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CN118667810B - 5'utr元件、表达载体及其应用 - Google Patents

5'utr元件、表达载体及其应用

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CN118667810B
CN118667810B CN202410554063.5A CN202410554063A CN118667810B CN 118667810 B CN118667810 B CN 118667810B CN 202410554063 A CN202410554063 A CN 202410554063A CN 118667810 B CN118667810 B CN 118667810B
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ggg
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王秋积
刘晨
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Yunzhou Biotechnology Guangzhou Co ltd
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Abstract

本发明涉及体外转录领域，尤其涉及5'UTR元件、表达载体及其应用。本发明提供了5'UTR元件，所述5'UTR元件具有：如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12任意所示的核苷酸序列；或如所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或与所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。本发明通过提供5'UTR序列，解决体外合成mRNA时，原核生物5'UTR序列无法同时具有既能使mRNA表达效率高，又能使其加帽效率高的功能的问题。

Description

5'UTR元件、表达载体及其应用
技术领域
本发明涉及体外转录领域，尤其涉及5′UTR元件、表达载体及其应用。
背景技术
5′UTR是指成熟mRNA位于编码区上游、5′端帽下游不被翻译为蛋白质的区域。5′UTR从转录起始位点开始，在起始密码子的前一个核苷酸处结束，可以包含通过调控元件控制基因表达的元件。5′UTR通过与RNA结合蛋白相互作用调控mRNA稳定性、核糖体识别、mRNA二级结构，很大程度上决定了蛋白质表达效率和翻译效率。
真核细胞中m7G是mRNA中广泛存在的5′帽结构，它通过一个三磷酸键连接mRNA 5′端第一个核苷酸，称为帽0(m7GpppN，又称Cap 0)，Cap 0结构对mRNA的翻译至关重要。mRNA的起始核苷酸2′O位置额外的甲基化修饰为帽1(m7GpppNm，又称Cap 1)修饰，Cap 1修饰能够降低mRNA体内应用引起的免疫反应。mRNA 5′帽能调节前体mRNA的剪切、保护mRNA不被核酸酶降解并决定蛋白质翻译的启动。因此体外合成的mRNA中，Cap 1的比例越高越好。
体外合成mRNA是一种利用酶、模板、NTPs和反应Buffer等成分，模拟mRNA在生物体内的合成过程。一般流程为：制备并纯化模板、体外转录mRNA、加帽反应、去除模板DNA、纯化mRNA。其中加帽反应受到5′UTR热力学自由能的影响非常大。经简单探究，5′UTR热力学自由能越低，加帽反应越难以进行。以此推测热力学自由能较高的5′UTR有着较高的加帽率。在其它条件相同的条件下，加帽效率越高的mRNA表达效率也越高。因此，体外转录的mRNA，其5′UTR既直接影响着mRNA的表达效率，又通过影响加帽效率间接影响着mRNA的稳定性和表达效率。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了5′UTR元件、表达载体及其应用。本发明通过提供5′UTR序列，解决体外合成mRNA(信使核糖核酸)时，mRNA表达载体5′UTR(5′非翻译区)序列无法同时具有既能使mRNA表达效率高，又能使其加帽效率高的功能的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了5′UTR元件，所述5′UTR元件具有：
(1)、如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12任意所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:1的序列为：ACTCTTCTGCTCGCCACAGTCTGGAGACGAACGCACC。(A1)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:2的序列为：ATTGGATTGTGACGAAGAGATTGAGAGAGAACTGACC。(A2)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:3的序列为：ATAGGATTGTGACGAAGAGATTGAGAGAGAACTGACC。(A3)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:4的序列为：AATATTAAGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAACGCACC。(A5)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:5的序列为：AATATTAAGG TAAAAAGAGAGAGGTGAATTAGAGAGTAGCCACC。(A7)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:6的序列为：AATATTATTGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(A9)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:7的序列为：AATATTAGGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(A10)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:8的序列为：AATATTAGAGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(A11)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:9的序列为：ACATTTGCTTC TGACACAACTGTGTTCACTTCACGCATCAAACAGACACC。(B1)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:10的序列为：ACATTTGCTT CTGACACAACTGTGTTCACTTCACGCATCAAACGGACACC。(B2)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:11的序列为：ACATTTGCTT CTGACACAACTACATCAACTTCACTAATCATACGGCCACC。(B8)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:12的序列为：ACATCTGCTT CTGACACAACTACATCAACTTCACTAATCATACGGCCACC。(B9)
在本发明的一些实施方案中，上述5′UTR元件中，所述核苷酸的5′端还包括：GGG碱基和/或AG碱基。
在本发明的一些实施方案中，上述5′UTR元件中，所述5′UTR元件具有：
(4)、如SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:36任意所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:13的序列为：GGGACTCTTCTGCTCGCCACAGTCTGGAGACGAACGCACC。(GGG+A1)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:14的序列为：AGACTCTTCTGCTCGCCACAGTCTGGAGACGAACGCACC。(AG+A1)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:15的序列为：GGGATTGGATTGTGACGAAGAGATTGAGAGAGAACTGACC。(GGG+A2)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:16的序列为：AGATTGGATTGTGACGAAGAGATTGAGAGAGAACTGACC。(AG+A2)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:17的序列为：GGGATAGGATTGTGACGAAGAGATTGAGAGAGAACTGACC(GGG+A3)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:18的序列为：AGATAGGATTGTGACGAAGAGATTGAGAGAGAACTGACC(AG+A3)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:19的序列为：GGGAATATTAAGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAACGCACC。(GGG+A5)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:20的序列为：AGAATATTAAGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAACGCACC。(AG+A5)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:21的序列为：GGGAATATT AAGGTAAAAAGAGAGAGGTGAATTAGAGAGTAGCCACC。(GGG+A7)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:22的序列为：AGAATATTA AGGTAAAAAGAGAGAGGTGAATTAGAGAGTAGCCACC。(AG+A7)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:23的序列为：GGGAATATTATTGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(GGG+A9)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:24的序列为：AGAATATTATTGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(AG+A9)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:25的序列为：GGGAATATTAGGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(GGG+A10)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:26的序列为：AGAATATTAGGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(AG+A10)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:27的序列为：GGGAATATTAGAGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(GGG+A11)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:28的序列为：AGAATATTAGAGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGGGACC。(AG+A11)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:29的序列为：GGGACATTT GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTTCACGCATCAAACAGACACC。(GG G+B1)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:30的序列为：AGACATTTGC TTCTGACACAACTGTGTTCACTTCACGCATCAAACAGACACC。(AG+B1)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:31的序列为：GGGACATTT GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTTCACGCATCAAACGGACACC。(GG G+B2)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:32的序列为：AGACATTTGC TTCTGACACAACTGTGTTCACTTCACGCATCAAACGGACACC。(AG+B2)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:33的序列为：GGGACATTT GCTTCTGACACAACTACATCAACTTCACTAATCATACGGCCACC。(GG G+B8)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:34的序列为：AGACATTTGC TTCTGACACAACTACATCAACTTCACTAATCATACGGCCACC。(AG+B8)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:35的序列为：GGGACATCT GCTTCTGACACAACTACATCAACTTCACTAATCATACGGCCACC。(GG G+B9)
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:36的序列为：AGACATCTGC TTCTGACACAACTACATCAACTTCACTAATCATACGGCCACC。(AG+B9)
本发明还提供了表达盒，包括：上述5′UTR元件。
本发明还提供了表达载体，包括：上述5′UTR元件和/或上述表达盒以及可接受的基因元件。
在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述基因元件包括：启动子、Kozak序列、荧光素酶基因、3′UTR元件和多聚腺苷尾中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述启动子包括：T7启动子。
在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述荧光素酶基因包括：高斯荧光素酶基因或萤火虫荧光素酶基因。
在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，还包括骨架质粒：pmRVac。
本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述表达载体。
本发明还提供了上述5′UTR元件、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主在体外转录mRNA中的应用。
本发明还提供了上述5′UTR元件、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主提高体外转录mRNA的表达效率和/或加帽效率。
本发明还提供了体外转录mRNA的方法，取上述表达载体线性化后，体外转录mRNA，加帽反应，获得所述mRNA。
本发明提供了5′UTR元件，所述5′UTR元件具有：
(1)、如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12任意所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
本发明的有益效果包括：
(1)、本发明中的5′UTR序列的加帽效率在体外合成的mRNA中很高。
(2)、本发明中的5′UTR序列的加帽效率高达80％以上。
(3)、本发明中的5′UTR序列的表达效率在体外合成的mRNA中高于现有的改造的5′UTR序列。
(4)、因此本发明中的5′UTR序列的表达效率和加帽效率在体外合成的mRNA中都是已知5′UTR序列中极高的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示mRNA表达载体图谱；
图2示设计的各5′UTR AG版本细胞表达效果强度图；
图3示设计的各5′UTR GGG版本细胞实验表达效果强度图；
图4示部分实施例与对比例细胞实验表达效果强度对比数据图；
图5示第一组GGG版本mRNA的小鼠活体成像荧光强度图；
图6示第二组GGG版本mRNA的小鼠活体成像荧光强度图；
图7示第一组AG版本mRNA的小鼠活体成像荧光强度图；
图8示第二组AG版本mRNA的小鼠活体成像荧光强度图；
图9示GGG版本的mRNA小鼠活体成像发光强度对比图；
图10示AG版本的mRNA小鼠活体成像发光强度对比图。
具体实施方式
本发明公开了5′UTR元件、表达载体及其应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提到的表达效果的检测：mRNA在细胞内会翻译出相应的蛋白质，高斯荧光素酶表达载体能够在细胞内翻译出高斯荧光素酶这种蛋白质，它与底物腔肠素反应会发出荧光。利用微孔板化学发光检测仪器可以检测到化学发光的强度并将其转化为数值。根据数值的大小，可以比较含不同5′UTR的高斯荧光素酶mRNA表达载体在细胞内的表达量的强弱，即表达效果的强弱。
本发明提到的加帽效率的检测：mRNA体外合成时的加帽过程会形成多种中间产物，将所有的中间产物和终产物的分子量计算出来，利用液相-质谱联用的方法可以检测到相应分子量大小的物质，统计所有中间产物和终产物的总值，即可计算加帽产物占所有加帽过程所有中间产物和终产物的比例，即可得出加帽效率。
mRNA的5′帽有多种类型。其中最重要的是Cap 1。本发明中关于提高加帽效率的描述指的都是提高Cap 1比例。
本发明涉及的序列如下所示：
GGG+A4：GGGACTCTTCTGCTCGCCACAGTCTCGAGACGAACGCAC C。(如SEQ ID NO:37所示)
GGG+A6：GGGAATATTAAGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGCCA CC。(如SEQ ID NO:38所示)
GGG+A8：GGGAATATTAAGGTAAGTTAGAGAGAGGTGAATTAGAG AGTAGCCACC。(如SEQ IDNO:39所示)
GGG+B3：GGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTTATTAGC TCAAACAGACACC。(如SEQID NO:40所示)
GGG+B4：GGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTTATTAGC TGAAACAGACACC。(如SEQID NO:41所示)
GGG+B5：GGGACATTTGCTTCTGACACAACTAAATAAACTTCACAA ATCAAACGGACACC。(如SEQID NO:42所示)
GGG+B6：GGGACATTTGCTTCTGACACAACTAAATAAACTTCACAA ATCATACGGCCACC。(如SEQID NO:43所示)
GGG+B7：GGGACATTTGCTTCTGACACAACTAAATAAACTTCACTA ATCATACGGCCACC。(如SEQID NO:44所示)
GGG+B10：GGGACATCTGCTTCTGACACAACTACATCAACTTCACT AATTTTACGGCCACC。(如SEQID NO:45所示)
AG+A4：AGACTCTTCTGCTCGCCACAGTCTCGAGACGAACGCACC。(如SEQ ID NO:46所示)
AG+A6：AGAATATTAAGGTAAAAAGAGAGTGAGAGAGAAGCCAC C。(如SEQ ID NO:47所示)
AG+A8：AGAATATTAAGGTAAGTTAGAGAGAGGTGAATTAGAGAG TAGCCACC。(如SEQ ID NO:48所示)
AG+B3：AGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTTATTAGCTC AAACAGACACC。(如SEQ IDNO:49所示)
AG+B4：AGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTTATTAGCTG AAACAGACACC。(如SEQ IDNO:50所示)
AG+B5：AGACATTTGCTTCTGACACAACTAAATAAACTTCACAAAT CAAACGGACACC。(如SEQ IDNO:51所示)
AG+B6：AGACATTTGCTTCTGACACAACTAAATAAACTTCACAAAT CATACGGCCACC。(如SEQ IDNO:52所示)
AG+B7：AGACATTTGCTTCTGACACAACTAAATAAACTTCACTAAT CATACGGCCACC。(如SEQ IDNO:53所示)
AG+B10：AGACATCTGCTTCTGACACAACTACATCAACTTCACTAAT TTTACGGCCACC。(如SEQID NO:54所示)
C1：ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC。(如SEQ ID NO:55所示)
GGG+C1：GGGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCA CC。(如SEQ ID NO:56所示)
GGG+C2：GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATAT AAGACCCCGGCGCC。(如SEQ IDNO:57所示)
C3：AGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCCAAC CGCGGTTCGCGGCCGCT。(如SEQ ID NO:58所示)
C4：AGGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAA GA。(如SEQ ID NO:59所示)
C5：AGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCCCCC GGCGCC。(如SEQ ID NO:60所示)
C6：AGGGCAGTAATAGAATGCTTTCAGGAAGATGACAGAATCAGG AGAAAGATGCTGTTTTGCACTATCTTGATTTGTTACAGCAGCCAACTTA TTGGCATGATGGAGTGACAGGAAAAACAGCTGGC。(如SEQ ID NO:61所示)
C7：AGGGGCAAAAATCAAAATCAATCATCATCACAACATCAACAATCAATCATCAACACATCATCAAGACACCACC。(如SEQ ID NO:62所示)
AG+C1的序列为：AGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAAC CCACC。(如SEQ ID NO:63所示)
本发明实施例和对比例中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、发明者在使用GGG版本的人类血红蛋白的α球蛋白的5′UTR序列时，发现其细胞内表达效果很差。检测其mRNA的加帽率发现其Cap 1的比例为0％，将该5′UTR序列输入到RNA结构和能量预测网站：http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi，发现其热力学自由能较低，推测可能是过低的热力学自由能使其难以进行加帽反应。为验证mRNA 5′UTR的加帽效率与其热力学自由能高低的关系，也为了获得高加帽效率的5′UTR序列，发明者进行了本发明。
2、根据人类血红蛋白的α球蛋白的5′UTR序列的长度，结合发明者对于5′UTR序列的热力学自由能与加帽效率关系的猜测，发明者设计了9条与人类血红蛋白的α球蛋白的5′UTR序列的长度相同的5′UTR序列(37nt)、一条长度为44nt的5′UTR序列、一条长度为45nt的5′UTR序列，共计11条5′UTR，设为实验组A组。另外为了探究5′UTR长度对自身的热力学自由能与加帽效率的关系是否有影响，发明者设计了10条长度为50nt的5′UTR序列，设为实验组B组。为了探究5′UTR序列的热力学自由能与加帽效率关系是否在不同的体外转录工艺中有相同的影响，对A组和B组的5′UTR序列前端加GGG或AG，以使用不同的转录工艺进行mRNA的体外合成，并称为GGG版本或AG版本。
3、GGG版本5′UTR热力学自由能数值如表1所示：
表1设计的5′UTR热力学自由能预测
4、将新5′UTR序列应用到含高斯荧光素酶基因的mRNA表达载体上。如图1所示，mRNA表达载体包含T7启动子、5′UTR、Kozak序列、高斯荧光素酶基因、3′UTR、多聚腺苷尾、pmRVac载体等部分。
5、通过基因工程的方法构建相应的mRNA表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌中。使转化的大肠杆菌在含有琼脂和卡那霉素的LB平板上生长。挑取单个菌落接种并在含有卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒。通过Sanger测序验证质粒中从T7启动子到多聚腺苷尾的目的区域的碱基序列的正确性。
6、将Sanger测序验证序列正确的质粒对应的甘油菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养，用甘油保存菌液，剩余菌液用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒。
7、取步骤6的质粒用限制性内切酶切割，使其线性化，用DNA纯化回收试剂盒进行线性化质粒的纯化，纯化后对样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认酶切完全。
8、以步骤7中的线性化DNA为模板，通过体外转录合成mRNA并进行加帽反应的方法获得含有5′端帽结构的成熟mRNA(GGG版本)或共转录加帽的方法体外合成含有帽结构的成熟mRNA(AG版本)。使用mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。对mRNA样品进行浓度测定，使用变性琼脂糖凝胶对mRNA进行凝胶电泳，以鉴定mRNA的完整性。
9、将步骤8的mRNA转染到HEK293T细胞中，37℃培养。在转染后6h、24h、48h、72h等4个时间点吸取细胞培养上清液与底物和反应Buffer混匀，表达产物高斯荧光素酶与其底物腔肠素接触会发生酶促反应，化学发光。使用微孔板化学发光分析仪测量化学发光的强度，并将强度转化为数值，可表现产物的表达效果。根据表达产物反应化学发光强度的高低，可对应不同5′UTR的mRNA的表达效率的高低。
10、使用液相-质谱联用的方法，测量mRNA的加帽效率。
根据细胞内的表达效果数据和加帽效率数据，筛选得到细胞内表达效率优于对比例C1的5′UTR且Cap 1加帽效率大于80％的5′UTR序列。
Cap 1加帽效率的计算方法为Cap 1在质谱检测中的峰面积占加帽过程中底物、所有中间产物、终产物之和的峰面积的百分比。Cap 1的比例超过80％为优，越高越好。
GGG版本和AG版本的mRNA加帽效率检测结果如表2所示，其中设计的5′UTR的mRNACap 1比例全都超过80％。从该实验结果来看，GGG版本的mRNA加帽效率在一定程度上受其5′UTR序列的热力学自由能影响，而AG版本的mRNA，其加帽效率可能不受其5′UTR序列的热力学自由能影响。
表2设计的GGG和AG版本的5′UTR的mRNA加帽率检测结果
11.用细胞实验检测mRNA表达差异性。
用各版本5′UTR的高斯荧光素酶的mRNA转染HEK293T细胞，使用12孔板细胞培养皿，转染用量为0.3μg/孔，在转染后6h、24h、48h、72h时收集20μL细胞培养上清液，与底物腔肠素和反应缓冲液混匀后，置于微孔板化学发光检测仪进行化学发光强度的检测。
细胞内表达效果验证实验结果如图2、图3和表3、表4所示。
其中AG版本的mRNA，以AG+C1作为阳性对照，以未经转染的HEK293T细胞作为空白对照，表达效率超过AG+C1的有AG+A1、AG+A2、AG+A3、AG+A4、AG+A5、AG+A6、AG+A7、AG+A10、AG+B1、AG+B2。
由于GGG+C1的加帽率极低，其mRNA表达载体在细胞中的表达效率受加帽率影响而无法真实反映，因此使用已知的一款较优的5′UTR来作为细胞内表达效率的比较，其为C2。其中GGG版本的各改造载体，以GGG+C2作为阳性对照，以未经转染的HEK293T细胞作为空白对照，表达效率超过GGG+C2的有：GGG+A1、GGG+A2、GGG+A3、GGG+A5、GGG+A7、GGG+A9、GGG+A10、GGG+A11、GGG+B1、GGG+B7、GGG+B8。
表3设计的各5′UTR AG版本细胞表达效果强度数据表
表4设计的各5′UTR GGG版本细胞实验表达效果强度数据表
对细胞内表达效果验证实验结果表3、表4两组数据进行差异显著性分析，以48h时间点的数据进行单因素分析。情况如表5、表6。
表5GGG版本显著性差异分析表
表6AG版本显著性差异分析表
根据细胞内表达效果验证实验结果表5、表6两组数据的差异显著性分析结果，有显著性差异的组别GGG的有8组：GGG+A1、GGG+A2、GGG+A5、GGG+A7、GGG+A9、GGG+A10、GGG+B1、GGG+B8，AG的有11组：AG+A1、AG+A3、AG+A4、AG+A5、AG+A6、AG+A7、AG+A10、AG+B1、AG+B2、AG+B4、AG+B10。根据两组的实验结果，我们确定具有统计学显著差异的相关序列有：A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A9、A10、B1、B2、B4、B8、B10。虽然A11和B9与对比例的差异不显著，但从细胞实验数据可见，其表达效果优于对比例。
对比例
本对比例选用了6条细胞内表达效率较好的5′UTR(AG+C1、C3、C4、C5、C6、C7)的高斯荧光素酶mRNA表达载体与本发明在实施例具有统计学显著差异序列组别中随机挑选的4条表达效率较高的5′UTR(AG+A2、AG+A5、AG+A7、AG+A10)进行比较。转染用量为0.5μg，实验步骤和其他变量与实施例一致。以未经转染的HEK293T细胞作为空白对照。实验结果如表7和图4所示，本发明的AG+A2、AG+A5、AG+A7、AG+A10的细胞内表达效率优于对比例的细胞内表达效率。
表7部分实施例与对比例细胞实验表达效果强度对比数据表
将实施例AG+A2、AG+A5、AG+A7、AG+A10分别与每一个对比例进行差异显著性分析，以48h时间点的数据进行单因素分析。情况如表8、表9、表10、表11。
表8AG+A2与对比例显著性差异分析表
表9AG+A5与对比例显著性差异分析表
表10AG+A7与对比例显著性差异分析表
表11AG+A10与对比例显著性差异分析表
根据上述实施例(AG+A2、AG+A5、AG+A7、AG+A10)与对比例(AG+C1、C3、C4、C5、C6、C7)细胞实验及显著性差异分析结果，可以认为AG+A5、AG+A7的表达效果都显著高于对比例C1、C3、C4、C5、C6、C7。AG+A10的表达效果与对比例相比部分有显著性差异。AG+A2的表达效果与对比例相比没有显著性差异。
关于对比例的说明：对比例C1为野生型人类血红蛋白的α球蛋白的5′UTR序列。C2-C7为文献或NCBI公开的5′UTR序列，其热力学自由能预测数据见表12。
表12对比例热力学自由能预测和加帽效率数据表
验证例萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)
小鼠实验：
由于高斯荧光素酶是分泌型的，因此其在小鼠体内表达后会分泌到细胞外，随着血液扩散到全身，不利于信号的收集。因此使用非分泌型的萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)基因进行小鼠体内的表达探究。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2存在时，能够催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧，同时发出550-580nm波长的可见光。
从高斯荧光素酶的细胞实验结果中挑选出1条表达效果较好的5′UTR，构建萤火虫荧光素酶的mRNA表达载体。分为AG版本和GGG版本。用相同的方法构建含不同5′UTR的萤火虫荧光素酶基因表达载体，获得mRNA。为了使萤火虫荧光素酶mRNA更稳定地进入到小鼠细胞内，发明者使用脂质纳米颗粒(LNP)将mRNA包封起来，形成LNP-mRNA。并测量LNP的浓度、包封率、粒径、电位、聚集度指数等参数。LNP质量检测数据如表13所示。
表13LNP质量检测数据表
取周龄为8周的ICR小鼠，称取重量，按照0.25mg/kg的注射用量将LNP-mRNA通过尾静脉注射到小鼠体内，6h后在腹腔注射底物溶液，麻醉后进行活体成像实验。
实验结果如图5～图10和表14所示：
表14小鼠活体成像发光强度数据表
对小鼠活体成像发光强度数据表进行显著性分析。结果如表15所示：
表15GGG+A2与GGG+C1对比例显著性差异分析表
表16AG+A2与AG+C1对比例显著性差异分析表
由上述小鼠体内实验和显著性差异分析结果可知，实施例GGG+A2小鼠体内的表达效果略优于对比例GGG+C2；实施例AG+A2的表达效果略优于对比例AG+C1，差异不显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.5' UTR元件，其特征在于，所述5' UTR元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.5' UTR元件，其特征在于，所述5' UTR元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:15或如SEQID NO:16所示。
3.表达盒，其特征在于，包括：如权利要求1或2所述的5' UTR元件。
4.表达载体，其特征在于，包括：如权利要求1或2所述的5' UTR元件和/或如权利要求3所述的表达盒以及可接受的基因元件。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述基因元件包括：启动子、Kozak序列、荧光素酶基因、3' UTR元件和多聚腺苷尾中的一种或多种。
6.如权利要求1或2所述的5' UTR元件、如权利要求3所述的表达盒和/或如权利要求4或5所述的表达载体在体外转录mRNA中的应用。
7.如权利要求1或2所述的5' UTR元件、如权利要求3所述的表达盒和/或如权利要求4或5所述的表达载体提高体外转录mRNA的表达效率和/或加帽效率。
8.体外转录mRNA的方法，其特征在于，取如权利要求4或5所述的表达载体线性化后，体外转录mRNA，加帽反应，获得所述mRNA。
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