CN118681057B - 高度仿生型多功能组织工程化骨膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高度仿生型多功能组织工程化骨膜及其制备方法和应用，涉及高分子材料和生物医用材料领域。该骨膜具有独特的多层结构，自下而上依次为：纳米纤维膜‑干细胞复合层、负载血管内皮细胞的水凝胶层和纳米纤维薄膜层。底层的纳米纤维膜‑细胞层是铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜，有效承载骨髓间充质干细胞后，经层层叠加技术形成，有效复刻了天然骨膜的生发层。中间层引入了铕掺杂介孔二氧化硅复合水凝胶，诱导内皮细胞体外预血管化，再现了天然骨膜的中间基质层。上层的纳米纤维薄膜层有效模拟了天然骨膜浅表层的隔离屏障功能。该仿生骨膜在促进骨组织快速生长、加速血管网络形成以及有效隔离纤维组织长入方面展现出显著效果。

Description

高度仿生型多功能组织工程化骨膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，特别是一种高度仿生型多功能组织工程化骨膜及其制备方法和应用。

背景技术

修复由创伤、肿瘤切除或先天性畸形引起的大骨缺损一直是骨科的重大临床挑战。自体移植物和同种异体移植物被认为是骨缺损修复的金标准疗法，但受到多种因素的限制，包括供体有限、疾病传播和免疫应答等多种因素的限制。组织工程技术通过结合细胞和生物材料来修复组织缺陷，为解决这些问题提供了新的选择。然而，由于成骨效率低和血管形成能力不足，组织工程化骨修复支架在临床应用方面仍然面临挑战。

天然骨膜作为一种高度复杂且多功能的结缔组织，广泛覆盖于各种骨骼外表面，内部密布微血管系统与骨细胞网络。从结构角度，骨膜可精细划分为三层：最内层为紧贴骨面的生发层（inner cambium layer），由疏松排列的纤维基质构成，富含具有成骨潜能的细胞群，是骨组织再生与修复的关键区域；中间层为基质层（matrix layer），其内部富含密集且层状排列的微血管网络，可有效为生发层运输营养物质和排泄代谢产物，并在骨损伤修复中发挥输送骨祖细胞的作用；最外层为浅表纤维层（outer fibrous layer），主要由粗大的胶原纤维束、弹性蛋白和成纤维细胞组成的纤维化区，不仅作为骨表面的主要防御屏障，还参与维持骨组织的稳定性和形态。天然骨膜具有复杂的三维结构和多功能性，使其在骨修复与再生过程中起着关键作用。在骨愈合阶段，骨膜依靠其丰富的血液供给系统和细胞储备，显著促进骨祖细胞的激活，从而加速骨组织的再生与重建。因此，仿生构建出具备类似天然骨膜三层结构及多功能性的组织工程化骨膜具有重要意义。

当前，国内外学者在应用组织工程技术构建仿生骨膜方面已经取得了一定进展。其中，静电纺丝技术通过高压电场作用，可产生直径从纳米级至微米级的纤维，与天然细胞外基质构成的三维网状结构极为相似。此外，电纺纤维支架的高比表面积有助于细胞粘附、药物装载和物质交换。因此，静电纺丝技术在构建仿生骨膜基底支架方面具有显著优势，能够高效、便捷、大规模地制备出与天然基质在组成、结构和力学特性等方面相似的柔性膜状支架，适用于包裹各种大小和形状的骨缺损。

近年来，部分国内外学者开始运用静电纺丝技术构建组织工程化骨膜。然而，目前构建的组织工程骨膜主要集中于模拟天然骨膜生发层的成骨特性，而忽略了基质层中微血管化网络对骨形成的重要作用。此外，静电纺丝技术制备的微纳米纤维支架孔径较小，限制了细胞的迁移和浸润生长，无法充分模拟天然骨膜内多细胞的空间分布，难以形成功能仿生型骨膜样组织。因此，开发一种能够模拟并再现天然骨膜复杂三维结构与功能的组织工程化仿生支架，已成为当前科研领域亟待攻克的关键技术挑战，对于推动骨组织修复与再生技术的进步具有重要意义。

发明内容

本发明涉及组织工程领域，特别是关于一种高度仿生型、多功能的组织工程化骨膜，旨在提供一种能有效促进骨膜修复和骨组织再生的三层结构骨膜及其制备方法。传统的组织工程骨膜构建方式难以重塑天然骨膜的复杂精密结构和引入微血管网络，因此难以实现功能仿生。本发明采用新颖的从下至上、从部分到整体的组合法构建了具有多重仿生功能的三层骨膜，使其能够充分模拟天然骨膜的解剖生理学特性，由底层、中层和上层叠加组成，包括具有诱导成骨能力的深面生发层、富含微血管网络且可在移植早期建立有效血供的中间基质层、以及具有生物屏障隔离作用的浅表纤维层。

该仿生骨膜的底层是由原料聚已内酯、丝素蛋白和铕掺杂介孔二氧化硅颗粒混合后，通过静电纺丝制成的铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜，简称NF-ME纤维膜；并在其上接种骨髓间充质干细胞（BMSCs）。通过层层叠加的方式进行仿生构建，充分模拟天然骨膜的生发层。这种层层叠加方法不仅可以精确调控每层的基质纤维组成和形貌以及细胞类型，还能有效克服传统电纺纤维支架因孔径狭小而限制细胞浸润的局限性，真实地模拟天然组织中细胞所处的三维环境。此外，支架缓释的铕离子和硅离子已被证实可显著促进BMSCs生长和成骨分化，为骨再生修复提供了良好平台。

该仿生骨膜的中层为铕掺杂介孔二氧化硅复合胶原水凝胶层，通过将铕掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒分散在胶原溶液中制备而成，并在水凝胶内负载血管内皮细胞（VECs），简称Gel-ME，模拟天然骨膜中富含微血管网络的中间基质层。胶原水凝胶本身具有优异的生物相容性和生物降解性，能够提供细胞生长所需的微环境。铕元素的掺杂进一步增强了胶原水凝胶的生物活性，释放的铕离子能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速血管新生，从而促进仿生骨膜中微血管网络的形成，提高移植早期的血供建立效率。

该仿生骨膜的上层是以聚已内酯和丝素蛋白为纺丝原料的静电纺丝膜，简称NF纤维膜。其主要功能是模拟天然骨膜的浅表纤维层，作为隔离屏障，防止成纤维细胞侵入成骨区域，为骨膜提供稳定的成骨微环境。

本发明的高度仿生型多功能组织工程化骨膜的制备方法，具体如下：

S1、制备铕掺杂介孔二氧化硅颗粒，简称Eu-MSN颗粒；具体方法如下：

将氢氧化铵和十六烷基三甲基溴化铵溶于水中形成水溶液，将四乙氧基硅烷的乙醇溶液加入水溶液中，在40 ℃下搅拌5 h，然后加入六水合硝酸铕，将溶液在室温下静置过夜，得到的沉淀物干燥后，在600 ℃煅烧6 h，得到Eu-MSN颗粒。

S2、将Eu-MSN颗粒分散在六氟异丙醇中获得均匀的悬浮液，然后将聚已内酯（PCL）和丝素蛋白（SF）溶于悬浮液中，搅拌均匀，得到纺丝溶液；然后进行静电纺丝，制得铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜，简称NF-ME纤维膜。

静电纺丝的方法是：在通风橱中将20G针头安装于5 mL注射器上并吸取电纺溶液，排净针头内空气后，将注射器固定于供液泵上，连接高压电源。静电纺丝参数设置为：环境温度30±1℃、环境湿度30±2%、15 KV电压、11 cm接收距离和1.5 mL/h的供液速度，裁取适当尺寸的锡箔纸铺展在收集板上，收集电纺纳米纤维膜。将得到的纤维膜置于乙醇中浸泡10 min，以诱导丝素蛋白构象的转变，室温通风干燥4 h。

S3、采用聚已内酯（PCL）和丝素蛋白（SF）为纺丝原料，按照步骤S2的静电纺丝方法，制得PCL/SF共混电纺膜，即为NF纤维膜。

S4、层层叠加组合法构建组织工程化仿生骨膜支架，包括以下三个子步骤：

S41、将骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种于NF-ME纤维膜上；

S42、将Eu-MSN颗粒分散在胶原冰醋酸溶液中，用NaOH调胶调节pH至6.7～7.3，该过程控制溶液温度为4 ℃，并将血管内皮细胞细胞均匀封装于胶内，然后将溶液涂覆于NF纤维膜的上表面，37 ℃静置数分钟使其微成胶，得到复合水凝胶层；

S43、将步骤S41获得的单片NF-ME纤维膜由下至上依次叠放至少三片，然后将步骤S42获得的含有复合水凝胶层的NF纤维膜以复合水凝胶层朝下的方式叠放于NF-ME纤维膜上，形成多层叠加膜。将多层叠加膜放置于37 ℃细胞培养箱中待胶原成胶后取出，再于培养基中培养24 h以上，得到组织工程化骨膜。

优选的是，所述Eu-MSN颗粒中铕与硅的摩尔比为（0.5-2）:100，简称ME0.5、ME1和ME2。

优选的是，步骤S2中，聚已内酯和丝素蛋的用量质量比为4:1，Eu-MSN颗粒的用量是聚已内酯和丝素蛋总质量的10%。

优选的是，步骤S42中，冰醋酸的浓度是0.2 M，胶原溶液的浓度是6 g/L，Eu-MSN颗粒在胶原溶液中的浓度是5 g/L。

一种优选的方式，步骤S43中，形成多层叠加膜的具体方法如下：

（1）准备两个相同的圆环形固定件，分别为第一圆环和第二圆环，圆环两端开口的口径尺寸不同；第一圆环的大口径端的内径与第二圆环的小口径端的外径相互匹配套合；第一圆环的小口径端的内径与第二圆环的大口径端的内径同样可以相互匹配套合。

（2）将第一圆环小口径端向上放置，将步骤S41获得的单片NF-ME纤维膜铺置覆盖在第一圆环上，由下至上依次叠放铺置至少3片，然后将步骤S42获得的NF纤维膜盖于三层叠加膜之上，然后将第二圆环的大口径端从NF纤维膜上方朝下套合固定在第一圆环的小口径端上，通过两个圆环的匹配套合，实现各层膜的固定连接，形成多层叠加膜。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

（1）本发明中将Eu-MSN与聚己内酯PCL、丝素蛋白SF共混制备纳米复合电纺膜，并将单片的纳米纤维膜-干细胞层从二维平面叠加成三维立体结构，更精准地模仿体内细胞所处的复杂生理微环境，为骨髓间充质干细胞（BMSCs）提供一个更为接近自然状态的生长平台，从而诱导BMSCs成骨分化，模拟骨膜结构中具有成骨能力的深面的生发层；将Eu-MSN加入胶原凝胶，诱导内皮细胞体外预血管化，模拟具有血管网络的中间基质层；PCL/SF共混电纺膜模拟具有隔离作用的浅表层。采用层层叠加法，由下至上、从部分到整体，将每层功能性组件逐层组装成一个完整的组织工程化骨膜，充分模拟了天然骨膜的三层结构和多功能性，构建出一种高度仿生型组织工程化骨膜。该三层仿生骨膜在促进骨生长、血管生成和隔离纤维组织长入方面效果显著，适用于骨缺损修复。

（2）铕（Eu）是一种能够促进血管生成的潜在元素，对伤口愈合和组织再生非常有利。研究发现，Eu不仅具有独特的促血管生成特性，能够促进血管内皮细胞的增殖和刺激血管萌发，还能影响骨重塑周期，有助于治疗骨质疏松等骨密度疾病。本发明将Eu掺入介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）中，制备成可降解、可控离子释放的均匀纳米球，然后将其分别引入到纳米纤维膜和水凝胶中，制备出具有优异生物活性和力学性能的多层仿生骨膜，显著提高了成骨细胞和内皮细胞的增殖和分化能力。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例中制备的高度仿生型多功能组织工程化骨膜的流程图和骨膜的结构示意图；其中（a）为制备流程图，（b）为制备的骨膜的多层结构示意图。

图2为本发明实施例中制备的各种纳米颗粒的形貌表征图。

图3为本发明实施例中制备的复合纳米纤维膜的形貌观察图。

图4为本发明实施例中制备的复合纳米纤维膜NF-ME1的成分分析图；其中（a）为各元素的分析图，（b）为EDS图谱；（c）为各元素的含量分析图。

图5为BMSCs细胞与不同纤维膜表面培养1、3和7天后的FDA/PI染色结果。

图6为BMSCs细胞与不同纤维膜表面培养1、3和7天后的增殖活性检测结果。n = 3,a: vs NF组，p<0.05; b: vs NF-M组，p<0.05; c: vs NF-ME0.5 组，p<0.05; d: vs NF-ME1组，p<0.05; e: vs NF-ME2组，p<0.05。

图7为鬼笔环肽染色和细胞铺展面积统计结果。其中（a）为鬼笔环肽染色图，（b）为细胞铺展面积统计图；a: vs NF组，p<0.05; b: vs NF-M组，p<0.05; c: vs NF-ME0.5 组，p<0.05; d: vs NF-ME1组，p<0.05; e: vs NF-ME2组，p<0.05。

图8为BMSCs细胞在不同纤维膜表面培养3、7和14天后的成骨标志性基因——Runx2、Alp和Ocn表达结果。其中（a）、（b）和（c）分别是Runx2、Alp和Ocn表达结果图。n = 3,a: vs NF组，p<0.05; b: vs NF-M组，p<0.05; c: vs NF-ME0.5 组，p<0.05; d: vs NF-ME1组，p<0.05; e: vs NF-ME2组，p<0.05。

图9为BMSCs在不同纤维膜上培养7天后的ALP免疫荧光染色图像和半定量分析结果。其中（a）为ALP免疫荧光染色图像，（b）为半定量分析结果。

图10为BMSCs细胞在不同纤维膜表面培养7和14天后的ALP活性结果。n = 3, a:vs NF组，p<0.05; b: vs NF-M组，p<0.05; c: vs NF-ME0.5 组，p<0.05; d: vs NF-ME1组，p<0.05; e: vs NF-ME2组，p<0.05。

图11为VECs细胞在不同凝胶组中培养1、3和5天后的增殖活性检测结果。n = 3,a: vs Gel组，p<0.05; b: vs Gel-M组，p<0.05; c: vs Gel-ME0.5 组，p<0.05; d: vsGel-ME1组，p<0.05; e: vs Gel-ME2组，p<0.05。

图12为血管分化相关基因的qRT-PCR检测结果。其中（a）、（b）、（c）和（d）分别是Vegf、Tgfβ1、Fgfr1和Fgf2的结果图。n = 3, a: vs Gel组，p<0.05; b: vs Gel-M组，p<0.05; c: vs Gel-ME0.5 组，p<0.05; d: vs Gel-ME1组，p<0.05; e: vs Gel-ME2组，p<0.05。

图13为体外成管实验的图片和统计结果图，包括交点数、节点数、总长度、分支数和网格数统计结果图；（a）为体外成管实验的图片，（b）为统计结果图。

图14为细胞迁移实验的图片和统计结果；其中（a）为细胞迁移实验的图片，（b）为统计结果图。

图15为仿生骨膜的荧光示踪检测图片。

图16为仿生骨膜的HE染色实验结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种铕掺杂介孔二氧化硅（Eu-MSN）颗粒的制备：

将2 mL氢氧化铵（NH₃H₂O）和0.728 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）加入200 mL蒸馏水中，在40 ℃搅拌1 h，得到水溶液；将0.045 g六水合铕（Eu(NO₃)₃·6H₂O）和4.167 gTEOS加入100 mL乙醇中，然后将乙醇溶液加入水溶液中，在40℃下搅拌5 h，然后将溶液在室温下静置过夜，得到沉淀物；以7000 rpm离心15 min，并用蒸馏水和乙醇洗涤3次，将清洗后的沉淀物在真空下60 ℃干燥24 h，然后在空气中以1 ℃/min的升温速率升温至600 ℃煅烧6 h，除去结构导向模板CTAB，得到铕掺杂介孔二氧化硅，简称Eu-MSN0.5。

按照上述方法，改变Eu(NO₃)₃·6H₂O的用量分别为0.09 g和0.182 g，制备得到不同Eu掺杂量的Eu-MSN1和Eu-MSN2。

未掺杂Eu的纯二氧化硅MSN的制备方法：将2 mL氢氧化铵（NH₃H₂O）和0.728 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）加入200 mL蒸馏水中，在40 ℃搅拌1 h，得到水溶液。将4.167 g四乙氧基硅烷（TEOS）溶于100 mL乙醇中，然后加入到水溶液中，在40 ℃下搅拌5 h；然后以7000 rpm离心15 min，并用蒸馏水和乙醇洗涤3次，将清洗后的沉淀物在真空下60 ℃干燥24 h，然后在空气中以1 ℃/min的升温速率升温至600 ℃煅烧6 h，除去结构导向模板CTAB，得到介孔二氧化硅，简称MSN。

实施例2

一种高度仿生型多功能组织工程化骨膜的制备方法，如图1（a）所示，具体如下：

（1）纺丝溶液配制：取10 mg实施例1制备的三种Eu-MSN0.5、Eu-MSN1和Eu-MSN2分别分散在1 mL六氟异丙醇（FHIP）中，超声1 h，直到获得均匀的悬浮液。然后，称取80 mg聚已内酯（PCL）和20 mg丝素蛋白（SF）加入上述悬浮液中，室温下搅拌12 h，得到纺丝溶液。

（2）静电纺丝操作：确认静电纺丝仪处于安全状态，保证器件接头连接正确。在通风橱中将20 G针头安装于5 mL注射器上并吸取纺丝溶液，排净针头内空气后，将注射器固定于供液泵上，连接高压电源。电纺参数设置为：环境温度30±1 ℃、环境湿度30±2 %、15KV电压、11 cm接收距离和1.5 mL/h的供液速度。裁取适当尺寸的锡箔纸铺展在收集板上，收集电纺纤维膜。待纺丝结束后，关闭仪器与高压电源，在室温干燥24 h后，制备得到三种纳米纤维膜，分别命名为NF-ME0.5、NF-ME1和NF-ME2纤维膜。将制备的静电纺丝膜置于乙醇中浸泡10 min，以诱导丝素蛋白构象的转变，室温通风干燥4 h。

（3）将静电纺丝技术制备出的三种纳米纤维膜（NF-ME0.5、NF-ME1和NF-ME2）放置于紫外灯下灭菌照射1 h。灭菌完成后，将三种纳米纤维膜分别放于皿中，同时将BMSCs消化、离心、计数并按照4.55×10⁴个/cm²的密度，分别均匀接种于三种纤维膜的表面，置于37℃细胞培箱1 h，待细胞贴于纳米纤维膜上后加入完全培养基，置于37 ℃，5%的CO₂细胞培养箱培养48 h，得到接种有BMSCs的NF-ME0.5、NF-ME1和NF-ME2纤维膜。

（4）采用聚已内酯（PCL）和丝素蛋白（SF）为纺丝原料，不添加Eu-MSN颗粒，按照步骤（1）和（2）进行静电纺丝，制得PCL/SF共混电纺膜，即为NF纤维膜；而在纺丝过程中添加介孔二氧化硅（MSN）颗粒，制备得到MSN复合纤维膜，即为NF-M纤维膜。

（5）铕掺杂介孔二氧化硅（Eu-MSN）复合水凝胶的制备：将实施例1制备的MSN、Eu-ME0.5、Eu-MSN1和Eu-MSN2颗粒分别以5 g/L的浓度均匀分散在6 g/L的I型胶原冰醋酸溶液中，然后用NaOH溶液调节pH值至中性。当胶原溶液的pH=7时（整个过程需要保持胶原在低温4 ℃状态），加入血管内皮细胞（VECs）。接着，将四种细胞-胶原悬浮液分别滴加在覆盖有NF纤维膜的圆形玻片上（膜面积为1.54 cm²，涂覆30 µL悬浮液）。然后，将含有胶原液滴的玻片转移到24孔板中，并置于37℃恒温箱中静置数分钟，使胶原成胶，得到负载VECs的四种复合水凝胶层，分别命名为Gel-M、Gel-ME0.5、Gel-ME1和Gel-ME2。不添加MSN和Eu-MSN纳米颗粒，制得纯胶原水凝胶，命名为Gel。

（6）层层叠加组合法构建多层仿生骨膜：

将接种有BMSCs的NF-ME1纤维膜铺置在第一个圆环固定件（铁环）上，由下至上依次叠放3片，然后，将含有复合水凝胶层（Gel-ME1）的NF纤维膜以复合水凝胶层朝下的方式叠放于三层电纺纤维膜上。接着，使用第二个圆环固定件（铁环）将其固定，形成多层叠加膜，命名为3D@NF/Gel-ME。将多层叠加膜放置于37 ℃细胞培养箱中静置10 min，待胶原成胶后，取出放入6孔板中，每孔加入8 mL混合完全培养基，完全浸没铁环，并在培养基中培养24 h以上，即可得到组织工程化骨膜。组织工程化骨膜的结构如图1（b）所示。

一、对实施例1和2制备的不同纳米颗粒及复合静电纺丝纳米纤维膜进行了物理表征。

1、纳米颗粒的形貌观察

分别利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察各组制备的纳米颗粒的形态结构和表面形貌。如图2所示，从SEM结果可以看出，所有的纳米颗粒都表现为均匀的球形形貌，且纳米球分散良好；从TEM结果可以看出，各组纳米颗粒都为均匀的球形形貌，且具有有序的介孔结构（上方误差棒为200 nm，下方误差棒为50 nm）。Eu掺入量的增加（从0.5 mol%到2 mol%）对颗粒大小没有显著影响。

2、复合纳米纤维膜的材料学表征

利用扫描电子显微镜（SEM）观察电纺PCL/SF纳米纤维膜（NF）以及掺杂不同铕含量的介孔二氧化硅纳米颗粒（Eu-MSN）的电纺PCL/SF纳米纤维膜（NF-M、NF-ME0.5、NF-ME1和NF-ME2）的形貌特征。如图3所示，纳米纤维随机分布并形成交织网络结构，且Eu-MSN纳米颗粒的添加未对纳米纤维膜的形态产生明显影响（p>0.05）。

利用能量色散X射线能谱（EDS）分析复合纳米纤维膜（NF-ME1）的元素分布。如图4所示，其中（a）为各元素的分析图，（b）为EDS图谱；（c）为各元素的含量分析图。由图可知，电纺纳米纤维膜内氧、硅和铕元素均匀分布。

二、对实施例2制备的不同的组织工程化骨膜进行如下性能测试。

1、成骨能力的测试

（1）Eu-MSN复合纳米纤维膜上BMSCs细胞的活性与增殖

FDA/PI活死染色：FDA/PI染色可以直观地展现BMSCs细胞在纳米纤维膜上的活细胞数量和分布情况。如图5所示，各组复合纳米纤维膜上绿色的活细胞长势良好，几乎没有观察到红色的死细胞，表明各组纤维膜均具有良好的生物相容性。接种第一天，五组材料表面的细胞数量较少，铺展程度较低。第三天，各组材料上的活细胞逐渐增多并呈现梭形和多角形，表明BMSCs细胞的铺展状态良好。随着培养时间的延长，从第3天到第7天，各组BMSCs细胞量成倍增加。相比于NF、NF-M和NF-ME2组，较低铕含量的纤维膜组（NF-ME0.5和NF-ME1）更加显著地促进了BMSCs的粘附和增殖。

CCK-8检测：CCK-8检测表征了NF、NF-M、NF-ME0.5、NF-ME1、NF-ME2五组复合纳米纤维膜与BMSCs共培养第1、3和7天后的细胞增殖情况。如图6所示，随着培养时间的延长，BMSCs细胞显著增殖，表明各组纤维膜都能够促进细胞持续的生长，具有良好的生物相容性。在第1天，不同组之间的细胞增殖没有显著差异（p>0.05）。在第3天和第7天，每组细胞数量都明显增加，且较低铕含量的纤维膜组（NF-ME0.5和NF-ME1）的细胞数量显著高于其他组，这可能归因于其释放的微量铕离子（Eu³⁺）对BMSCs细胞增殖的促进作用。

（2）Eu-MSN复合纳米纤维膜上BMSCs细胞的铺展与形貌

鬼笔环肽染色：将BMSCs细胞分别接种在五组复合纳米纤维膜表面，培养3天后，采用鬼笔环肽对细胞骨架进行了染色。如图7所示，其中（a）为鬼笔环肽染色结果图，红色为细胞骨架，蓝色为细胞核。结果发现，BMSCs细胞在五组纳米纤维膜上均呈现出典型的成纤维细胞表型，包括多角形和不规则三角形。图7（b）为细胞铺置面积统计图，可以看出，较低铕含量的纤维膜组（NF-ME0.5和NF-ME1）能显著促进BMSCs细胞的铺展，其中NF-ME1展现出最佳的增强细胞铺展的效果。

（3）Eu-MSN复合纳米纤维膜上BMSCs细胞的成骨分化

成骨标志性基因的表达：通过实时荧光定量qRT-PCR法，研究不同纤维膜对BMSCs细胞的成骨相关标志基因——Runx2、碱性磷酸酶（Alp）和骨钙素（Ocn）表达的影响。结果如图8所示，其中，（a）、（b）和（c）分别是Runx2、Alp和Ocn表达结果图，相比于NF组，第7天时，含有纳米颗粒的四组纤维膜显著上调了早期成骨标志性基因——Runx2和Alp的表达。虽然NF组在第3天具有较高的Runx2基因表达，但NF-ME1组在第3和7天均显示出最高的Runx2基因表达，并在所有时间点显著上调了Alp和Ocn基因的表达。结果表明，Eu-MSN复合纳米纤维膜所释放的Eu²⁺具有显著的促成骨分化作用，且呈现浓度依赖性，NF-ME1组表现出最佳的促成骨效果。

碱性磷酸酶（ALP）染色和活性测定：为了探究不同纤维膜对BMSCs细胞成骨分化的影响，检测了不同组别上BMSCs细胞的ALP蛋白表达水平。如图9所示，其中（a）为ALP免疫荧光染色图像，（b）为半定量分析结果。ALP免疫荧光染色结果表明，在培养第7天，含有Eu-MSN纳米颗粒的复合纤维膜显著促进了ALP蛋白的表达，其中NF-ME1组具有更高的ALP蛋白表达。进一步使用定量试剂盒定量对ALP表达进行了定量测定，如图10所示，在培养第7天和第14天，NF-ME1组的ALP活性显著高于其他各组；而在第14天，NF组的ALP活性显著低于NF-ME0.5和NF-ME1组。

上述结果表明，含有Eu-MSN纳米颗粒的复合纤维膜对BMSCs细胞的增殖、铺展和成骨分化均有显著的促进作用，可能归因于Eu³⁺的促成骨作用，且呈现浓度依赖性，其中NF-ME1纤维膜表现出最强的促成骨效果。因此，后续实验将选取NF-ME1纤维膜来构建仿生骨膜。

2、成血管作用测试

（1）CCK-8检测

如图11所示，CCK-8检测表征了VECs细胞与纯胶原水凝胶（Gel）和不同铕掺杂量的复合胶原水凝胶（Gel-M、Gel-ME0.5、Gel -ME1、Gel -ME2）共培养第1、3和5天后的细胞增殖情况。随着培养时间的延长，VECs细胞显著增殖，表明这五组胶原水凝胶均能维持细胞持续的生长，具有良好的生物相容性。在第1天和第3天，相比于纯水凝胶组（Gel），含有MSN纳米颗粒的Gel-M凝胶组能够显著增加细胞增殖，可能归因于MSN颗粒所释放的Si离子的促细胞增殖作用。而在所有时间点，三组含有Eu-MSN纳米颗粒的复合水凝胶对细胞增殖的促进作用更加显著，其中Gel -ME1组显示出最高的细胞量，可能与其释放的微量铕离子促进VECs的增殖密切相关。

（2）成血管相关基因的表达

采用RT-qPCR法定量检测不同材料组上VECs细胞的成血管相关标志基因的表达，包括：血管内皮生长因子（Vegf）、转化生长因子β1（Tgfβ1）、成纤维细胞生长因子2（Fgf2）和成纤维细胞生长因子受体1（Fgfr1）。结果如图12所示，（a）、（b）、（c）和（d）分别是血管内皮生长因子（Vegf）、转化生长因子β1（Tgfβ1）、成纤维细胞生长因子受体1（Fgfr1）和成纤维细胞生长因子2（Fgf2）的结果图。相比于Gel组和Gel -M组，含有Eu-MSN纳米颗粒复合凝胶组在第3天具有更高的Fgfr1基因表达，在第5天具有更高的Fgf2和Fgfr1基因表达。在第3天，Gel-ME0.5组显著上调了Tgfβ1、Fgf2和Fgfr1基因的表达；在第5天，Gel -ME1组具有最高的Vegf、Tgfβ1、Fgf2和Fgfr1表达量。结果揭示出，Eu的引入具有显著促成血管的作用。

（3）体外成管实验

在组织修复过程中，内皮细胞作为早期血管网络重建的重要细胞，能够自发形成血管样结构。因此，通过成管实验来考察五组水凝胶的促血管生成能力。实验结果如图13所示，（a）为体外成管实验的图片，（b）为统计结果图。可以看出，五组水凝胶均能促进VECs细胞形成血管样网络结构。其中，Gel-ME1组在交点数、节点数、总长度、分支数和网格数方面均显著高于其他各组，表明Gel-ME1表现出更强的促血管生成潜能。

（4）细胞迁移实验

采用不同复合纳米颗粒凝胶浸提液处理后的VECs细胞的划痕愈合情况如图14所示。其中（a）为细胞迁移实验的图片，（b）为统计结果图。结果表明，在培养12小时和24小时，相比于Gel组，含纳米颗粒的复合水凝胶组显著促进了VECs细胞的迁移，而Eu-MSN纳米颗粒组的促迁移效果更为显著。其中，Gel -ME1组在各个时间点均表现出最快的迁移速度，直至24小时，Gel-ME1组的划痕基本愈合。划痕实验结果表明，Gel-ME组水凝胶中释放的Eu³⁺能够显著提升VECs细胞的迁移能力，达到更好的促血管效果。

上述结果表明，Gel-ME1水凝胶表现出最强的促成血管潜能。因此，后续实验将选取Gel-ME1水凝胶来构建仿生骨膜。

3、仿生骨膜的检测

（1）荧光示踪实验

为了考察两种细胞在仿生骨膜中的空间分布，我们分别采用活细胞示踪染料——Dio（绿色荧光）和Dil（红色荧光）对BMSCs和VECs细胞进行荧光标记，以确保细胞在后续处理中的可视化追踪。随后，将Dio标记的BMSCs接种于电纺纳米纤维膜上，通过逐层叠加，形成三层细胞/纳米纤维交替复合支架（3D@NF-ME），模拟天然骨膜的生发层。再将Dil标记的VECs负载于复合胶原凝胶中，置于上述支架之上，以模拟天然骨膜的血管化中间层，表面覆盖一层模拟浅表层的电纺薄膜，形成复杂三维结构的仿生骨膜（3D@NF/Gel-ME）。培养1天后，取出样品，采用冰冻切片技术进行包埋切片，通过倒置荧光显微镜观察仿生骨膜多层结构内部不同荧光标记的两种细胞的分布情况。如图15所示，在3D@NF-ME样品内部，绿色荧光标记的BMSCs通过逐层组装呈均匀分布，且展现出清晰的层级结构，表明逐层叠加方法能够将BMSCs细胞包埋在纳米纤维支架内部。而在3D@NF/Gel-ME样品中，红色荧光标记的VECs则特异性地定位于胶原层内，紧密覆盖于绿色荧光标记的BMSCs之上。这一空间分布模式与实验设计的细胞叠加顺序高度一致。结果表明，利用层层叠加法制备的仿生骨膜（3D@NF/Gel-ME）能够精确重现天然骨膜中细胞的空间分布，并确保细胞处于三维模拟天然基质的环境中，从而为细胞增殖和分化提供了适宜条件。

（2）组织学切片染色

对培养3天后的仿生生发层（3D@NF/ME）和仿生骨膜（3D@NF/Gel-ME）进行组织学切片观察。如图16所示，与冰冻切片结果一致，3D@NF/ME组内部的细胞分布与预设层数相吻合，可明确辨识出三层结构特征。大部分区域的三层细胞/纳米纤维膜支架实现了紧密结合，形成了稳固的整体结构，而少数局部区域则出现了一定程度的分层现象。进一步采用逐层组装和层层叠加法所构建的3D@NF/Gel-ME组，成功制备出了充分模拟天然骨膜的复杂而精细三维结构的仿生骨膜，不但包含下方的仿生生发层（3D@NF/ME），还引入了负载VECs细胞的中层复合凝胶层和上方纳米纤维薄膜，三者之间紧密连接，形成了层次分明的复合结构。在此结构中，细胞分布与预设层数高度一致，各层结构清晰可辨，充分展示了该仿生骨膜在结构上的精准复制与功能上的潜在优势。

值得注意的是，HE染色结果表明，相比于3D@NF-ME组，3D@NF/Gel-ME组展现出更高的层间融合度，并且其成分结构特征与天然骨膜高度相似。这可能归因于仿生中间层负载的VECs细胞，这些细胞可以分泌多种成长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）及转化生长因子-β（TGF-β）等。这些生长因子能够促进下方仿生生发层内部的BMSCs细胞增殖和基质分泌，从而加强层间粘合，将细胞紧密包埋于纳米纤维内部，实现更为稳固与高效的层间结合。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种高度仿生型多功能的组织工程化骨膜，其特征在于，该骨膜结构由底层、中间层和上层通过叠加构建组成；

所述底层为纳米纤维膜-干细胞复合层，由至少三片负载骨髓间充质干细胞的铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜叠加而成；所述铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜由原料聚已内酯、丝素蛋白及铕掺杂介孔二氧化硅颗粒混合后，通过静电纺丝制成，简称NF-ME纤维膜；并在NF-ME纤维膜上接种有骨髓间充质干细胞；

所述中间层为负载血管内皮细胞的铕掺杂介孔二氧化硅复合水凝胶；所述铕掺杂介孔二氧化硅复合水凝胶是将铕掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒分散在胶原溶液中制备而成，并在水凝胶内封装有血管内皮细胞；

所述上层为纳米纤维薄膜层，是以聚已内酯和丝素蛋白为纺丝原料的静电纺丝膜，简称NF纤维膜。

2.一种如权利要求1所述的高度仿生型多功能的组织工程化骨膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备铕掺杂介孔二氧化硅颗粒，简称Eu-MSN颗粒；

S2、将Eu-MSN颗粒分散在六氟异丙醇中获得均匀的悬浮液，然后加入聚已内酯和丝素蛋白，搅拌均匀，得到纺丝溶液；再通过静电纺丝制得铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜，即NF-ME纤维膜；

S3、以聚已内酯和丝素蛋白为原料通过静电纺丝，制得NF纤维膜；

S4、通过层层叠加组合法构建组织工程化骨膜，包括以下三个子步骤：

S41、将骨髓间充质干细胞接种于NF-ME纤维膜上；

S42、将胶原溶解在冰醋酸中配制成胶原溶液，然后加入Eu-MSN颗粒并分散均匀，调节pH至6.7～7.3，该过程控制溶液温度为4 ℃，接着，将血管内皮细胞均匀悬浮于混合溶液中，然后将混合溶液涂覆于NF纤维膜的上表面，37 ℃静置数分钟，形成复合水凝胶层；

S43、将步骤S41获得的单片NF-ME纤维膜由下至上依次叠放至少三片；然后将步骤S42获得的含有复合水凝胶层的NF纤维膜以复合水凝胶层朝下的方式叠放于NF-ME纤维膜上，形成多层叠加膜；将多层叠加膜放置于37 ℃细胞培养箱中待胶原成胶后取出，加入培养基，37 ℃培养24 h以上，得到组织工程化骨膜。

3.如权利要求2所述的高度仿生型多功能的组织工程化骨膜的制备方法，其特征在于，步骤S1中，Eu-MSN颗粒的制备方法如下：

将氢氧化铵和十六烷基三甲基溴化铵溶于水中形成水溶液，将四乙氧基硅烷的乙醇溶液加入水溶液中，在40 ℃下搅拌5 h，然后加入六水合硝酸铕，溶液在室温下静置过夜，得到的沉淀物干燥后，在600 ℃煅烧6 h，得到Eu-MSN颗粒。

4.如权利要求3所述的高度仿生型多功能的组织工程化骨膜的制备方法，其特征在于，所述Eu-MSN颗粒中铕与硅的摩尔比为（0.5-2） ：100。

5.如权利要求2所述的高度仿生型多功能的组织工程化骨膜的制备方法，其特征在于，步骤S2中，聚已内酯和丝素蛋白的质量比为4:1，Eu-MSN颗粒的用量占聚已内酯和丝素蛋白总质量的10%。

6.如权利要求5所述的高度仿生型多功能的组织工程化骨膜的制备方法，其特征在于，步骤S2中，静电纺丝参数设置为：环境温度30±1 ℃、环境湿度30±2%、电压15 KV、接收距离11 cm和供液速度1.5 mL/h，将锡箔纸铺展在收集板上，收集纳米纤维膜。

7.如权利要求2所述的高度仿生型多功能的组织工程化骨膜的制备方法，其特征在于，步骤S42中，冰醋酸的浓度是0.2 M，胶原溶液的浓度是6 g/L，Eu-MSN颗粒在胶原冰醋酸溶液中的浓度是5 g/L。