CN118667818B - 一种在猪凝血因子ⅶ和ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅶ和ⅷ编码基因的方法及应用 - Google Patents
一种在猪凝血因子ⅶ和ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅶ和ⅷ编码基因的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种在猪凝血因子Ⅶ和Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ和Ⅷ编码基因的方法及应用，属于基因编辑技术领域。本发明提供了一组在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的sgRNA。针对猪凝血因子Ⅶ编码基因F7和猪凝血因子Ⅷ编码基因F8的第1内含子特定位点，分别设计sgRNA和打靶载体，将人凝血因子FⅦ和FⅧ蛋白编码基因定点敲入，以猪F7基因内源性启动子启动人凝血因子FⅦ蛋白表达，以猪F8基因内源性启动子启动人凝血因子FⅧ蛋白表达，表达水平与生理水平相当，不会对制备的基因编辑猪的健康状况产生显著影响，用于大规模生产人凝血因子FⅦ和FⅧ蛋白产品。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种在猪凝血因子Ⅶ和Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ和Ⅷ编码基因的方法及应用。
背景技术
凝血因子是血浆与组织中直接参与凝血的一大类物质统称，其中大多是由肝脏合成并分泌至血浆的蛋白质，对于机体出血后的凝血至关重要。在凝血过程中，不同凝血因子按一定次序被先后激活，通过内源性和外源性凝血途径的凝血级联反应(“凝血瀑布”学说)，最终实现凝血功能。
凝血因子缺陷导致凝血功能障碍，造成血友病等多种出血性疾病。临床上，通过外源输注缺失的凝血因子的替代疗法是当前治疗血友病的有效手段。其中，凝血因子Ⅷ(Coagulation factorⅧ，FⅧ)是内源性凝血途径的关键因子，其缺陷导致的血友病A，占人类血友病患者的80％～85％，因而对治疗用FⅧ的需求量较大。此外，对于部分接受外源输注凝血因子治疗的患者，体内产生相应凝血因子抗体，降低了治疗效果并增加了治疗风险。针对这类患者，参与外源凝血途径的关键因子凝血因子Ⅶ(FⅦ)是首选替代药物。FⅦ也被广泛用于创伤性出血的治疗，因此临床对FⅦ同样有较大需求量。
目前用于治疗的人类凝血因子制品主要来源于人类血浆，原料来源较为受限；早期也直接使用猪血浆凝血因子制品，但猪凝血因子与人类凝血因子并不完全相同；借助于基因工程技术，国外有用来自于体外培养的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达的重组人类FⅦ和FⅧ蛋白以及重组猪FⅧ蛋白产品，但由于蛋白表达水平偏低且蛋白翻译后修饰不完全，影响分泌、蛋白活性及半衰期等，再加上技术壁垒高、生产工艺复杂、产量小、成本较高，当前也缺乏国产化产品。因此，需要开发新的高效制备人类FⅦ和FⅧ的方法。近几十年来，用基因改造的动物或植物作为生物反应器生产人类功能性蛋白的技术，有望为人类凝血因子生产提供新的来源。比如，通过转基因技术，用乳腺特异性表达载体在羊或兔等哺乳动物乳腺表达人类FⅦ或FⅧ蛋白。乳腺生物反应器存在局限性，一方面目的基因在动物基因组中整合存在较大随机性，结果不稳定，目的蛋白表达水平存在较大个体差异；另一方面，蛋白加工和修饰系统在物种间和组织间存在较大差异，影响目的蛋白的活性、免疫原性和药代动力学等凝血因子特性。同时，乳腺生物反应器生产的目的蛋白仅占乳腺分泌的总蛋白的很小比例，增加了目的蛋白的纯化难度。将功能蛋白敲入动物基因组内源性位点，使其原位表达，可以获得翻译后修饰更完整的目的蛋白。羊和牛虽然也可以用于开发血液生物反应器，但人兽共患病的风险更高(如布鲁氏菌病、朊病毒感染、结核病等)。相比而言，猪的生理、代谢和蛋白翻译后修饰系统等方面与人类更相近，便于大规模繁殖饲养，人兽共患病风险低。当前，通过将人类血清白蛋白编码序列定点敲入到猪白蛋白基因位点，将猪作为血液生物反应器生产人类白蛋白，已有报道。利用猪作为血液生物反应器生产人类凝血因子还有待开发。
此外，猪作为一种理想的异种器官移植供体，有望解决人类器官移植中的供体器官短缺问题。解决人与猪器官间不相容性是该领域长期关键人物，其中凝血系统的不兼容性是重要方面。过去研究主要集中在免疫排斥反应问题上，凝血方面主要表达血栓调节蛋白。随着研究深入，对猪与人类之间功能蛋白人源化越来越受到重视，而凝血因子人源化是其中重要部分。构建仅表达人类凝血因子而不表达猪凝血因子的人源化猪模型，对于改善异种移植效果具有重要价值，特别是肝脏异种移植(大部分凝血因子是由肝脏合成)。比如，有报道在猪的FⅦ基因(F7)位点同时敲入人类FⅦ和人类白蛋白表达序列，进行人源化修饰(Li L,Meng H,Zou Q,et al.Establishment of gene-edited pigs expressing humanblood-coagulation factor VII and albumin for bioartificial liver use[J].JGastroenterol Hepatol,2019,34(10):1851-1859.)。但由于额外敲入人类白蛋白表达序列，并未完全模拟人类FⅦ人源化修饰，且可能表达猪FⅦ蛋白。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供有效对靶位点进行切割的一种在猪凝血因子Ⅶ和Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ和Ⅷ编码基因的方法及应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，一组在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的sgRNA，
所述一组sgRNA包括在猪凝血因子Ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ编码基因的第一sgRNA、在猪凝血因子Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅷ编码基因的第二sgRNA；
所述第一sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述第二sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
所述猪凝血因子Ⅶ基因在NCBI上的登录号为NC_010453，所述猪凝血因子Ⅷ基因在NCBI上的登录号为NC_010461。本发明的sgRNA有效对猪凝血因子Ⅶ基因位点和猪凝血因子Ⅷ基因位点进行定点切割。
第二方面，本发明还提供了一种表达所述sgRNA的表达载体。
进一步地，表达所述第一sgRNA的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示，表达所述第二sgRNA的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
第三方面，一种用CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的打靶载体，在猪凝血因子Ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子FⅦ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；在猪凝血因子Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅷ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
第四方面，本发明提供了所述sgRNA、所述表达载体和所述打靶载体在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞中的应用。
第五方面，本发明提供了一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞的制备方法，在猪胎儿成纤维细胞内共转染所述sgRNA表达载体和所述打靶载体，进行培养。
进一步地，sgRNA靶向识别位点在猪凝血因子编码基因的第1内含子内，猪凝血因子Ⅶ基因位点的sgRNA靶向识别位点的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；猪凝血因子Ⅷ基因位点的sgRNA靶向识别位点的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
在本发明具体实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
S1：取所述sgRNA表达载体和所述打靶载体各5～15μg，优选10μg，混合，得到混合质粒；
S2：将步骤S1的混合质粒转染至猪胎儿成纤维细胞中，电转，得到电转后的细胞；
S3：将步骤S2电转后的细胞培养成单克隆细胞，得到靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞。
进一步地，步骤S1中，将核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的sgRNA表达载体和核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的打靶载体各10μg，混合，得到混合质粒1；将核苷酸序列如SEQID NO：19所示的sgRNA表达载体和核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的打靶载体各10μg，混合，得到混合质粒2。
混合质粒1培养得到的靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞为在猪凝血因子Ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ编码基因的猪胎儿成纤维细胞；
混合质粒2培养得到的靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞为在猪凝血因子Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅷ编码基因的猪胎儿成纤维细胞。
进一步地，步骤S2电转的参数为：1350V、30ms和1pulse。
进一步地，步骤S3细胞铺于培养皿中的密度为50～5000个/皿。优选步骤S2中混合质粒1的电转后的细胞密度为3000～5000个/皿，步骤S2中混合质粒2的电转后的细胞密度为50～100个/皿。
进一步地，步骤S3用含胎牛血清的高糖DMEM培养基培养细胞。
进一步地，步骤S3胎牛血清的浓度为15％(v/v)。
进一步地，步骤S3培养条件为38.5℃、5％ CO2培养箱中培养。
进一步地，步骤S3培养基中嘌呤霉素的浓度为0.3～1μg/mL，优选1μg/mL。
进一步地，步骤S3培养时间为8～12天。
进一步地，步骤S3中，对混合质粒1制备得到的电转后的细胞，培养基中添加嘌呤霉素进行筛选。
第六方面，本发明提供了一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞，由所述制备方法制备得到。
第七方面，本发明提供了所述猪胎儿成纤维细胞在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪中的应用。
第八方面，本发明提供了一种靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪的制备方法，将所述猪胎儿成纤维细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，融合形成重组胚胎，重组胚胎移植到母猪体内，妊娠产仔后，获得所述基因编辑猪。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明针对猪凝血因子Ⅶ编码基因F7和猪凝血因子Ⅷ编码基因F8的第1内含子特定位点，分别设计sgRNA和打靶载体，将人凝血因子FⅦ和FⅧ蛋白编码基因定点敲入，以猪F7基因内源性启动子启动人凝血因子FⅦ蛋白表达，以猪F8基因内源性启动子启动人凝血因子FⅧ蛋白表达，表达水平与生理水平相当，不会对制备的基因编辑猪的健康状况产生显著影响，用于大规模生产人凝血因子FⅦ和FⅧ蛋白产品，同时使猪内源性凝血因子编码基因由于敲入的人凝血因子编码基因而被阻断，不能表达。并且人FⅦ和FⅧ单个蛋白人源化及两个蛋白人源化均可以实现，也可以与其他功能蛋白(如血清白蛋白)人源化的猪进行交配，获得更多功能蛋白同时人源化的猪模型，是更灵活、理想的凝血因子等多种功能蛋白人源化修饰方案，可用于完善异种移植相关基因修饰。
附图说明
图1为猪F7和F8基因靶位点序列与sgRNA。其中，A为F7基因靶位点序列与sgRNA；B为F8基因靶位点序列与sgRNA。
图2为sgRNA介导的靶位点切割效果。其中，A为pF7-sgRNA-1；B为pF7-sgRNA-2；C为pF8-sgRNA-0；D为pF8-sgRNA-1；E为pF8-sgRNA-2；F为pF8-sgRNA-0靶位点序列(猪F8)与对应的人类FⅧ蛋白编码序列(人F8)的碱基差异。
图3为猪F7基因位点精确打靶原理示意图。
图4为猪F8基因位点精确打靶原理示意图。
图5为克隆猪基因型鉴定结果图。其中，A为F7位点基因型鉴定；B为F8位点基因型鉴定。
图6为Sanger测序确认猪F7位点敲入人类FⅦ蛋白编码基因。其中A为克隆猪靶位点敲入人类FⅦ蛋白编码基因的Sanger测序峰图；B为测序结果的敲入序列所对应的蛋白序列与人类FⅦ蛋白序列比对结果。
图7为Sanger测序确认猪F8位点敲入人类FⅧ蛋白编码基因。其中A为克隆猪靶位点敲入人类FⅧ蛋白编码基因的Sanger测序峰图；B为测序结果的敲入序列所对应的蛋白序列与人类FⅧ蛋白序列比对结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1设计猪F7和F8基因靶位点特异性sgRNA
从NCBI中猪参考基因组(Sscrofa11.1)获取猪凝血因子FⅦ蛋白编码基因F7(NCBI登录号：NC_010453)和凝血因子FⅧ蛋白编码基因F8(NCBI登录号：NC_010461)的序列信息，以起始密码子ATG附近作为靶位点，设计特异的sgRNA，并测试设计的sgRNA是否有效。测序验证靶位点序列与参考序列是否一致，并以测序结果为准。
1、设计sgRNA
如图1A所示，设计了2条猪FⅦ蛋白编码基因F7的sgRNA序列，分别为pF7-sgRNA-1和pF7-sgRNA-2。如图1B所示，设计了3条猪FⅧ蛋白编码基因F8的sgRNA序列，分别为pF8-sgRNA-0、pF8-sgRNA-1和pF8-sgRNA-2。
sgRNA序列及其对应的靶序列如表1和表2所示。
表1
表2
2、构建sgRNA表达载体
(1)以PX330质粒(品牌：Addgene，货号：#42230，包含了SpCas9效应蛋白和U6启动子的核酸序列)为空白载体，用限制性内切酶BpiI切开后，作为酶切载体骨架。配制50μL酶切反应体系：10×Fast Digest缓冲液(品牌：Thermo Scientific，货号：B64)5μL，BpiI(品牌：Thermo Scientific，货号：FD1014)2μL，PX330质粒5μg，加双蒸水(ddH2O)补足至50μL；37℃孵育酶切2h，纯化回收酶切后的片段，得到PX330酶切载体骨架。
(2)合成靶位点特异的正反两条互补引物，在表2所示序列的5’端分别添加4个额外碱基，以与PX330酶切载体骨架的粘性末端互补配对；表2正义链的5’端额外碱基为5’-CACC-3’，作为正向引物；表2反义链的5’端额外碱基为5’-AAAC-3’，作为反向引物。将浓度为4μM的正向引物和反向引物各取5μL，混合，退火。退火程序为：98℃加热10min，自然冷却至室温(25℃)，得到退火产物(包含粘性末端的双链DNA片段)。
(3)将步骤(2)的退火产物克隆到步骤(1)的PX330酶切载体骨架上。
将步骤(1)的PX330酶切载体骨架0.5μL、步骤(2)的退火产物2μL和Solution I(Takara公司)2.5μL混合，16℃孵育2h，得到连接产物。
(4)将步骤(3)各连接产物(5μL)转化到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min后，42℃热激转化45s，得到转化后的大肠杆菌DH5α细胞。将转化后的大肠杆菌DH5α细胞涂布在添加氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落，于添加氨苄(100μg/mL)的液体LB培养基中37℃培养8h，得到筛选培养后的大肠杆菌DH5α细胞。裂解筛选培养后的大肠杆菌DH5α细胞，提取纯化，获得5种PX330-sgRNA表达载体(将表1中pF7-sgRNA-1、pF7-sgRNA-2、pF8-sgRNA-0、pF8-sgRNA-1和pF8-sgRNA-2序列分别插入PX330质粒中，即将原始PX330载体中的序列GGGTCTTCGAGAAGACCT替换为表2对应的正义链序列，获得分别表达表1中pF7-sgRNA-1、pF7-sgRNA-2、pF8-sgRNA-0、pF8-sgRNA-1和pF8-sgRNA-2序列的PX330-sgRNA表达载体)。
(5)通过测序验证步骤(4)制备的5种PX330-sgRNA表达载体序列正确。
3、测试sgRNA
通过转染测试步骤1设计的sgRNA的切割效果。
(1)用PFF培养基(添加15％v/v胎牛血清的高糖改良伊格尔氏培养基DMEM培养基)将猪的胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblast，PFF)，在38.5℃、5％ CO2培养箱中培养至汇合度80％时，消化收集PFF细胞。
(2)用InvitrogenTMNeonTM转染系统在步骤(1)处理后的PFF细胞中，分别转染步骤2构建的5种PX330-sgRNA表达载体，得到转染后的PFF细胞。每组细胞为2.5×105个，每组PX330-sgRNA表达载体的质量为5μg，电转参数为：1350V、30ms和1pulse。将转染后的细胞铺于24孔板中，添加新鲜PFF培养基，在38.5℃、5％ CO2培养箱中培养48h。
(3)收集步骤(2)培养后的PFF细胞，提取基因组，以提取的基因组为模板进行PCR扩增，得到sgRNA靶位点范围的片段(PCR产物)。
用2×Rapid Taq Master Mix(货号：P222-02，品牌Vazyme)进行PCR反应，PCR反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 10μL，浓度为10μM的上游引物0.2μL，浓度为10μM的下游引物0.2μL，提取的基因组模板1.5μL，超纯水8.1μL，总体积为20μL。PCR反应条件为：95℃3min；[95℃15s，55℃15s，72℃10s]36个循环；72℃5min；12℃保温。
F7位点的正向引物为：CCGACCGGGAAAGTCAACAGAC，F7位点的反向引物为：CACTTGGTACCGGAGTCAGGA；F8位点的正向引物为：TCGTGCTAATGCTGCTGTCA，F8位点的反向引物为：AGACCCTCTAGACACGCCTT。
(4)将步骤(3)得到的sgRNA靶位点范围的片段(PCR产物)进行Sanger测序(一代基因测序)，根据测序峰图判断靶位点是否发生切割，确定有效切割靶位点DNA双链的sgRNA。
如图2A和图2B所示，pF7-sgRNA-1没有切割所产生的双峰，没有切割活性，而pF7-sgRNA-2有明显的切割双峰，有效介导靶位点切割。如图2C、2D和图2E所示，pF8-sgRNA-1没有明显切割所产生的双峰，而pF8-sgRNA-0和pF8-sgRNA-2有明显的切割双峰，有效介导靶位点切割，其中pF8-sgRNA-0靶位点位于第一外显子内，而pF8-sgRNA-2靶位点位于第一内含子内。
实施例2设计猪F7和F8位点的打靶载体
将人凝血因子编码序列表达元件定点敲入到猪内源性位点时，需要提供打靶载体，为CRISPR/Cas9(一种基因编辑技术)切割双链DNA后的同源重组提供修复模板。
1、如图3所示，猪FⅦ蛋白编码基因F7位点的打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，由F7位点的左端同源臂、人类全长FⅦ蛋白编码基因(包括起始密码子和末尾的终止密码子，CCDS数据库登录号：CCDS9528.1)、转录终止的加尾信号(PolyA，图3中PA)、独立表达的嘌呤霉素(Puro)筛选标签(loxP-PGK-Puro-PA-loxP)、F7位点的右端同臂和表达白喉毒素A链(DTA)筛选标签(PGK-DTA-pA，用于负筛选杀死转基因的细胞，防止发生转基因而非同源重组)组成。
2、如图4所示，猪FⅧ蛋白编码基因F8位点的打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，由F8位点的左端同源臂、人类全长FⅧ蛋白编码基因(包括起始密码子和末尾的终止密码子，CCDS数据库登录号：CCDS35457.1)、转录终止的加尾信号(PolyA，图4中PA)、F8位点的右端同臂和表达DTA筛选标签组成。
由于FⅧ蛋白编码序列本身较长(>7kb)，导致打靶载体较大，故去除掉了Puro筛选标签。一方面，载体过大影响质粒拷贝数、得率和转染效率；另一方面，外源puro标签在后续猪模型应用中也需要去除。
实施例3猪体细胞基因修饰，定点敲入人类FⅦ或FⅧ表达元件
一、实验方法
1、人类FⅦ表达元件定点敲入：
(1)取实施例1制备的表达pF7-sgRNA-2的PX330-sgRNA表达载体(核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示)和实施例2制备的猪F7位点的打靶载体各10μg，混合，得到F7混合质粒。
(2)将步骤(1)的F7混合质粒转染至PFF细胞(5×105个)中，电转方法与实施例1相同，得到电转后的细胞。
(3)将步骤(2)电转后的细胞以低密度(3000～5000个/皿)铺于10cm培养皿中，用添加15％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养基，在38.5℃、5％ CO2培养箱中培养，培养基中添加1μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。培养8～12天，单细胞长成克隆样，得到单细胞来源的克隆细胞。
(4)挑取步骤(3)单细胞来源的克隆细胞至24孔板中继续培养至细胞长满培养孔，培养条件与步骤(3)相同。
(5)对步骤(4)培养完成的细胞，取四分之三细胞铺于24孔板继续培养至长满培养孔，培养条件与步骤(3)相同；剩余四分之一细胞进行细胞裂解，提取其基因组作为模板，用PCR扩增鉴定目标序列(人类全长FⅦ蛋白编码基因+PolyA+Puro筛选标签片段)是否精确整合到猪基因组靶位点，得到人类FⅦ敲入细胞，冻存备用。
用实施例1步骤3的方法进行PCR反应，其中，PCR反应条件为：95℃3min；[95℃15s，55℃15s，72℃2min]36个循环；72℃5min；12℃保温。PCR引物序列如表3所示。细胞为二倍体，有一对同源染色体。单等位基因敲入表示杂合子，双等位基因敲入表示纯合子。表3和表4中F7-纯/杂合指鉴定两条同源染色体中一个染色体敲入(杂合/单等位基因敲入)，还是两条染色体均发生敲入(纯合/双等位基因敲入)
表3
2、人类FⅧ表达元件定点敲入：
(1)取实施例1制备的表达pF8-sgRNA-0的PX330-sgRNA表达载体和实施例2制备的猪F8位点的打靶载体各10μg，混合，得到F8混合质粒0。将pF8-sgRNA-0替换为pF8-sgRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示)，其他条件不变，得到F8混合质粒1。
(2)按照本实施例人类FⅦ表达元件定点敲入方法中步骤(2)～(5)的方法，制备人类FⅦ敲入细胞。由于猪F8位点的打靶载体不包含Puro筛选标签，故培养基中不添加嘌呤霉素进行筛选，其中电转后的细胞以50～100个/皿的密度铺于10cm培养皿中。PCR引物序列如表4所示。
表4
二、实验结果
如表5所示，为F7和F8基因位点编辑的细胞克隆统计。F8位点由于位于X染色体，筛细胞使用的雄性细胞，仅有单条X染色体，故最终仅能获得单等位基因敲入的细胞，没有双等位基因敲入的细胞。
表5
用含pF8-sgRNA-0的PX330-sgRNA表达载体制备人类FⅧ敲入细胞时，未能成功获得预期的人类FⅧ敲入细胞。进一步分析发现，所设计的pF8-sgRNA-0的靶位点的序列与对应的人类FⅧ蛋白编码序列仅存在2个碱基差异(图2F)，因此pF8-sgRNA-0不但能切割猪F8基因靶位点，也会切割打靶载体，导致最终无法获得目标修饰的细胞克隆。因此用含pF8-sgRNA-2的PX330-sgRNA表达载体制备人类FⅧ敲入细胞，冻存备用。
实施例4通过体细胞核移植技术，获得FⅦ或FⅧ蛋白人源化的猪模型
一、实验方法
以实施例3获得的人类FⅦ敲入细胞(编号分别为#1、#2和#3)和人类FⅧ敲入细胞(编号分别为#77、#106和#165)作为供体细胞，用于体细胞核移植。
在显微操作仪下，将供体细胞注入去核的猪成熟卵母细胞的卵周隙，并通过电激活方式，用ECM2001(BTX)细胞融合电穿孔仪进行融合和激活(参数：120V/mm、30μsec、2pulses)，获得重组胚胎。
将重组胚胎移植到母猪受体输卵管内(每个母猪受体移植200枚左右重组胚胎)，共计移植767枚重组胚胎，其中3头母猪受体成功妊娠到期，分娩产下11只克隆仔猪(表6)。
取小块克隆仔猪的耳组织，提取基因组DNA作为模板，用于PCR扩增，PCR扩增步骤与实施例3相同)，对F7和F8靶位点的基因型进行鉴定。得到的PCR扩增产物进一步通过Sanger测序，以确认靶位点敲入人类FⅦ或FⅧ蛋白编码基因。
二、实验结果
如图5A和图5B所示，编号为451-5、306-3和306-7的共3头克隆仔猪为人类FⅦ敲入的阳性模型猪；编号451-1、451-3、451-7、451-9、306-1、306-5和306-9的共7头克隆仔猪为人类FⅧ敲入的阳性模型猪，而010-1克隆猪为野生型猪。如图6A、图6B、图7A和图7B所示，Sanger测序结果确认靶位点精确敲入了人类FⅦ或FⅧ蛋白编码序列。
表6体细胞核移植获得克隆猪情况统计
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一组在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的sgRNA，其特征在于，
所述一组sgRNA包括在猪凝血因子Ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ编码基因的第一sgRNA、在猪凝血因子Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅷ编码基因的第二sgRNA；
所述第一sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述第二sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO：5所示。
2.一种表达权利要求1所述sgRNA的表达载体，其特征在于，所述表达载体为表达所述第一sgRNA的表达载体或表达所述第二sgRNA的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，表达所述第一sgRNA的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示，表达所述第二sgRNA的表达载体的核苷酸序列如SEQ IDNO：19所示。
4.一种用CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的打靶载体，其特征在于，在猪凝血因子Ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子FⅦ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；在猪凝血因子Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅷ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
5.权利要求1所述sgRNA、权利要求2或3所述表达载体和权利要求4所述打靶载体在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞中的应用。
6.一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在猪胎儿成纤维细胞内共转染权利要求2或3所述表达载体和权利要求4所述打靶载体，进行培养。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，sgRNA靶向识别位点在猪凝血因子编码基因的第1内含子内，猪凝血因子Ⅶ基因位点的sgRNA靶向识别位点的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；猪凝血因子Ⅷ基因位点的sgRNA靶向识别位点的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
8.一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞，其特征在于，由权利要求6或7所述制备方法制备得到。
9.权利要求8所述猪胎儿成纤维细胞在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪中的应用。
10.一种靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求8所述猪胎儿成纤维细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，融合形成重组胚胎，重组胚胎移植到母猪体内，妊娠产仔后，获得所述基因编辑猪。
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