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CN118638826A - 表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中应用 - Google Patents

表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中应用 Download PDF

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CN118638826A
CN118638826A CN202310212946.3A CN202310212946A CN118638826A CN 118638826 A CN118638826 A CN 118638826A CN 202310212946 A CN202310212946 A CN 202310212946A CN 118638826 A CN118638826 A CN 118638826A
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protein
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surfactant
cell extract
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CN202310212946.3A
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卢元
王婷
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Tsinghua University
Original Assignee
Tsinghua University
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Abstract

本申请公开了表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中应用，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，本申请使用表面活性剂或纳米圆盘进行无细胞反应，所得到的嗅觉受体蛋白都有较好的表达，并且也具有较好的可溶性，这可以为后续传感器的开发提供了多种不同的传感元件。

Description

表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中应用
技术领域
本申请涉及无细胞反应技术领域，尤其涉及表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中应用。
背景技术
无细胞体系能够为膜蛋白生产应用提供多种高效且不受蛋白活性毒性影响的合成体系。而除了高效表达以外，限制膜蛋白生产应用的另一个重要因素是其跨膜结构的有效支撑，这是膜蛋白保持活性的先决条件。没有得到有效支撑的膜蛋白疏水区域往往会形成聚集沉淀，从而影响其活性折叠甚至无法折叠成活性口袋。无细胞体系中由于其没有细胞膜的限制，在膜蛋白的跨膜支撑上有着其独特的优势。开放式无细胞反应可以很容易地补充各种添加剂来支持蛋白质合成、稳定为膜蛋白提供能够嵌入的疏水环境。
目前的无细胞体系例如大肠杆菌体系中缺失其中的生物膜结构，从而使得膜蛋白在无细胞体系表达后表现出一定的不可溶性，即疏水区域没有得到有效稳定造成的蛋白聚集情况。所以在无细胞体系中需要添加额外协助膜蛋白稳定疏水结构的成分。目前用的较多的是具有两亲性的表面活性剂，以及依靠合成脂质组成的生物膜模拟成分纳米圆盘以及脂质体。由不同膜模拟成分组成不同的膜结构可供不同膜蛋白对脂质组成、相、张力、流动性以及曲率等膜参数的需求。但由合成脂质种类的限制导致纳米圆盘及脂质体形成的膜种类有限而不能满足多种膜蛋白对膜条件的需求，以及膜上天然蛋白也会对某些蛋白的功能与结构有影响。
发明内容
针对现有技术中不能满足不同膜蛋白对膜成分的需求，本申请提供了表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中的应用，所述表面活性剂或纳米圆盘可以提供合成膜蛋白自然状态下的脂质材料，提供尽可能的复杂性，便于膜蛋白的嵌入及功能的维持，并且，所述表面活性剂或纳米圆盘可以为无细胞反应的膜蛋白提供疏水支撑条件。
本申请具体技术方案如下：
1.表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中的应用。
2.根据项1所述的应用，其中，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，优选为MscL膜蛋白、嗅觉受体蛋白或新冠病毒受体蛋白。
3.根据项1或2所述的应用，其中，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，优选地，所述支架蛋白为载脂蛋白；所述载脂蛋白优选选自MSP1、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1E3D1_D37C、MSP1D1-△H5、MSP1D1-△H4H5或MSP1D1-△H4-H6，优选为MSP1E2；
优选地，所述脂质为DPPC、DMPG、DOPC或DMPC。
4.根据项1-3中任一项所述的应用，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、月桂醇聚氧乙烯醚、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、葵基-β-D-麦芽糖苷、月桂基二甲基氧化胺、十二烷基-β-D-麦芽糖苷或7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
5.根据项1-4中任一项所述的应用，其中，所述表面活性剂的浓度为临界胶束浓度值的数倍，优选为2-5倍的临界胶束浓度值。
6.根据项3-5中任一项所述的应用，其中，所述脂质的浓度为0.085-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.1-0.15mg/mL；
优选地，所述脂质与所述支架蛋白的质量比为1:1-10，优选为1:5-10。
7.根据项1-6中任一项所述的应用，其中，所述表面活性剂或纳米圆盘加入无细胞合成体系组合物中合成膜蛋白，优选地，所述无细胞合成体系组合物包含DNA模板、无细胞试剂和细胞提取物。
8.根据项7所述的应用，其中，所述细胞提取物为原核生物或真核生物来源的细胞提取物，优选为原核生物来源的细胞提取物，进一步优选为大肠杆菌来源的细胞提取物、枯草芽孢杆菌来源的细胞提取物、谷氨酸棒杆菌来源的细胞提取物或者需钠弧菌来源的细胞提取物，最优选为大肠杆菌来源的细胞提取物。
9.根据项7或8所述的应用，其中，所述无细胞试剂包含无机盐、镁离子、氨基酸组合物、转录翻译相关辅助因子、能量源物质和DNA模板；
优选地，所述无机盐选自谷氨酸钾、谷氨酸氨和/或草酸钾，优选为谷氨酸钾、谷氨酸氨和草酸钾；
优选地，所述氨基酸组合物选自精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的两种或两种以上；
优选地，所述转录翻译相关辅助因子选自辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺中的一种或两种以上，优选为辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺；
优选地，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。
10.一种表达膜蛋白的方法，其包括：
将含有编码膜蛋白基因的表达质粒加入含有表面活性剂或纳米圆盘的无细胞反应体系组合物中进行无细胞反应得到膜蛋白。
11.根据项11所述的方法，其中，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，优选为MscL膜蛋白、嗅觉受体蛋白或新冠病毒受体蛋白。
12.根据项10或11所述的方法，其中，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，优选地，所述支架蛋白为载脂蛋白；所述载脂蛋白优选选自MSP1、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1E3D1_D37C、MSP1D1-△H5、MSP1D1-△H4H5或MSP1D1-△H4-H6，优选为MSP1E2；
优选地，所述脂质为DPPC、DMPG、DOPC或DMPC。
13.根据项10-12中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、月桂醇聚氧乙烯醚、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、葵基-β-D-麦芽糖苷、月桂基二甲基氧化胺、十二烷基-β-D-麦芽糖苷或7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
14.根据项10-13中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂的浓度为临界胶束浓度值的数倍，优选为2-5倍的临界胶束浓度值。
15.根据项12-14中任一项所述的方法，其中，所述脂质的浓度为0.085-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.1-0.15mg/mL；
优选地，所述脂质与所述支架蛋白的质量比为1:1-10，优选为1:5-10。
16.根据项10-15中任一项所述的方法，其中，所述无细胞合成体系组合物包含DNA模板、无细胞试剂和细胞提取物。
17.根据项16所述的方法，其中，所述细胞提取物为原核生物或真核生物来源的细胞提取物，优选为原核生物来源的细胞提取物，进一步优选为大肠杆菌来源的细胞提取物、枯草芽孢杆菌来源的细胞提取物、谷氨酸棒杆菌来源的细胞提取物或者需钠弧菌来源的细胞提取物，最优选为大肠杆菌来源的细胞提取物。
18.根据项16或17所述的方法，其中，所述无细胞试剂包含无机盐、镁离子、氨基酸组合物、转录翻译相关辅助因子、能量源物质和DNA模板；
优选地，所述无机盐选自谷氨酸钾、谷氨酸氨和/或草酸钾，优选为谷氨酸钾、谷氨酸氨和草酸钾；
优选地，所述氨基酸组合物选自精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的两种或两种以上；
优选地，所述转录翻译相关辅助因子选自辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺中的一种或两种以上，优选为辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺；
优选地，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。
发明的效果
由于膜蛋白跨膜区域为疏水结构，当没有疏水材料进行支撑时则会不正常折叠，常常表现出聚集不可溶的状态，而加入表面活性剂或纳米圆盘后，能够有效支撑膜蛋白的疏水结构，从而使无细胞反应后得到的膜蛋白呈现可溶状态，并且膜蛋白的表达量增高。
本申请使用表面活性剂或纳米圆盘进行无细胞反应，所得到的嗅觉受体蛋白都有较好的表达，并且也具有较好的可溶性，这可以为后续传感器的开发提供了多种不同的传感元件。
本申请使用纳米圆盘进行无细胞反应，所得到的新冠病毒受体蛋白均具有较好的表达，也具有较好的可溶性，并且所述的新冠病毒受体蛋白可以被用于物种全长ACE2的表达及结合力表征等工作。
附图说明
图1为在含有细胞提取物、盐离子、氨基酸、辅因子、能量源物质及DNA模板组成的无细胞反应体系中使用不同原核生物的细胞提取物的膜蛋白的表达量示意图。
图2是使用表面活性剂进行无细胞反应时的示意图，其中，a是进行无细胞反应的流程示意图，b是反应后所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图3是支架蛋白和脂质组装的电镜图，其中，a是支架蛋白和脂质组成的示意图，b是不同的支架蛋白和不同的脂质组成的纳米圆盘的电镜图。
图4是使用不同浓度的脂质进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，其中，a是不同浓度的脂质DPPC进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，b是不同浓度的脂质DMPG进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，c是不同浓度的脂质DOPC进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，d是不同浓度的脂质DMPC进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图5是使用不同浓度的纳米圆盘进行无细胞反应时的示意图，其中，a是使用纳米圆盘进行无细胞反应的示意图，b是使用不同浓度的纳米圆盘进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图6是使用不同的纳米圆盘进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，其中，a是脂质DPPC与4种支架蛋白组装的纳米圆盘进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，b是脂质DMPG与4种支架蛋白组装的纳米圆盘进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，c是脂质DOPC与4种支架蛋白组装的纳米圆盘进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，d是脂质DMPC与4种支架蛋白组装的纳米圆盘进行无细胞反应时所得到的膜蛋白的荧光强度的示意图，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图7是使用表面活性剂Brij-35进行无细胞反应所得到的19种嗅觉受体蛋白的表达量通过测量荧光值计算得到的示意图，其中，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图8是使用表面活性剂Brij-35进行无细胞反应所得到的8种非融合嗅觉受体蛋白的表达量通过灰度分析的示意图，其中，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图9是使用纳米圆盘进行无细胞反应所得到的19种非融合嗅觉受体蛋白的表达量通过测量荧光值计算得到的示意图，其中，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图10是使用纳米圆盘进行无细胞反应所得到的8种非融合嗅觉受体蛋白的表达量通过灰度分析的示意图，其中，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图11是使用纳米圆盘进行无细胞反应所得到的8种非融合嗅觉受体蛋白的表达量通过测量荧光值计算得到的示意图，其中，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
图12是使用纳米圆盘进行无细胞反应所得到的人源全长ACE2的示意图，其中，a是表达了人源全长hACE2的无细胞体系western blot的结果，b是通过对表达western blot结果进行灰度分析后的表达结果，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本申请做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中的应用。
所述表面活性剂是两亲性的化合物，并且在结构上是多样的。它们在临界胶束浓度(CMC)时即能形成胶束，由于表面活性剂的两亲性，活性剂单分子会形成最有利的结构。在水溶液中，低浓度的表面活性剂分子呈分子分散的状态，当浓度增高到一定程度(CMC浓度)时，单分散的分子就会聚集成大的(球形)聚集体，疏水基团朝内，亲水基团朝外，而将表面活性剂加入无细胞合成体系中合成膜蛋白时，由于表面活性剂的两亲性，可以使膜蛋白的疏水区域被表面活性剂的疏水端包围。
在本申请中，所述纳米圆盘是稳定的人工生物膜结构，由合成的脂质组成，可适用于跨膜结构复杂且需要明确成分的应用中，例如结构解析等。
在无细胞合成体系中加入表面活性剂或纳米圆盘，可以为膜蛋白提供疏水支撑材料。
在一些实施方式中，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，优选为MscL膜蛋白、嗅觉受体蛋白或者新冠病毒受体蛋白。
在本申请中，所述膜蛋白可分为外周膜蛋白以及整合蛋白(跨膜蛋白)。
在本申请中，所述含有疏水跨膜区域的膜蛋白，其指的是蛋白中有疏水氨基酸组成强疏水的区域，并且此区域能深嵌入到磷脂双层的疏水区，分布或者跨越在磷脂双分子层中。
在本申请中，所述MscL膜蛋白指的是2段跨膜(III型)的大电导机械敏感通道蛋白。
在本申请中，所述嗅觉受体蛋白是GPCR(G蛋白偶联受体)家族蛋白，含有七段跨膜区域。G蛋白偶联受体在细胞膜上，是许多细胞信号转导过程的参与者。在这些过程中，嗅觉受体蛋白能结合细胞周围环境中的化学物质例如气味分子并激活细胞内的一系列信号通路，最终引起细胞状态的改变。
在本申请中，所述新冠病毒受体蛋白受体血管紧张素ACE2为是单段跨膜蛋白。为了进入宿主细胞，新冠病毒SARS-CoV-2利用病毒表面的刺突蛋白与细胞膜上的血管紧张素转化酶2(ACE2)进行结合，该酶在体内表达与多种细胞中，包括肺泡上皮细胞，鼻和口腔粘膜细胞，血管内皮和小肠的肠上皮细胞。ACE2的表达水平与SARS-CoV-2假病毒有较高的感染性相关，表明ACE2水平升高可能使个体更容易发生新冠病毒传播。同时ACE2与新冠病毒表面蛋白刺突蛋白结合力越高，其被入侵的概率及程度越高。
本申请使用上述所述的无细胞反应体系合成新冠病毒受体蛋白，表达量高，并且具有较好的可溶效果，并将合成得到的新冠病毒受体蛋白与新冠受体结合位点(RBD)使用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)进行结合能力的测试，评价了新冠病毒受体蛋白与新冠RBD的结合能力。
在一些实施方式中，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，优选地，所述支架蛋白为为载脂蛋白；所述载脂蛋白优选选自MSP1、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1E3D1_D37C、MSP1D1-△H5、MSP1D1-△H4H5或MSP1D1-△H4-H6；优选为MSP1E2；
优选地，所述脂质为DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，分子量为734.04)、DMPG(二肉蔻酰磷脂酰甘油，分子量为688.85)、DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，分子量为786.11)或DMPC(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，分子量为678.93)，对于脂质，其可以是市购的，例如可以购自Avanti Polar Lipids，Inc，美国。
MSP1是载脂蛋白一段200个氨基酸的功能区域，这个蛋白能够自发组装包围脂质形成纳米圆盘。
MSP1E1、MSP1E2及MSP1E3则是在MSP1蛋白的基础上，在56位谷氨酰胺及56位脯氨酸之间分别插入一段、两段及三段的22个氨基酸螺旋重复体。在添加了这些螺旋的重复体之后，这些支架蛋白形成直径大小不一的纳米圆盘，且添加的重复螺旋越多，其形成纳米圆盘的直径越大。大直径的纳米圆盘可容纳大的多跨膜蛋白以及复合结构的膜蛋白。
例如，所述MSP1E1是一种扩展膜支架蛋白，其是在MSP1序列的基础上，通过在55位谷氨酰胺后插入两个(氨基酸56-99)22个氨基酸螺旋重复体获得，在插入这些螺旋的重复体之后，该支架蛋白可形成直径更大的纳米圆盘。
MSP1D1则是在MSP1的基础上去除了N端的11个氨基酸，去除后的支架蛋白则形成直径更小的纳米圆盘，虽稳定性稍下降，此时的纳米圆盘流动性更强。
MSP1E3D1_D73C则在73位的天冬氨酸突变为半胱氨酸。
MSP1D1△H5、MSP1D1△H4-H6及MSP1D1△H4H5则分别删减了蛋白中的多种螺旋结构，这些删减版本包绕着脂质双分子层能形成直径不一且稳定性不同的纳米圆盘。
在本申请中，所述支架蛋白是通过使用大肠杆菌原核细胞表达，并纯化得到，优选地，所述支架蛋白带有组氨酸标签。
所述表达纯化方法采用本领域常规的方法进行，优选地，所述支架蛋白通过下述方法制备得到：
1)转化：采用本领域常规的方法制备含有支架蛋白基因的表达载体，然后将表达支架蛋白的表达载体转到表达宿主感受态BL21(DE3)中。
2)培养：挑取形状平整的单菌落到新鲜的液体LB培养基中进行12-24h的培养。随后以培养物5％加到液体培养基中进行扩大培养。
3)诱导：当OD600为0.6-0.8时，添加0.5mM诱导剂IPTG，在诱导剂条件下后培养4小时，通过离心培养基收集菌体。其中培养表达条件仍为37℃，220rpm。
4)破碎：收集后菌泥用磷酸盐缓冲液洗涤三次后用结合缓冲液重悬为OD600为40的菌体悬浮液，利用低温高压破碎仪(1500bar)对细胞进行破碎。破碎的细胞裂解物12000rpm低温离心20分钟后用0.22μm滤头进行过滤。
5)纯化：过滤后的细胞破碎液过有镍填料的柱子对有组氨酸标签的目的蛋白进行亲和纯化，纯化步骤按照纯化柱说明书所示上样及洗脱。
6)透析：纯化后的支架蛋白由于在高浓度咪唑的洗脱缓冲液中需要在低温中透析到透析缓冲液中以备后续功能检测，部分液氮速冻后存放于-80℃冰箱中后续冰上融化使用，其中，所述结合缓冲液是通过称取20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，30mM咪唑，用磷酸或氢氧化钠调节pH到7.4，其在使用前需要用0.45μm水系膜进行抽滤、超声及预冷；
所述洗脱缓冲液包含500mM氯化钠，500mM咪唑，20mM磷酸二氢钠，并且用磷酸或氢氧化钠调节pH到7.4，其在使用前需要用0.45μm水系膜进行抽滤、超声及预冷。
所述透析缓冲液包含20mM Tris，100mM氯化钠，0.5mM EDTA，并且用盐酸调节pH到7.4，其在使用前需要用0.45μm水系膜进行抽滤、4℃预冷。
在本申请中，对于支架蛋白和脂质制备纳米圆盘的方法，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行制备，例如可以在冰上将支架蛋白与脂质混合进行制备组装得到纳米圆盘；
例如，制备组装纳米圆盘的方法如下：
1)脂质前处理：脂质使用前保存于-20℃中，使用前需要用氯仿进行溶解，配制成5mM的脂质氯仿溶液。此溶液在通风橱中旋蒸12小时后放置过夜使得有机溶剂全部蒸发，脂质在瓶壁形成一层脂质膜。成膜后的脂质利用胆酸钠进行充分重悬。配制成50mM的脂质溶液。
2)支架蛋白准备：纯化后的支架蛋白在冰上融化并调整浓度至2mg/mL待用。
3)纳米圆盘组装：制备好的脂质与支架蛋白以体积比1：1-10或质量比1：1-10在冰上进行混合，并在4℃条件下静置1小时。待支架蛋白与脂质充分组装后加入生物珠(Bio-Beads SM-2，BIO-RAD公司)以去除有机杂质，4℃静置过夜。次日，组装好的纳米圆盘用0.22μm的滤膜进行过滤，待用。
在一些实施方式中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、月桂醇聚氧乙烯醚、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、葵基-β-D-麦芽糖苷、月桂基二甲基氧化胺、十二烷基-β-D-麦芽糖苷或7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)为非离子型表面活性剂，其CMC值为0.9mM，其通过本领域常规的方法可以得到，例如可以通过电导法测试可以得到。
桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)为非离子型表面活性剂，其CMC值为0.09mM；
吐温20(Tween 20)为非离子型表面活性剂，其CMC值为0.06mM；
吐温80(Tween 80)为非离子型表面活性剂，其CMC值为0.012mM；
十一烷基-β-D-麦芽糖苷(UDM)为非离子型表面活性剂，分子量为496.59，其CMC值为0.2mM；
3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐(CHAPS)为两性离子型表面活性剂，分子量为614.88，其CMC值为10mM；
葵基-β-D-麦芽糖苷(DM)为非离子型表面活性剂，分子量为482.56，其CMC值为0.2mM；
月桂基二甲基氧化胺(DDAO)为两性离子型表面活性剂，其分子量为229.4，CMC值为2mM；
十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)为非离子型表面活性剂，分子量为510.6，其CMC值为0.17mM；
7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Cymal-7)为非离子型表面活性剂，分子量为522.63，其CMC值为0.19mM。
在一些实施方式中，所述表面活性剂的浓度为临界胶束浓度值的数倍，优选为2-5倍的临界胶束浓度值。
例如，所述表面活性剂的浓度可以为2倍、3倍、4倍、5倍等的临界胶束浓度值。
在一些实施方式中，所述脂质的浓度为0.085-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.1-0.15mg/mL；
优选地，所述脂质与所述支架蛋白的质量比为1:1-10，优选为1:5-10。
例如，所述脂质的浓度可以为0.085mg/mL、0.090mg/mL、0.091mg/mL、0.092mg/mL、0.093mg/mL、0.094mg/mL、0.095mg/mL、0.096mg/mL、0.097mg/mL、0.098mg/mL、0.099mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL等；
所述脂质与所述支架蛋白的质量比(m脂质:m支架蛋白)可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等。
在一些实施方式中，所述表面活性剂或纳米圆盘加入无细胞合成体系组合物中合成膜蛋白，优选地，所述无细胞合成体系组合物包含DNA模板、无细胞试剂和细胞提取物。
在本申请中，所述无细胞合成体系指的是一种没有细胞膜及细胞生长的非生物系统，其主要通过基础的细胞裂解物或者表达纯化的蛋白合成相关的组合酶组分在体外进行蛋白合成，同时需要添加的蛋白合成氨基酸、能量系统、盐离子和相关的辅因子等转录翻译必需的底物，由于体系中没有细胞膜，其是一种可以进行调控操作的系统，可以使用加入量身定制的膜材料协助膜蛋白的折叠，满足特定的膜蛋白合成要求和应用。
在一些实施方式中，所述细胞提取物为原核生物或真核生物来源的细胞提取物，优选为原核生物来源的细胞提取物，进一步优选为大肠杆菌来源的细胞提取物、枯草芽孢杆菌来源的细胞提取物、谷氨酸棒杆菌来源的细胞提取物或者需钠弧菌来源的细胞提取物，最优选为大肠杆菌来源的细胞提取物。
在本申请中，对于细胞的培养，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或需钠弧菌的培养，本申请不作任何限制，其可以根据本领域常规的方法进行培养。
本申请使用上述所述的表面活性剂或者上述所述的纳米圆盘进行无细胞反应时，膜蛋白具有较好的表达量，并且被表面活性剂或纳米圆盘有效支撑后膜蛋白具有较好的可溶性。
在本申请中，DNA模板可以采用本领域常规的方法制备，例如，可以采用下述方法制备：
首先利用PCR进行DNA片段扩增，插入片段与载体分别设计双向引物(购自苏州金唯智公司(中国))，Tm值在60-65℃，长度18-75bp片段之间，引物的5’端设计与接连片段有20-25bp的同源臂。使用Primer STAR DNA或Q5 DNA连接酶在PCR仪(Bio-Rad公司)中按照酶使用说明书进行扩增。
扩增后的产物加入DNA loading buffer(全式金公司)后用DNA凝胶电泳(120V，200mA，30分钟)确认后，试剂盒回收的DNA片段。
回收后的载体及需要插入的片段的DNA通过T5外切酶(购自Epicentre公司)，T4DNA连接酶和Phusion DNA聚合酶(购自NEB公司)等在适当溶液中进行连接。
连接后的质粒转化到商业化的DH5α感受态中生长过夜并且挑取单菌落进行测序确认，将确认后的含有正确DNA模板质粒的菌株进行过夜培养后进行DNA模板质粒的提取得到DNA模板。
对于DNA模板质粒的提取方法，本申请不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行提取，例如可以质粒小提取试剂盒提取，优选为OMEGA公司提供的质粒小提取试剂盒进行提取。例如，在本申请中，对于无细胞反应(共20μL)，DNA模板可以为15-60ng/μL。
例如，DNA模板可以为15ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、35ng/μL、40ng/μL、45ng/μL、50ng/μL、55ng/μL、60ng/μL等。在本申请的后续实验中，将DNA模板在无细胞反应体系中的浓度设定为15ng/mL
在一些实施方式中，所述无细胞试剂包含无机盐、镁离子、氨基酸组合物、转录翻译相关辅助因子和能量源物质；
优选地，所述转录翻译相关辅助因子为辅酶A、NAD和/或NTPs；
优选地，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。
在一些实施方式中，所述无机盐为谷氨酸钾、谷氨酸氨和/或草酸钾，优选为谷氨酸钾、谷氨酸氨和草酸钾。在一些实施方式，谷氨酸钾在无细胞反应体系中的浓度为175mM，谷氨酸氨在无细胞反应体系中的浓度为10mM，草酸钾在无细胞反应体系中的浓度为2.7mM。
在本申请的后续实验中无机盐采用上述浓度。
在本申请中，镁离子是RNA催化及组装核糖体的关键离子。当镁离子浓度不足时，核糖体会分解而导致翻译过程停止。但是当镁离子浓度过高时，也会引起翻译过程提早结束。因此镁离子的浓度是无细胞反应中关键条件组分，对于不同表达特性的核糖体及转录翻译过程，需要进行镁离子浓度的优化。在本申请中，镁离子在无细胞反应体系中的浓度为0-40mM，优选为10mM。
例如，镁离子在无细胞反应体系中的浓度可以为0mM、8mM、10mM、13mM、20mM、40mM等。
在本申请中，所述镁离子为来源于谷氨酸镁中的镁离子。
在本申请后续的实验中，将镁离子在无细胞反应体系中的浓度设定为10mM。
在一些实施方式中，所述氨基酸组合物选自精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的两种或两种以上，优选包含精氨酸(L-Arginine)、缬氨酸(Valine)、色氨酸(L-Tryptophan)、苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、异亮氨酸(L-Isoleucine)、亮氨酸(L-Leucine)、半胱氨酸(L-Cysteine)、甲硫氨酸(L-Methionine)、丙氨酸(L-Alanine)、天冬氨酸(L-Asparagine)、天冬酰胺(L-AsparticAcid)、甘氨酸(L-Glycine)、谷氨酰胺(L-Glutamine)、组氨酸(L-Histidine)、赖氨酸(L-Lysine Monohydroch loride)、脯氨酸(L-Proline)、丝氨酸(L-Serine)、苏氨酸(L-Threonine)和酪氨酸(L-Tyrosine)。在一些实施方式中，所述氨基酸组合物在无细胞反应体系中的浓度为0-4mM，优选为0.5-4mM。在一些实施方式中，每种氨基酸的浓度为2mM。
例如，所述氨基酸组合物在无细胞反应体系中的浓度可以为0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM等。
在本申请后续的实验中，将所述氨基酸组合物在无细胞反应体系中的浓度设定为4mM。
所述氨基酸是翻译蛋白的底物，除了参与蛋白合成过程外，氨基酸还参与一些中心代谢途径。
在一些实施方式中，所述能量源物质可以供给ATP的再生从而为无细胞反应体系继续提高能量代谢。在一些实施方式中，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。在一些实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸在无细胞反应体系中的浓度为0-200mM，优选为40-70mM。
例如，所述磷酸烯醇式丙酮酸在无细胞反应体系中的浓度可以为0mM、40mM、50mM、70mM、100mM、150mM、200mM等。
在本申请的后续实验中，将所述磷酸烯醇式丙酮酸在无细胞反应体系中的浓度设定为40mM。
在一些实施方式中，所述转录翻译相关辅助因子为选自辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺中的一种或两种以上，优选为辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺，优选地，辅酶A在无细胞反应体系中的浓度为0-0.54mM，优选为0.068-0.14mM。
例如，辅酶A在无细胞反应体系中的浓度可以为0mM、0.068mM、0.14mM、0.27mM、0.41mM、0.54mM。
在本申请后续实验中，将辅酶A在无细胞反应体系中的浓度设定为0.135mM。
在本申请中，NAD在无细胞反应体系中的浓度为0.0825-0.165mM。在本申请中，将NAD在无细胞反应体系中的浓度设定为0.165mM。
在本申请中，ATP在无细胞反应体系中的浓度为0.3-0.6mM。在本申请中，将ATP在无细胞反应体系中的浓度设定为0.6mM。
在本申请中，NTPs(GTP、UTP和CTP)在无细胞反应体系中的浓度为0.3-0.6mM。在本申请中，将NTPs在无细胞反应体系中的浓度设定为0.6mM。
在本申请中，叶酸在无细胞反应体系中的浓度为8.5-17μg/mL。在本申请中，将叶酸在无细胞反应体系中的浓度设定为17μg/mL。
在本申请中，亚精胺在无细胞反应体系中的浓度为0.375-0.75mM。在本申请中，将亚精胺在无细胞反应体系中的浓度设定为0.75mM。
在本申请中，腐胺在无细胞反应体系中的浓度为0.25-0.5mM。在本申请中，将腐胺在无细胞反应体系中的浓度设定为0.5mM。
在一些实施方式中，在进行无细胞反应时，氧气含量可以为0-100％，优选为21％；优选地，反应温度为4-45℃，优选为30℃或者37℃。
例如，在进行无细胞反应时，氧气含量可以为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、100％等；
反应温度可以为4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、45℃等。
本申请使用上述所述的表面活性剂或纳米圆盘合成嗅觉受体蛋白，所得到的嗅觉受体蛋白表达量高，可溶性高，从而可以进行后续仿生嗅觉传感器的开发。
在一些实施方式中，反应时间为0.5-48小时，优选为2-6小时，进一步优选为2-4小时。
例如，反应时间可以为0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、48小时等。
本申请提供了一种表达膜蛋白的方法，其包括：将含有编码膜蛋白基因的表达质粒加入含有表面活性剂或纳米圆盘的无细胞反应体系组合物中进行无细胞反应得到膜蛋白。在一些实施方式中，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，优选为MscL膜蛋白、嗅觉受体蛋白或新冠病毒受体蛋白。在一些实施方式中，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，优选地，所述支架蛋白为载脂蛋白；所述载脂蛋白优选选自MSP1、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1E3D1_D37C、MSP1D1-△H5、MSP1D1-△H4H5或MSP1D1-△H4-H6，优选为MSP1E2；优选地，所述脂质为DPPC、DMPG、DOPC或DMPC。在一些实施方式中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、月桂醇聚氧乙烯醚、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、葵基-β-D-麦芽糖苷、月桂基二甲基氧化胺、十二烷基-β-D-麦芽糖苷或7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。在一些实施方式中，所述表面活性剂的浓度为临界胶束浓度值的数倍，优选为2-5倍的临界胶束浓度值。在一些实施方式中，所述脂质的浓度为0.085-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.1-0.15mg/mL；优选地，所述脂质与所述支架蛋白的质量比为1:1-10，优选为1:5-10。在一些实施方式中，所述无细胞合成体系组合物包含DNA模板、无细胞试剂和细胞提取物。在一些实施方式中，所述细胞提取物为原核生物或真核生物来源的细胞提取物，优选为原核生物来源的细胞提取物，进一步优选为大肠杆菌来源的细胞提取物、枯草芽孢杆菌来源的细胞提取物、谷氨酸棒杆菌来源的细胞提取物或者需钠弧菌来源的细胞提取物，最优选为大肠杆菌来源的细胞提取物。在一些实施方式中，所述无细胞试剂包含无机盐、镁离子、氨基酸组合物、转录翻译相关辅助因子、能量源物质和DNA模板；
优选地，所述无机盐选自谷氨酸钾、谷氨酸氨和/或草酸钾，优选为谷氨酸钾、谷氨酸氨和草酸钾；
优选地，所述氨基酸组合物选自精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的两种或两种以上；
优选地，所述转录翻译相关辅助因子选自辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺中的一种或两种以上，优选为辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺；
优选地，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1无细胞合成体系的制备
实施例1-1大肠杆菌来源的无细胞合成体系的制备
(1)在固体培养基上的细胞Rosetta/BL21 Star的中平整光滑的单菌落被挑取于LB培养基(包含1％的胰蛋白胨(w/v)、0.5％的酵母提取物(w/v)和1％的氯化钠(w/v))中作为种子液进行12-24小时的培养，第二天以5％接种量接到2×YTP培养基(包含1.6％的胰蛋白胨(w/v)、1％的酵母提取物(w/v)、0.5％氯化钠(w/v)，40mM磷酸氢二钾和22mM磷酸二氢钾)中，并培养到OD600大约在2-3时扩大接种到含新鲜2×YTP(培养Rosetta可添加34μg/mL氯霉素抗生素)的5L发酵罐或1L挡板三角摇瓶的中发酵培育，37℃，300rpm。全过程无菌操作。
(2)在培养期间需要定时测量生长曲线，并且在对数生长期后期(～4小时，OD600＝3-4)低温离心收获细胞。
(3)离心获得的菌泥用预冷的S30A缓冲液洗涤细胞沉淀三次。全程在低温或冰上进行。
(4)将洗涤后的菌泥重新充分悬浮在S30A缓冲液(其中1g细胞需要1mL缓冲液)中，以便在高压破碎仪(1500bar)中破碎，破碎后用新的离心管接取细胞的裂解物，随后低温离心，离心速度分别为4000×g、12000×g和30000×g进行离心，得到含有天然囊泡的细胞提取物，分别命名为B4、B12和B30。
(5)离心后取上清液(添加剂)换到新的离心管并加入3mM DTT进行离心，离心速度为30000×g，将离心获得的上清液在摇床中37℃进行孵育80分钟，并再次在低温条件下离心，离心速度为30000×g。最后将上清液装在分子多孔膜管(6-8KD MWCO)中并且放置在S30B缓冲液中用磁力搅拌器低温下透析3h。然后将透析后的提取物在4℃离心，上清液分装在EP管后用液氮闪存冷冻并储存在-80℃备用，其中，S30A缓冲液和S30B缓冲液的组分如表1所示。
表1S30A缓冲液和S30B缓冲液的组分表
实施例1-2枯草芽孢杆菌来源的无细胞合成体系的制备
实施例1-2和实施例1-1的区别在于，实施例1-2的枯草芽孢杆菌(购自于广东微生物菌种保藏中心，其为枯草芽孢杆菌168)利用2×YTP培养基培养，培养温度为30℃。
实施例1-3谷氨酸棒杆菌来源的无细胞合成体系的制备
实施例1-3和实施例1-1的区别在于，实施例1-3的谷氨酸棒杆菌(其为谷氨酸棒杆菌BM001(DE3))利用2×YTP培养基培养，培养温度为30℃。
实施例1-4需钠弧菌来源的无细胞合成体系的制备
实施例1-4和实施例1-1的区别在于，实施例1-4的需钠弧菌(其为需钠弧菌Vmax)利用Enhanced 2×YTP培养基(包含3.2％的胰蛋白胨(w/v)、2％的酵母提取物(w/v)、1.7％氯化钠(w/v)，0.2％葡萄糖(w/v)，17.6mM磷酸氢二钠)培养，培养温度为30℃。
将实施例1-1至1-4的所得到的无细胞合成体系配比了本领域常用的基础成分体系表达模式绿色荧光蛋白sfGFP(super fold green florescent protein)进行测试，其结果如图1所示。
从图1可以看出，大肠杆菌来源的无细胞合成体系仍是表达量最高的无细胞体系，表达量为0.94mg/ml，因此，在后续的研究中采用大肠杆菌来源的无细胞合成体系用于无细胞反应。
实施例2合成MscL膜蛋白
实施例2-1使用表面活性剂合成MscL膜蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)
质粒的构建：基因MscL(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1)由金斯瑞公司合成并利用两个酶切位点NdeI及XhoI采用本领域常规的方法构建于pET24a质粒中，碳端融合6×组氨酸标签，并融合有荧光蛋白sfGFP。
在实施例1-1中制备得到的无细胞合成体系中分别加入表达目的蛋白MscL(蛋白信息数据库编号为EFM9909735.1)-sfGFP(蛋白信息数据库编号为AGR66192.1)的质粒、无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子、能量源物质以及表面活性剂在氧气含量为21体积％下进行无细胞反应，反应温度为30℃或37℃，采用本领域常规的方法测定荧光值，并计算可溶率，其结果如图2所示，其中，荧光强度(柱状图)代表膜蛋白-荧光蛋白的融合蛋白MscL-sfGFP表达水平，T代表无细胞体系全蛋白的荧光强度，S代表无细胞体系可溶(上清)蛋白的荧光强度，a是表面活性剂在无细胞表达中促溶示意图。b是在无细胞中分别添加终浓度为5倍CMC的表面活性剂作为膜蛋白疏水区域的支撑材料的荧光强度示意图；
其中，无机盐中的谷氨酸钾的浓度为175mM，谷氨酸铵的浓度为10mM，草酸钾的浓度为2.7mM，PEP的浓度为20mM，T7聚合酶的浓度为1％(v/v)，每种氨基酸的浓度均为2mM，谷氨酸镁的浓度为10mM，NAD的浓度为0.165mM，CoA的浓度为0.135mM，ATP的浓度为0.6mM，GTP,UTP,CTP的浓度为0.43mM，tRNA的浓度为85μg/mL，叶酸的浓度为17μg/mL，亚精胺的浓度为0.75mM，腐胺的浓度为0.5mM，DNA模板的浓度为15ng/μL。
从图2可以看出，添加了表面活性剂Tween-20、Tween-80、DDM及Cymal-7的无细胞表达体系膜蛋白可溶性并无明显增加，虽然以上表面活性剂已达其CMC值，能够形成胶束，但是其不能有效地包围支持膜蛋白的疏水区域，从而膜蛋白仍为聚集沉淀的状态。
而添加了表面活性剂Triton X-100、CHAPS及DDAO的无细胞体系表达活性明显下降，所得荧光强度比对照组大幅度降低。此类表面活性剂的CMC值较高，其中CHAPS高达10mM。在高浓度的试剂添加下，影响了无细胞体系中组分的活性，对体系表现出一定的毒性，从而使得表达活性大大下降。
由以上表面活性剂的测试与筛选中，Brij-35对在无细胞体系中能有效地对膜蛋白进行疏水的支撑，随之而来提高了体系对膜蛋白的表达活性，可以作为简单的大规模工业应用的疏水支撑材料。
实施例2-2使用纳米圆盘合成MscL膜蛋白
(1)纳米圆盘的组装
将10种支架蛋白(MSP1(SEQ ID NO:43)、MSP1E1(SEQ ID NO:44)、MSP1E2(SEQ IDNO:45)、MSP1E3(SEQ ID NO:46)、MSP1D1(SEQ ID NO:47)、MSP1E3D1(SEQ ID NO:48)、MSP1E3D1_D73C(SEQ ID NO:49)、MSP1D1△H5(SEQ ID NO:50)、MSP1D1△H4-H6(SEQ ID NO:51)、MSP1D1△H4H5(SEQ ID NO:52))在冰上与4种脂质(DPPC、DMPG、DOPC和DMPC)以10:1的质量比进行组装，组装的结构通过电镜进行观察，其结果如图3所示，其中，a是支架蛋白与脂质组装成纳米圆盘的示意图，b是不同的支架蛋白与不同的脂质形成的纳米圆盘，图中的箭头是具有典型纳米圆盘的结构。
从图3可以看出，7种支架蛋白与四种脂质都能形成明显的纳米圆盘的堆叠结构，且形态大小与先前报道一致。MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3D1_D73C及MSP1D1-△H5能分别与DOPC形成了大量的且较为均一的目标纳米结构。MSP1E3及MSP1E3D1两种支架蛋白与四种脂质都能形成明显且均一的结构。这些结构能够给膜蛋白提供多种且可靠的膜支撑材料。其中三种形成的圆盘结构不明显，在电镜视野中目标结构较少，后续可以通过调整纳米圆盘的比例进行优化。
并且从电镜结果中可以看到大部分的支架蛋白与脂质都能组装成明显的纳米圆盘结构，且形成的结构长度不一，多种纳米圆盘的长度利用Image J软件进行了长度的测量，其结果如表2所示。
表2
表2(续)
从表2可以看出，纳米圆盘的大小在8-23nm之间，其中DOPC与各个脂质形成的纳米圆盘直径与先前报道相似，增强的MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3形成的结构直径更大，而截短的MSP1E3D1及MSP1D1直径更小，为膜蛋白提供不同大小的脂质平面。其余的支架蛋白与脂质中，即使是同一种的支架蛋白与不同的脂质形成的纳米圆盘其直径大小也有区别。截短的MSP1E3D1_D73C仍有17nm的直径，在截短的版本中因其删减的是载脂蛋白N端氨基酸，支架蛋白之间的非共价键力会相对减弱，此时形成的大纳米圆盘的流动性会更大，给膜蛋白嵌入提供更大的空间效率。但总体来说，增加了核心氨基酸螺旋的MSP1E3所形成的纳米圆盘偏大，而删减的版本MSP1D1形成的纳米圆盘偏小。这些纳米圆盘中的脂质类型及直径的不同，给膜蛋白提供了多种疏水支撑条件，可满足多种结构及功能需求。
(2)脂质浓度对合成MscL膜蛋白的影响
质粒的构建:按照与实施例2-1相同的方法进行构建。
在实施例1-1中制备得到的无细胞合成体系中分别加入含有表达目的蛋白MscL-sfGFP的质粒以及实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及不同浓度的脂质在氧气含量为21体积％下进行无细胞反应，反应温度为30℃或37℃，测定荧光值，并计算可溶率，其结果如图4所示。
从图4可以看出，4种脂质随着浓度的增加，其无细胞体系表达量呈递减的趋势，其中DPPC在较低的浓度下仍有较大的影响(图4中的a)。DMPG在低浓度0.086mg/mL下对表达影响较小而在稍高浓度(＞0.344μg/mL)则影响较大(图4中的b)。而DOPC及DMPC则在低于约0.35mg/mL(即0.375mM)浓度下的递减效果稍弱(图4中的c和d)，这两种脂质对无细胞体系活性的影响较小，可以进行稍高浓度的添加从而满足高表达水平的膜蛋白。
(3)不同脂质浓度以及不同支架蛋白的浓度组成的纳米圆盘对合成MscL膜蛋白的影响
质粒的构建:按照与实施例2-1相同的方法进行构建。
在实施例1-1中制备得到的无细胞合成体系中分别加入含有表达目的蛋白MscL-sfGFP的质粒以及实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及不同浓度的脂质和支架蛋白组成的纳米圆盘在氧气含量为21体积％下进行无细胞反应，反应温度为30℃或37℃，测定荧光值，并计算可溶率，其结果如图5所示，其中，图5的a是加入纳米圆盘的无细胞表达体系中，膜蛋白跨膜区域嵌入到圆盘脂质内形成完整结构示意图，图5中的b是四种脂质与MSP1E2形成的不同纳米圆盘体系中，无细胞表达的膜蛋白的可溶效果的示意图，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
从图5可以看出，在不同浓度的脂质和支架蛋白制备成的纳米圆盘中，膜蛋白的可溶率不一。其中在脂质DPPC、DMPC、DMPG与MSP1E2形成的纳米圆盘中，0.1-0.15mg/mL的脂质形成纳米圆盘体系的表达量与可溶蛋白量更高。而DOPC与MSP1E2形成的体系中蛋白可溶水平不随纳米圆盘浓度升高而增大，说明添加了纳米圆盘的无细胞体系能提高膜蛋白的可溶度。
(4)使用四种支架蛋白(MSP1E1、MSP1E2、MSPE3D1及MSPD1-△H4H5)组装的纳米圆盘对合成MscL膜蛋白的影响
质粒的构建:按照与实施例2-1相同的方法进行构建。
在实施例1-1中制备得到的无细胞合成体系中分别加入含有表达目的蛋白MscL-sfGFP的质粒以及实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及0.1-0.15mg/mL的脂质与支架蛋白按照质量比例(1：10)混合制成的纳米圆盘在氧气含量为21体积％下进行无细胞反应，反应温度为30℃或37℃，测定荧光值，并计算可溶率，其结果如图6所示，其中，图6的a是脂质DPPC与4种支架蛋白组装的纳米圆盘表达荧光蛋白示意图，图6中的b是脂质DMPG与4种支架蛋白组装的纳米圆盘表达荧光蛋白示意图，图6中的c是脂质DOPC与4种支架蛋白组装的纳米圆盘表达荧光蛋白示意图，图6中的d是脂质DMPC与4种支架蛋白组装的纳米圆盘表达荧光蛋白示意图，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
从图6可以看出，加入基于DPPC及DMPG两种脂质的纳米圆盘虽然表达量稍有下降，但是可溶性增高(图6中的a及b)。脂质DOPC、DMPC与各个支架蛋白的组合中，无细胞体系的表达结果与可溶的总蛋白呈现更高的水平(图6中c及d)。其中支架蛋白MSP1E2与各种脂质组合仍为促溶效果最佳的纳米圆盘结构。在组装的纳米圆盘中，无细胞体系的膜蛋白可溶率有42％-57％，组装的纳米圆盘能够有效地使得无细胞表达的膜蛋白有明显的增溶效果，可以在无细胞表达中添加纳米圆盘进行促溶和结构的保持。从而纳米圆盘为无细胞体系提供人工且稳定的多种仿膜材料，可应用于基础科学等领域。
此外，在下述实验中，根据嗅觉蛋白的大小(约35kDa)以及七段跨膜的特性，选用了大小为7.8nm的相对较小但流动性更强的纳米圆盘体系(MSP1E3D1+DMPC)，便于嗅觉受体蛋白的嵌入，即在下面的嗅觉受体蛋白表达实验中采用MSP1E3D1+DMPC组装得到的纳米圆盘进行实验。
实施例3嗅觉受体蛋白的表达
实施例3-1加入表面活性剂对嗅觉受体蛋白的表达
(1)质粒构建：嗅觉受体蛋白信息来源于数据库(ORDB，https://senselab.med.yale.edu/ordb/)，基因均由金斯瑞公司合成并利用两个酶切位点NdeI及XhoI构建于pET24a中，并与载体组氨酸标签重组表达。同时绿色荧光蛋白(sfGFP)融合于嗅觉受体蛋白碳端，并且设计TEV蛋白酶切位点以便表达后切除荧光白。
(2)融合的嗅觉受体蛋白的表达
将构建的含有OR001-G(2-Phenylbutyricacid，MOR2-1，来自于家鼠(Musmusculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)、OR005-G(Camphor，MOR189-1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、OR007-G(Camphor，MOR185-1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)、OR013-G(Carvone，MOR272-1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、OR016-G(Carvone，MOCLOR1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)、OR030-G(3-HEPTANONE，OR912-93，来自于黑猩猩(Pantroglodytes)，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、OR039-G(4-Chromanone，MOR170-1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、OR044-G(NONANOL，S18，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)、OR046-G(NONANOL，S41，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、OR049-G(NONANOL，S83，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)、OR051-G(ACETALDEHYDE，CeCR373，来自于秀丽虫(Caenorhabditis elegans)，核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、OR060-G(HEXANAL，Olfr65，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)、OR066-G(CYCLOHEXANONE，H7，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)、OR067-G(DECANAL，MOR30-1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)、OR076-G(PENTANOL，S3，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)、OR084-G(n-NONANOICACID，S86，来自于家鼠(Musmusculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示)、OR087-G(NONENAL，CeCR472，来源于秀丽虫(Caenorhabditis elegans)，核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示)、OR088-G(Peanut aroma，hOR51E2，来源于人(Homo sapiens)，核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示)和OR090-G(Vanillicacid，MOR9-1，来自于家鼠(Mus musculus)，核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示)基因的质粒加入到实施例1-1制备得到的无细胞合成体系中，并加入实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及表面活性剂Brij-35进行无细胞反应，反应5小时后，将表达后的无细胞体系全蛋白及离心后的上清分别测量其荧光值，根据荧光与蛋白量的标准曲线进行表达量的计算，其结果如图7所示，其中，OR001-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，OR005-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，OR007-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，OR013-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，OR016-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，OR030-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，OR039-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，OR044-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，OR046-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，OR049-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，OR051-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，OR060-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，OR066-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，OR067-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，OR076-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，OR084-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，OR087-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示，OR088-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，OR090-G的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
从图7可以看出，将0.055％的Brij-35添加到各种融合嗅觉受体蛋白无细胞表达体系中作为促溶剂，对照组(Control)为不添加任何增溶试剂的无细胞体系。表达后的无细胞体系分别测量其全蛋白及离心后上清的荧光值。表达量为通过荧光蛋白与荧光蛋白量的标准曲线进行计算。
在添加了0.055％的Brij-35的无细胞中可以看到，总的来说添加了Brij-35后，19种融合嗅觉受体蛋白表达可溶度上升，其在90％以上。在表面活性剂体系中，12种融合蛋白OR001-G、OR005-G、OR013-G、OR016-G、OR046-G、OR049-G、OR066-G、OR076-G、OR084-G、OR087-G、OR088-G及OR090-G表达量能达到0.1mg/mL以上。并且部分融合蛋白在添加了Brij-35的体系中表达量上升，其中OR016-G的表达量增加了54.0％，OR066-G及OR001-G分别增加了40.0％及39.1％，而OR087-G及OR051-G则分别增加了33.9％及21.6％。由此表面活性剂Brij-35能有效增加多跨膜蛋白嗅觉受体蛋白的可溶性。同时由于能对跨膜区进行有效疏水支撑避免了转录时的疏水肽链聚集从而保持了无细胞中翻译元件的活性而增强融合蛋白的表达量。表达的融合嗅觉受体蛋白可以直接对目标气体分子结合或者纯化切割后进行嗅觉的传感。由此，在添加了表面活性剂的无细胞体系能有效表达合成可溶即疏水区域能有效折叠的融合嗅觉受体蛋白，为嗅觉传感领域提供多种可用的嗅觉敏感元件。同时此表达体系可以应用于多种基于受体蛋白仿生传感领域，并且Brij-35的体系能够有效的提高嗅觉蛋白的可溶率和表达量，接下来将利用表面活性剂Brij-35对没有融合荧光蛋白的嗅觉受体蛋白进行表达探究。
(3)未融合的嗅觉蛋白受体的表达
将构建的含有未融合的上述8个嗅觉受体蛋白基因的质粒加入到实施例1-1制备得到的无细胞合成体系中，并分别加入实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及表面活性剂Brij-35进行无细胞反应，反应5小时后，将表达后的无细胞体系全蛋白及离心后的上清分别测量其荧光值，根据荧光与蛋白量的标准曲线进行表达量的计算，其结果如图8所示。
从图8可以看出，添加了Brij-35后的嗅觉受体蛋白有较好的可溶性表达，有效增加嗅觉受体蛋白的可溶性。其中OR001、OR028、OR044及OR080仍有较好的表达效果。非融合的嗅觉受体蛋白在表面活性剂作为疏水支撑的情况下，能够以较高的可溶性进行表达，并且可以直接应用在嗅觉仿生领域。
实施例3-2加入纳米圆盘对嗅觉受体蛋白的表达
(1)融合的嗅觉受体蛋白的表达
将实施例3-1制备得到的质粒加入到实施例1-1制备得到的无细胞合成体系中，并加入实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及0.1-0.15mg/mL的DMPC与MSP1E3D1按照质量比例(1：10)混合制成的纳米圆盘进行无细胞反应，反应5小时后，将表达后的无细胞体系全蛋白及离心后的上清分别测量其荧光值，根据荧光与蛋白量的标准曲线进行表达量的计算，其结果如图9所示，其中，T为无细胞中全蛋白的荧光量，而S为可溶(上清)蛋白的荧光量。
从图9可以看出，融合的嗅觉受体蛋白在纳米圆盘体系的表达可溶率都有所增大，能达到90％以上。同时由于疏水区得到了及时的支撑，其无细胞表达活性增高，嗅觉受体蛋白的表达量增高，OR001-G、OR013-G、OR016-G、OR049-G、OR076-G、OR084-G、OR087-G及OR088-G等8个蛋白表达量达到0.2mg/mL。因此纳米圆盘体系是有效的表达七段跨膜蛋白嗅觉受体蛋白的表达体系，融合的嗅觉受体蛋白能够有效在这些体系中可溶表达。
(2)未融合的嗅觉蛋白受体的表达
将构建的含有未融合的上述8个嗅觉受体蛋白基因的质粒加入到实施例1-1制备得到的无细胞合成体系中，并分别加入实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及纳米圆盘(其由MSP1E3D1+DMPC组装得到)进行无细胞反应，反应5小时后，将表达后的无细胞体系全蛋白及离心后的上清分别测量其荧光值，根据荧光与蛋白量的标准曲线进行表达量的计算，其结果分别如图10和图11所示，其中，图10是8个嗅觉受体蛋白在纳米圆盘体系中表达的示意图，图11是8个嗅觉受体蛋白在纳米圆盘体系中表达量的示意图。
从图10和图11可以看出，OR001、OR029、OR073及OR080仍有较高的表达量，并且有较高的可溶率，说明无细胞膜蛋白体系对非融合的七段跨膜嗅觉受体蛋白亦能有效可溶表达。未融合的嗅觉受体蛋白在纳米圆盘中的可溶表达可直接进行嗅觉传感器的开发。
实施例4新冠病毒受体蛋白的表达
SARS-CoV-2是现今影响全球人类的大流行病，引起了全世界的极大关注，并刺激了对治疗及传播途径发现的迫切需求。为了进入宿主细胞，新冠病毒利用病毒表面的刺突蛋白与细胞膜上的血管紧张素转化酶2(ACE2)进行结合，该酶在体内表达与多种细胞中，包括肺泡上皮细胞，鼻和口腔粘膜细胞，血管内皮和小肠的肠上皮细胞。ACE2的表达水平与SARS-CoV-2假病毒有较高的感染性相关，表明ACE2水平升高可能使个体更容易发生新冠病毒传播。同时ACE2与新冠病毒表面蛋白刺突蛋白结合力越高，其被入侵的概率及程度越高。因此研究不同物种或不同突变体的ACE2、新冠刺突蛋白及其二者的相互作用对研究新型冠状病毒感染的传播特征有极大的意义，可进行溯源评价。而ACE2是细胞膜上单段跨膜的膜蛋白，其表达仍需克服跨膜区跨膜的问题。目前细胞体系包括大肠杆菌，酵母及哺乳动物细胞主要表达其截断区域ACE2-740版本，都没有涉及跨膜区。虽然截短区域有较好的功能活性，但是其跨膜区仍对其结构及功能有一定的影响，因此全长的蛋白对其基础研究有重要的意义。无细胞膜蛋白表达体系为此提供了一种新的方法。多物种的ACE2-740及全长ACE2在无细胞中表达并且结合酶联免疫吸附剂测定快速评价其与新冠刺突蛋白识别区域RBD(receptor binding domain)的结合能力。在这个评价体系中，ACE2蛋白可以被快速、高效表达，并无需进行复杂的细胞破碎及纯化步骤，可实现快速检测的目的。
质粒构建：人源全长的血管紧张素转化酶2(ACE2)表达序列(其氨基酸序列如SEQID NO:41所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示)从NCBI数据库中获取，并去除其N端信号肽。人源全长hACE2则在740版本基础利用Gibson无痕构建方式把剩余跨膜区序列添加并完整表达全长ACE2。
将构建的质粒加入到实施例1-1制备得到的无细胞合成体系中，并加入实施例2-1所述的无机盐、氨基酸组合物、镁离子、转录翻译相关辅助因子和能量源物质以及纳米圆盘(其由MSP1E3D1+DMPC组装得到)在氧气含量为21体积％下进行无细胞反应，反应温度为30℃或37℃，反应5小时后进行蛋白免疫印迹以进行表达量测试，其结果如图12所示，其中，a表达了全长hACE2的无细胞体系western blot的结果，b通过对表达western blot结果进行灰度分析后的表达结果，T为全蛋白样品，S为可溶上清样品。
从图12可以看出，全长ACE2在纳米圆盘体系有较好的表达，纳米圆盘的体系是表达全长ACE2的有效体系，可以对蛋白进行可溶表达并且进行初步的结合力测定。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
表3序列表

Claims (18)

1.表面活性剂或纳米圆盘在无细胞合成体系合成膜蛋白中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，优选为MscL膜蛋白、嗅觉受体蛋白或新冠病毒受体蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，优选地，所述支架蛋白为载脂蛋白；所述载脂蛋白优选选自MSP1、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1E3D1_D37C、MSP1D1-△H5、MSP1D1-△H4H5或MSP1D1-△H4-H6，优选为MSP1E2；
优选地，所述脂质为DPPC、DMPG、DOPC或DMPC。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、月桂醇聚氧乙烯醚、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、葵基-β-D-麦芽糖苷、月桂基二甲基氧化胺、十二烷基-β-D-麦芽糖苷或7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中，所述表面活性剂的浓度为临界胶束浓度值的数倍，优选为2-5倍的临界胶束浓度值。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述脂质的浓度为0.085-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.1-0.15mg/mL；
优选地，所述脂质与所述支架蛋白的质量比为1:1-10，优选为1:5-10。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其中，所述表面活性剂或纳米圆盘加入无细胞合成体系组合物中合成膜蛋白，优选地，所述无细胞合成体系组合物包含DNA模板、无细胞试剂和细胞提取物。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述细胞提取物为原核生物或真核生物来源的细胞提取物，优选为原核生物来源的细胞提取物，进一步优选为大肠杆菌来源的细胞提取物、枯草芽孢杆菌来源的细胞提取物、谷氨酸棒杆菌来源的细胞提取物或者需钠弧菌来源的细胞提取物，最优选为大肠杆菌来源的细胞提取物。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中，所述无细胞试剂包含无机盐、镁离子、氨基酸组合物、转录翻译相关辅助因子、能量源物质和DNA模板；
优选地，所述无机盐选自谷氨酸钾、谷氨酸氨和/或草酸钾，优选为谷氨酸钾、谷氨酸氨和草酸钾；
优选地，所述氨基酸组合物选自精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的两种或两种以上；
优选地，所述转录翻译相关辅助因子选自辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺中的一种或两种以上，优选为辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺；
优选地，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。
10.一种表达膜蛋白的方法，其包括：
将含有编码膜蛋白基因的表达质粒加入含有表面活性剂或纳米圆盘的无细胞反应体系组合物中进行无细胞反应得到膜蛋白。
11.根据权利要求11所述的方法，其中，所述膜蛋白为含有疏水跨膜区域的膜蛋白，优选为MscL膜蛋白、嗅觉受体蛋白或新冠病毒受体蛋白。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述纳米圆盘通过支架蛋白和脂质制备得到，优选地，所述支架蛋白为载脂蛋白；所述载脂蛋白优选选自MSP1、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1E3D1_D37C、MSP1D1-△H5、MSP1D1-△H4H5或MSP1D1-△H4-H6，优选为MSP1E2；
优选地，所述脂质为DPPC、DMPG、DOPC或DMPC。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、月桂醇聚氧乙烯醚、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、葵基-β-D-麦芽糖苷、月桂基二甲基氧化胺、十二烷基-β-D-麦芽糖苷或7-环己基庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂的浓度为临界胶束浓度值的数倍，优选为2-5倍的临界胶束浓度值。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中，所述脂质的浓度为0.085-0.5mg/mL，优选为0.1-0.3mg/mL，进一步优选为0.1-0.15mg/mL；
优选地，所述脂质与所述支架蛋白的质量比为1:1-10，优选为1:5-10。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的方法，其中，所述无细胞合成体系组合物包含DNA模板、无细胞试剂和细胞提取物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述细胞提取物为原核生物或真核生物来源的细胞提取物，优选为原核生物来源的细胞提取物，进一步优选为大肠杆菌来源的细胞提取物、枯草芽孢杆菌来源的细胞提取物、谷氨酸棒杆菌来源的细胞提取物或者需钠弧菌来源的细胞提取物，最优选为大肠杆菌来源的细胞提取物。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述无细胞试剂包含无机盐、镁离子、氨基酸组合物、转录翻译相关辅助因子、能量源物质和DNA模板；
优选地，所述无机盐选自谷氨酸钾、谷氨酸氨和/或草酸钾，优选为谷氨酸钾、谷氨酸氨和草酸钾；
优选地，所述氨基酸组合物选自精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的两种或两种以上；
优选地，所述转录翻译相关辅助因子选自辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺中的一种或两种以上，优选为辅酶A、NAD、NTPs、叶酸、亚精胺和腐胺；
优选地，所述能量源物质为磷酸烯醇式丙酮酸。
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