CN118649235A - Hvem抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体公开了一种HVEM抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除肿瘤细胞上的HVEM基因，增强了机体的抗肿瘤免疫应答，使得肿瘤的生长受到明显抑制。机制上，本发明证明HVEM缺失所介导的抗肿瘤免疫反应依赖于CD8⁺T细胞，且HVEM通过其CRD1结构域促使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视，从而促进肿瘤进展。进一步，通过敲除肿瘤细胞上的HVEM基因，联合多柔比星化疗治疗，可以使接种急性淋巴细胞白血病的小鼠实现无病生存，并能够诱导其机体产生免疫记忆，有效防止肿瘤复发，为针对急性淋巴细胞白血病的免疫疗法联合化疗提供了新的药物靶点。

Description

HVEM抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，更具体地，涉及一种HVEM抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用。

背景技术

白血病是最常见的儿科癌症，其中急性淋巴细胞白血病是最好发的亚型。各种白血病治疗方案虽经过多年发展有效提升了白血病患者的生存期，但每项疗法均存在一定弊端。化疗的副作用十分严重，造血干细胞移植和靶向药物治疗都有相当一部分患者存在复发的情况，免疫疗法如嵌合抗原受体T细胞疗法虽然治疗效果优越，但其成本十分高昂，且对于急性T淋巴细胞白血病患者无效。因此，目前亟待探索急性淋巴细胞白血病新的靶点，开发出高效、省时、低成本的治疗策略，以优化当前白血病的治疗手段。

疱疹病毒侵入介体（HVEM，又名TNFRSF14，CD270）作为肿瘤坏死因子受体家族的一员，在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突状细胞中均有表达。目前研究表明，HVEM在免疫细胞中调控多种生物学活动，具有双向免疫调节功能。作为配体，HVEM通过与BTLA或CD160结合，将抑制信号转导至T细胞或其他免疫细胞胞内，从而阻碍靶细胞的增殖与活化。而当HVEM与LIGHT或LTα结合时则会向T细胞传递共刺激信号，正反馈作用于T细胞的激活。作为受体，HVEM能够通过BTLA或LIGHT传递促炎和促生存信号。最近的临床试验结果表明，抗BTLA抗体在实体瘤治疗中展现出强大的抗肿瘤疗效（NCT04137900，NCT03856411）。此外，激活LIGHT或靶向CD160活化免疫细胞同样也能够达到增强抗肿瘤反应的效果。

而HVEM在免疫细胞中的分子机制虽然已被广为探究，但很少有研究关注肿瘤内源性HVEM的功能机制。之前曾有研究揭示了HVEM的表达与各种实体瘤（包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤和肝细胞癌）的肿瘤进展之间存在正相关性。在滤泡性淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病中，HVEM也是不良疾病预后的指标。然而在肿瘤相关研究领域中，鲜有研究者关注HVEM与包括白血病在内的血液系统恶性肿瘤之间的关联，也因此留下了进一步探索的空间。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术至少一项的不足，提供一种HVEM抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用，以肿瘤细胞的HVEM基因、蛋白和/或蛋白中间体作为抑制靶点，能抑制急性淋巴细胞白血病进展，增强免疫细胞抗肿瘤效应。

本发明的一个目的在于提供一种HVEM抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用。在本发明的一个以上实施例中，发现敲除急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞HVEM后，能够显著抑制肿瘤细胞的进展。

现有研究表明，HVEM在免疫细胞中调控多种生物学活动，具有双向免疫调节功能；以此为基础，现有技术将HVEM作为肿瘤组织靶点应用于实体癌的治疗，如结肠癌和前列腺癌，但是鲜有研究者关注HVEM与包括白血病在内的血液系统恶性肿瘤之间的关联。而本申请则创造性地从急性淋巴细胞白血病肿瘤组织出发，并在一个以上实施例中，发现敲除急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞HVEM后，能够显著抑制肿瘤细胞的进展。即HVEM抑制剂有望应用于制备急性淋巴细胞白血病治疗药物，提供了新的治疗策略。

进一步地，HVEM抑制剂靶向敲低或敲除肿瘤细胞的HVEM表达。

进一步地，HVEM抑制剂包括抑制HVEM表达的CRISPR/Cas9制剂。

进一步地，CRISPR/Cas9制剂包括sgRNA；sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列所示；所述SEQ ID NO.1为CACCGCATGGGC CTGCTGACCTGGC，所述SEQ ID NO.2为AAACGCCAGGTCAGCAGGCCCATGC。在本发明的一个以上实施例中，通过上述sgRNA能成功构建敲除HVEM基因的肿瘤细胞系。

进一步地，急性淋巴细胞白血病治疗药物包含多柔比星。在本发明的一个以上实施例中，发现当敲除肿瘤细胞HVEM与化疗药物多柔比星联合应用时，实现了试验对象的无瘤生存，并形成了免疫记忆。所述肿瘤为急性淋巴细胞白血病。

本发明的再一目的在于提供HVEM基因、其蛋白或其蛋白中间体作为肿瘤组织靶点在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。所述肿瘤为急性淋巴细胞白血病。在本发明的一个以上实施例中，发现敲除肿瘤细胞而非免疫细胞上的HVEM时，具有抗肿瘤效应。

本发明的再一目的在于提供靶向肿瘤细胞HVEM的HVEM抑制剂在制备增强免疫细胞抗肿瘤效应的药物中的应用。在本发明的一个以上实施例中，发现敲除肿瘤细胞的HVEM时，具有抗肿瘤效应，且该抗肿瘤效应主要依赖于CD8⁺T细胞，其实际是增强了相应免疫细胞的抗肿瘤效应。

进一步地，所述敲除HVEM基因是通过基因突变、RNA介导的抑制、RNA编辑、DNA基因编辑和/或碱基编辑实现的。

进一步地，基因编辑涉及使用Cas酶。

进一步地，提供根据上述基因编辑方法获得的肿瘤细胞。

本发明的再一目的在于提供一种HVEM抑制剂，包括sgRNA；sgRNA序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2序列所示；所述SEQ ID NO.1为CACCGCATGGGC CTGCTGACCTGGC，所述SEQID NO.2为AAACGCCAGGTCAGCAGGCCCATGC。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除肿瘤细胞上的HVEM基因，增强了机体的抗肿瘤免疫应答，使得肿瘤的生长受到明显抑制。机制上，本发明证明HVEM缺失所介导的抗肿瘤免疫反应依赖于CD8⁺T细胞，且HVEM通过其CRD1结构域促使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视，从而促进肿瘤进展。进一步，通过敲除肿瘤细胞上的HVEM基因，联合多柔比星化疗治疗，可以使接种急性淋巴细胞白血病的小鼠实现无病生存，并能够诱导其机体产生强大且长期的免疫保护作用，有效防止肿瘤的复发。

目前治疗急性淋巴细胞白血病的疗法各有弊端，造血干细胞移植和靶向药物治疗都有相当一部分患者存在复发的情况，免疫疗法如嵌合抗原受体T细胞疗法虽然治疗效果优越，但其成本十分高昂，且对于急性T淋巴细胞白血病患者无效。本发明通过靶向HVEM联合多柔比星治疗，能够使患有急性淋巴细胞白血病的个体肿瘤完全消退，并为机体建立长期的针对肿瘤的免疫保护，这对于急性淋巴细胞白血病的治疗以及有效防止疾病复发有着重要意义，为免疫疗法联合化疗提供了新的药物靶点。

附图说明

图1显示流式细胞术验证EL4-Vec和HVEM KO EL4细胞系中HVEM的表达。

图2a显示HVEM敲除显著抑制急性淋巴细胞白血病皮下瘤的生长，图2b显示HVEM敲除能够明显延缓急性淋巴细胞白血病皮下荷瘤鼠的生存期。

图3a显示HVEM敲除增加免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润，图3b显示HVEM敲除增加CD8+ T细胞在肿瘤微环境中的浸润。

图4a显示HVEM敲除显著抑制急性淋巴细胞白血病皮下瘤的生长的效应依赖CD8⁺T细胞，图4b显示HVEM敲除延缓急性淋巴细胞白血病皮下荷瘤鼠的生存期的效应依赖CD8+ T细胞。

图5a显示HVEM敲除显著抑制急性淋巴细胞白血病皮下瘤的生长的效应依赖CD8⁺T细胞，图5b显示HVEM敲除延缓急性淋巴细胞白血病皮下荷瘤鼠的生存期的效应依赖CD8⁺T细胞。

图6显示HVEM敲除联合多柔比星治疗彻底消除急性淋巴细胞白血病皮下瘤。

图7显示HVEM敲除联合多柔比星治疗可触发长期免疫记忆。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、HVEM基因敲除EL4细胞系的构建

本实施例以小鼠急性T淋巴细胞白血病细胞系EL4作为急性T淋巴细胞白血病肿瘤模型，利用CRISPR-Cas9技术构建HVEM敲除EL4细胞系（HVEM KO EL4），并将转导空载体的EL4细胞作为对照（EL4-Vec）。使用流式细胞术对敲除细胞系进行流式染色，以确定HVEM基因的敲除情况（图1）。用于敲除HVEM基因的sgRNA序列如下：1F-CACCGCATGGGCCTGCTGACCTGGC (SEQ ID NO.1)；1R- AAACGCCAGGTCAGCAGGCCCATGC (SEQ ID NO.2)。

二、HVEM KO EL4体内生长情况监测

将上述HVEM KO EL4或EL4-Vec细胞系皮下接种于C57BL/6小鼠，每只小鼠接种量为0.5×10⁶肿瘤细胞/50 μl PBS。与对照组相比，图2a显示敲除组的肿瘤体积明显减小，图2b显示敲除组的生存期显著延长，证明了敲除HVEM能够显著抑制体内肿瘤的发生发展。

三、HVEM KO EL4肿瘤免疫微环境分析

将上述HVEM KO EL4或EL4-Vec细胞系皮下接种于C57BL/6小鼠，于第17天解剖并取出完整的肿瘤，将其制备成单细胞悬液，对其肿瘤免疫微环境进行流式细胞分析。结果如图3所示，与对照组相比，HVEM敲除的肿瘤微环境中的免疫细胞和CD8⁺T细胞浸润显著增加，这表明肿瘤内源性HVEM缺失能够重塑肿瘤免疫微环境，增加微环境中免疫细胞特别是CD8⁺T细胞的浸润。

四、通过免疫细胞剔除确定HVEM敲除介导的抗肿瘤免疫应答中关键的免疫细胞亚群

将上述HVEM KO EL4或EL4-Vec细胞系皮下接种于C57BL/6小鼠，每只小鼠接种量为0.5×10⁶肿瘤细胞/50 μl PBS，并使用CD8阻断抗体剔除小鼠体内的CD8⁺T细胞。结果如图4所示，可观察到在没有CD8⁺T细胞存在的情况下，HVEM敲除的肿瘤生长速度和小鼠生存预后与对照组相似，且相较于未剔除CD8⁺T细胞的HVEM敲除的肿瘤，其肿瘤体积显著增加、生存期显著缩短，证明HVEM敲除介导的抗肿瘤免疫反应依赖于CD8+ T细胞。

五、通过构建HVEM突变体确定HVEM分子发挥免疫抑制效应的功能结构域

HVEM的胞外部分由4个富含半胱氨酸的结构域（CRDs）组成，免疫细胞固有的HVEM通过不同的CRD结构域发挥双向免疫调节的作用，而肿瘤细胞固有的HVEM的功能尚不明确。因此本发明构建HVEM突变的EL4细胞株EL4 ΔCRD1 （CRD1结构域缺失） 和EL4 ΔCRD3（CRD3结构域缺失），其中，构建ΔCRD1序列如SEQ ID NO.3所示。

将上述HVEM KO EL4或EL4-Vec或EL4 ΔCRD1或EL4 ΔCRD3细胞系皮下接种于C57BL/6小鼠，每只小鼠接种量为0.5×10⁶肿瘤细胞/50 μl PBS。结果如图5所示，CRD1缺失能够显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期，而CRD3缺失显著加速肿瘤生长并缩短小鼠生存期，这表明CRD1结构域对HVEM发挥免疫抑制功能至关重要。因此，肿瘤固有的HVEM通过其CRD1结构域促进肿瘤进展。

六、HVEM敲除联合多柔比星治疗疗效探究

多柔比星（Dox）是抗有丝分裂的细胞毒性药物，常用于急性白血病的治疗。将HVEMKO EL4或EL4-Vec细胞系皮下接种于C57BL/6小鼠，每只小鼠接种量为0.5×10⁶肿瘤细胞/50 μl PBS，并分别用2.5mg/kg剂量的多柔比星对小鼠进行治疗。结果如图6所示，接种HVEMKO EL4的小鼠在给予多柔比星治疗的情况下，均可实现无瘤生存，表明HVEM敲除联合多柔比星治疗可彻底消除急性淋巴细胞白血病，达到治愈的效果。

七、HVEM敲除联合多柔比星治疗对机体免疫记忆形成的探究

上述接种HVEM KO EL4并接受多柔比星治疗后痊愈的小鼠，再次接种2.5×10⁶EL4细胞。结果如图7所示，大部分个体的肿瘤仍然会完全消退或进展缓慢，说明靶向HVEM并联用多柔比星治疗能够使机体形成系统性免疫记忆。

据最新统计，急性淋巴细胞白血病是儿科癌症中最好发的亚型，而50岁以上的急性淋巴细胞白血病患者5年生存率仅为25%，故而发现急性淋巴细胞白血病的新靶点与新机制具有重要意义。而正如本申请前述关于HVEM作为急性淋巴细胞白血病新靶点的内容以及本申请实施例内容，在本发明的一个以上实施例中，利用敲除肿瘤HVEM基因并联合多柔比星治疗，使接种急性淋巴细胞白血病的小鼠实现无病生存，并能够诱导其机体产生系统性免疫记忆，该结果表示，敲除肿瘤HVEM基因并联合多柔比星具有显著疗效，且有效防止肿瘤复发，从而为联合治疗提供了新的药物靶点。

显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种HVEM抑制剂在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，HVEM抑制剂在靶向敲低或敲除肿瘤细胞的HVEM表达的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，HVEM抑制剂包括抑制HVEM表达的CRISPR/Cas9制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9制剂包括sgRNA；sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列所示；所述SEQ ID NO.1为CACCGCATGG GCCTGCTGACCTGGC，所述SEQ ID NO.2为AAACGCCAGG TCAGCAGGCC CATGC。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，急性淋巴细胞白血病治疗药物还包括多柔比星。

6.靶向肿瘤细胞的HVEM抑制剂联合化疗药物在制备急性淋巴细胞白血病治疗药物中的应用。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包含多柔比星。

8.HVEM基因、其蛋白或其蛋白中间体作为肿瘤组织靶点在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

9.靶向肿瘤细胞HVEM的HVEM抑制剂在制备增强免疫细胞抗肿瘤效应的药物中的应用。

10.一种HVEM抑制剂，其特征在于，包括sgRNA；sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2序列所示；所述SEQ ID NO.1为CACCGCATGG GCCTGCTGAC CTGGC，所述SEQ ID NO.2为AAACGCCAGG TCAGCAGGCC CATGC。