CN118684772A

CN118684772A - 抗4-1bb的激动型抗体及其应用

Info

Publication number: CN118684772A
Application number: CN202311375595.4A
Authority: CN
Inventors: 任志衡; 介淼星; 李文佳
Original assignee: Guangdong HEC Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong HEC Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2022-09-01
Publication date: 2024-09-24
Also published as: CN116253799B; CN116253799A; WO2023036041A1

Abstract

本文公开了抗体或其抗原结合部分，及其人源化的抗体或其抗原结合部分，以及这些抗体或其抗原结合部分在治疗癌症中的用途。

Description

抗4-1BB的激动型抗体及其应用

技术领域

本公开属于生物技术领域，具体涉及4-1BB的抗体及其应用。更具体地，本公开涉及能特异性识别人源4-1BB的鼠源抗体、人源化抗体或其抗原结合片段、药物组合物、检测试剂盒及其应用。

背景技术

4-1BB(也称为CD137、TNFRSF9等)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的成员。4-1BB广泛存在于免疫细胞亚系，例如激活的自然杀伤性(NK)细胞和自然杀伤性(NKT)细胞、调节性T细胞、树突状细胞(DC)、刺激的肥大细胞、分化中的髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中(Wang,2009,Immunological Reviews229:192-215)，参与调节细胞增殖、分化和程序性细胞死亡。

人4-1BB是具有255个氨基酸的蛋白质。该蛋白质包含氨基酸第1～17位的信号序列，随后是169个氨基酸的胞外结构域，27个氨基酸的跨膜区，及42个氨基酸的胞内结构域(Cheuk ATC et al.,2004,Cancer Gene Therapy,11:215-226)。4-1BB在细胞表面以单体和二聚体形式上表达，并且易于与配体三聚体化而进行信号传导。

据报道，4-1BB是活化T细胞的共刺激受体，4-1BB的交联可增强T细胞增殖、IL-2分泌、存活和细胞溶解活性。4-1BB还可以诱导外周单核细胞的增殖，增强由TCR/CD3触发的激活和受调节的CD28共刺激诱导的T细胞凋亡，从而促进Th1细胞应答。它的表达是由淋巴细胞激活诱导的，并且除4-1BB配体外，还发现了TNF受体相关因子(TRAF)衔接子蛋白与4-1BB结合，导致激活NF-κB的信号转导。已经开发了针对4-1BB的特异性激动型抗体，并发现这样的抗体可增强T细胞功能并促进抗肿瘤活性。

因此，仍然需要开发和改进针对4-1BB的特异性激动型抗体。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开提供了具有治疗应用的且安全的特异性结合4-1BB的抗体或其抗原结合部分。本公开的针对4-1BB的特异性抗体或其抗原结合部分是针对4-1BB的激动型抗体。针对4-1BB的激动型抗体显示出优异的抗肿瘤作用。因此，预期这些激动型抗体或其抗原结合部分可通过调节免疫应答，例如通过调节CD4⁺细胞、CD8⁺细胞、树突状细胞和/或天然杀伤细胞的活性来有效治疗癌症或自身免疫性疾病。

为此，本公开涉及与4-1BB结合并引发由4-1BB介导的细胞信号传导的分离的抗体或其抗原结合部分。

根据本公开的一个方面，提供了一种特异性结合4-1BB或其片段的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，所述HCDR1包括选自由1、7、13、19、25或31所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，例如其中1～4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述HCDR2包括选自如SEQ ID NO:2、8、14、20、26或32所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，例如其中1～10个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述HCDR3包括选自如SEQ ID NO:3、9、15、21、27或33所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，例如其中1～2个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述LCDR1包括选自如SEQ ID NO:4、10、16、22、28或34所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，例如其中1～10个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述LCDR2包括选自如SEQ ID NO:5、11、17、23、29或35所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，例如其中1～6个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述LCDR3包括选自如SEQ ID NO:6、12、18、24、30或36所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，例如其中1～8个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述抗体可以是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，本公开的抗体或抗原结合部分能够结合4-1BB上的不同表位，或者结合除了4-1BB之外的其他抗原或表位。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括：包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括：包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括：包括如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括：包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括：包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括：包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括：包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括：包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括：包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括：包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括：包括如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括：包括如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:37、39、41、43、45或47所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:38、40、42、44、46或48所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

DVQPQQSGAELVRPGASVKLSCKALGYTFTDYEMYWVRQTPVHGLEWIGAIHPGSGGTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTELRYWGQGTTLTVSASS(SEQ ID NO:37)。

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DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:42)。

QVQMKESGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTYAVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGITDYNAAFISRLSISKDDSKSQVFFKMSSLQANDTAIYYCARNGAYYGNAYYYAMDYWGQGTSVTVSASS(SEQ ID NO:43)。

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DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:52)。

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DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:54)。

QVQMKESGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTYAVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGITDYNAAFISRLSISKDDSKSQVFFKMSSLQANDTAIYYCARNGAYYGNAYYYAMDYWGQGTSVTVSASSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:55)。

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QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARFRHYGYDGFAYWGQGTSVTVSASSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:57)。

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKMLVYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAKDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:58)。

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTKSGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAREGEFRSVTTVVFDYWGQGTSVTVSASSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:59)。

DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYFCQNGHSFPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:60)。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体或其抗原结合部分包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体或其抗原结合部分包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体或其抗原结合部分包括如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体或其抗原结合部分包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体或其抗原结合部分包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体或其抗原结合部分包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链，和如SEQ IDNO:50所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链，和如SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链，和如SEQ IDNO:54所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体包括如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链，和如SEQ IDNO:56所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体包括如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链，和如SEQ IDNO:58所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链。

根据本公开的一些实施方式，上述抗体包括如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的重链，和如SEQ IDNO:60所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的轻链。

根据本公开的另一方面，提供了一种由上述抗体或其抗原结合部分衍生的人源化抗体或其抗原结合部分。

根据本公开的一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述HCDR1具有由SYWX₁X₂所示的氨基酸序列，其中X₁选自异亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸，X₂选自天冬酰胺、组氨酸或苏氨酸；所述HCDR2具有由X₃IYPSDTYTX₄YX₅QKFQX₆所示的氨基酸序列，其中X₃选自天冬酰胺或异亮氨酸，X₄选自天冬酰胺、天冬氨酸或丝氨酸，X₅选自天冬酰胺或丙氨酸，X₆选自天冬氨酸或甘氨酸；所述HCDR3具有如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述HCDR1具有如SEQ ID NO:7、61、62或63所示的氨基酸序列；所述HCDR2具有如SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列；所述HCDR3具有如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，上述重链可变区还包括框架区(FR)；该重链可变区的框架区(H-FR)可以包括，含SEQ ID NO:79或80所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR1，含SEQ ID NO:81～84中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～5个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR2，含SEQ ID NO:85～89中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～12个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR3，和含SEQ ID NO:90或91中所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～3个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR4。

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT(SEQ ID NO:79)。

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:80)。

WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID NO:81)。

WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:82)。

WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:83)。

WVRQAPGQGLEWVG(SEQ ID NO:84)。

KATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYLCTR(SEQ ID NO:85)。

RVTLTVDTSTSTVYMELSSPRSEDTAVYLCAR(SEQ ID NO:86)。

RVTLTRDTSTSTVYMELSSPRSEDTAVYLCAR(SEQ ID NO:87)。

RVTLTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYLCAR(SEQ ID NO:88)。

RATLTVDTSTSTAYMELSSPRSEDTAVYLCAR(SEQ ID NO:89)。

WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:90)。

WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:91)。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:132～138中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述LCDR1具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～10个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述LCDR2具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～6个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述LCDR3具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～8个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，上述轻链可变区还包括框架区(FR)；该轻链可变区的框架区(L-FR)可以包括，含SEQ ID NO:92或93中所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～5个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR1；含SEQ ID NO:94～98中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～5个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR2；含SEQ ID NO:99～102中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～7个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR3；和含SEQ ID NO:103或104中所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～3个)氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR4。

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC(SEQ ID NO:92)。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:93)。

WYQQKPDGTVKLLIY(SEQ ID NO:94)。

WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:95)。

WYQQKPGTAPKLLIY(SEQ ID NO:96)。

WYQQKPGTSPKLLIY(SEQ ID NO:97)。

WYQQKPEGTPKLLIY(SEQ ID NO:98)。

GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC(SEQ ID NO:99)。

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:100)。

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:101)。

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFC(SEQ ID NO:102)。

FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:103)。

FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:104)。

根据本公开的一些实施方式，所示轻链可变区具有如SEQ ID NO:139～144中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分是具有如SEQ ID NO:132～138中任一项所示的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:139～144中任一项所示的氨基酸序列的轻链可变区的任意组合。

根据本公开的一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分是鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体，优选地是鼠源抗体或人源抗体。根据本公开的一些实施方式，人源化抗体包括如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列的重链恒定区，和如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列的轻链恒定区。

根据本公开的又一方面，提供了一种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述HCDR1具有由SYDIS所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～4个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述HCDR2具有由VIWTGZ₁GTNYZ₂Z₃Z₄FZ₅S所示的氨基酸序列，其中Z₁选自甘氨酸或丝氨酸，Z₂选自天冬酰胺或丙氨酸，Z₃选自丝氨酸或脯氨酸，Z₄选自苏氨酸或脯氨酸，Z₅选自甲硫氨酸或赖氨酸；所述HCDR3具有VDY所示的氨基酸序列或其中一个或多个(例如，1～2个)氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述HCDR1具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列；所述HCDR2具有如SEQ ID NO:72、73或74所示的氨基酸序列，或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列；所述HCDR3具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，上述重链可变区还包括框架区(FR)；该重链可变区的框架区(H-FR)包括：含SEQ ID NO:105～108中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR1；含SEQ ID NO:109或110所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR2；含SEQ ID NO:111～116中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR3；和含SEQID NO:117或118所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的H-FR4。

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT(SEQ ID NO:105)。

EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLS(SEQ ID NO:106)。

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLS(SEQ ID NO:107)。

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSIT(SEQ ID NO:108)。

WIRQPPGKGLEWLG(SEQ ID NO:109)。

WIRQPPGKGLEWIG(SEQ ID NO:110)。

RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQKDDTAIYYCER(SEQ ID NO:111)。

RLSISVDTSKSQVSLKMNSVTKADTAVYYCAR(SEQ ID NO:112)。

RLSISVDTSKNQVSLKLNSVTKADTAVYYCAR(SEQ ID NO:113)。

RLSISVDTSKSQVFLKMSSVTKADTAVYYCAR(SEQ ID NO:114)。

RLSISVDTSKSQVSLKMSSVTKADTAVYYCAR(SEQ ID NO:115)。

RVTISRDNSKSQFYLKLNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:116)。

WGQGTSVTVSSAR(SEQ ID NO:117)。

WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:118)。

根据本公开的一些实施方式，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:147～152中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区包括轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述LCDR1具有由RSSQZ₆LVHSNTNTYLH所示的氨基酸序列，其中Z₆选自丝氨酸或苏氨酸；所述LCDR2具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列；所述LCDR3具有由SQZ₇THVPWT所示的氨基酸序列，其中Z₇选自丝氨酸或苏氨酸。根据本公开的一些实施方式，所述LCDR1具有如SEQ ID NO:75或76所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列；所述LCDR2具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列；所述LCDR3具有如SEQ ID NO:18或78所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，上述轻链可变区还包括以下框架区(FR)；该轻链可变区的框架区(L-FR)包括，含SEQ ID NO:119～122中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR1；含SEQ ID NO:123～126中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR2；含SEQ ID NO:127～129中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR3；和含SEQ ID NO:130或131所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列的L-FR4。

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:119)。

DVVMTQTPLSLPVTLGQQASISC(SEQ ID NO:120)。

DVVMTQTPLSLPVTLGQPASISC(SEQ ID NO:121)。

DVVMTQSPLSLPVTLGQQASISC(SEQ ID NO:122)。

WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:123)。

WYLQRPGQTPRLLIY(SEQ ID NO:124)。

WYLQRPGQSPRLLIY(SEQ ID NO:125)。

WYQQRPGQSPRLLIY(SEQ ID NO:126)。

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:127)。

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC(SEQ ID NO:128)。

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:129)。

FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:130)。

FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:131)。

根据本公开的一些实施方式，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:153～157中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

根据本公开的一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分是具有如SEQ ID NO:147～152中任一项所示的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:153～157中任一项所示的氨基酸序列的轻链可变区的任意组合。

根据本公开的一些实施方式，如SEQ ID NO:147～152中任一项所示的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:153～157任一项所示的氨基酸序列的轻链可变区，为人源化可变区序列。

根据本公开的一些实施方式，本公开的抗体或其抗原结合部分是鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体，优选地是鼠源抗体或人源抗体。根据本公开的一些实施方式，人源化抗体包括如SEQ ID NO:158所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列的重链恒定区，和如SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列的轻链恒定区。

根据本公开的一些实施方式，本公开的抗体或其抗原结合部分与来自选自食蟹猴、小鼠、大鼠、狗和/或人中的至少一种4-1BB交叉反应。

根据本公开的一些实施方式，本公开的抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE抗体，优选为IgG1或IgG4抗体。

根据本公开的又一方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本公开的上述抗体或其抗原结合部分。

根据本公开的又一方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述核酸分子。

根据本公开的又一方面，提供了一种细胞，所述细胞经本公开的上述表达载体转染。

根据本公开的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本公开的上述抗体或其抗原结合部分、如本公开的上述核酸分子、如本公开的上述表达载体或如本公开的上述细胞，以及药学上可接受的载剂。

根据本公开的又一方面，提供了一种用于诱导或增强受试者体内免疫细胞的细胞因子产生的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本公开的上述抗体或其抗原结合部分，或本公开的上述药物组合物。

根据本公开的一些实施方式，所述细胞因子是IL-2、TNF-α、IL-13、IFN-γ或其组合。所述细胞因子产生在肿瘤微环境中。

根据本公开的又一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本公开的上述抗体或其抗原结合部分，或如本公开的上述药物组合物。

根据本公开的一些实施方式，所述癌症选自由黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、血液癌症以及头颈癌。根据本公开的一些实施方式，所述癌症是血液癌症，例如可以B细胞淋巴瘤。

根据本公开的又一方面，提供了本公开的上述抗体或其抗原结合部分、本公开的上述核酸分子、本公开的上述表达载体、本公开的上述细胞或本公开的上述药物组合物，在制备治疗癌症的药物中的应用。

根据本公开的一些实施方式，所述癌症选自由黑色素瘤、神经胶质瘤、结肠腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、肾癌、乳腺癌、血液癌症以及头颈癌。

下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。本公开的其它特征或优点将通过以下附图和对几个实施例的详细描述并且还通过所附权利要求书变得显而易见。

附图说明

为了使本公开的内容更容易被清楚的理解，下面根据本公开的具体实施例并结合附图，对本公开作进一步详细的说明，其中

图1示出了根据本公开的一些实施方式的抗体与人源4-1BB高表达的CHO细胞株的结合。

图2示出了根据本公开的一些实施方式的抗体与猴源4-1BB重组蛋白的结合。

图3示出了根据本公开的一些实施方式的抗体与激活后的T细胞的结合。

图4示出了T细胞分泌IL2指标测定根据本公开的一些实施方式的抗体的激动剂活性。

图5示出了T细胞分泌IFN-γ指标测定根据本公开的一些实施方式的抗体的激动剂活性。

图6示出根据本公开的一些实施方式的人源化抗体与人源4-1BB高表达的CHO细胞株的结合能力。

图7示出了根据本公开的一些实施方式的人源化抗体的抗肿瘤活性。

图8示出了人源化抗体HEC512119的抗肿瘤活性。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。

定义

除非另外定义，否则在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。

本文所使用的数值范围，例如1～10，旨于涵盖该范围内所有数值，例如涵盖1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

本文所使用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，碳结合至氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍类。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸也可以由其公认的单字母代码提及。如本文所使用的，“极性氨基酸”是指包含偏好驻留在水环境中的侧链的氨基酸。在一些实施方案中，极性氨基酸选自精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸。极性氨基酸可以带正电、带负电或呈电中性。如本文所使用的，“非极性氨基酸”选自丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸以及缬氨酸。

如本文所使用的“被一个或多个不同的氨基酸取代”是指预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基被另一个不同的“置换”氨基酸残基置换。“氨基酸插入”是指将至少一个额外氨基酸掺入预定氨基酸序列中。虽然插入物通常由插入1或2个氨基酸残基组成，但也可以制备较大的“肽插入物”，例如插入约3至5个或甚至最多约10、15或20个氨基酸残基。如以上所公开，插入的残基可以是天然存在或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。

适用于本公开的抗体可在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体中的必需或非必需氨基酸残基优选地用来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基置换。在某些实施方式中，氨基酸链段可以用结构类似且侧链家族成员的次序和/或组成不同的链段置换。或者，在某些实施方式中，可沿编码序列的全部或一部分随机引入突变，如通过饱和诱变引入，并且由此得到的突变体可掺入本发明的结合多肽中，并针对这些结合多肽结合至所希望的靶的能力进行筛选。

本文所使用的术语“抗4-1BB激动型抗体”或“针对4-1BB的特异性激动型抗体”是指特异性结合4-1BB，并且部分或完全地促进、诱导、增加和/或激活4-1BB生物活性、应答和/或由4-1BB信号传导介导的下游通路或其它4-1BB介导的功能的抗体。肿瘤坏死因子受体(TNFR)信号传导，特别是TNFRSF激活需要受体聚簇和多聚化。4-1BB是已知需要聚簇以触发下游信号传导的TNFSF受体之一。据报道，4-1BB通过交联形成2个或更多个三聚体会产生较强激活的蛋白质。在一些实施方案中，抗4-1BB激动型抗体结合4-1BB，诱导4-1BB发生2个或更多个三聚体的多聚化。

本文所使用的术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体或其抗原结合部分结合至预定抗原上的表位。典型地，当通过表面等离子体共振(SPR)技术，在BIACORE 2000仪器中使用重组人4-1BB作为分析物且抗体作为配体测定时，该抗体以大约小于10^-6M，如大约小于10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M甚至更低的平衡解离常数(K_D)结合，并且结合至预定抗原的亲和力是结合至除该预定抗原或密切相关的抗原外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力的至少两倍.

本文所使用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

本文所使用的术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗原结合部分”或类似术语是指抗体中保留结合至靶抗原(例如4-1BB)并具有与抗体全长相同活性的片段。此类片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。scFv片段是单一多肽链，该片段包括作为scFv来源的抗体的重链和轻链可变区。此外，内抗体、微型抗体、三功能抗体和双功能抗体也包括在抗体的定义内并且适用于本文所述的方法中。参见例如Todorovska等人(2001),J.Immunol.Methods,248(1):47-66；Hudson和Kortt,(1999),J.Immunol.Methods,231(1):177-189；Poljak,(1994),Structure,2(12):1121-1123；Rondon和Marasco,(1997),Annu.Rev.Microbiol.,51:257-283，所述文献各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

两个序列之间的同一性百分比随这些序列共有的相同位置的数量而变(即，同一性％＝相同位置的数量/位置总数×100)，其中要考虑为最佳地使这两个序列对齐而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包(可得自http://www.gcg.com)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6测定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4测定，该算法已被并入到ALIGN程序(2.0版)中。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6测定，该算法已被并入到GCG软件包(可得自http://www.gcg.com)中的GAP程序。

本文所使用的术语“肿瘤微环境”是指肿瘤或赘瘤所处的细胞环境或微环境，包括周围血管以及非癌性细胞，包括但不限于免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞和淋巴细胞。肿瘤和周围的微环境紧密相关并且不断地相互作用。肿瘤可通过释放胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受性来影响微环境，而微环境中的免疫细胞可影响肿瘤细胞的生长和进化。

人源4-1BB是有255个氨基酸的跨膜多肽(登录号NM_001561；NP_001552)，是在系统发育上保守的肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。4-1BB及其配体参与很多免疫活动的调控。4-1BB配体与其在激活T细胞上表达的受体4-1BB交联，并共刺激T细胞活性。4-1BB是激活诱导的共刺激分子。近期的研究表明，4-1BB介导的抗癌作用主要是基于其激活T细胞的能力，特别是诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，并诱导细胞因子产生，特别是诱导产生大量的IFNγ的能力。

本文所使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。

本文所使用的术语“可变”是指可变域的某些区段在抗体之间在序列上普遍不同。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变域并非均匀分布的。相反，集中于轻链与重链可变域内三个称为高变区(HVR)的区段中。可变域的更高度保守部分被称作框架区(FR)。天然重链与轻链的可变域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，由三个HVR连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧密保持在一起，并且与其它链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，具有其他效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性。

本文所使用的术语“高变区”或“HVR”是指在抗体可变结构域区域中序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个存在于VH中(H1、H2、H3)，三个存在于VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区(CDR)”的氨基酸残基，来自CDR的氨基酸残基具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。基于Chothia定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L26-L32(L1)、L50-L52(L2)、L91-L96(L3)、H26-H32(H1)、H52-H56(H2)和H96-H101(H3)处(Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。基于Kabat定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L24-L34(L1)、L50-L56(L2)、L89-L97(L3)、H31-H35(H1)、H50-H65(H2)和H95-H102(H3)处(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)。基于定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L27-L32(L1)、L50-L51(L2)、L89-L97(L3)、H26-H33(H1)、H51-H56(H2)和H93-H102(H3)处(Honjo,T.和Alt,F.W.(1995)Immunoglobulin genes.Academic Press pp.3-443)。作为比较，在表1中列出了包含上文引用的参考文献中所定义的CDR的相应氨基酸残基。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于CDR移植的抗体人源化设计的参考工具(参见J Mol Biol273:927-48,1997)。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本公开请求保护的范围是基于Kabat定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。

表1.各CDR区的氨基酸编号系统(可参见http://bioinf.org.uk/abs/)

CDR\编号体系	Kabat	Chothia	IMGT
				LCDR1	24-34	26-32	27-32
LCDR2	50-56	50-52	50-51
				LCDR3	89-97	91-96	89-97
HCDR1	31-35	26-32	26-33
				HCDR2	50-65	52-56	51-56
HCDR3	95-102	96-101	93-102

本文所使用的“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

本文所使用的抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

本文所使用的“人源化抗体”包含来自非人源高变区(HVR)的氨基酸残基和来自人源抗体的重链及轻链的恒定区进行拼接，得到人源化抗体完整序列。在某些实施例中，人源化抗体包含至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行了人源化的抗体。

本文所使用的“交叉反应”是指本公开的抗体结合来自不同物种的4-1BB的能力。例如，本公开的抗体可以结合人4-1BB，同时也可以结合另一物种(例如小鼠、大鼠、食蟹猴或狗)的4-1BB。如本文所使用，交叉反应性是通过检测在结合分析(例如SPR、ELISA)中与纯化抗原的特异性反应性，或与生理学上表达)的细胞结合或以其它方式功能上相互作用来测量。

相比于一序列，本文所使用的与该序列具有“至少95％序列同一性”指与该序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。

本文所使用的“表达载体”和“表达构建体”可互换使用，在将上述分离的核酸分子连接到载体上时，可以将核酸序列与载体上的调控元件直接或者间接相连，只要这些调控元件能够调控该核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些调控元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。也就是说，核酸分子与调控元件可操作地连接。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的调控元件，例如转录调控序列和翻译调控序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。

本文所使用的“细胞”或“重组细胞”中可包含有表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本公开提供的抗体或者抗原结合部分。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。

本文所使用的“药学上可接受的载剂”可以包括生理学上相容的任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中可以包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载剂还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

例如，本公开的抗体或其抗原结合部分可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式，例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。本公开的抗体或其抗原结合部分可通过静脉输注、注射、肌肉内或皮下注射来施用。

本文所使用的术语“血液癌症”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴系恶性疾病，以及脾和淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤(B细胞血液癌症)和T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤和大多数的非霍奇金氏淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特仑氏巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿。T细胞淋巴瘤的非限制性实例包括结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。血液恶性疾病还包括白血病，如但不限于继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病和急性淋巴母细胞性白血病。血液恶性疾病还包括骨髓瘤，如但不限于多发性骨髓瘤和冒烟性多发性骨髓瘤。术语血液恶性疾病涵盖其它血液和/或B细胞或T细胞相关癌症。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)中进行了描述。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.杂交瘤方式获得抗体序列过程

通过杂交瘤技术和ELISA方法筛选可以产生与4-1BB结合的抗体的杂交瘤细胞株。简单来讲，混合人源重组蛋白4-1BB(UniProtKB-Q07011)和完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂成为乳剂，并分散注射于Balb/c小鼠皮下。经过2～4次免疫后，用ELISA方法测定小鼠的血清与人源重组蛋白4-1BB的结合效价。如果小鼠的血清的结合效价达到标准，则可以获取小鼠脾脏，将小鼠脾脏充分研磨后获取单细胞悬液，与骨髓瘤细胞用PEG方法进行融合成为杂交瘤细胞。培养7～14天后，将杂交瘤细胞的培养上清液用ELISA方法进行检测，选定符合标准的阳性细胞继续培养。第二次获取上述ELISA阳性细胞上清，使用FACs方法检测上清液中抗体与高表达4-1BB的稳定转染CHO细胞株结合。

对显示阳性结合的细胞进行亚克隆。通过对杂交瘤细胞进行大样本量的筛选，得到6株阳性单克隆杂交瘤细胞株能产生与4-1BB结合的分子水平。这6株阳性单克隆杂交瘤细胞株被分别编号为HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504和HEC505。收获细胞后，获取细胞的mRNA，并逆转录为cDNA。使用常用的抗体钓取序列引物获取杂交瘤细胞株内的抗体序列并测序。同时，可以将亚克隆后的细胞以5×10⁵～1×10⁶个细胞数接种至小鼠的腹腔。7～10天后，采取腹腔内的腹水，通过Protein A介质的纯化制备，获取纯度超过90％的鼠源单抗体，并用于进一步的检测评估。抗体序列详见表2。

下面表2示出了基于Kabat定义规则筛选出的六种抗体的CDR序列。

表2.抗体的CDR序列

实施例2.本公开的抗体与稳定转染人源4-1BB的CHO细胞株的结合

本实施例使用流式细胞仪，检测了在实施例1筛选出的各抗体HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504、HEC505，对人源4-1BB(UniProtKB-Q07011)高表达稳转CHO细胞株的结合能力。抗体与细胞孵育后，随后使用FITC标记的山羊抗鼠IgG Fc二抗结合，使用同种型IgG抗体作为阴性对照，并使用anti-4-1BB抗体Urelumab(BMS公司)和Utomilumab(Pfizer公司)作为阳性对照。结果示于图1中。

从图1的结果可以看出，抗体HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504、HEC505均可以与人源4-1BB膜表达的蛋白有效结合。

实施例3.本公开的抗体与猴源4-1BB重组蛋白的ELISA结合

本实施例使用ELISA，检测抗体对食蟹猴4-1BB(XP_005544947.1)重组蛋白的结合能力。

简单来讲，将重组4-1BB蛋白包被于酶标板，4℃过夜。3次洗净后甩干，37℃封闭1小时，3次洗净后甩干备用。将各抗体与上述备用酶标板孵育，4℃，2小时。3次洗净后甩干，随后使用HRP标记的山羊抗鼠IgG(Abcam：ab97023)二抗结合。使用同种型IgG抗体作为阴性对照，并使用Urelumab和Utomilumab抗体作为对照样品。结果示于图2中。

从图2可以看出，抗体HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504、HEC505均可以与猴源4-1BB蛋白有效结合。而Urelumab和Utomilumab抗体与猴源4-1BB蛋白的结合能力明显较弱。结合实施例2结果(图1)，可以得出抗体HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504、HEC505能够与猴源及人源4-1BB蛋白的相似区域有效结合。与这些相似区域结合的抗体有成为临床药物的潜力。并且，在临床前的猴子毒理实验中评价，与百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb，BMS)临床在研抗体Urelumab和辉瑞(Pfizer)公司临床在研抗体Utomilumab相比是有优势的。

实施例4.本公开的抗体与人血体外分离且经激活的T细胞的结合

从人体来源的外周血单个核细胞(PBMC)细胞群中分离出T细胞。使用CD3和CD28抗体耦联磁珠(Invitrogen-11161D)，体外刺激T细胞48～72小时。将抗体HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504和HEC505分别与T细胞孵育后，随后使用PE标记的山羊抗鼠IgG Fc二抗(Jackson)结合，同时使用同种型IgG抗体作为阴性对照，并使用Urelumab和Utomilumab抗体作为对照样品。然后，使用流式细胞仪，检测抗体HEC500、HEC501、HEC502、HEC503、HEC504和HEC505与刺激后的T细胞的结合能力。结果示于图3中。

从图3可以看出，本公开的抗体可以与人源经激活的T细胞有效结合。

实施例5.使用T细胞活化IL2指标测定本公开的抗体的激动剂活性

将Anti-CD3抗体预先涂布于酶标板，然后加入分离的人源T细胞，加入浓度梯度稀释的抗体，孵育。三天后检测上清中IL2的表达量。使用同种型IgG抗体(Isotype IgG)作为阴性对照，并使用Urelumab和Utomilumab抗体作为对照样品。结果示于图4中。

从图4可以看出，本公开的抗体在较低剂量时，能够以浓度依赖性地激活体内来源的T细胞，并分泌IL2细胞因子。

实施例6.使用T细胞活化IFN-γ指标测定本公开的抗体的激动剂活性

将Anti-CD3抗体预先涂布于酶标板，然后加入分离的人源T细胞，加入浓度梯度稀释的抗体，孵育。三天后检测上清中IFN-γ的表达量。使用同种型IgG抗体作为阴性对照，并使用Urelumab和Utomilumab抗体作为对照样品。结果示于图5中。

从图5可以看出，本公开的抗体在较低剂量时，能够以浓度依赖性地激活体内来源的T细胞，并分泌IFN-γ细胞因子。

实施例7.人源化抗体的制备及表达量检测

本实施例按照本领域的常规技术，制备了HEC501和HEC502人源化抗体。

使用全基因合成手段，获得HEC501和HEC502的可变区序列及其人源化突变序列。基于HEC501抗体获得的人源化抗体的HCDR序列和LCDR序列示于表3中。基于HEC502抗体获得的人源化抗体的HCDR序列和LCDR序列示于表4中。将HEC501和HEC502的可变区序列进行人源化得到如表5和表6所示的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)。

表3.基于HEC501抗体获得的人源化抗体的CDR序列

表4.基于HEC502抗体获得的人源化抗体的CDR序列

表5.HEC501抗体人源化后的重链可变区序列和轻链可变区序列

表6.HEC502抗体人源化后的重链可变区序列和轻链可变区序列

抗体所需恒定区序列来自于人源IgG4(EU：S228P)，其中，HEC501人源化抗体重链恒定区为SEQ ID NO:145；HEC501人源化抗体轻链恒定区为SEQ ID NO:146；恒定区序列与表5所示的人源化重链可变区和轻链可变区直接进行拼接即可获得人源化抗体完整序列。

抗体所需恒定区序列来自于人源IgG1，其中，HEC502人源化抗体重链恒定区为SEQID NO:158；HEC502人源化抗体轻链恒定区为SEQ ID NO:159；恒定区序列与表6所示的人源化重链可变区和轻链可变区直接进行拼接即可获得人源化抗体的完整序列。

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:145)。

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:146)。

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:158)。

RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:159)。

将得到的构建体瞬时转染到HEK293细胞中。通过Protein A介质的纯化制备，获取纯度超过95％的嵌合抗体以及人源化抗体(其中HEC51118及HEC51225为嵌合抗体链)。通过常规方法，检测本公开的人源化抗体的表达量。HEC501人源化抗体的表达量的检测结果示于表8。HEC502人源化抗体的表达量的检测结果示于表9。

表8.HEC501人源化抗体的表达量的检测结果

表9.HEC502人源化抗体的表达量的检测结果

实施例8.本公开的人源化抗体与人源4-1BB蛋白ELISA结合和与4-1BB高表达的CHO细胞株的结合。

本实施例使用流式细胞仪，检测实施例7中获得的人源化抗体对人源4-1BB高表达稳转CHO细胞株的结合能力。抗体与细胞孵育后，随后使用FITC标记的山羊抗人IgG Fc二抗结合，使用同种型IgG抗体(Isotype IgG)作为阴性对照，结果见表10和图6中。

另外，使用ELISA，检测了实施例7中获得的人源化抗体对人源4-1BB(UniProtKB-Q07011)重组蛋白的结合能力。将重组4-1BB蛋白包被于酶标板，4℃过夜。3次洗净后甩干，37℃封闭1小时，3次洗净后甩干备用。将抗体与上述备用酶标板孵育，4℃，2小时，3次洗净后甩干。随后，使用HRP标记的山羊抗人IgG Fc二抗结合，使用同种型IgG抗体(IsotypeIgG)作为阴性对照，结果见表11。

从表10和11以及图6可以看出，本公开的人源化抗体具有相对较高的结合人源4-1BB的能力。

表10.HEC501人源化抗体与人源4-1BB高表达的CHO细胞株的结合

表11.HEC502人源化抗体与人源4-1BB高表达的CHO细胞株的结合

实施例9.检测65℃加热处理5min后，本公开的人源化抗体与41BB高表达的CHO细胞株的结合

使用pH为5、6、7、8或9的不同磷酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液，处理浓度为1mg/ml的抗体样品，于65℃，处理5分钟。使用流式细胞仪，检测抗体对稳定转染人源4-1BB的CHO细胞株的结合能力。并使用pH7.4缓冲液下未经过加热处理的各自编号样品作为分母，计算经过加热处理后样品的活性保留率(％)。结果示于表12中。

表12.对HEC501人源化抗体的耐热检测结果加热处理后结合能力

从表12可以看出，本公开的人源化抗体能够在加热处理后仍然保持一定水平的结合活性。

实施例10.生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry，BLI)测定亲和力

将人源4-1BB蛋白固定在传感器上持续时间300s，然后将传感器插入到PBST溶液中平衡Baseline 180s。随后，将探针浸入到抗体溶液中结合持续时间600s，再将探针置于PBST溶液中解离持续时间1200s。最后，将探针置入再生液中完成探针的再生及保存。使用BLI检测本公开的抗体与人源重组蛋白4-1BB的亲和性。结果如表7所示。

表7.抗体与人源重组蛋白4-1BB的亲和性

编号	K_D(M)	k_on(1/Ms)	k_dis(1/s)
				HEC502	8.13E-10	2.23E+05	1.81E-04
HEC512119	9.68E-10	8.95E+05	8.66E-04

结果显示，人源化抗体(HEC512119)与未人源化抗体(HEC502)对结合人源4-1BB无明显差异。

实施例11.MC38高表达GPC3稳转细胞系荷瘤人源化小鼠模型中受试抗体的抗肿瘤活性评价

使用4-1BB/4-1BBL双人源化C57BL/66小鼠接种MC38高表达人源GPC3蛋白的肿瘤细胞系，当平均肿瘤体积达到100-150mm³时，根据小鼠体重和肿瘤体积选择合适的小鼠入组，以Urelumab作为对照，将受试抗体HEC502和Urelumab按照20mg/kg剂量腹腔注射到小鼠体内，定期测量肿瘤大小，观察肿瘤的生长或抑制情况。结果如图7所示，显示受试抗体HEC502有显著抑制GPC3阳性肿瘤生长的效果，且长期的抑制效果优于Urelumab。

实施例12.MC38高表达GPC3稳转细胞系荷瘤人源化小鼠模型中受试抗体的抗肿瘤活性评价

使用4-1BB/4-1BBL双人源化C57BL/66小鼠接种MC38高表达人源GPC3蛋白的肿瘤细胞系，当平均肿瘤体积达到100-150mm³时，根据小鼠体重和肿瘤体积选择合适的小鼠入组，将受试抗体HEC512119按照20mg/kg和5mg/kg剂量腹腔注射到小鼠体内，定期测量肿瘤大小，观察肿瘤的生长或抑制情况。结果如图8所示，显示受试抗体HEC512119有显著抑制GPC3阳性肿瘤生长的效果。

本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形，均落入本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种特异性结合4-1BB或其片段的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区包括：

包括如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR1，包括如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR2，和包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的HCDR3，

所述轻链可变区包括：

包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR1，包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR2，包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，和/或

所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体重链选自SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，和/或

所述抗体轻链选自SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列。

4.一种由权利要求1至3中任一项的抗体或其抗原结合部分衍生的人源化抗体或其抗原结合部分；

优选地，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

所述HCDR1具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，

所述HCDR2具有由VIWTGZ₁GTNYZ₂Z₃Z₄FZ₅S所示的氨基酸序列，且

所述HCDR3具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，

所述轻链可变区包括轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中

所述LCDR1具有由RSSQZ₆LVHSNTNTYLH所示的氨基酸序列，

所述LCDR2具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代的氨基酸序列，且

所述LCDR3具有由SQZ₇THVPWT所示的氨基酸序列，

其中，

Z₁选自甘氨酸或丝氨酸，Z₂选自天冬酰胺或丙氨酸，Z₃选自丝氨酸或脯氨酸，Z₄选自苏氨酸或脯氨酸，Z₅选自甲硫氨酸或赖氨酸，Z₆选自丝氨酸或苏氨酸，Z₇选自丝氨酸或苏氨酸；优选地，所述HCDR1具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2具有如SEQ ID NO:72、73或74所示的氨基酸序列，所述HCDR3具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述LCDR1具有如SEQ ID NO:75或76所示的氨基酸序列，所述LCDR2具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，和/或所述LCDR3具有如SEQ ID NO:18或78所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:147～152中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列，和/或

所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:153～157中任一项所示的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸序列被取代的氨基酸序列。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的核酸分子。

8.一种细胞，其特征在于，所述细胞经如权利要求7所述表达载体转染。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、如权利要求6所述的核酸分子、如权利要求7所述的表达载体或如权利要求8所述的细胞，以及药学上可接受的载剂。

10.如权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、如权利要求6所述的核酸分子、如权利要求7所述的表达载体、如权利要求8所述的细胞或如权利要求9所述的药物组合物，在制备治疗癌症的药物中的应用，

优选地，所述癌症选自由黑色素瘤、神经胶质瘤、结肠腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、肾癌、乳腺癌、血液癌症以及头颈癌。