肽是合成的。在一些实施例中，靶多肽是天然地产生的或重组地产生的。在一些实施例中，靶多肽包括被分离、纯化和/或重组地表达为可溶性蛋白(例如，分离、纯化或表达为可溶性融合蛋白)的蛋白质或蛋白质的一部分。在一些实施例中，靶多肽或融合蛋白在细胞中或上表达。在一些实施例中，靶多肽或融合蛋白在细胞的表面上表达。在某些实施例中，细胞是合适的真核细胞(例如，哺乳动物细胞)。在某些实施例中，细胞是原核细胞(例如，细菌)。
在一些实施例中，靶多肽是MTH1。在一些实施例中，核酸酶受体是S标签肽。在一些实施例中，MTH1与S标签肽之间不存在接头。在一些实施例中，MTH1-S标签构建体的氨基酸序列以SEQ ID NO：25示出。
测试化合物
本文的方法可以用于筛选任何合适的测试化合物或测试化合物的文库。
如本文所用，短语“测试化合物”是指可以使用本文所述的方法针对与所关注的靶多肽相互作用或结合的能力进行筛选的任何合适的化合物。测试化合物的非限制性实例包含小化合物(例如，小有机或无机分子)、大化合物(例如，大于5000Da)、多糖、碳水化合物、糖、脂肪酸、脂质、生物大分子(例如，肽、多肽、蛋白质、肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核苷酸、核苷酸类似物)、天然存在的或合成的化合物、结合剂(例如，抗体或其结合片段，包含非天然存在的结合剂和合成的结合剂(例如，TandAbs、纳米抗体、适体、BiTE、SMIP、DARPin、DNL、亲和体、Duocalins、adnectins、菲诺体(fynomer)、Kunitz结构域Albu-dabs、DART、DVD-IG、Covx体、肽体、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、旋钮入孔(Knob-in-Hole)、triomAb等)、其衍生物、其聚合物、其盐、其异构体、其多晶型物以及其组合。在一些实施例中，测试化合物容纳在由生物材料制成的提取物，如细菌、植物、真菌、动物细胞或动物组织的提取物内。在一些实施例中，测试化合物容纳在生物流体内。因此，在一些实施例中，测试化合物包括提取物或生物流体。小化合物包含分子量大于约40道尔顿(Da)但小于5000Da、小于3000Da或小于1000Da的分子。小化合物可以包括任何合适的化学部分或基团，所述化学部分或基团的非限制性实例包含烷烃、烯烃、炔烃、醇、卤素、酮、醛、羧酸、醚、酯、胺、酰胺、饱和、部分饱和或不饱和环结构、核苷酸、核苷、多原子非金属(例如，P、S、Se)、过渡金属、后过渡金属、类金属等、其盐以及其组合。
在某些实施例中，测试化合物包含合适的文库的合成的或天然存在的化合物。许多小分子文库是本领域已知的，其中一些是可商购获得的。可商够获得的化合物文库可以从例如ArQule公司(ArQule)、药典(Pharmacopia)、graffinity公司(graffinity)、Panvera公司(Panvera)、Vitas-M实验室(Vitas-M Lab)、Biomol国际公司(Biomol International)和牛津大学(Oxford)获得。用于开发基于小分子、聚合物和基因组的文库的方法描述于例如Ding等人《美国化学学会杂志(JAm.Chem.Soc.)》124：1594-1596(2002)以及Lynn等人，《美国化学学会杂志》123：8155-8156(2001)中。还可以使用来自例如NIH路线图(NIHRoadmap)、分子文库筛选中心网络(Molecular Libraries Screening CentersNetwork，MLSCN)的化学化合物文库。可以使用任何合适的方法来制备小化合物文库。可以使用本文所述的合适方法筛选化合物文库。
在某些实施例中，测试化合物包括的分子量为40Da至500,000Da、40Da至200,000Da、40Da至100,000Da、40Da至50,000Da、40Da至25,000Da、40Da至10,000Da、40Da至5000Da或40Da至1000Da。在某些实施例中，测试化合物包括的分子量为5000Da至500,000Da、10,000Da至500,000Da、25,000Da至500,000Da或5000Da至100,000Da。
测试化合物可以在任何合适的浓度下进行测试。在一些实施例中，测试化合物在至少1pM、至少10pM、至少100pm、至少1nM、至少10nM、至少100nM、至少1μM、至少10μM、至少100μM或至少1mM的浓度下进行测试。在一些实施例中，测试化合物在范围为1pM至100mM、1pM至10mM、1pM至1mM、10pM至100mM、10pM至10mM、10pM至1mM、100pM至100mM、100pM至10mM或100pM至1mM的浓度下进行测试。在一些实施例中，测试化合物在小于100mM、小于10mM、小于1mM或小于100nM的浓度下进行测试。在一些实施例中，测试化合物在一种或多种不同浓度下进行测试或测定。
底物
在一些实施例中，使融合蛋白和/或RNA酶供体或包括融合蛋白和RNA酶供体的混合物或细胞与合适的核酸底物接触。在一些实施例中，核酸底物是可以由本文公开的RNA酶或本文所述的经组装的RNA酶复合物(例如，包括S标签受体肽和RNA酶受体)切割的核酸。在一些实施例中，核酸底物包括RNA和/或DNA。在一些实施例中，核酸底物包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。核酸底物可以是单链的或双链的。在某些实施例中，核酸底物包括2个或更多个、3个或更多个、5个或更多个或10个或更多个核苷酸。在某些实施例中，核酸底物包括至少1个嘧啶核苷酸。在某些实施例中，核酸底物包括至少2个、至少3个或至少4个相邻的嘧啶核苷酸。
在某些实施例中，核酸底物包括合适的可检测标记。在某些实施例中，底物的可检测标记提供可检测信号、可检测信号的变化(例如，信号的增加或减少或波长漂移)，或在RNA酶切割所标记的底物时可检测信号的损失。在一些实施例中，从核酸底物的标记发出的可检测信号在切割底物之前是不可检测到的。在一些实施例中，从核酸底物的标记发出的可检测信号在切割底物之后增强。在某些实施例中，从核酸底物的标记发出的可检测信号在切割底物之后减少。
可检测标记的非限制性实例包含金属标记、荧光标记、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、PH敏感型蛋白或PH敏感型GFP(例如，PHlourin等)、任何合适的荧光团(例如，mCherry)、发色团、化学发光标记、电化学发光标记(例如，OrigenTM)、磷光标记、淬灭剂(例如，荧光团淬灭剂)、荧光共振能量转移(FRET)对(例如，供体和受体)、蛋白质(例如，酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等))、抗原或其部分、接头、结合对的成员)、酶底物、小分子(例如，生物素、亲和素)、质量标签、量子点、纳米颗粒等或其组合。任何合适的荧光团或发光材料可以用作可检测标记。荧光标记的非限制性实例包含荧光素、罗丹明、德州红、藻红蛋白、别藻青素、6-羧基荧光素(6-FAM)、2，7-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，7，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、氰染料，如Cy3、Cy5、Alexa 542、Bodipy 630/650、荧光颗粒、荧光半导体纳米晶体等以及其组合。可检测标记可以通过多种合适的技术，例如数字摄影、流式细胞术、凝胶电泳、芯片分析(例如，任何芯片方法)、微阵列、质谱法、细胞荧光分析、荧光显微术、共聚焦激光扫描显微术、激光扫描细胞术、合适的板读取器等以及其组合来检测和/或定量。
在一些实施例中，核酸底物包括合适的荧光能量转移(FRET)标记。FRET标记的核酸的一个优点在于，其可以容易地进入完整细胞，由此允许检测整个细胞中的底物的切割。在某些实施例中，核酸底物包括FRET标记对，所述FRET标记对包括合适的荧光供体/受体对，所述荧光供体/受体对被包括RNA酶切割型序列的多核苷酸分离，使得供体的荧光发射在底物被经组装的RNA酶复合物切割之前被淬灭。在某些实施例中，核酸底物包括FRET标记，所述FRET标记包括合适的荧光供体/受体对，所述荧光供体/受体对被包括RNA酶切割型序列的多核苷酸分离，使得供体的荧光发射在底物被经组装的RNA酶复合物切割之前被淬灭。在某些实施例中，FRET标记包括被两个或更多个连续核苷酸分离的6-羧基荧光素(6-FAM)和6-羧基-四甲基罗丹明(6-TAMRA)(图19)。在一些实施例中，核酸底物包括(6-FAM)-X-(6-TAMRA)，其中X包括包含2个至10个核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中，核酸底物包括6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA(图19)，其中rU是尿苷，并且dA是脱氧腺嘌呤。
在本文所述的方法的某些实施例中，使用合适的方法确定底物切割的量。在某些实施例中，使用合适的方法确定核酸底物的切割产物的存在或不存在。在一些实施例中，使用合适的方法确定FRET标记对标记的核酸底物的切割的存在、不存在或量。所标记的核酸底物的切割的存在、不存在或量可以在使细胞或混合物与核酸底物或核酸酶供体接触之后的合适时间确定。所标记的核酸底物的切割的存在、不存在或量可以在使细胞或混合物与核酸底物或RNA酶供体接触之后的合适时间确定。在一些实施例中，所标记的核酸底物的切割的存在、不存在或量在一定时间段内动态地确定，例如以确定切割速率。切割产物的预定量可以使用合适的阳性对照来确定。例如，阳性对照可以利用融合蛋白和测试化合物，所述融合蛋白包括已知蛋白质，所述测试化合物已知在暴露于变性剂时与已知蛋白质相互作用并使已知蛋白质稳定，由此允许S标签受体肽与RNA酶供体蛋白进行互补，以形成活性核酸酶复合物。由阳性对照的活性核酸酶复合物切割的核酸底物的存在或量可以用作用于检测与靶多肽相互作用的其它测试化合物的基线。
FRET标记的切割和对FRET标记的核酸底物的切割的检测非常快速(通常需要不到30秒)(例如，参见图29-31)。因此，在某些实施例中，FRET标记的底物用于本文所述的高通量方法，并且允许本文所述的方法的自动化。
变性剂
在一些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触。变性剂的非限制性实例包含(i)热、(ii)紫外光、(iii)微波、(iv)辐射和(iv)化学变性剂。
在某些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触包括使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物与热接触。在一些实施例中，使融合蛋白与足以使融合蛋白变性和/或聚集的量的热接触。在某些实施例中，使融合蛋白与热接触包括将融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物加热到在40℃至90℃、40℃至80℃、40℃至75℃、45℃至75℃、50℃至75℃或55℃至70℃的范围内的温度。在某些实施例中，使融合蛋白与热接触包括将融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物加热到至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少65℃或至少70℃的温度。在某些实施例中，使融合蛋白与热接触包括将融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物从约30℃-40℃的温度加热到约50℃至70℃的温度。在某些实施例中，使融合蛋白与热接触包括将融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物暴露于在30℃至90℃、30℃至80℃、30℃至75℃、37℃至75℃、37℃至70℃的范围内的温度梯度。在一些实施例中，使融合蛋白与温度梯度接触包括以至少约1℃/分钟至10℃/分钟或约1℃/分钟至5℃/分钟的速率增加融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物的温度。在一些实施例中，使融合蛋白与热接触包括使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物暴露于热或不断增加的温度梯度，持续至少30秒、至少1分钟、至少3分钟或至少5分钟的时间段。
在某些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触或暴露于变性剂，持续一定时间段。在一些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触或暴露于变性剂，持续至少20秒、至少30秒、至少1分钟、至少3分钟或至少5分钟的时间段。
在某些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触包括使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物经受一个或多个冷冻-解冻循环。
在某些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触包括使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物与足以使蛋白质变性的合适量的电磁辐射暴露，所述电磁辐射的非限制性实例包含紫外光、微波或辐射(例如，β或γ辐射)。在一些实施例中，蛋白质的变性可以用UV在250nm下进行5分钟，或在0.1焦耳/cm2下进行。
在某些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触包括使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物与化学变性剂接触，所述化学变性剂的非限制性实例包含氧化剂、毒素、酸、碱、致癌剂和化学治疗剂。可以进行简单的常规测试以快速确定使融合蛋白变性所需的化学变性剂的量。在一些实施例中，使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物与化学变性剂在存在测试化合物的情况下接触，并且化学变性剂在融合蛋白与RNA酶供体蛋白接触之前被基本上去除(例如，通过并入洗涤步骤)。在某些实施例中，使融合蛋白与变性剂接触包括使融合蛋白或包括融合蛋白的细胞或混合物与化学变性剂在范围为1fM至500mM、1pM至100mM、1nM至10mM、1nM至1mM或1nM至100μM的浓度下接触。
示例性方法
在一些实施例中，使融合蛋白与测试化合物和变性剂接触。在一些实施例中，使分离的融合蛋白与测试化合物和/或变性剂接触。在一些实施例中，使位于细胞内或上或混合物(例如，细胞裂解物)中的融合蛋白与测试化合物和/或变性剂接触。在一些实施例中，使融合蛋白与测试化合物在融合蛋白与变性剂接触之前或之后接触。在一些实施例中，融合蛋白与测试化合物和变性剂同时或基本上同时接触。在一些实施例中，融合蛋白在细胞中或上(例如，在细胞表面上)表达，并且使细胞与测试化合物和/或变性剂接触。
在某些实施例中，方法包括使细胞与编码融合蛋白或指导融合蛋白的表达的核酸接触。例如，在一些实施例中，方法包括用编码融合蛋白或指导融合蛋白的表达的核酸(例如载体)转染或转化细胞，随后使细胞或细胞的裂解物与测试化合物、变性剂、RNA酶供体和/或核酸底物接触。在某些实施例中，方法包括使用合适的方法将编码融合蛋白或指导融合蛋白的核酸引入到细胞中。例如，核酸可以使用病毒载体引入到真核细胞中，或使用噬菌体引入到细菌细胞中。
在一些实施例中，使融合蛋白与核糖核酸酶(RNA酶)供体和/或核酸底物接触。在某些实施例中，使包括融合蛋白、测试化合物和/或变性剂的混合物与RNA酶供体和/或核酸底物接触。在一些实施例中，使位于细胞内或上或混合物(例如，细胞裂解物，例如，包括融合蛋白、测试化合物和/或变性剂的混合物)中的融合蛋白与RNA酶供体和/或核酸底物接触。在一些实施例中，使融合蛋白与RNA酶供体在融合蛋白与核酸底物接触之前或之后接触。在一些实施例中，使融合蛋白与RNA酶供体和核酸底物同时或基本上同时接触。
在某些实施例中，使包括融合蛋白的细胞与变性剂和测试化合物接触，将变性剂任选地去除或撤回，将细胞暴露于RNA酶供体和核酸底物，并且对核酸底物的切割进行检测或定量。在一些实施例中，使包括融合蛋白的混合物或细胞与测试化合物、RNA酶受体、核酸底物和变性剂基本上同时接触，并且对底物的切割进行检测和/或定量。例如，细胞可以重组地产生以表达融合蛋白、RNA酶供体和/或核酸底物，在一些实施例中，所述融合蛋白、所述RNA酶供体和/或所述核酸底物的表达由一个或多个诱导型启动子控制。然后使细胞或其裂解物与测试化合物和变性剂接触，例如，通过添加测试化合物并施加热来使其接触，同时实时监测包括FRET标记的核酸底物的切割。本文还设想了此方法的变化。
在一些实施例中，在本文所述的方法中，核酸底物包括一个或多个可检测标记。在一些实施例中，核酸底物包括一个或多个FRET标记。在一些实施例中，核酸底物包括FRET标记对，其中切割产物的量包括检测从切割产物发出的荧光信号的量并获得数据点，并且其中荧光信号允许鉴定靶多肽与测试化合物之间的靶饱和剂量、表观平衡解离常数(KD)、靶标接合的半最大有效浓度(EC50)。
在一些实施例中，测试化合物的靶饱和剂量通过酶反应中的核酸FRET标记的底物的切割/耗竭之后的峰荧光值(Emax)来鉴定。在一些实施例中，靶多肽与测试化合物之间的表观平衡解离常数(KD)通过绘制饱和结合曲线来鉴定，其中超过Emax的数据点从绘图中排除。在一些实施例中，靶标接合的EC50根据反应中存在过量的核酸FRET标记的底物的早期数据点确定。
在一些实施例中，在使融合蛋白与热接触期间或之后，确定融合蛋白的绝对、平均或均值聚集温度(Tagg)。在一些实施例中，Tagg在不存在测试化合物的情况下确定。在一些实施例中，Tagg在存在溶剂对照或对照化合物(例如，已知对融合蛋白的Tagg有影响的化合物或已知增加融合蛋白的Tagg的化合物)的情况下确定。此类对照可以用于确定阈值Tagg(例如，预定阈值)，在一些实施例中，所述阈值Tagg用于鉴定与靶多肽相互作用或结合的化合物。例如，在某些实施例中，将融合蛋白的Tagg改变或漂移到高于预定阈值的量的测试化合物通常被鉴定为与靶多肽相互作用或结合的测试化合物。
可以使用类似方法以鉴定在使用电磁辐射、冷冻-解冻或化学品作为变性剂时与靶多肽相互作用或结合的测试化合物。例如，可以在不存在测试化合物的情况下和/或在存在对照化合物的情况下确定使融合蛋白变性所需的临界暴露时间、变性剂浓度、解冻温度、波长或能量，以确定预定阈值量。在一些实施例中，导致阈值量的漂移或变化的任何测试化合物被确定为与融合蛋白的靶多肽相互作用或结合的化合物。
在某些实施例中，本文所述的方法或测定以多重测定和/或高通量测定的形式进行，所述测定包括在至少96个、至少100个、至少384个、至少500个、至少1000个、至少1536个、至少5000或至少10,000个单独容器中执行方法。在某些实施例中，本文所述的方法或测定以多重测定和/或高通量测定的方式进行，其中所述方法的步骤中的一些或全部步骤是基本上同时或在多个容器中同时进行的。在一些实施例中，多重测定和/或高通量测定中使用的多个单独容器中的一些或全部容器与不同的融合蛋白、不同的变性剂、不同的测试化合物、不同的RNA酶受体和/或不同的核酸底物接触或包括不同的融合蛋白、不同的变性剂、不同的测试化合物、不同的RNA酶受体和/或不同的核酸底物。在一些实施例中，多重测定和/或高通量测定中使用的多个单独容器中的一些或全部容器与相同的融合蛋白、相同的变性剂、相同的测试化合物、相同的RNA酶受体和/或相同的核酸底物接触或包括相同的融合蛋白、相同的变性剂、相同的测试化合物、相同的RNA酶受体和/或相同的核酸底物。如本文所用，“容器(vessel)”或“容器(container)”是指任何合适的容器(container)、容器(vessel)、管或孔。容器可以是孔，例如微量滴定板中的孔。
在某些实施例中，本文所述的方法或测定以多重测定和/或高通量测定的形式使用通常位于合适的底物(例如，芯片)上的可寻址位置处的表面结合的融合蛋白的阵列进行。在一些实施例中，阵列包括至少20种、至少96种、至少100种、至少384种、至少500种、至少1000种、至少1536种、至少5000种或至少10,000种不同的与合适底物的表面结合的融合蛋白。
相较于其它类型的互补测定，本文所述的方法和测定使响应性和敏感性增加。本文提供的方法可以检测ng水平的活性测试化合物的存在。
实例
实例1
以下是用于实时细胞药物-靶标接合的方法的实例。此实例可以至少部分地根据图1中示出的方法100、至少部分地通过图2中所示的系统10中的一个或多个组件和/或以其它方式进行。
材料：试剂、细胞系和构建体
以下抗体获自细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)：兔mAb S标签(D2K2V)XP(目录号12774)、抗MTH1(D6V4O)兔mAb(目录号43918)。HEK-293细胞来自ATCC公司(ATCC，目录号CRL-1573)，并且在补充有10％胎牛血清(FBS)(密理博西格玛公司(Millipore SIGMA)，目录号F2442)和1x青霉素/链霉素(密理博西格玛公司，目录号P4333)的DMEM(密理博西格玛公司，目录号D5796)中培养。胰蛋白酶-EDTA溶液1X(0.05％胰蛋白酶、0.02％EDTA)来自密理博西格玛公司(目录号59417C)，并且20X TBS溶液来自Teknova公司(Teknova，目录号T1680)。Triton-X-100来自密理博西格玛公司(目录号X100)。MTH1抑制剂(S)克唑替尼来自密理博西格玛公司(目录号PZ0240)。DMSO来自密理博西格玛公司(目录号673439)。96孔板来自CELLTREAT科技公司(CELLTREAT Scientific，目录号229196)；白色PCR板来自伯乐公司(BIORAD，目录号MLL9651)，并且用于密封PCR板的Microseal‘B’膜来自伯乐公司(目录号MSB1001)；黑色96孔板来自科士达公司(COSTAR，目录号3915)。细胞的转染使用Lipofectamine 2000转染试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，目录号11668027)根据制造商推荐的方案进行。经优化的荧光底物(5′-6FAM/ArUAA/3′TAMRA_(NHS酯)(v3))购自IDT公司(IDT)。由泓迅技术公司(Synbio TechnologiesInc.)使用KPN1 GGTACC和BamH1 GGATCC克隆位点将S蛋白用6x His标签在羧基末端处克隆到载体pET-30a(+)中以用于细菌表达。S蛋白His标签融合蛋白由泓迅技术公司从细菌中表达和纯化。
编码RNA酶供体的经克隆的构建体的序列如下：
编码6x His标签的序列是粗体，并且TAG终止密码子是加下划线的。
带His标签的RNA酶供体蛋白(S蛋白)的对应经翻译的氨基酸序列为：
S标签受体肽与mutT同源物(MTH1)蛋白(即，靶多肽)的克隆由泓迅技术公司进行。S标签受体肽克隆到MTH1的羧基末端在载体pcDNA3.1(+)中如下进行：克隆位点KPN1GGTACC和BamH1 GGATCC(粗体)。
生成了如下所示的在MTH1与S标签肽(加下划线的)之间没有接头的编码构建体：
包括MTH1和羧基末端S标签受体肽的所产生的融合蛋白的经翻译的氨基酸序列在下面示出。S标签受体肽的20个氨基酸序列是加下划线的。确定了S标签可以缩短到前15个氨基酸，并且仍然可以充当S标签受体肽。
还生成了如下所示的包括位于MTH1靶多肽与S标签受体肽(加下划线的)之间的3个氨基酸接头(加方框的)的融合蛋白的编码构建体：
包括MTH1靶多肽以及3个氨基酸间隔子和羧基末端S标签受体肽的所产生的融合蛋白的经翻译的氨基酸序列在以下示出。S标签是加下划线的，并且3个氨基酸间隔子是加方框的。
包括位于MTH1靶多肽与S标签受体肽(加下划线的)之间的10个氨基酸接头(加方框的)的编码构建体还如下所示构建：
MTH1靶多肽以及10个氨基酸间隔子和羧基末端S标签受体肽的经翻译的氨基酸序列在以下示出。S标签是加下划线的，并且10个氨基酸间隔子是加方框的。
方法：用于使用S标签系统评估药物靶标接合的方案
A.动力学读取中的测试细胞数量
使用Lipofectamine 2000用MTH1-S标签融合构建体对转染HEK-293细胞进行转染。此方案使用反向转染改进，由此将细胞提升并用转染试剂与DNA一起重新铺板。转染后二十四小时，将细胞用胰蛋白酶提升，用1X TBS洗涤，并且对细胞进行计数。测试了细胞数量的稀释液系列。
将细胞在1x TBS(冷TBS)中稀释至1x106个细胞/ml(即1000个细胞/μl)。在96孔板中用冷TBS以50μl的最终体积对在50,000个细胞至1000个细胞的范围内的细胞计数进行测试。向含有50μl细胞的每个孔中添加50μl含室温的1％-Triton-X 100的TBS溶液，以获得最终0.5％Triton-X-100的浓度。通过上下移液并允许在室温下温育10分钟来将孔混合，以使细胞膜轻轻裂解。将来自每个孔的80μl转移到黑色科士达公司板中，同时避免气泡，并且添加10μl 10X S蛋白(RNA酶受体)以得到1ng/μl的最终浓度，随后添加10μl 10X底物(核酸底物)以得到50nM的最终底物浓度。仅在使用之前，在室温下在含0.5％triton-X的TBS中制备10X S蛋白(10ng/μl)。仅在使用之前，在室温下用dH20制备10X底物(500nM)。
用PolarStar Omega 96孔板读取器在动力学模式(激发＝430nm，发射＝520nm)下立即读取板。每分钟读取每个板，进行10分钟(生成了11个时间点)。选择产生最高信号，而不会使信号在6分钟内饱和的适当的细胞稀释液。
B.通过运行热梯度鉴定实验的Tagg
将细胞在1x TBS(冷TBS)中稀释至1x106个细胞/ml(1000个细胞/ul)。
在白色PCR板中用冷TBS以50μl的最终体积制备正确的细胞稀释液。将板使用热循环仪(MJ研究公司PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research PTC-200Peltier ThermalCycler))暴露于40℃至64℃的热梯度，持续3分钟，并允许其在室温下静置3分钟，随后添加50μl含室温1％Triton-X-100的TBS，以得到最终的0.5％Triton-X-100。将孔通过上下移液混合，随后在室温下温育10分钟。
将来自每个孔的80ul裂解物转移到黑色科士达公司板中，同时避免气泡，随后添加10μl 10X S蛋白(RNA酶受体)以得到1ng/μl的最终浓度，随后添加10μl 10X底物(核酸底物)以得到50nM的最终浓度。用PolarStar Omega 96孔板读取器在动力学模式(激发＝430nm，发射＝520nm)下立即读取板。每分钟读取板，进行10分钟。MTH1-S标签融合蛋白的Tagg被确定为约50℃。
C.给定细胞数量和Tagg的测试抑制剂剂量
使用从以上实验确定的最佳细胞数量和Tagg测试抑制剂(即，测试化合物)剂量。将细胞在1x TBS(冷TBS)中稀释至1x106个细胞/ml(1000个细胞/u1)。在白色PCR板中用冷TBS以50ul的最终体积制备正确的细胞稀释液。添加0.25ul含200X克唑替尼(多靶标的小分子酪氨酸激酶抑制剂)的DMSO溶液(或要测试的其它抑制剂)。对于克唑替尼，测试出EC50在约50nM的范围内。对照孔包含在Tagg(50℃)下测试的DMSO(0％稳定性对照)和在40℃下测试的DMSO(100％稳定性对照)。
将细胞与抑制剂一起在冰上温育40分钟，然后置于热循环仪中在Tagg下持续3分钟(将对照孔单独在40℃下加热3分钟)，随后在室温下持续3分钟，随后添加50ul含室温1％Triton-X-100的TBS，以得到最终的0.5％Triton-X-100。将细胞通过上下移液混合，随后在室温下温育10分钟。将80μl转移到黑色科士达公司板，同时避免气泡，随后添加10μl 10X S蛋白，以得到最终的1ng/μl，并且添加10μl 10X底物，以得到最终的50nM。每分钟用PolarStar Omega 96孔板读取器在动力学模式(激发＝430nm，发射＝520nm)下立即读取板，进行10分钟。荧光单位相对于对应的抑制剂(测试化合物)剂量进行绘制，以确定蛋白质稳定化的EC50。
结果
用三种MTH1-S标签肽融合蛋白构建体对HEK293哺乳动物细胞进行转染，以确定靶多肽与S标签受体肽之间的间隔子长度是否影响功能性RNA酶S互补的检测。图22示出了如通过蛋白质印迹所确定的构建体在HEK293细胞中的相等表达。
测试50μg经转染的细胞裂解物输入并比较间隔子的不同长度显示出，间隔子长度对荧光信号没有显著影响(图23)。间隔子长度似乎在靶蛋白的信号水平或聚集温度(Tagg)中没有发挥重要作用。S标签的结构性和惰性以及热不敏感性对靶蛋白的生物物理稳定性没有贡献。这极大地改善了这种S标签技术的下游应用以及其在广泛范围的靶蛋白的情况下的用途。另外，数据显示，在不存在S标签融合体的表达的情况下，没有可检测到的信号证明S标签S蛋白互补的特异性。
为了确定S蛋白浓度是否影响荧光信号，测试了具有不同S标签融合体的S蛋白的增加的浓度。图24显示出，S蛋白浓度开始使信号在约1-2ng/ul S蛋白下饱和。数据证明了系统的敏感性，因为其仅需要最低水平的S蛋白来驱动酶互补。
类似地，测试了FRET核酸底物的增加的浓度，并且观察到，理想浓度在50nM或更大的范围内(表1)。
荧光底物的切割的动力学是快速的，并且检测是灵敏的。图25示出了荧光信号相对于细胞数量的变化。在确定了最佳细胞数量后，然后通过进行经修改的细胞-热漂移测定(CTSA)来鉴定融合蛋白的Tagg。图26证实，对于MTH1-S标签融合体，Tagg为约50℃。使用Tagg，执行剂量应答曲线，以鉴定小分子克唑替尼与融合蛋白的结合。将用MTH1-S标签融合蛋白转染的细胞与MTH1抑制剂(S)克唑替尼一起在增加的浓度下温育(图27)。克唑替尼使MTH1融合蛋白稳定化，如通过荧光信号的增加所指示的(图27)。EC50使用下文所示的蛋白质稳定化的式确定，并且指示蛋白质稳定化的EC50为约25nM(图28)。
蛋白质稳定化的式：
(1-((RLU40℃-RLU50℃)-(RLUx-RLU50℃))/(RLU40℃-RLU50℃)))*100
其中RLU是相对光单位。
表2-在热激发后在不进行离心的情况下检测到的信号。在激发＝475nm/发射＝500-550nm的波长下检测到荧光。
表3-在热激发后在进行离心的情况下检测到的信号。在激发＝475nm/发射＝500-550nm的波长下检测到荧光。在热激发后，将板以12K rpm离心。
*注意，表2和3中的信号水平没有差异。离心步骤的去除会加速信号检测，减少样品分配与信号读取之间花费的时间，并且重要的是极大地改善这种S标签技术的下游应用。
裂解物与S蛋白和底物的短温育时间足以实现完全信号产生(图29)。最短温育时间(0.5分钟)足以实现完全信号产生。在较长的温育时间下，信号质量不会受损。这种快速信号产生对于这种技术的下游应用，特别是对于阵列和芯片应用来说是重要的。
低裂解物/细胞输入与短温育时间的组合产生敏感信号，这表明靶蛋白的在与其配体接合时的熔融谱(图14和15)。对于克唑替尼-MTH1接合来说，高裂解物输入与低裂解物输入之间的信号图案是相同的。这些图证实了即使在信号饱和的情况下，信号图案在较长温育时间下的持久性。裂解物/细胞输入与温育时间的组合的这种灵活性可以用于检测具有各种靶标接合效力的配体的接合EC50。
图32-34展示了裂解物/细胞输入与温育时间的组合对信号图案和持久性的影响，其展示了靶蛋白的在与其配体接合时的熔融谱。注意，对于克唑替尼-MTH1接合来说，短温育时间与长温育时间之间的信号图案是相同的(图32-34)。注意到，即使在信号饱和的情况下，信号图案在较长温育时间下的持久性。还注意到，在0.5分钟的短温育时间下的信号分离宽，并且在较长温育下的信号分离较窄。还注意到，裂解物输入与温育时间之间的互惠性。裂解物/细胞输入与温育时间的组合的这种灵活性可以用于检测具有各种靶标接合效力的配体的接合EC50，以及其中各种量的裂解物输入或温育时间可以是优选的各种应用。
实例2
在本文所描述的方法或测定的一个实施例中，靶多肽是由致病菌(非限制性实例包含冠状病毒、流感病毒、肝炎病毒以及甚至噬菌体)编码的蛋白质或其经修饰的蛋白质。融合蛋白包括使用N末端和/或C末端S标签(例如，S标签受体肽)表达的靶致病菌蛋白。致病菌蛋白的表达构建体将包含用于允许融合蛋白的最大表达的经密码子优化的cDNA。在此实例中，使用阵列，使得编码融合蛋白的DNA以多孔形式(96孔或384孔或1536孔形式)提供给细胞，以在所关注的细胞系中表达。可以将DNA转染到位于多孔板的每个孔中的细胞中，以允许蛋白质表达。板阵列可以用于在单次运行中对所有融合蛋白上的单独药剂或多种药剂(药物，即测试化合物)进行测试。另外，阵列可以用单独测试化合物或多种测试化合物的多个剂量进行测试。阵列可以在高通量方法中用于对致病菌的整个蛋白质组上的化合物文库进行测试。阵列可以用于筛选在各种生理条件下(例如，不同缓冲液、血清组分的存在、生长因子或其它刺激剂)结合的测试化合物。然后可以使板经受梯度加热变性步骤，随后添加RNA酶供体，以用于酶互补和FRET底物切割检测。使用板读取器的荧光检测将在动力学模式下进行，以监测荧光随时间推移的任何潜在增加。
实例3
图5：时间过程信号产生。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。使表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞裂解，并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为由多个10秒循环构成的1步反应，每个循环在25℃下(左上图)。示出了温度图(右上)和实时荧光信号产生(显示为循环，右下)。实时信号产生在176个循环(每个循环10秒)的过程内测量。观察到信号产生的线性相和平台相。
图6：时间过程信号产生(反应24小时后)。
图5中开始的反应在开始后继续24小时。使用如图5中所描述的相同的运行方法。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为由多个10秒循环构成的1步反应，每个循环在25℃下(左上图)。示出了温度图(右上)和实时荧光信号产生(显示为循环，右下)。实时信号产生在151个循环(每个循环10秒)的过程内测量。荧光信号在反应开始后24小时之后稳定。
图7：时间过程信号产生-与缓冲液比较。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。使表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞裂解，并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。将信号与空白缓冲液的信号进行比较。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为由多个10秒循环构成的1步反应，每个循环在25℃下(左上图)。示出了温度图(右上方)和实时荧光信号产生(显示为循环，右中)以及荧光信号的ΔRn(右下方)。实时信号产生在175个循环(每个循环10秒)的过程内测量。对于MTH1-S标签互补的反应，观察到信号产生的线性相和平台相，而对于缓冲液，未检测到信号。
图8：从酶互补测定中使用QuantStudio 3qPCR实时系统的对荧光的实时检测。
具有S标签融合体的构建体在HEK293细胞中表达，非变性裂解物分离并在38℃至62℃的范围内的指定温度下加热，然后针对荧光进行测定，以对蛋白质水平进行定量。
图9：图1中检查的融合构建体的热谱。
将来自图1中示出的曲线的线性部分的荧光(相对光单位)(x 106)相对于所测试的温度进行绘制。使用非线性回归分析以绘制剂量应答曲线。对于β2 AR和EGFR两者，聚集温度均优于62℃。
图10和图10-续：时间过程信号产生-温度激发。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。使表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞裂解，并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。温度以3℃增量从25 ℃斜升到83℃。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为20步反应，每个反应由多个60秒循环构成，使得在每个步骤中，温度以3℃增量斜升，从25℃开始并达到83℃(图10)。示出了温度图(图10-续，顶部)和实时荧光信号产生(图10-续，底部)。实时信号产生在20个循环(每个循环60秒)的过程内测量。热熔融谱从MTH1-S标签融合蛋白的荧光信号相对于温度梯度的角度示出。MTH1-S标签融合蛋白的聚集温度50(Tagg50)可以计算为59℃。荧光信号可以用于确定Tagg50。
图11：时间过程信号产生-与对照比较。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。使表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞裂解，并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。将完全反应(表达MTH1 S标签的细胞裂解物+S蛋白+底物)的信号与几种对照的信号进行比较：仅MTH1-S标签、仅底物、仅S蛋白、仅底物+S蛋白、仅MTH1-S标签+底物、仅裂解物+S蛋白。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为由多个10秒循环构成的1步反应，每个循环在25℃下(左上图)。示出了温度图(右上)和实时荧光信号产生(右下)。实时信号产生在349个循环(每个循环10秒)的过程内测量。对于所有反应，均观察到信号产生的线性相和平台相。相较于所有对照，仅完全反应(表达MTH1_S标签的细胞裂解物+S蛋白+底物)实时产生荧光信号。
图12和图12-续：温度激发-与对糕比较。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。使表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞裂解，并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。将完全反应(表达MTH1_S标签的细胞裂解物+S蛋白+底物)的信号与几种对照的信号进行比较：仅MTH1-S标签、仅底物、仅S蛋白、仅底物+S蛋白、仅MTH1-S标签+底物、仅裂解物+S蛋白。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为14步反应，每个反应由多个60秒循环构成，使得在每个步骤中，温度以5℃增量斜升，从25℃开始并达到83℃(图12)。示出了温度图(图12-续，顶部)和实时荧光信号产生(图12-续，底部)。实时信号产生在14个循环(每个循环60秒)的过程内测量。热熔融谱从MTH1-S标签融合蛋白的荧光信号相对于温度梯度的角度示出。相较于所有对照，仅完全反应(表达MTH1_S标签的细胞裂解物+S蛋白+底物)实时产生温度依赖性荧光信号。MTH1-S标签融合蛋白的聚集温度50(Tagg50)可以计算为59℃。
图13和图13-续：温度激发-与对照比较。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。使表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞裂解，并与核酸酶底物+S蛋白进行互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为20步反应，每个反应由多个60秒循环构成，使得25℃下的180循环温育随后是在3℃增量下从25℃开始并达到83℃的1循环温度斜升(图13)。示出了温度图(图13-续，顶部)和实时荧光信号产生(图13-续，底部)。热熔融谱从MTH1-S标签融合蛋白的荧光信号相对于温度梯度的角度实时示出。MTH1-S标签融合蛋白的聚集温度50(Tagg50)可以计算为59℃。此图表明，可以对实时靶标接合反应进行编程，以测量响应于在一个设置中的温度激发的靶标Tagg(50)的信号成熟度和热谱。
图14、图14-续-1和图14-续-2-时间过程信号产生-使用克唑替尼剂量范围的温度 激发。
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用384孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为19步反应多重化反应，在所述多重化反应中，克唑替尼的各种剂量以温度梯度独立地测试。每个步骤由多个10秒循环构成，使得25℃下的360循环温育随后是在3℃增量下从25℃开始并达到81℃的1循环温度斜升(图14)。温度图(图14-续-1，顶部)和实时荧光信号产生(图14-续-1，底部)针对25℃温育期示出。
图14-续-2中示出了温度图与在温度斜升期期间用各种剂量的克唑替尼处理的MTH1-S标签的实时荧光/热谱的相关性。MTH1-S标签融合蛋白的聚集温度50(Tagg50)可以计算为59℃。另外，可以观察和测量克唑替尼对Tagg50的剂量依赖性影响。此图表明，可以对多重化的实时靶标接合反应进行编程，以相对于抑制剂的剂量测量靶标的聚集温度。这种类型的多重化的反应将生成多维细胞靶标接合数据。
图15、图15-续-时间过程信号产生-克唑替尼剂量范围
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为1步反应，在所述反应中，克唑替尼的各种剂量在59℃的稳定温度点处测试。1步反应步骤由180x 10秒循环构成，温度立即斜升到59℃(图15，左上)。温度图(图15，右上)和实时荧光信号产生(图15，右下)针对59℃温度激发期示出。
图15中示出了59℃温度激发与用各种剂量的克唑替尼处理的MTH1-S标签的实时荧光/热谱的相关性。注意到临界区中对曲线斜率和信号水平的剂量依赖性影响，这使得能够计算出克唑替尼的EC50为约3.2nM。
Δ-Rn可以充当剂量依赖性荧光信号的另一个读数。图15-续中示出了59℃温度激发与用各种剂量的克唑替尼处理的MTH1-S标签的实时Δ-Rn/热谱的相关性。注意到对Δ-Rn的剂量依赖性影响，这使得能够计算出克唑替尼的EC50介于3.2-16nM之间。这种类型的反应将生成多维细胞靶标接合数据。
图16、图16-续-1、图16-续-2、图16-续-3-时间过程信号产生-克唑替尼剂量范围
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应通过25℃温育混合，随后进行25℃-82℃温度激发后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为23步反应，在所述反应中，克唑替尼的各种剂量以温度梯度独立地测试。每个步骤由多个10秒循环构成，使得25℃下的360循环温育随后是在2℃增量下从25℃开始并达到82℃的3循环温度斜升(图16)。温度图(图16-续-1，顶部)和实时荧光信号产生(图16-续-1，底部)针对25℃温育期示出。
图16-续-2中示出了温度图与在温度斜升期期间用各种剂量的克唑替尼处理的MTH1-S标签的实时荧光/热谱的相关性。MTH1-S标签融合蛋白的聚集温度50(Tagg50)可以计算为59℃。另外，可以在单次运行中观察和测量克唑替尼对靶标的Tagg50的剂量依赖性影响。
图16-续-3中示出了温度图Δ-Rn/在25℃温育和温度斜升期期间用各种剂量的克唑替尼处理的MTH1-S标签的热谱的相关性。可以计算MTH1-S标签融合蛋白的聚集温度50(Tagg50)。另外，可以在单次运行中以Δ-Rn作为读数观察和测量克唑替尼对靶标的Tagg50的剂量依赖性影响。
图16表明，可以对实时靶标接合反应进行编程，以测量相对于抑制剂的剂量的靶标的聚集温度。这种类型的反应将生成多维细胞靶标接合数据。
图17、图17-续-时间过程温度斜升-克唑替尼剂量范围
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10.000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应通过25℃温育混合，随后是在5℃温度增量下的45℃-70℃温度激发后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为8步反应，在所述反应中，克唑替尼的各种剂量以温度梯度独立地测试。每个步骤由多个10秒循环构成，使得25℃下的10循环温育随后是在5℃增量下从45℃开始并达到70℃的10循环温度斜升，然后返回到25℃的60循环温育(图17)。此方法将温育和后续T激发两者与抑制剂组合。其可以在不事先了解靶标的Tagg(50)的情况下应用于任何靶标，所有均组合在一起。
温度图(图17-续，顶部)和实时荧光信号产生(图17-续，底部)针对整个运行示出。注意，靶标的实时荧光谱揭示了至少三个重要的区：剂量依赖性信号幅度区1(循环1-9)；剂量依赖性衰减斜率和T漂移区(循环40-61)；以及剂量依赖性信号幅度区2(循环75-100)。
在剂量依赖性信号幅度区1(循环1-9)中，注意到对曲线斜率和信号水平的剂量依赖性影响，这使得能够计算出克唑替尼的EC50。在剂量依赖性衰减斜率和T漂移区(循环40-61)中，注意到对曲线衰减的剂量依赖性影响，这使得能够独立计算出克唑替尼的EC50。在剂量依赖性信号幅度区2(循环75-100)中，注意到25℃下具有剂量依赖性曲线斜率和信号水平的信号的再生，这使得能够独立计算出克唑替尼的EC50。
此运行使得能够计算出细胞靶标接合的这些关键维度：1)对荧光信号幅度的剂量依赖性影响；2)在温度激发期间的剂量依赖性荧光信号衰减；3)聚集温度的(Tagg)在温度激发期间的剂量依赖性漂移；4)荧光信号水平再生到移除温度激发后的荧光信号水平；5)计算出克唑替尼的EC50介于3-16nM之间。这种类型的经编程的反应将生成多维细胞靶标接合数据。
图18、图18-续-时间过程温度斜升-克唑替尼剂量范围
HEK293细胞用编码MTH1-S标签融合体的DNA转染。使用96孔RT-QPCR反应板以设置靶标接合反应。将表达MTH1-S标签融合蛋白的HEK293细胞用在10,000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3,2nM、0，64nM、0nM的剂量范围内的克唑替尼处理1小时。然后使细胞裂解并与核酸酶底物+S蛋白互补。荧光信号的测量在RT-QPCR机器中在将反应混合，然后温度以2℃斜升从25℃斜升到83℃，以在单次运行中获得信号高分辨率后立即开始。
在RT-QPCR机器中的运行被编程为31步反应，在所述反应中，克唑替尼的各种剂量以温度梯度独立地测试。每个步骤由多个10秒循环构成，使得25℃下的3循环温育随后是在2℃增量下达到83℃的3循环温度斜升，然后返回到25℃的60循环温育(图18)。此方法将温育和后续T激发两者与抑制剂组合。其可以在不事先了解靶标的Tagg(50)的情况下应用于任何靶标，所有这些均组合在一起，由此生成高分辨率靶标接合谱。
温度图(图18-续，顶部)和实时荧光信号产生(图18-续，底部)针对整个运行示出。注意，靶标的实时荧光谱揭示了至少三个重要的区：剂量依赖性信号幅度区1(循环1-49)；剂量依赖性衰减斜率和T漂移区(循环49-80)；以及剂量依赖性信号幅度区2(循环90-120)。
在剂量依赖性信号幅度区1(循环1-49)中，注意到对曲线斜率和信号水平的剂量依赖性影响，这使得能够计算出克唑替尼的EC50。在剂量依赖性衰减斜率和T漂移区(循环49-80)中，注意到对曲线衰减的剂量依赖性影响，这使得能够独立计算出克唑替尼的EC50。在剂量依赖性信号幅度区2(循环90-120)中，注意到25℃下具有剂量依赖性曲线斜率和信号水平的信号的再生，这使得能够独立计算出克唑替尼的EC50。
此运行使得能够计算出细胞靶标接合的这些关键维度：1)对荧光信号幅度的剂量依赖性影响；2)在温度激发期间的剂量依赖性荧光信号衰减；3)聚集温度的(Tagg)在温度激发期间的剂量依赖性漂移；4)荧光信号水平再生到移除温度激发后的荧光信号水平；5)计算出克唑替尼的EC50介于3-16nM之间。这种类型的经编程的反应将生成高分辨率多维细胞靶标接合数据。
图19：监测克唑替尼对映异构体与MTH1 S标签融合体的使用QuantStudio 3实时 qPCR系统的靶标接合。
对于图19的小图A上示出的实验，将克唑替尼的(S)和(R)对映异构体两者添加到来自表达MTH1 S标签融合体的细胞的裂解物中。样品在根据如图2中的MTH1的热谱所确定的54℃下加热，随后使用QuantStudio 3实时qPCR系统进行酶互补测定和荧光检测。在图19的小图B中，来自小图A的曲线的线性部分的荧光(循环10；10分钟)相对于半对数图上的抑制剂的剂量进行绘制，并且使用非线性回归分析，以使用Log激动剂相对于可变应答四参数逻辑(4PL)回归来拟合曲线。
实例4
返回到图2，系统10被配置成用于实时或近实时细胞药物-靶标接合。例如，系统10可以用于确定测试化合物是否可以与靶多肽相互作用。在一些实施例中，系统10包括处理器14、机器22、服务器26、数据存储区30、移动用户装置34、桌面型用户装置38、外部资源46、网络50和/或其它组件。这些组件中的每种组件进而在下面描述。
处理器14被配置成在系统10中提供信息处理能力。因此，处理器14可以包括数字处理器、模拟处理器、被设计成处理信息的数字电路、被设计成处理信息的模拟电路、状态机和/或用于以电子方式处理信息的其它机制中的一者或多者。虽然处理器14在图2中被示出为单个实体，但这只是出于说明性目的。在一些实施例中，处理器14可以包括多个处理单元。这些处理单元可以物理地位于同一装置内(例如，位于机器22、服务器26、移动用户装置34、桌面型用户装置38等内)，或者处理器14可以代表协调操作的多个装置的处理功能。在一些实施例中，处理器14可以是计算装置，如桌面型计算机、膝上型计算机、智能手机、平板计算机、服务器和/或其它计算装置和/或可以包含在计算装置中。这些计算装置可以运行具有图形用户接口的一个或多个电子应用，所述图形用户接口被配置成促进与系统10的用户交互。在一些实施例中，处理器14可以包含在例如机器工具22中和/或可以控制所述机器工具。
处理器14由机器可读指令15配置以执行一个或多个计算机程序组成部分。计算机程序组成部分可以包括例如由机器可读指令15编码和/或以其它方式定义和/或嵌入在处理器14中的软件程序和/或算法。处理器14可以被配置成通过软件；硬件；固件；软件、硬件和/或固件的某种组合；和/或用于对处理器14上的处理能力进行配置的其它机制来执行计算机程序组成部分。
机器22被配置成如上所述的起作用。
在一些实施例中，处理器14通过下面参考图3描述的计算机中的一个或多个计算机执行。在一些实施例中，系统10的组件彼此通信，以便提供处理器14、机器22和/或本文所述的其它组件的功能。在一些实施例中，数据存储区30可以存储关于上面所述的操作中的一个或多个操作的数据或其它信息。服务器26可以通过将可能相关的数据存储在相对高速的存储器中，例如存储在随机存取存储器或固态驱动器中来加速对此数据的存取。服务器26可以与网页和/或其它网络信息源通信。服务器26可以将数据提供给处理与上面所描述的操作相关的数据和/或其它数据的各种应用。服务器26和数据存储区30的操作可以通过一个或多个处理器14协调(所述一个或多个处理器可以位于机器22、服务器26、移动用户装置34、桌面型用户装置38、外部资源46和/或其它计算装置内和/或由其形成)，所述一个或多个处理器可以与这些组件中的每个组件双向地通信或引导这些组件彼此通信。通信可以通过在单独的计算装置之间传输数据(例如，通过网络上的传输控制协议/互联网协议(TCP/IP)通信)、在一个计算装置上的单独应用或过程之间传输数据、或者将值传递到应用或过程内的功能、模块或对象以及从所述功能、所述模块或所述对象传递值，例如通过参考或值来进行。
在一些实施例中，可以通过处理器14、机器22、服务器26、移动用户装置34、桌面型用户装置38和/或其它组件来促进与用户的交互(例如，发送和/或接收对信息的请求等)。这可以通过用户的用户接口或在机器22上查看的本机应用、桌面型计算机(例如，桌面型用户装置38)、移动计算机(例如，移动用户装置34)如平板电脑或膝上型计算机来进行。在一些实施例中，此类交互通过在智能电话、平板电脑或其它移动用户装置上查看的移动网站，或通过在智能电话、平板电脑或其它移动用户装置上执行的专用本机应用来进行。
为了说明处理器14操作的环境的实例，图2的所示出的实施例包含多个处理器14与其通信的组件：机器22；服务器26；数据存储区30；移动用户装置34；桌面型用户装置38；以及外部资源46。这些装置通过网络50，如互联网或互联网与各种其它网络的组合，如局域网、蜂窝网络或个人局域网、内部组织网络和/或其它网络与处理器14通信。
移动用户装置34可以是智能电话、平板电脑或其它具有显示器、用户输入装置(例如，按钮、密钥、语音识别或单点或多点触摸式触摸屏)、存储器(如有形机器可读的非暂时性存储器)、网络接口、便携式能量源(例如，电池)和与这些组件中的每个组件偶接的处理器(如本文中所使用，包含一个或多个处理器的术语)的手持式联网的计算装置。移动用户装置34的存储器可以存储指令，所述指令在由相关联的处理器执行时提供操作系统和各种应用，包含网络浏览器和/或本机移动应用。
桌面型用户装置38还可以包含web浏览器、本机应用和/或其它组成部分。另外，桌面型用户装置38可以包含监视器；键盘；鼠标；存储器；处理器；以及存储指令的有形非暂时性机器可读存储器，所述指令在由处理器执行时提供操作系统、web浏览器、本机应用和/或其它组成部分。在一些实施例中，本机应用和web浏览器可操作成提供图形用户接口，所述图形用户接口与处理器14通信并且促进与来自处理器14的数据的用户交互。web浏览器可以被配置成从处理器14接收基于网站和/或其它web的通信，所述通信具有与指令(例如，在JavaScriptTM中表达的指令)相关的数据，所述指令在由浏览器(所述浏览器由处理器执行)执行时使移动用户装置34和/或桌面型用户装置38与处理器14通信并促进与来自处理器14的数据的用户交互。在由处理器14渲染网页和/或图形用户接口时，本机应用和web浏览器通常可以被称为处理器14(和/或服务器26，所述服务器可以包含处理器14)的客户端应用，在一些实施例中，所述处理器可以被称为服务器。然而，实施例不限于客户端/服务器架构，并且如所图示的，处理器14可以包含除了主要起到服务器的作用的那些组件之外的各种组件。
在一些实施例中，机器22可以包含一个或多个计算组件，所述一个或多个计算组件被配置成执行与上面所描述的移动用户装置34和/或桌面型用户装置38相关联的操作中的一个或多个操作，和/或可以包含例如桌面型用户装置38本身。
在一些实施例中，外部资源46包含信息源，如数据库、网站等；参与系统10的外部实体(例如，存储与上面所描述的操作中的一个或多个操作相关的数据的系统或网络；系统10外部的一个或多个服务器；网络(例如，互联网)；电子存储装置；与Wi-FiTM技术相关的设备；与技术相关的设备；数据输入装置；或其它资源。在一些实施例中，本文中归属于外部资源46的功能中的一些或全部功能可以通过系统10中包含的资源提供。外部资源46可以被配置成通过有线和/或无线连接、通过网络(例如，局域网和/或互联网)、通过蜂窝技术、通过Wi-Fi技术和/或通过其它资源与处理器14、机器22、服务器26、移动用户装置34、桌面型用户装置38和/或系统10的其它组件通信。所示出的处理器14、机器22、外部资源46、服务器26、桌面型用户装置38和移动用户装置34的数量仅出于解释目的进行选择，并且实施例不限于图2中图示的任何此类装置的具体数量，这并不意味着其它描述是限制性的。
系统10包含上文介绍的促进用户、其它计算系统对本文所描述的处理操作的请求和/或来自其它来源的请求的组件。例如，服务器26可以被配置成通过协议，如在超文本传输协议(HTTP)或其它协议上的基于表现层状态转换(REST)的API协议传送关于请求、那些请求的结果和/或其它信息的数据。可以通过服务器26促进的操作的实例包含对显示、链接、修改、添加或检索金属部件的电子模型的部分的请求，和/或此类请求的结果，或其它信息。API请求可以通过指定用于标识记录，如用于检索或处理关于特定金属部件的信息的查询的准则来标识哪些数据要显示、链接、修改、添加或检索。在一些实施例中，服务器26与机器22、移动用户装置34和桌面型用户装置38和/或系统10的其它组件的本机应用通信(例如，例如，以发送和/或接收此类请求)。
服务器26可以被配置成显示、链接、修改、添加或检索与特定操作相关的部分或所有数据，通过特定操作产生的结果和/或在网页(例如，通过浏览器和相关联的插件，包含脚本，如通过网页调用的JavaScriptTM的执行渲染的资源的集合)或在例如图形用户接口显示器中编码的其它信息。在一些实施例中，通过网页呈现的图形用户接口可以包含输入，用户可以通过所述输入来输入或选择数据，如可点击或可触摸的显示区或用于文本输入的显示区。此类输入可以提示浏览器从服务器26请求额外的数据或将数据传输到服务器26，并且服务器26可以通过获得所请求的数据并将其返回到用户装置或对所传输的数据进行操作(例如，存储所发布的数据或执行所发布的命令)来对此类请求作出响应。在一些实施例中，请求是针对新网页或客户端脚本将以网页的变化为基础的数据，如对序列化格式，例如JavaScriptTM对象表示(JSON)或可扩展标记语言(XML)的数据的XMLHttpRequest请求。例如，服务器26可以与由用户装置34或38执行的web浏览器、通过机器22运行的本机应用和/或其它组件通信。在一些实施例中，由服务器26基于用户装置的类型，例如，通过呈现给移动用户装置34的具有更少和更小图像和更窄宽度的移动网页以及呈现给机器22和/或桌面型用户装置38的更大、内容更丰富的网页来修改网页。用户装置的类型，例如，移动或非移动的标识符可以由web浏览器在对网页的请求中编码(例如，编码为HTTP标头中的与GET请求相关联的用户代理类型)，并且服务器26可以基于此嵌入的标识符来选择适当的接口，由此提供适当地配置成用于使用中的特定用户装置的接口。
数据存储区30存储与上面所描述的操作、对此类操作的请求、来自此类请求的结果等相关的数据。例如，数据存储区30可以包含各种类型的数据存储区，包含关系型或非关系型数据库、文件集合、分层键值对或存储器图像。此类组成部分可以在单个数据库、文件或其它组成部分中形成，或者可以存储在单独的数据结构中。在一些实施例中，数据存储区30包括电子存储介质，所述电子存储介质以电子方式存储信息。数据存储区30的电子存储介质可以包含与系统10一体地(即，基本上不可移除)提供的系统存储装置和/或可通过例如端口(例如，USB端口、火线端口等)或驱动器(例如，磁盘驱动器等)可移除地连接到系统10的可移除存储装置中的一种或两种。数据存储区30可以是(全部或部分地)系统10内的单独组件，或者数据存储区30可以与系统10的一个或多个其它组件(例如，处理器14等)一体地(全部或部分地)提供。在一些实施例中，数据存储区30可以位于数据中心中、机器22中、服务器26中、作为外部资源46的一部分的服务器中、计算装置34或38中或其它位置中。数据存储区30可以包含光学可读存储介质(例如，光盘等)、磁性可读存储介质(例如，磁带、磁性硬盘、软盘驱动器等)、基于电荷的存储介质(例如，EPROM、RAM等)、固态存储介质(例如，闪速驱动器等)和/或其它电子可读存储介质中的一种或多种。数据存储区30可以存储软件算法、通过处理器14确定的信息、通过在机器22和/或计算装置34和/或38上显示的图形用户接口接收的信息、从外部资源46接收的信息或由系统10存取以如本文中所描述起作用的其它信息。
图3是示出根据本系统的实施例的示例性计算系统1000的图。本文中所描述的系统和方法的各个部分可以包含与计算系统1000相同或类似的一个或多个计算机系统或可以在所述一个或多个计算机系统上执行。例如，处理器14、机器22、服务器26、移动用户装置34、桌面型用户装置38、外部资源46和/或系统10的其它组件(图2)可以是和/或可以包含与计算系统1000相同或类似的一个或多个计算机系统。此外，本文所述的系统10的过程、模块、处理器组件和/或其它组件可以由与计算系统1000类似和/或相同的一个或多个处理系统执行。
计算系统1000可以包含通过输入/输出(I/O)接口1050与系统存储器1020、输入/输出I/O装置接口1030和网络接口1040偶接的一个或多个处理器(例如，与图2中所示的处理器14类似和/或相同的处理器1010a-1010n)。处理器可以包含单个处理器或多个处理器(例如，分布式处理器)。处理器可以是能够执行或以其它方式执行指令的任何合适的处理器。处理器可以包含中央处理单元(CPU)，所述CPU执行程序指令，以执行计算系统1000的算术、逻辑和输入/输出操作。处理器可以执行创建程序指令的执行环境的代码(例如，处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统或其组合)。处理器可以包含可编程处理器。处理器可以包含通用或专用微处理器。处理器可以从存储器(例如，系统存储器1020)接收指令和数据。计算系统1000可以是包含一个处理器(例如，处理器1010a)的单处理器系统或包含任何数量的合适处理器(例如，1010a-1010n)的多处理器系统。多个处理器可以用于提供本文所述的技术的一个或多个部分的并行或依序执行。本文所述的过程，如逻辑流，可以由一个或多个可编程处理器执行，所述一个或多个可编程处理器执行一个或多个计算机程序，以通过对输入数据进行操作并生成对应输出来执行功能。本文所述的过程可以由专用逻辑电路系统，例如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)执行，并且设备还可以实施为所述专用逻辑电路系统。计算系统1000可以包含多个用于实施各种处理功能的计算装置(例如，分布式计算机系统)。
I/O装置接口1030可以提供用于将一个或多个I/O装置1060连接到计算机系统1000的接口。I/O装置可以包含接收输入(例如，来自用户)或输出信息(例如，输出给用户)的装置。I/O装置1060可以包含例如呈现在显示器(例如，阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)监视器)、定点装置(例如，计算机鼠标或轨迹球)、键盘、按键、触摸板、扫描装置、语音识别装置、手势识别装置、打印机、音频扬声器、麦克风、相机或其它装置上的图形用户接口。I/O装置1060可以通过有线或无线连接来连接到计算机系统1000。I/O装置1060可以从远程位置连接到计算机系统1000。例如，位于远程计算机系统上的I/O装置1060可以通过网络和网络接口1040连接到计算机系统1000。
网络接口1040可以包含网络适配器，所述网络适配器提供计算机系统1000与网络的连接。网络接口1040可以促进计算机系统1000与连接到网络的其它装置之间的数据交换。网络接口1040可以支持有线或无线通信。网络可以包含电子通信网络，如互联网、局域网(LAN)、广域网(WAN)、蜂窝通信网络或其它网络。
系统存储器1020可以被配置成存储程序指令1070或数据1080。程序指令1070可由处理器(例如，处理器1010a-1010n中的一个或多个)执行，以实施本发明技术的一个或多个实施例。指令1070可以包含用于实施本文关于各种处理模块和/或组成部分描述的一种或多种技术的计算机程序指令的模块和/或组成部分(例如，图2中所示的机器可读指令15)。程序指令可以包含计算机程序(所述计算机程序在呈某些形式时被称为程序、软件、软件应用、脚本或代码)。计算机程序可以以编程语言，包含编译型或解释型语言，或说明性或程序性语言编写。计算机程序可以包含适于在计算环境中使用，包含用作独立程序、模块、组成部分或子例程的单元。计算机程序可以或可以不对应于文件系统中的文件。程序可以存储在文件的保持其它程序或数据的部分(例如，存储在标记语言文档中的一个或多个脚本)中、存储在专用于所讨论的程序的单个文件中、或者存储在多个协调文件(例如，存储一个或多个模块、子程序、或代码的部分的文件)中。计算机程序可以部署成在本地位于一个站点处或分布在多个远程站点上的一个或多个计算机处理器上执行，并且通过通信网络互连。
系统存储器1020可以包含有形程序载体，所述程序载体上存储有程序指令。有形程序载体可以包含非暂时性计算机可读存储介质。非暂时性计算机可读存储介质可以包含机器可读存储装置、机器可读存储基板、存储器装置或其任何组合。非暂时性计算机可读存储介质可以包含非易失性存储器(例如，闪速存储器、ROM、PROM、EPROM、EEPROM存储器)、易失性存储器(例如，随机存取存储器(RAM)、静态随机存取存储器(SRAM)、同步动态RAM(SDRAM))、大容量存储存储器(例如，CD-ROM和/或DVD-ROM、硬盘驱动器)或其它存储器。系统存储器1020可以包含非暂时性计算机可读存储介质，所述非暂时性计算机可读存储介质上存储有程序指令，所述程序指令可由计算机处理器(例如，处理器1010a-1010n中的一个或多个)执行，以引起本文所描述的主题和功能性操作。存储器(例如，系统存储器1020)可以包含单个存储器装置和/或多个存储器装置(例如，分布式存储器装置)。用于提供本文所描述的功能的指令或其它程序代码可以存储在有形的非暂时性计算机可读介质上。在一些情况下，整个指令集可以并行地存储在介质上，或者在一些情况下，指令的不同部分可以在不同时间存储在同一介质上，例如，可以通过将程序代码写入到网络接口中的先进先出缓冲器来创建副本，其中所述指令中的一些指令在将所述指令的其它部分写入到所述缓冲器之前被推送到所述缓冲器之外，其中所述指令中的所有指令驻留在缓冲器上的存储器中，但并非全部同时驻留在所述存储器中。
I/O接口1050可以被配置成协调处理器1010a-1010n、系统存储器1020、网络接口1040、I/O装置1060和/或其它外围装置之间的I/O流量。I/O接口1050可以执行协议、定时或其它数据转化，以将来自一个组件(例如，系统存储器1020)的数据信号转换为适于供另一个组件(例如，处理器1010a-1010n)使用的格式。I/O接口1050可以包含对通过各种类型的外围总线，如外围组件互连(PCI)总线标准或通用串行总线(USB)标准的变体附接的装置的支持。
本文中所描述的技术的实施例可以使用计算机系统1000或被配置成托管实施例的不同部分或实例的多个计算机系统1000的单个实例来实施。多个计算机系统1000可以提供本文所描述的技术的一个或多个部分的并行或依序处理/执行。
本领域的技术人员将理解，计算机系统1000仅仅是说明性的，并且不旨在限制本文所描述的技术的范围。计算机系统1000可以包含可以执行本文所描述的技术或以其它方式提供所述技术的执行的装置或软件的任何组合。例如、计算机系统1000可以包含或可以是云计算系统、数据中心、服务器机架、服务器、虚拟服务器、桌面型计算机、膝上型计算机、平板计算机、服务器装置、客户端装置、移动电话、个人数字助理(PDA)、移动音频或视频播放器、游戏控制台、车载计算机、电视或连接到电视的装置(例如、Apple TVTM)、或全球定位系统(GPS)、或其它装置的组合。计算机系统1000还可以连接到未示出的其它装置，或者可以作为独立系统操作。另外，在一些实施例中，由所展示组件提供的功能可以组合在较少组件中或分布在额外组件中。类似地，在一些实施例中，可以不提供所展示的组件中的一些组件的功能，或者可使用其它另外的功能。
本领域的技术人员还将理解，尽管各个项被图示为在使用时存储在存储器或存储装置中，但是出于存储器管理和数据完整性的目的，这些项或其一部分可以在存储器与其它存储装置之间转移。可替代地，在其它实施例中，软件组件中的一些或全部可以在另一个装置上的存储器中执行，并且通过计算机间通信与所展示的计算机系统通信。系统组件或数据结构中的一些或全部也可以存储(例如，作为指令或结构化数据)在计算机可存取介质或便携式物品上，以由适当的驱动器读取，所述适当的驱动器的各个实例在上文描述。在一些实施例中，存储在与计算机系统1000分离的计算机可存取介质上的指令可以通过传输介质或信号，如通过如网络或无线链路等通信介质而传送的电信号、电磁信号或数字信号来传输到计算机系统1000。各个实施例可以进一步包含在计算机可存取介质上接收、发送或存储根据前述描述而实施的指令和/或数据。因此，本发明可以用其它计算机系统配置来实践。
实例5-具有S标签(Micro标签)的融合蛋白的不同热谱特征
材料和方法：
HEK-293细胞来自ATCC公司(ATCC，目录号CRL-1573)，并且在补充有10％胎牛血清(FBS)(密理博西格玛公司，目录号F2442)和1x青霉素/链霉素(密理博西格玛公司，目录号P4333)的DMEM(密理博西格玛公司，目录号D5796)中培养。胰蛋白酶-EDTA溶液1X(0.05％胰蛋白酶、0.02％EDTA)来自密理博西格玛公司(目录号59417C)，并且20X TBS溶液来自Teknova公司(目录号T1680)。Triton-X-100来自密理博西格玛公司(目录号X100)。洗涤剂正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)来自密理博西格玛公司(目录号D4641)。MTH1抑制剂(S)克唑替尼来自密理博西格玛公司(目录号PZ0240)。BCL6抑制剂BI-3812和BI-5273来自勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)。DMSO来自密理博西格玛公司(目录号673439)。96孔板来自CELLTREAT科技公司(目录号229196)；白色PCR板来自伯乐公司(BIORAD，目录号MLL9651)，并且用于密封PCR板的Microseal‘B’膜来自伯乐公司(目录号MSB1001)；黑色96孔板来自科士达公司(COSTAR，目录号3915)。细胞的转染使用Lipofectamine 2000转染试剂(赛默飞世尔科技公司，目录号11668027)根据制造商推荐的方案实现。经优化的荧光底物(5′-6FAM/ArUAA/3′TAMRA_(NHS酯)(v3))购自IDT公司(IDT)。由泓迅技术公司使用KPN1GGTACC和BamH1 GGATCC克隆位点将S蛋白用6x His标签在羧基末端处克隆到载体pET-30a(+)中以用于细菌表达。S蛋白His标签融合蛋白由泓迅技术公司从细菌中表达和纯化。
编码RNA酶供体的经克隆的构建体的序列如下：
编码6x His标签的序列是粗体，并且TAG终止密码子是加下划线的。
带His标签的RNA酶供体蛋白(S蛋白)的对应经翻译的氨基酸序列为：
S标签受体肽与mutT同源物(MTH1)蛋白(即，靶多肽)的克隆由泓迅技术公司进行。S标签受体肽克隆到MTH1的羧基末端在载体pcDNA3.1(+)中如下进行：克隆位点KPN1GGTACC和BamH1 GGATCC(粗体)。
生成了如下所示的在MTH1与S标签肽(加下划线的)之间没有接头的编码构建体：
包括MTH1和羧基末端S标签受体肽的所产生的融合蛋白的经翻译的氨基酸序列在下面示出。S标签受体肽的20个氨基酸序列是加下划线的。确定了S标签可以缩短到前15个氨基酸，并且仍然可以充当S标签受体肽。
还生成了如下所示的包括位于MTH1靶多肽与S标签受体肽(加下划线的)之间的3个氨基酸接头(加方框的)的融合蛋白的编码构建体：
进行BCL6(B细胞淋巴瘤6)S肽micro标签构建体的合成在Twist Biosciences公司(Twist Biosciences)处进行，并且对应的核苷酸序列为：
小写字母标识羧基末端处的S肽核苷酸残基。所表达的蛋白质的所产生的蛋白质氨基酸序列在下面示出，并且S肽序列是加下划线的：
EGFR S肽标签构建体的合成在Twist Biosciences公司处进行，并且对应的核苷酸序列为：
羧基末端处的S肽核苷酸序列是加下划线的。所表达的蛋白质的所产生的蛋白质氨基酸序列为：
羧基末端处的S肽序列是加下划线的。
A.细胞转染和裂解物制备
使用Lipofectamine 2000，根据制造商方案，对HEK293细胞进行转染。在转染后两天，去除培养基，并且通过使用1X TBS上下移液来提升细胞。将细胞以400g离心4分钟。将TBS洗涤液去除，并且将细胞针对MTH1和BCL6用含1％Triton X 100的TBS裂解，或用含0.5％DDM的TBS针对表达EGFR的细胞裂解。将细胞在旋转器上在4℃下裂解1小时，并且将细胞碎屑通过在6000rpm下轻轻离心1分钟来去除。将裂解物转移到新管，并且将不立即用于测定的等分式样冷冻在-80℃下，以供未来使用。
B.热谱
将由过表达构建体的细胞制备的裂解物用1X TBS1/10稀释，并且将40ul等分到PCR管或板，并在热循环仪中以一定热梯度加热15分钟。加热后，立即在酶互补中测定样品。将含1.25μg/ml S蛋白和250nM FRET标记的核酸底物的1X TBS与0.5％DMSO的混合物与经加热的样品合并，并且使用微板读取器检测荧光。用PolarStar Omega 96孔板读取器在动力学模式(激发＝485nm，发射＝520nm)下读取板。每分钟读取每个板，进行20分钟(生成了21个时间点)。
为了确定热谱并确定Tagg、Tmax或Tmin，将每分钟生成的RAW荧光或荧光信号相对于温度进行绘制。S形图鉴定聚集温度、或最大信号、或最小信号。
C.小分子靶标接合筛选
将小分子化合物以10mM溶解于DMSO中，并且由此储备液制备于100X浓度的DMSO中的连续稀释液。将来自表达带micro标签的(带S肽标签的)蛋白质的细胞的裂解物用冷1XTBS以1/10稀释，并且将39.6ul等分到PCR板中；添加0.4ul 100X小分子，将板密封，涡旋并离心2分钟。然后将板在适当温度下加热15分钟，随后在25℃下冷却1分钟。制备反应缓冲液(含1.25μg/ml S蛋白结合伴侣和250nM FRET标记的底物的1X TBS与0.5％DMSO)，并将120ul转移到黑色96孔板中。添加经加热的样品(30ul)，并且使用微板读取器检测荧光。用PolarStar Omega 96孔板读取器在动力学模式(激发＝485nm，发射＝520nm)下读取板。
为了进行分析，使用GraphPad Prism将RAW荧光信号或每分钟的荧光变化相对于半对数尺度上的抑制剂剂量绘制。使用非线性回归分析以进行曲线拟合，以鉴定靶标接合的EC50或表观KD。
结果
Micro标签(S标签)应用于细胞靶标接合依赖于蛋白质热熔融的原理。使表达Micro标签构建体的细胞或细胞裂解物经受热梯度，以鉴定聚集温度。所述聚集温度是蛋白质的一部分变性并聚集，由此变得不可溶的温度。在热漂移测定中，蛋白质可以通过影响蛋白质构象的配体的结合而从这种热变性中挽救，从而使其在变性条件下，如热激发下更稳定。
A.带Micro标签的靶标的热谱
为了筛选将与带micro标签的构建体结合的配体，使表达构建体的细胞或由这些细胞制备的非变性裂解物经受热梯度，以鉴定蛋白质的聚集温度。然而，此Micro标签系统的一个有趣的特征在于，对带标签的蛋白质的热激发鉴定出若干个不同的热特征：聚集温度(Tagg)、最大信号温度(Tmax)和最小信号温度(Tmin)(图36A-36C)。
在55℃(Tagg)下加热过表达MTH1 micro标签(带S肽标签的)蛋白的细胞或来自细胞的裂解物可以用于筛选将与MTH1带micro标签的蛋白结合并使其稳定化，从而产生更高的荧光信号的分子。micro标签(S肽)测定系统检测到与反应中的带micro标签的蛋白质的量直接成比例的荧光增加。与活性全RNA酶(与S蛋白互补的S肽)的快速酶动力学组合的实时监测荧光信号产生的能力提供了其它类似靶标接合策略不可能实现的独特特征；监测FRET标记的底物耗竭。如图34中所示，此系统可以用于检查由FRET标记的底物的切割直接引起的随时间推移的荧光的产生(相对光单位(RLU)变化/分钟)。反应的前3分钟内的荧光信号的增加、约3分钟至4分钟时的峰值荧光和4分钟后的荧光的下降均与测定中的带micro标签的蛋白质的量直接成比例。这显示了测定在提供用于对带micro标签的蛋白质的水平直接进行定量的不同方式方面的灵活性。
B.筛选与带micro标签的蛋白质结合的分子
在鉴定出所关注的蛋白质的最大信号温度(Tmax)、聚集温度(Tagg)或最小信号的温度(Tmin)后，然后可以评估在这些温度下的配体结合。如果配体与带micro标签的蛋白质结合，则从结合事件中可能发生构象变化，所述构象变化将使带micro标签的蛋白质在热或其它变性激发中稳定化。在此，采用BCL6带Micro标签的蛋白以及其良好表征的勃林格殷格翰公司抑制剂BI-3812，所述抑制剂的体外IC50为约3nM。BI-3812的紧密结构类似物是非活性化合物BI-5273，所述非活性化合物的体外IC50为约10uM。将这些抑制剂与来自过表达BCL6Micro标签的HEK293细胞的细胞或裂解物一起温育实现对靶标接合的EC50的鉴定(图38A-38B)。
4分钟温育后，可以将检测到的荧光相对于在半对数尺度上测试的抑制剂的剂量进行绘制。使用非线性回归分析以及使用GraphPad Prism拟合S形剂量-应答曲线(具有可变斜率)鉴定出靶标接合的EC50。BCL6特异性抑制剂BI-3812与BCL6 micro标签蛋白以0.63nM的靶标接合的EC50结合(图38A-38B)。非活性类似物不与靶标结合。允许S蛋白反应持续较长时间段(10-15分钟)导致FRET标记的底物的缺失，如通过在已使靶标稳定化的BI-3812的浓度下每分钟的荧光增加(RLU/分钟)的减少所证明的。峰值荧光信号鉴定出使micro标签蛋白靶标饱和的抑制剂的剂量。在高于此饱和剂量的抑制剂的浓度下，FRET标记的底物快速切割，从而导致荧光信号随时间推移而丢失(相对光单位/分钟(RLU/分钟)))，并且检测到较低荧光。在低于此饱和剂量的浓度下，micro标签构建体在热激发中变性，并且可用于酶互补的micro标签较少，从而导致荧光信号较低(图36A)。去除超出靶饱和剂量的数据点允许：(1)确定靶标接合的EC50，以及(2)确定与蛋白质靶标结合的药物的表观平衡解离常数(表观KD)(图39B和39C)。通过此方法确定的靶标接合的EC50分别非常接近于表观KD 0.9nM和1.6nM。
C.生理学上下文中的定量结合动力学数据
所述方法可以用于鉴定药物使蛋白质靶标饱和以产生最大荧光的药物的剂量。靶饱和剂量可以通过这种方法鉴定，如图40A-C中的时间过程所示出的。在较长温育时间的情况下，通过随时间推移的荧光信号下降鉴定出拐点，所述下降发生在5分钟后(图40B)。信号在较长温育后达到峰值的剂量是靶饱和剂量(图40C)。其中较长温育开始使荧光信号随时间推移而降低的点是拐点。峰值荧光被称为Emax值(最大效应)。已知使给定靶标饱和的药物的浓度是药物发现的重要参数，因为其可用于定义靶标占有率。靶标接合的EC50使用在较高药物浓度下发生的任何信号降低之前的早期时间点(0分钟)，根据半对数尺度上的荧光信号相对于药物浓度的S形剂量应答曲线来确定(图40D)。使用GraphPad Prism软件拟合S形剂量应答曲线的非线性回归分析鉴定出靶标接合的EC50(图40D和图39B)。还可以使用GraphPad Prism将可观察到的荧光信号数据拟合到饱和结合方程(单位点总数)(图40E和图39C)。这鉴定出与蛋白质靶标结合的药物的表观平衡解离常数(表观KD)，所述表观平衡解离常数与观察到的靶标接合的EC50类似(图40E和图39C)。可以进行可观察到的荧光数据拟合到饱和结合方程，因为预期靶标结合与荧光应答之间的关系直到药物达到饱和浓度时直接成比例。
作为鉴定靶饱和剂量、Emax和表观KD的另一个实例，测试了MTH1带Micro标签的蛋白和抑制剂(S)克唑替尼。将抑制剂与蛋白质一起在热激发期间温育，随后进行酶互补和荧光检测实现了鉴定2分钟后的靶标接合的EC50(图41A)。在较长的温育时间(10分钟)的情况下，对于较高的药物剂量，荧光随时间推移而降低。信号在较长温育后达到峰值的剂量是靶饱和剂量(图41B)。峰值荧光被称为Emax值(图41B)。使用GraphPad Prism软件拟合S形剂量应答曲线的非线性回归分析鉴定出靶标接合的EC50为约43nM(图41A)。还可以使用GraphPad Prism将可观察到的荧光信号数据拟合到饱和结合方程(单位点总数)(图41C)。这鉴定出表观平衡解离常数(表观KD)为32nM，这与使用S形剂量应答曲线拟合在2分钟时间点时鉴定出的靶标接合的EC50(43nM)相似。
讨论
采用S肽标签(Micro标签)的方法具有优于其它酶互补策略的若干优点。首先，短标签(15个至20个氨基酸)小到足以使其不干扰带标签的蛋白质靶标的折叠、定位、蛋白质-蛋白质相互作用和功能。其次，采用与S蛋白的酶互补以及使用FRET标记的核酸底物以生成荧光信号具有快速反应的优点，所述快速反应可以实时监测(图35)。此方法以及荧光检测为此技术提供了一些独特的特征。一些靶标的鉴定蛋白质熔融的最大温度和最小温度的热谱具有优点(图36A-36C)。可以在通常显著低于聚集温度的那些温度下筛选用于配体结合的具有Tmax和Tmin的蛋白质。
此技术的特征是反应的速度(图37)。FRET标记的底物的快速酶促切割允许确定酶互补的前5分钟内的靶标接合的EC50。然后，这可以随时间推移进行跟踪，以鉴定小分子使蛋白质靶标饱和的剂量。使用FRET标记的底物耗竭后的峰值荧光值(Emax)，以鉴定饱和剂量。FRET标记的核酸底物的这种RNA酶切割的速度导致FRET标记的底物在10分钟至20分钟内耗竭。这随着荧光信号随时间推移的降低而被实时地检测。这种峰值荧光(靶饱和剂量)在来自靶蛋白的稳定化的信号的增加通过来自过量的稳定化的蛋白质靶标的信号的减少(快速FRET耗竭)平衡时产生。小分子使其靶标饱和的剂量可用于对靶标占有率，即与药物发现高度相关的特征进行定量。
提供了用于对与其蛋白质靶标在生理环境中结合的小分子进行定量动力学分析的能力，作为荧光读数，这直接是配体结合的稳定化的带micro标签的蛋白质的结果。表观平衡解离常数(KD)可以因为在反应中鉴定出靶饱和剂量而确定。消除超过饱和剂量的剂量允许饱和结合曲线可以提供与靶标结合的小分子的表观KD。从FRET标记的底物耗竭之前的早期时间点确定的靶标接合的EC50与根据饱和结合曲线确定的表观KD量度相关。
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如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则所有数值或数值范围包含此类范围内的整数和数值的分数或范围内的整数。此外，当本文描述了值列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，列表包含其所有中间值和分数值(例如，，54％、85.4％)。因此，为了说明，对80％或更大值的引用包含81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等。
对更多(更大)或小于的整数的引用分别包含大于或小于参考数字的任何数字。因此，例如，对小于100的引用包含99、98、97等，一直到数字一(1)；并且小于10包含9、8、7等，一直到数字一(1)。
如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则所有数值或范围包含值的分数和在此类范围内的整数以及在此类范围内的整数的分数。因此，为了说明，对数值范围的引用，如1-10包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等。因此，对1-50的范围的引用包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直到50并包含50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等。
对一系列范围的引用包含组合所述系列内的不同范围的边界的值的范围。因此，为了说明对一系列范围，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000的引用包含10-50、50-100、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000等的范围。
在不脱离技术的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。尽管已经参考一个或多个具体实施例对技术进行了实质性详细描述，但本领域的普通技术人员将认识到，可以对本申请中具体公开的实施例进行改变，但是这些修改和改进在技术的范围和精神内。
本发明在本文中大体上使用肯定语言来公开，以描述许多实施例和方面。本发明还具体包含其中特定主题被全部或部分地排除的实施例，如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。例如，在本发明的某些实施例或方面中，排除材料和/或方法步骤。因此，即使本发明一般不以本发明不包含的内容在本文中表达，但未明确包含在本发明中的方面仍然在本文中公开。
本文示意性地描述的技术可以在不存在本文未具体公开的任何元件的情况下适当地实践。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一个可以被其它两个术语中的任一个替代。已采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且此类术语和表达的使用不排除所示和描述的特征或其区段的任何等效物，并且各种修改在所要求保护的技术的范围内是可能的。术语“一个(a)”或“一种(an)”可以指其修饰的要素中的一者或多者(例如，“试剂”可以指一种或多种试剂)，除非在上下文上清楚，描述了要素中的任一者或要素中的多于一者。如本文所用，术语“约”是指在基础参数的10％内的值(即，正负10％)，并且在值串开始时使用术语“约”修饰值中的每个值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可以包含介于90克与110克之间的重量。如本文所用，术语“基本上”是指值修饰语，其意指“至少95％”、“至少96％”、“至少97％”、“至少98％”或“至少99％”，并且可以包含100％。例如，基本上不含X的组合物可以包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的X，和/或X可在组合物中不存在或不可检测到。短语“基本上同时”意指当时或在数秒的时间帧内(例如在0秒至10秒的窗口内)发生。
因此，应当理解，尽管本技术已通过代表性实施例具体公开，并且本文公开的概念的可选特征、修改和变化可以由本领域的技术人员采用，并且此类修改和变化被视为在本技术的范围内。
非正式序列表：

Claims (29)

1.一种确定测试化合物是否能够与靶多肽相互作用的方法，所述方法包括：
(a)制备使得融合蛋白能够在系统内接触的反应溶液，所述系统包括：
(i)测试化合物或媒剂，
(ii)变性剂，
(iii)核酸酶供体，
(iv)核酸底物，和/或
(v)信号控制器；以及
(b)通过使用被配置成检测荧光、所产生的光或其衍生物的机器来实时检测所述核酸底物的切割产物的量和速度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述机器是qPCR或RT-qPCR机器。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述qPCR或RT-qPCR机器被编程为混合、发起、放大信号、寄存信号、使数据解卷积、分析实时从所述反应溶液中获得的数据，其中程序包括以下中的任一项：
a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分在不同时间添加；
b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据能够自动地定义下一个模块的命令；
c)运行单重或多重反应；
d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；
e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；
f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；
g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；
h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；
i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或
j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以鉴定信号图案。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述机器生成靶标接合数据，所述靶标接合数据被配置成促进所述测试化合物与所述靶多肽之间的接合的多维确定和定量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述靶标接合数据被配置成促进结合化学计量、靶标占有率、停留时间、KD、K-on、K-off和EC50的鉴定。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述机器被编程为生成所述靶标接合数据，其中程序包括以下中的任一项：
a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分单独地和/或在不同时间添加；
b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据能够自动地定义下一个模块的命令；
c)运行单重或多重反应；
d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；
e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；
f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；
g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；
h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；
i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或
j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以找到信号图案。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包括：
(a)所述靶多肽和核酸酶受体，
(b)所述靶多肽和核酸酶，或
(c)所述靶多肽和核酸酶的N末端结构域以及第一结构域，所述第一结构域允许所述N末端结构域与同一核酸酶的C末端结构域二聚化，所述C末端结构域与第二结构域融合，所述第二结构域与所述允许二聚化的结构域互补。
8.根据权利要求7所述的方法，其中(a)的所述核酸酶受体是S标签受体肽，并且所述核酸酶供体是RNA酶S复合物的S蛋白。
9.根据权利要求7所述的方法，其中(b)的所述核酸酶选自由以下组成的组：Cas9、微球菌核酸酶、RNA酶H、非天然核酸酶混合物，如Cas9-Fok1和Cpfl/Cas12a。
10.根据权利要求7所述的方法，其中(c)的所述核酸酶是Cas9，所述允许二聚化的第一结构域是Coh2，并且所述第二结构域是DocS。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述信号控制器是远红光。
12.根据权利要求1所述的方法，其中反应溶液的部分或整体在所述机器外部或内部制备，使得：
反应的整体在所述机器内部制备；
反应的部分在所述机器外部制备，然后转移到所述机器中；和/或
某些反应组分被一次或依序注入到所述机器中。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述机器在回路中与本地或远程连接的其它机器通信。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述溶液保持在与实时荧光测量兼容的容器内，并且其中所述机器被编程为实时读取来自所述反应溶液的荧光信号。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述容器是与实时荧光测量兼容的管或多孔板。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多孔板包括使得反应能够多重化的微流控芯片。
17.一种非暂时性计算机可读介质，其上具有指令，所述指令在由计算机执行时使所述计算机执行根据权利要求1至16所述的方法中的任一种。
18.一种机器，其被配置成确定测试化合物是否能够与靶多肽相互作用，其中所述机器包括一个或多个处理器，所述一个或多个处理器由机器可读指令配置以：
(a)促进制备使得融合蛋白能够在系统内接触的反应溶液，所述系统包括：
(i)测试化合物或媒剂，
(ii)变性剂，
(iii)核酸酶供体，
(iv)核酸底物，和/或
(v)信号控制器；以及
(b)通过使用被配置成检测荧光、所产生的光或其衍生物的机器来实时检测所述核酸底物的切割产物的量和速度。
19.根据权利要求18所述的机器，其中所述机器是qPCR或RT-qPCR机器。
20.根据权利要求19所述的机器，其中所述qPCR或RT-qPCR机器被编程为混合、发起、放大信号、寄存信号、使数据解卷积、分析实时从所述反应溶液中获得的数据，其中程序包括以下中的任一项：
a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分在不同时间添加；
b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据能够自动地定义下一个模块的命令；
c)运行单重或多重反应；
d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；
e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；
f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；
g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；
h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；
i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或
j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以鉴定信号图案。
21.根据权利要求18所述的机器，其中所述机器生成靶标接合数据，所述靶标接合数据被配置成促进所述测试化合物与所述靶多肽之间的接合的多维确定和定量。
22.根据权利要求21所述的机器，其中所述靶标接合数据被配置成促进结合化学计量、靶标占有率、停留时间、KD、K-on、K-off和EC50的鉴定。
23.根据权利要求21所述的机器，其中所述机器被编程为生成所述靶标接合数据，其中程序包括以下中的任一项：
a)将反应溶液分批或按注入模式混合，在分批的情况下，所有成分从混合开始时添加，在按注入模式的情况下，成分单独地和/或在不同时间添加；
b)运行反应模块，每个反应模块具有其自身的命令，使得在一个模块中生成的数据能够自动地定义下一个模块的命令；
c)运行单重或多重反应；
d)运行动力学系列，其中在不事先了解靶多肽的热谱的情况下对温度和化合物剂量的各种组合进行测试；
e)在进行或不进行搅动或激励的情况下进行一次或多次不同时间的温育；
f)使温度线性地、逐步定期地或不定期地斜升，其中每个斜升步骤用其自身的温度范围、速度、重复数和温度/信号比定义；
g)引入温度温育、信号激励和暂停的交替步骤；
h)进行数据寄存、放大、转化、解卷积和/或分析；
i)在本地或远程机器回路内传送数据；和/或
j)使用经编程的分析方法解析所生成的元数据，以找到信号图案。
24.根据权利要求18所述的机器，其中所述融合蛋白包括所述靶多肽和S标签受体肽。
25.根据权利要求18所述的机器，其中反应溶液的部分或整体在所述机器外部或内部制备，使得：
反应的整体在所述机器内部制备；
反应的部分在所述机器外部制备，然后转移到所述机器中；和/或
某些反应组分被一次或依序注入到所述机器中。
26.根据权利要求18所述的机器，其中所述机器在回路中与本地或远程连接的其它机器通信。
27.根据权利要求18所述的机器，其中将所述溶液保持在与实时荧光测量兼容的容器内，并且其中所述机器被编程为实时读取来自所述反应溶液的荧光信号。
28.根据权利要求27所述的机器，其中所述容器是与实时荧光测量兼容的管或多孔板。
29.根据权利要求28所述的机器，其中所述多孔板包括使得反应能够多重化的微流控芯片。
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