CN118684678A

CN118684678A - 一类作为wrn解旋酶抑制剂的化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN118684678A
Application number: CN202410339181.4A
Authority: CN
Inventors: 周明伟; 别平彦; 彭建彪
Original assignee: Shanghai Jiyu Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jiyu Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-24
Filing date: 2024-03-22
Publication date: 2024-09-24

Abstract

本发明公开了式(Ⅰ)所示化合物及其药效上可接受的盐，具体地，本发明公开了一类作为WRN解旋酶抑制剂的化合物及其制备方法。

Description

一类作为WRN解旋酶抑制剂的化合物及其制备方法

本发明主张如下优先权：

申请号CN2023103116441，申请日：2023年3月24日。

技术领域

本发明涉及式(Ⅰ)所示化合物及其药效上可接受的盐，具体地，本发明涉及一类作为WRN解旋酶抑制剂的化合物及其制备方法。

背景技术

人体内整个基因组有很多短串联重复序列区域，这些重复DNA区域被成为“微卫星”，在复制过程中易于滑动而出现错误，因此非常依赖于MMR(错配修复)系统进行修复。当MMR(错配修复)系统出现异常时，引起dMMR(错配修复缺陷)，就不能对微卫星复制错误进行识别和修复而造成MSI，就有可能导致移码突变，从而引起肿瘤相关基因出现异常，进而诱导癌症的发生和发展。2017年免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitor,ICI)获批用于高度微卫星不稳定/错配修复缺陷(Microsatellite Instability-High/DeficientMismatch Repair,MSI-H/dMMR)肿瘤的治疗，MSI-H/dMMR也成为第一个“泛瘤种”肿瘤标志物。微卫星高度不稳定性(MSI-H)癌细胞依赖于WRN(Werner syndrome RecQ helicase)解旋酶活性。抑制WRN可以诱导DNA双链断裂，激活DNA损伤响应，并且诱导细胞凋亡和细胞周期捕获。dMMR(错配修复缺陷)/MSI-H型癌症病人通常的治疗手段包括靶向疗法、化疗和免疫疗法。靶向治疗和化疗的临床有效性受到耐药性和药物毒性的限制，另外大约一半的免疫治疗患者对免疫检查点抑制剂没有积极反应。45-60％的MSI-H癌症患者对免疫治疗没有反应，靶向治疗、化疗、免疫治疗的原发性、继发性耐药问题亟待解决。2019年美国哈佛和MIT的布罗德研究所分析了Achilles和drive两个数据库，评估了各细胞系对不同靶点的依赖程度，他们发现RecQ DNA解旋酶WRN的活性在dMMR/MSI-H型细胞系体内和体外都是必需的，而MSS细胞不依赖WRN存活。在MSI-H模型中，敲除WRN会诱导双链DNA断裂并选择性地促进细胞凋亡和细胞周期停滞。这种抑癌机制与靶向药物(抑制癌细胞特异性致癌改变)和免疫疗法(抑制免疫逃避和耐受)不同。2021年Wellcome Sanger研究所Mathew J Garnett博士课题组利用PDX模型证明了WRN抑制剂可以作为dMMR患者的二线或三线单药治疗。在dMMR肿瘤中，肿瘤的突变性与免疫检查点阻断反应呈负相关，而WRN敏感性与突变负荷无关。由于不同的作用模式存在，联合检查点抑制剂、化疗或靶向治疗与WRN抑制剂进行治疗，可能会抑制交叉耐药性，促进肿瘤根除。此外，因为DNA修复的缺失会调节新抗原的结构，增加突变负担，导致免疫应答增强，WRN抑制也可能与免疫治疗协同作用。因此WRN可以作为dMMR/MSI-H肿瘤单一治疗或联合靶向药物、化疗或免疫治疗的一个关键靶点。

MSI-H肿瘤可发生于多个部位，其中子宫内膜癌(31％)、结肠腺癌(20％)和胃癌(19％)中的发生率最高，美国每年新发MSI-H肿瘤患者约32.5万，中国约为30万，其药物开发具有很大的市场价值。在错配修复正常(MSS)的肿瘤中，WRN表达的缺失(或降低)不影响肿瘤细胞的生长。在错配修复缺陷(MSI-H)的肿瘤中，如果同时伴有WRN表达的缺失(或降低)，可引起细胞DNA双链断裂的累积增加，细胞周期阻滞在G1或者G2/M期，从而导致肿瘤细胞死亡。这也就是所谓的合成致死效应。开发WRN解旋酶抑制剂有望成为MSI-H癌症的有效治疗方式之一。

发明内容

在本发明的一方面，本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，

其中，

环B选自C_3-6环烷基、5-6元杂环烷基、C_5-6环烯基、5-6元杂环烯基、C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

环D选自C_3-6环烷基、5-6元杂环烷基、C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

环E选自C_3-6环烷基、5-6元杂环烷基、C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

L₁选自单键、-N(R_b1)-、-O-、-S-、-C(R_b2)₂-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-或L₂选自单键、-N(R_b1)-、-O-、-S-、-C(R_b2)₂-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-或R_b1选自H、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

R_b2分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

R₁分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

或者，两个R₁连接在一起，形成一个C_4-6环烷基或4-6元杂环烷基；

选自选自

或者，选自选自

当选自时，T选自C；

当选自时，T选自N或CH；

当选自时，R₂选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

当选自时，R₂选自O或S；

R₃、R₄分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

或者，R₃与R₄连接在一起，形成一个C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅中1个或2个选自N其余选自C(R₅)，且当X₂或X₄中的一个选自N时，此6元杂芳基含有2个N；

R₅分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、SF₅、CN、HC(＝O)-、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；或者，两个R₅连接在一起，形成一个C_4-6环烷基或4-6元杂环烷基，所述C_4-6环烷基和者4-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

R₆分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

或者，两个R₆连接在一起，形成一个C_4-6环烷基或4-6元杂环烷基，所述C_4-6环烷基和者4-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

R₇分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

n、p、q分别独立地选自0、1、2或3；

R分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、COOH、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基和C_1-6烷氨基，所述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基或C_1-6烷氨基任选被1、2或3个R’取代；

R’选自F、Cl、Br、I、OH、NH₂和CH₃；

上述C_1-6杂烷基、5-6元杂环烷基、5-6元杂环烯基、5-6元杂芳基或5-10元杂芳基包含1、2或3个独立选自-O-、-NH-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-和N的杂原子或杂原子团。

本发明的一些方案中，R选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、COOH、Me、CF₃、CHF₂、CH₂F、

本发明的一些方案中，当选自时，R₂选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、所述Me、任选被1、2或3个R取代。

本发明的一些方案中，当选自时，R₂选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

本发明的一些方案中，结构单元选自

本发明的一些方案中，R₁分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基、C_1-3烷氨基、C_1-3烷基-C(＝O)-、C_1-3烷基-O-C(＝O)-、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基、C_1-3烷氨基、C_1-3烷基-C(＝O)-、C_1-3烷基-O-C(＝O)-、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代。

本发明的一些方案中，R₁分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、

本发明的一些方案中，环B选自环己基、3,6-二氢-2H-吡喃基、3,4-二氢-2H-吡喃基、吗啉基、环己烯基、哌啶基、2,3-二氢-1,4-二恶英基、6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷基、1,2,3,4-四氢吡啶基、1,2,3,6-四氢吡啶基、四氢-2H-吡喃基、5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮基、苯基、吡啶基或吡咯烷基。

本发明的一些方案中，结构单元选自：

本发明的一些方案中，R₅分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、SF₅、Me、HC(＝O)-、所述Me、任选被1、2或3个R取代。

本发明的一些方案中，R₅分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、SF₅、CN、Me、CF₃、HC(＝O)-、

本发明的一些方案中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅中1个选自N，其余选自C(R₅)。

本发明的一些方案中，结构单元选自

本发明的一些方案中，R₆分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、所述Me、任选被1、2或3个R取代。

本发明的一些方案中，R₆分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

本发明的一些方案中，环D选自哌啶基或哌嗪基。

本发明的一些方案中，结构单元选自

本发明的一些方案中，R₇分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、所述Me、任选被1、2或3个R取代。

本发明的一些方案中，R₇分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

本发明的一些方案中，环E选自苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基或噻吩基。

本发明的一些方案中，结构单元选自

本发明的一些方案中，R₃、R₄分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、所述Me、任选被1、2或3个R取代。

本发明的一些方案中，R₃、R₄分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

本发明还提供了下式化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其选自

在本发明的再一方面，本发明还提供了一种药物组合物。本发明的一些方案中，上述药物组合物保护前面所述的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐。

本发明的一些方案中，上述药物组合物进一步包含药用辅料。

在本发明的再一方面，本发明还提供了上述化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐或上述药物组合物在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。

本发明的目的就是提供一种作为WRN抑制剂的化合物或者其立体异构体、氘代物、溶剂化合物、前药、代谢产物、药学上可以接受的盐或共晶，及其中间体和制备方法，以及在制备治疗微卫星高度不稳定性肿瘤相关疾病的药物中的应用。

本发明的一些方案中，肿瘤相关疾病为与实体瘤相关疾病中的一种或多种。

本发明的化合物可单用或者与其他化疗药物、靶向治疗药物或免疫治疗药物联用，用于多种肿瘤的治疗，尤其是微卫星高度不稳定的(microsatellite instability,MSI)恶性肿瘤，或者错配修复缺陷(mismatch repair deficient，dMMR)的恶性肿瘤，或者检测有大量(TA)_n重复序列的恶性肿瘤，包括但不限于结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌等。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

这里所采用的术语“药效上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药效上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药效上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药效上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、三氟乙酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。

本发明的药效上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以存在特定的。除非另有说明，术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指在室温下，不同官能团异构体处于动态平衡，并能很快的相互转化。若互变异构体是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(proton tautomer)(也称质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键异构体(valencetautomer)包括一些成键电子的重组来进行的相互转化。其中酮-烯醇互变异构化的具体实例是戊烷-2,4-二酮与4-羟基戊-3-烯-2-酮两个互变异构体之间的互变。

本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(³H)，碘-125(¹²⁵I)或C-14(¹⁴C)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。

“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。

术语“被…取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。术语“任选被…取代”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。

当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1、2或3个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。例如，可以选自等。

不在两个字母或符号之间的短横(“-”)表示取代基的连接位点。例如，C_1-6烷基羰基-指通过羰基与分子的其余部分连接的C_1-6烷基。然而，当取代基的连接位点对本领域技术人员来说是显而易见的时候，例如，卤素取代基，“-”可以被省略。

除非另有说明，当基团价键上带有虚线时，例如在中，虚线表示该基团与分子其它部分的连接点。

当所列举的取代基中没有指明其通过哪一个原子连接到被取代的基团上时，这种取代基可以通过其任何原子相键合，例如，吡啶基作为取代基可以通过吡啶环上任意一个碳原子连接到被取代的基团上。

当所列举的连接基团没有指明其连接方向，其连接方向是任意的，例如，中连接基团L为此时既可以按与从左往右的读取顺序相同的方向连接苯基和环戊基构成也可以按照与从左往右的读取顺序相反的方向连接苯基和环戊基构成所述连接基团、取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。

除非另有规定，环上原子的数目通常被定义为环的元数，例如，“4-6元环”是指环绕排列4-6个原子的“环”。

除非另有规定，术语“C_1-6烷基”用于表示直链或支链的由1至6个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C_1-6烷基包括C_1-5、C_1-4、C_2-6烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C_1-5烷基的实例包括但不限于甲基(“Me”)、乙基(“Et”)、丙基如正丙基(“n-Pr”)或异丙基(“i-Pr”)、丁基如正丁基(“n-Bu”)、异丁基(“i-Bu”)、仲丁基(“s-Bu”)或叔丁基(“t-Bu”)、戊基、己基等。

除非另有规定，术语“C_1-3烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C_1-3烷基包括C_1-2和C_2-3烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C_1-3烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)等。

除非另有规定，“C_2-6烯基”用于表示直链或支链的包含至少一个碳-碳双键的由2至6个碳原子组成的碳氢基团，碳-碳双键可以位于该基团的任何位置上。所述C_2-6烯基包括C_2-4、C_2-3、C₄、C₃和C₂烯基等；其可以是一价、二价或者多价。C_2-6烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁间二烯基、戊间二烯基、己间二烯基等。

除非另有规定，“C_2-3烯基”用于表示直链或支链的包含至少一个碳-碳双键的由2至3个碳原子组成的碳氢基团，碳-碳双键可以位于该基团的任何位置上。所述C_2-3烯基包括C₃和C₂烯基；所述C_2-3烯基可以是一价、二价或者多价。C_2-3烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基等。

术语“杂烷基”本身或者与另一术语联合，表示由一定数目碳原子和至少一个杂原子或杂原子团组成的，稳定的直链或支链的烷基原子团或其组合物。在一些实施方案中，杂原子选自B、O、N和S，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮杂原子任选地被季铵化。在另一些实施方案中，杂原子团选自-C(＝O)O-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)、-S(＝O)₂-、-C(＝O)N(H)-、-N(H)-、-C(＝NH)-、-S(＝O)₂N(H)-和-S(＝O)N(H)-。在一些实施方案中，所述杂烷基为C_1-6杂烷基；在另一些实施方案中，所述杂烷基为C_1-3杂烷基。杂原子或杂原子团可以位于杂烷基的任何内部位置，包括该烷基与分子其余部分的连接位置，但术语“烷氧基”属于惯用表达，是指通过一个氧原子连接到分子的其余部分的那些烷基基团。杂烷基的实例包括但不限于-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-OCH₂(CH₃)₂、-CH₂-CH₂-O-CH₃、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-SCH₃、-SCH₂CH₃、-SCH₂CH₂CH₃、-SCH₂(CH₃)₂、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(＝O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(＝O)₂-CH₃、和至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃。

除非另有规定，术语“C_1-6烷氧基”表示通过一个氧原子连接到分子的其余部分的那些包含1至6个碳原子的烷基基团。所述C_1-6烷氧基包括C_1-4、C_1-3、C_1-2、C_2-6、C_2-4、C₆、C₅、C₄和C₃烷氧基等。C_1-6烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(包括正丙氧基和异丙氧基)、丁氧基(包括n-丁氧基、异丁氧基、s-丁氧基和t-丁氧基)、戊氧基(包括n-戊氧基、异戊氧基和新戊氧基)、己氧基等。

除非另有规定，术语“C_1-4烷氧基”表示通过一个氧原子连接到分子的其余部分的那些包含1至4个碳原子的烷基基团。所述C_1-4烷氧基包括C_1-3、C_1-2、C_2-4、C₄和C₃烷氧基等。C_1-6烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(包括正丙氧基和异丙氧基)、丁氧基(包括n-丁氧基、异丁氧基、s-丁氧基和t-丁氧基)、戊氧基(包括n-戊氧基、异戊氧基和新戊氧基)、己氧基等。

除非另有规定，术语“C_1-3烷氧基”表示通过一个氧原子连接到分子的其余部分的那些包含1至3个碳原子的烷基基团。所述C_1-3烷氧基包括C_1-2、C_2-3、C₃和C₂烷氧基等。C_1-3烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(包括正丙氧基和异丙氧基)等。

除非另有规定，术语“C_1-6烷氨基”表示通过氨基连接到分子的其余部分的那些包含1至6个碳原子的烷基基团。所述C_1-6烷氨基包括C_1-4、C_1-3、C_1-2、C_2-6、C_2-4、C₆、C₅、C₄、C₃和C₂烷氨基等。C_1-6烷氨基的实例包括但不限于-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)CH₂CH₃、-N(CH₂CH₃)(CH₂CH₃)、-NHCH₂CH₂CH₃、-NHCH₂(CH₃)₂、-NHCH₂CH₂CH₂CH₃等。

除非另有规定，术语“C_1-4烷氨基”表示通过氨基连接到分子的其余部分的那些包含1至4个碳原子的烷基基团。所述C_1-4烷氨基包括C_1-3、C_1-2、C_2-4、C₄、C₃和C₂烷氨基等。C_1-4烷氨基的实例包括但不限于-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)CH₂CH₃、-N(CH₂CH₃)(CH₂CH₃)、-NHCH₂CH₂CH₃、-NHCH₂(CH₃)₂、-NHCH₂CH₂CH₂CH₃等。

除非另有规定，术语“C_1-3烷氨基”表示通过氨基连接到分子的其余部分的那些包含1至3个碳原子的烷基基团。所述C_1-3烷氨基包括C_1-2、C₃和C₂烷氨基等。C_1-3烷氨基的实例包括但不限于-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)CH₂CH₃、-NHCH₂CH₂CH₃、-NHCH₂(CH₃)₂等。

除非另有规定，术语“C_1-6烷硫基”表示通过硫原子连接到分子的其余部分的那些包含1至6个碳原子的烷基基团。所述C_1-6烷硫基包括C_1-4、C_1-3、C_1-2、C_2-6、C_2-4、C₆、C₅、C₄、C₃和C₂烷硫基等。C_1-6烷硫基的实例包括但不限于-SCH₃、-SCH₂CH₃、-SCH₂CH₂CH₃、-SCH₂(CH₃)₂等等。

除非另有规定，术语“C_1-4烷硫基”表示通过硫原子连接到分子的其余部分的那些包含1至4个碳原子的烷基基团。所述C_1-4烷硫基包括C_1-3、C_1-2、C_2-4、C₄、C₃和C₂烷硫基等。C_1-4烷硫基的实例包括但不限于-SCH₃、-SCH₂CH₃、-SCH₂CH₂CH₃、-SCH₂(CH₃)₂等等。

除非另有规定，术语“C_1-3烷硫基”表示通过硫原子连接到分子的其余部分的那些包含1至3个碳原子的烷基基团。所述C_1-3烷硫基包括C_1-3、C_1-2和C₃烷硫基等。C_1-3烷硫基的实例包括但不限于-SCH₃、-SCH₂CH₃、-SCH₂CH₂CH₃、-SCH₂(CH₃)₂等。

除非另有规定，“C_3-6环烷基”指具有3-6个环碳原子、例如具有3-5个环碳原子、例如3-4个环碳原子的饱和一价单环或二环烃基。例如，“C_4-6环烷基”表示具有4-6个环碳原子的环烷基。类似地，“C_3-4环烷基”表示具有3-4个环碳原子的环烷基。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基等。

除非另有规定，“C_4-6环烷基”表示由4至6个碳原子组成的饱和环状碳氢基团，其为单环和双环体系，所述C_4-6环烷基包括C_4-5、C_5-6、C₄、C₅和C₆环烷基等；其可以是一价、二价或者多价。C_4-6环烷基的实例包括，但不限于，环丁基、环戊基、环己基等。

除非另有规定，术语“3-6元杂环烷基”本身或者与其他术语联合分别表示由3至6个环原子组成的饱和环状基团，其1、2、3或4个环原子为独立选自O、S和N的杂原子，其余为碳原子，其中氮原子任选地被季铵化，氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)_p，p是1或2)。其包括单环和双环体系，其中双环体系包括螺环、并环和桥环。此外，就该“3-6元杂环烷基”而言，杂原子可以占据杂环烷基与分子其余部分的连接位置。所述3-6元杂环烷基包括5-6元、4元、5元和6元杂环烷基等。4-6元杂环烷基的实例包括但不限于氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、四氢噻吩基(包括四氢噻吩-2-基和四氢噻吩-3-基等)、四氢呋喃基(包括四氢呋喃-2-基等)、四氢吡喃基、哌啶基(包括1-哌啶基、2-哌啶基和3-哌啶基等)、哌嗪基(包括1-哌嗪基和2-哌嗪基等)、吗啉基(包括3-吗啉基和4-吗啉基等)、二噁烷基、二噻烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、1,2-噁嗪基、1,2-噻嗪基、六氢哒嗪基、高哌嗪基或高哌啶基等。

除非另有规定，本发明术语“环烯基”是指环状烯基。“C_3-7环烯基”包括C₃、C₄、C₅、C₆和C₇环烯基。环烯基的实例包括但不限于环丁烯基、环戊烯基和环己烯基。

除非另有规定，本发明术语“杂环烯基”是指包含若干个杂原子的环状烯基。“5-6元杂环烯基”本身或者与其他术语联合分别表示由5至6个环原子组成的不饱和环状基团，其1、2、3或4个环原子为独立选自O、S和N的杂原子，其余为碳原子，其中氮原子任选地被季铵化，氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)_p，p是1或2)。杂环烯基的实例包括但不限于等。

除非另有规定，C_n-n+m或C_n-C_n+m包括n至n+m个碳的任何一种具体情况，例如C_1-12包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、和C₁₂，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如C_1-12包括C_1-3、C_1-6、C_1-9、C_3-6、C_3-9、C_3-12、C_6-9、C_6-12、和C_9-12等；同理，n元至n+m元表示环上原子数为n至n+m个，例如3-12元环包括3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环、11元环、和12元环，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如3-12元环包括3-6元环、3-9元环、5-6元环、5-7元环、6-7元环、6-8元环、和6-10元环等。

除非另有规定，术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至20个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，含1至3个杂原子；更优选为5元或6元，含1至3个杂原子；非限制性实例如吡唑基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡咯基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：等。

杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基和杂环烷硫基中的一个或多个取代基所取代。

本领域技术人员应当理解的是，一些式(I)化合物可以包含一个或多个手性中心，因此存在两个或更多个立体异构体。因此，本发明的化合物可以以单个立体异构体(例如对映异构体、非对映异构体)及其任意比例的混合物例如外消旋物的形式存在，以及在适当的情况下，可以以其互变异构体和几何异构体的形式存在。

本文所用的术语“立体异构体”指具有相同化学构成、但在原子或基团的空间排列方面不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体和构象异构体等。

本文所用的术语“对映异构体”指化合物的彼此是不可重叠的镜像的两种立体异构体。

本文所用的术语“非对映异构体”指具有两个或更多个手性中心并且其分子彼此不是镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质或生物活性。非对映异构体的混合物可以用高分辨率分析方法例如电泳和色谱例如HPLC分离。

立体化学定义和惯例可遵循S.P.Parker编辑,McGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.和Wilen,S.,“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。许多有机化合物以光学活性形式存在，即，它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，前缀D和L或者R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或者(+)和(-)用于表示化合物旋转平面偏振光的符号，其中(-)或l表示该化合物是左旋的。带有(+)或d的前缀的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，除了它们彼此互为镜像之外，这些立体异构体是相同的。特定的立体异构体也可以称为对映异构体，这类异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，其可以出现在化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性的情况中。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指不具有光学活性的两种对映异构体的等摩尔混合物。

外消旋混合物可以以其本身的形式使用或者拆分成单个异构体使用。通过拆分可以得到立体化学上的纯的化合物或者富集一种或多种异构体的混合物。分离异构体的方法是众所周知的(参见Allinger N.L.和Eliel E.L.,"Topics in Stereochemistry"，第6卷，Wiley Interscience，1971)，包括物理方法，例如使用手性吸附剂的色谱法。可以由手性前体制备得到手性形式的单个异构体。或者，可以通过与手性酸(例如10-樟脑磺酸、樟脑酸、α-溴樟脑酸、酒石酸、二乙酰基酒石酸、苹果酸、吡咯烷酮-5-羧酸等的单个对映异构体)形成非对映异构体盐而由混合物化学分离得到单个异构体，将所述的盐分级结晶，然后游离出拆分的碱中的一个或两个，任选地重复这一过程，从而得到一个或两个基本上不包含另一种异构体的异构体，即光学纯度以重量计为例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的所需的立体异构体。或者，如本领域技术人员所熟知的，可以将外消旋物共价连接到手性化合物(辅助物)上，得到非对映异构体。

本文所用的术语“互变异构体”或“互变异构形式”指经由低能量障碍可相互转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括通过质子迁移进行的相互转化，例如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括通过一些键合电子的重组进行的相互转化。

本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本文所用的未具体定义的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。

具体实施方式

下面通过实施例对本申请进行详细描述，但并不意味着存在对本申请而言任何不利的限制。本文已经详细地描述了本申请，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本申请精神和范围的情况下针对本申请具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

实施例1：化合物1的合成

步骤1：化合物1-2的制备

在室温下，将中间体4-(2-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧乙基)-5-乙基-7-氧代-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-6-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.5g,2.90mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入三氟乙酸(4.69g,43.5mmol)，在室温下反应1小时。反应完毕后，旋蒸浓缩得到化合物1-2(1.2g,收率：99.32％)，为棕色油状物。MS(ESI)m/z[M+H]⁺＝417.2。

步骤2：化合物1-4的制备

室温下，将中间体1-2(1.2g,2.88mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入中间体5-(苄氧基)-6-甲基嘧啶-4-羧酸(0.77g，3.17mmol)，HATU(1.64g，4.32mmol),N,N-二异丙基乙胺(1.12g,8.64mmol),反应混合物室温搅拌反应3h。反应完毕后，加入水稀释，使用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并所得有机相用饱和食盐水清洗、无水硫酸钠干燥、过滤、旋蒸浓缩，所得残余物经硅胶柱纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝0％～5％)得目标化合物1-4(1.1g,收率：59.4％)，为黄色油状物。MS(ESI)m/z[M+H]⁺＝643.5。

步骤3：化合物1-5的制备

化合物1-4(5.0g,7.78mmol)溶解在Water(20mL)、MeOH(20mL)和THF(60mL)混合溶剂中，加入LiOH(652.08mg,27.23mmol)，混合物在25℃下反应2小时至原料反应完全，调节pH<4,加入乙酸乙酯萃取(100mL×2),合并所得有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、旋蒸浓缩，得到化合物1-5(4.76g,产率为99.5％)，为黄色固体。(ESI)m/z[M+H]⁺＝615.4。

步骤4：化合物1-6的制备

室温下，化合物1-5(100mg,0.16mmol)溶解在DCM(2mL)中，加入Oxalyl chloride(41.30mg,0.33mmol)，滴加一滴DMF，混合物在25℃下反应1小时后浓缩，加入THF(4mL)中溶解后所得反应液加入到NaH(39.04mg,0.98mmol,60％purity)与2-三氟甲基嘧啶-5-胺(79.61mg,0.49mmol)的THF(4mL)溶液中，混合物升温至70℃反应2小时至反应完全，反应液加入饱和氯化铵溶液中(10mL)淬灭,再加入乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并所得有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、旋蒸浓缩，所得残余物经硅胶柱纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝0％～5％)分离得到化合物1-6(55mg,产率为44.5％)。(ESI)m/z[M+H]⁺＝760.2。

步骤5：化合物1的制备

化合物1-6(45mg,59.23μmol)溶解在DCM(815.73μL)中，加入Boron trichloride(1M,236.92μmol,236.92μL)，混合物在25℃下反应0.2小时至反应完全，反应液弄缩后经pre-HPLC分离得到产物1(16mg,产率为40％)。

(ESI)m/z[M+H]⁺:670.4；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.20(s,2H),8.58(s,1H),6.80(m,1H),5.25(s,2H),4.54-4.51(m,1H),4.24(m,2H),3.79(m,2H),3.51(m,3H),3.25(m,1H),3.00(m,3H),2.84(m,1H),2.66(m,1H),2.44(m,3H),1.17(m,3H)。

实施例2：化合物2的合成

步骤1：化合物2-1的制备

氮气保护下，将化合物1-5(24.0mg,39.05μmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)中，加入草酰氯(42.0mg，330.7μmol)的二氯甲烷(0.2mL)溶液，所得反应液在25℃下搅拌反应60分钟至反应完成，反应液直接经过减压旋蒸得化合物2-1(24.7mg，浅黄色固体)，产率为99％。

步骤2：化合物2-2的制备

氮气保护下，将化合物5-三氟甲基嘧啶胺(12.9mg,78.9μmol)溶于四氢呋喃(1mL)中，加入钠氢(6.3mg,157.9μmol，60％)后搅拌5分钟，加入化合物2-1(24.7mg,39.4μmol)的四氢呋喃溶液(0.5mL)，所得反应液在25℃下搅拌反应60分钟至反应完成，反应液经水(2.0mL)淬灭，加乙酸乙酯萃取(1.0mL×3)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压旋蒸所得剩余物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得化合物2-2(16.0mg，白色固体)，产率为53.3％。LC-MS(ESI)[M+H]⁺:760.2。

步骤3：化合物2的制备

氮气保护下，将化合物2-2(25.0mg,32.9μmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氯化硼(0.2mL,0.2mmol，1mol/L)，所得反应液在25℃下搅拌反应60分钟至反应完成，反应液经甲醇(1.0mL)淬灭后经HPLC纯化得化合物2(1.2mg)，产率为5.6％。

LC-MS(ESI)[M+H]⁺:670.2；¹H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.89(s,2H),8.39(s,1H),6.81-6.75(m,1H),5.53(s,2H),4.24-4.16(m,2H),3.82–3.74(m,3H),3.68-3.59(m,2H),3.08-3.02(m,3H),3.00-2.92(m,2H),2.91-2.80(m,1H),2.73-2.65(m,1H),2.58-2.49(m,2H),2.41(s,3H),1.25-1.21(m,3H)。

实施例3：化合物3的合成

步骤1：化合物3-1的制备

氮气保护下，将化合物3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-胺(96mg,488.1μmol)溶于四氢呋喃(3mL)中，加入钠氢(39mg,976.2μmol，60％)后搅拌5分钟，加入化合物2-1(102mg,162.7μmol)的四氢呋喃溶液(3mL)，所得反应液在50℃下搅拌反应2小时至反应完成，反应液经饱和氯化铵溶液(10mL)淬灭，加乙酸乙酯萃取(15mL×2)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压旋蒸所得粗品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得化合物2-3(46mg,黄色固体)，产率为36％。LC-MS(ESI)[M+H]⁺:793.2。

步骤2：化合物3的制备

氮气保护下，将化合物3-1(36mg,45.4μmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氯化硼溶液(0.18mL,0.18mmol，1mol/L)，所得反应液在25℃下搅拌反应12分钟至反应完成，反应液浓缩后所得粗品经HPLC纯化得化合物3(4.6mg)，产率为14％。

LC-MS(ESI)[M+H]⁺:703.4；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.83(d,J＝2.1Hz,1H),8.60–8.49(m,2H),

6.89–6.77(m,1H),5.32(s,2H),4.52(d,J＝12.4Hz,1H),4.27(d,J＝2.9Hz,2H),3.81(t,J＝5.5Hz,2H),3.49(q,J＝11.3,10.1Hz,3H),3.25(t,J＝12.3Hz,3H),2.97(d,J＝9.7Hz,3H),2.81(d,J＝11.5Hz,1H),2.63(d,J＝10.2Hz,1H),2.44(s,3H),1.19(t,J＝7.4Hz,3H)。

实施例4：化合物4的合成

步骤1：化合物4-1的制备

氮气保护下，将化合物2-氨基-5-三氟甲基吡嗪(38.6mg,236.9μmol)溶于四氢呋喃(1mL)中，加入钠氢(18.9mg,473.9μmol,60％)后升温至50℃下搅拌2小时，加入化合物2-1(100mg,157.9μmol)的四氢呋喃溶液(0.3mL)，所得反应液在50℃下搅拌反应2小时至反应完成，反应液经水(2.0mL)淬灭，加乙酸乙酯萃取(5.0mL×2)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压旋蒸所得剩余物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得化合物4-1(80mg,浅黄色固体)，产率为53％。LC-MS(ESI)[M+H]⁺:760.0。

步骤2：化合物4的制备

氮气保护下，将化合物4-1(45mg,59.2μmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三溴化硼(27.8mg,236.9μmol)，所得反应液在25℃下搅拌反应15分钟至反应完成，反应液直接浓缩得粗品，粗品经HPLC纯化得化合物4(20mg)，产率为50％。

LC-MS(ESI)[M+H]⁺:670.2；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.87(s,1H),10.25(s,1H),9.35(s,1H),8.99(d,J＝1.4Hz,1H),8.57(s,1H),6.80–6.77(m,1H),5.32(s,2H),4.52(d,J＝12.4Hz,1H),4.23(q,J＝2.8Hz,2H),3.79(t,J＝5.5Hz,2H),3.59–3.40(m,4H),3.29–3.21(m,1H),2.99(q,J＝10.2,9.4Hz,4H),2.82(d,J＝11.3Hz,1H),2.67(dd,J＝4.3,2.4Hz,1H),2.44(s,3H),1.16(t,J＝7.4Hz,3H)。

实施例5：化合物5的合成

步骤1：化合物5-1的制备

氮气保护下，将化合物6-(三氟甲基)哒嗪-3-胺(57.9mg,355.4μmol)溶于四氢呋喃(1mL)中，加入钠氢(37.9mg,947.7μmol,60％)后升温至50℃下搅拌10分钟，加入化合物2-1(150mg,236.9μmol)的四氢呋喃溶液(0.5mL)，所得反应液在50℃下搅拌反应2小时至反应完成，反应液经水(2.0mL)淬灭，加乙酸乙酯萃取(5.0mL×2)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压旋蒸所得剩余物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得化合物5-1(100mg,浅黄色固体)，产率为51％。LC-MS(ESI)[M+H]⁺:760.2。

步骤2：化合物5的制备

氮气保护下，将化合物5-1(80mg,97.9μmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三溴化硼(45.9mg,391.7μmol)，所得反应液在25℃下搅拌反应15分钟至反应完成，反应液直接浓缩得粗品，粗品经HPLC纯化得化合物5(19mg)，产率为29％。

LC-MS(ESI)[M+H]⁺:670.2；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.12(s,1H),10.12(s,1H),8.50(s,1H),8.39(d,J＝9.3Hz,1H),8.17(d,J＝9.4Hz,1H),6.73–6.70(m,1H),5.28(s,2H),4.45(d,J＝12.4Hz,1H),4.16(q,J＝2.9Hz,2H),3.72(t,J＝5.4Hz,2H),3.41(t,J＝10.7Hz,4H),3.18(t,J＝13.2Hz,2H),2.92(q,J＝9.6,9.2Hz,3H),2.75(d,J＝11.3Hz,1H),2.57(d,J＝10.8Hz,1H),2.37(s,3H),1.10(t,J＝7.4Hz,3H)。

实施例6：化合物6的合成

步骤1：化合物6-1的制备

氮气保护下，将3,5-二(三氟甲基)吡啶-2-胺(10mg,43μmol)、化合物1-5(40mg,65μmol)溶于乙腈(3mL)中，再加入N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐(0.17g，0.61mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(36mg，95μmol)和N-甲基咪唑(18mg，0.22mmol)，升温至70℃下搅拌反应1小时至反应完成，反应液加水(6mL)淬灭，加乙酸乙酯萃取(5.0mL×3)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压旋蒸所得剩余物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得化合物6-1(12mg,浅黄色固体)，产率为33％。LC-MS(ESI)[M+H]⁺:826.9。

步骤2：化合物6的制备

氮气保护下，将化合物6-1(9mg,11μmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，加入三氯化硼/二氯甲烷溶液(0.1mL,1mol/L)，所得反应液在25℃下搅拌反应2小时至反应完成，加甲醇(1.0mL)淬灭后减压浓缩，所得粗品经HPLC纯化得化合物6(1.2mg)，产率为15％。

LC-MS(ESI)[M+H]⁺:737.1；¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ9.03(s,1H),8.55(d,J＝10.1Hz,2H),6.94(s,1H),5.45(s,2H),4.71–4.67(m,1H),4.33(s,2H),4.07(s,1H),3.89(t,J＝5.5Hz,2H),3.73(s,2H),3.44–3.39(m,2H),3.08(d,J＝7.0Hz,2H),2.91(s,1H),2.79(s,1H),2.63(s,2H),2.52(s,3H),1.31(s,3H)。

实施例7：化合物7的合成

步骤1：化合物7-1的制备

氮气保护下，将化合物2,4-二甲基-5-嘧啶胺(35.4mg,287.5μmol)和吡啶(0.3mL)溶于二氯甲烷(3mL)中，加入化合物2-1(140mg,221.1μmol)的二氯甲烷溶液(1mL)，所得反应液在25℃下搅拌反应2小时至反应完成，反应液经水(2.0mL)淬灭，加二氯甲烷萃取(1.0mL×3)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压旋蒸所得剩余物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得化合物7-1(110mg,白色固体)，产率为72％。LC-MS(ESI)[M+H]⁺:720.2。

步骤2：化合物7的制备

氮气保护下，将化合物7-1(45.0mg,62.5μmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，加入三氯化硼/二氯甲烷溶液(0.5mL，1mol/L)，所得反应液在25℃下搅拌反应60分钟至反应完成，反应液经甲醇(1.0mL)淬灭后经HPLC纯化得化合物7(5.8mg)，产率为15％。

LC-MS(ESI)[M+H]⁺:630.2；¹H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.57(s,1H),8.36(s,1H),6.87-6.82(m,1H),5.22(s,2H),4.27-4.21(m,2H),3.97-3.84(m,1H),3.80(t,J＝5.4Hz,2H),3.73-3.53(m,3H),3.44-3.27(m,2H),3.15-2.96(m,4H),2.89-2.78(m,1H),2.77-2.65(m,1H),2.53(s,3H),2.46–2.36(m,6H),1.22(t,J＝8.0Hz,3H)。

实验例1WRN解旋酶活性检测实验

1、实验仪器

本实验例所用仪器信息如表1所示。

表1

仪器名称	仪器厂家	型号
			离心机	Eppendorf	5810R
酶标仪	PerkinElmer	EnVision-2015

2、实验材料

实验所用WRN酶N端带有1个His-TEV标签，用真核细胞表达，纯度为90％。检测使用的两条单链DNA分别带有BHQ2和Cy5标记，当两个荧光分子靠近时(DNA处于双链状态时)由于淬灭效应，检测不到荧光信号。WRN具有解旋酶活性，可以使双链DNA解开形成单链，从而产生荧光信号。实验所需其他试剂耗材信息如表2所示。

表2

3、实验方法

将两条标记的单链DNA退火形成双链DNA。退火缓冲液：12mM Tris(pH 8.0),300mMNaCl,12mM MgCl₂,2mM DTT。退火程序：95℃，5min。

使用缓冲液(20mM Bicine，10mM KCl，1mM MgCl₂，0.005％ BSG，1mM TCEP，0.1％F-127，pH7.5)配置2×WRN酶(2nM)和2×底物(100nM双链DNA,1000nM捕获DNA,100uM ATP)。待测化合物用DMSO溶解至10mM，并用96孔V底板梯度稀释。在25uL 2×WRN酶中加入0.5uL化合物，室温孵育30min。加入25uL 2×底物，室温反应30min。使用酶标仪检测，激发光620nm，发射光685nm。

4、数据分析

用GraphPad Prism 8软件拟合浓度-效应曲线，并计算50％抑制效果的化合物浓度IC₅₀。首先计算每个化合物浓度所对应的百分比抑制率，然后使用GraphPad Prism 8软件的“log(inhibitor)vs.normalized response--Variable slope”方程拟合浓度-效应曲线，从而得到IC₅₀。

抑制率(％)＝(阳性对照孔荧光强度平均值-化合物孔荧光强度)/(阳性对照孔荧光强度平均值-阴性对照孔荧光强度平均值)*100

阳性对照：25uL 2×WRN酶+0.5uL DMSO+25uL 2×底物

阴性对照：25uL 2×缓冲液+0.5uL DMSO+25uL 2×底物

实验结果如表3所示。表3中IC50分级如下：“+++++”代表5nm<IC50<10nm，“++++”代表10nm<IC50<50nm，“+++”代表50nm<IC50<100nm，“++”代表100nm<IC50<500nm，“+”代表500nm<IC50<1500nm。

表3

实施例	WRN解旋酶活性(IC50 nM)
		实施例1	++++
实施例2	+
		实施例3	+++++

实验结果与结论：

上述测试表明，本发明化合物具有良好的WRN解旋酶活性，有进一步开发成为WRN解旋酶抑制剂的潜力。

实验例2WRN水解酶活性检测实验

1、实验仪器

本实验例所用仪器信息如表4所示。

表4

2、实验材料

实验所用WRN酶N端带有1个His-TEV标签，用真核细胞表达，纯度为90％。检测用的试剂盒(ADP-Glo^TMKinase Assay)购自Promega公司，货号V9101，分装后-40℃冰箱保存，试剂盒可以定量检测反应中ADP的生成量。WRN水解ATP生成ADP，加入ADP-Glo reagent会消耗反应体系中多余的ATP，再加入Kinase Detection Reagent将反应产生的ADP转化为ATP并产生化学发光。通过酶标仪检测化学发光信号可以反应出WRN的酶活性。实验所需其他试剂耗材信息如表5所示。

表5

试剂	品牌	货号
			Bicine	Sigma	B8660
KCl	Sigma	P9541
			MgCl₂	Sigma	M1028
Tween 20	Thermo Fisher	28320
			Tris	BBI Life Sciences	A600194-0500
NaCl	BBI Life Sciences	A610476-001
			TCEP	Sigma	646547
BSG	Sigma	G9391
			DNA	金斯瑞	NA
ATP	Sigma	A7699
			96孔V底板	碧云天	FPT019
384Well Plate	PE	6008280

3、实验方法

将单链DNA退火形成双链DNA。5×退火缓冲液：50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl。退火程序：95℃，5min。

使用缓冲液(20mM Bicine(pH 7.5)，10mM KCl，10mM MgCl₂，0.005％ BSG，0.002％ Tween 20，1mM TCEP)配置2×WRN酶(1nM)和2×底物(1nM双链DNA,100uM ATP)。待测化合物用DMSO溶解至10mM，并用96孔V底板梯度稀释。首先，在96孔板中加入25uL 2×WRN酶与0.5uL化合物，室温孵育30min。再加入25uL 2×底物，室温反应60min。从反应板中取5uL加入384孔板中检测，加5uL ADP-Glo reagent，室温孵育60min，加10uL KinaseDetection Reagent，室温孵育40min。酶标仪检测化学发光信号。

4、数据分析：

抑制率(％)＝(阳性对照孔发光强度平均值-化合物孔发光强度)/(阳性对照孔发光强度平均值-阴性对照孔发光强度平均值)×100

阳性对照：25uL 2×WRN酶+0.5uL DMSO+25uL 2×底物

阴性对照：25uL 2×缓冲液+0.5uL DMSO+25uL 2×底物

实验结果如表6所示。表6中IC50分级如下：“++++”代表100nm<IC50<500nm，“+++”代表500nm<IC50<1500nm。

表6

实施例	WRN水解酶活性(IC50 nM)
		实施例3	++++
实施例4	+++
		实施例5	+++

实验结果与结论：

上述测试表明，本发明化合物具有良好的WRN水解酶活性。

Claims

1.式(Ⅰ)所示化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，

其中，

L₁选自单键、-N(R_b1)-、-O-、-S-、-C(R_b2)₂-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-或

L₂选自单键、-N(R_b1)-、-O-、-S-、-C(R_b2)₂-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-或

R_b1选自H、C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基或3-6元杂环烷基，所述C_1-6烷基、C_1-6杂烷基、C_3-6环烷基和3-6元杂环烷基任选被1、2或3个R取代；

选自选自

或者，选自选自

当选自时，T选自C；

当选自时，T选自N或CH；

当选自时，R₂选自O或S；

n、p、q分别独立地选自0、1、2或3；

R’选自F、Cl、Br、I、OH、NH₂和CH₃；

2.根据权利要求1所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，R选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、COOH、Me、CF₃、CHF₂、CH₂F、

3.根据权利要求1或2所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，当选自时，R₂选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

4.根据权利要求3所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，结构单元选自

5.根据权利要求1或2所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，R₁分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、

6.根据权利要求5所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，结构单元选自：

7.根据权利要求1或2所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，R₅分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、SF₅、CN、Me、CF₃、HC(＝O)-、

8.根据权利要求1所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，结构单元选自

9.根据权利要求8所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，结构单元选自

10.根据权利要求1或2所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，R₆分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

11.根据权利要求10所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，结构单元选自

12.根据权利要求1或2所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，R₇分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

13.根据权利要求12所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，结构单元选自

14.根据权利要求1或2所述化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其中，R₃、R₄分别独立地选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、CN、Me、CF₃、

15.下式化合物、其光学异构体或其药效上可接受的盐，其选自

16.一种药物组合物，其中，包含权利要求1～15任一项所述的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐。

17.权利要求1～15任一项所述的化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐或权利要求16所述的药物组合物在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其中，所述肿瘤为微卫星高度不稳定的恶性肿瘤、错配修复缺陷的恶性肿瘤或者检测有大量(TA)_n重复序列的恶性肿瘤。

19.根据权利要求17所述的应用，其中，所述肿瘤相关疾病为与实体瘤相关疾病中的一种或多种。

20.根据权利要求17所述的应用，其中，所述肿瘤相关疾病包括结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌与卵巢癌中的一种或多种。