CN118620798B - 硝基还原假单胞菌b1-22及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硝基还原假单胞菌B1‑22，硝基还原假单胞菌B1‑22的IAA产量为11.2435 mg/L、降解磷酸三钙为可溶性磷的含量为7.3677 mg/L、纤维素酶活性为8.9692 U/mL。菌落和发酵菌液能抑制黄瓜枯萎病菌的菌丝生长，防效分别为28.89%和25.51%。本发明所提供的硝基还原假单胞菌菌株具有良好的产生促进植株生长相关酶以及抑制黄瓜枯萎病的能力。
Description
技术领域
本发明发现了一株硝基还原假单胞菌，该菌株的拉丁文分类命名为：Pseudomonas nitroreducens，该菌株已于2023年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.29051。
本发明涉及的是用于农业生产的硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens，具体涉及的是一株硝基还原假单胞菌B1-22及其应用。
背景技术
在农业生产过程中，为有效控制病害的发生，大量化学农药被用于农田，但长期或过量使用化学农药除了会引起一系列农业和社会问题外，例如影响农田土壤质地、破坏本土微生物区等，并且极易引起病原菌的抗药性，制约农业经济发展。因此，迫切需要一种能够促进植物健康生长、对生态环境友好、不会产生抗药性的替代品。
作为构成植物根际微生物群最普遍的成员假单胞菌属，具有分布广泛﹑繁殖快数量多﹑竞争以及定殖力强等特点，导致其具有较强的防病效果，例如CN115261289A公开Pseudomonas nitroreducens PNr-1及其制品对草莓叶部病害具有明显生物防治作用。CN115261289A公开Pseudomonas nitroreducens QL-9a可应用于依赖DSF及/或AHLs信号介导致病的病原菌的生物防治。CN107012107A公开硝基还原假单胞菌能产多种酶高效降解纤维素。因此，寻找新的具有促进生长和防病能力的硝基还原假单胞菌菌株对农业生产，特别对促进植物生长和防治农作物病害来讲具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens，这株硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens可以产生IAA和纤维素酶，并具有降解磷的功能；本发明的另一个目的是提供一株硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens抑制病原菌生长。
本发明采用的技术方案是：这株硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens，该菌株的保藏编号为CGMCC No.29051。
上述方案中硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens的IAA产量为11.2435mg/L。所述硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens降解磷酸三钙为可溶性磷的含量为7.3677 mg/L。所述硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens的纤维素酶活性为8.9692 U/mL。
上述硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens用于抑制病原菌生长。
上述方案中硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens的菌落和发酵菌液对，能抑制黄瓜枯萎病菌的菌丝生长，防效分别为28.89%和25.51%。
有益效果：本发明所提供的硝基还原假单胞菌菌株具有良好的产生促进植株生长相关酶以及抑制黄瓜枯萎病的能力。
保藏说明
分类命名：硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens；
保藏编号：CGMCC No.29051；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2023年11月20日。
附图说明
图1为本发明硝基还原假单胞菌菌落抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长的对照图；其中，图左为空白对照，图右为对峙平板；
图2为本发明硝基还原假单胞菌发酵菌液抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长的对照图；其中，图左为空白对照，图右为对峙平板
具体实施方式
下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。
一株新的硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.29051。
这株硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens菌落为淡黄白色的粘稠的圆形，呈扩散性混浊，凸起，边缘规则，表面湿润、光滑不透明，好氧，生长速度快。
实施例1：硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens的分离和保藏
1、硝基还原假单胞菌菌株B1-22，采集自海南省海口市海南大学温室黄瓜根际土中。
土样采集：土壤的采集选用五点对角线取样法。即在采集地块的对角线选5等分点的黄瓜植株，然后在超净工作台内抖落根系的非根际土后，将根系样品转移至含10 mL无菌10 mM PBS溶液的无菌15 mL离心管中，120 rpm/min，25 ℃下震荡20 min，静置后使用无菌镊子挑出根系，剩余土壤离心收集，液氨速冻后，-80 ℃保存待用。
硝基还原假单胞菌分离：采用稀释平板法，从冰箱中取10 g土壤样品装入盛有90mL灭菌水和5-10粒直径4 mm玻璃珠的离心管中，然后30 ℃，200 r/min的摇床上摇30 min。取5 mL倒入盛有45 mL灭菌水的三角瓶中，混匀后，再吸取5 mL转入盛有45 mL灭菌水的三角瓶中，充分混匀后吸取0.2 mL于直径9 cm的平板上，用涂布器涂抹均匀，放于30 ℃恒温培养箱中培养。48-72 h后挑取产疑似硝基还原假单胞菌的菌落，转接到TSB平板上，30 ℃恒温培养箱中继续培养，待刚长出单菌落时再次转接TSB平板30 ℃恒温培养。
2、硝基还原假单胞菌菌株B1-22菌种保藏
硝基还原假单胞菌菌株Pseudomonas nitroreducens于2023年11月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行真空冻干保藏，保藏编号为CGMCCNo.29051，保藏期限为30年。
3、通过形态学鉴定结合分子生物学（基因测序）鉴定结果为Pseudomonas nitroreducens，16S rDNA序列见序列表。
产IAA、纤维素酶以及降解磷能力测定
简化细菌产IAA定性分析：取2 mL在TSB培养基中活化后的菌液接种在10 mL IAA检测培养基中，以不加菌液为阴性对照，每个处理重复3次，在30 ℃、200 r/min培养5 d。取50 μL培养5d的液体滴入白色陶瓷板，然后加入50 μL IAA检测显色剂，室温遮光显色25min，颜色变粉红色说明可以产生IAA，不变色表明不产IAA。
简化细菌产IAA定量分析：（i）IAA标准溶液的测定：使用100mg/mL的磷标准溶液稀释10倍为10 mg/L磷标准溶液备用，吸取10mg/mL磷标准溶液0、2、4、6、8、10 mL分别加入容量瓶，用无菌水定容到50 mL摇匀，制备出浓度为0mg/L，0.4mg/L，0.8mg/L，1.2mg/L，1.6mg/L，2mg/L的IAA标准溶液6种，每种吸取1 mL并按1:2的比例加入IAA检测显色剂，室温下遮光显色25 min，每个处理重复3次。（ii）样品的测定：将定性时培养5 d的菌液8000 r/min离心10 min，取1mL上清液按按1:2的比例加入IAA检测显色剂，室温下遮光显色25 min，每个处理重复3次。测定显色后的IAA标准溶液和样品溶液在530 nm波长的吸光值，绘制IAA标准曲线，利用显色后样品溶液的吸光值和IAA标准曲线计算出样品对应的有效IAA的浓度。
表1 本发明硝基还原假单胞菌B1-22的产IAA能力
| 菌株 | 硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens |
| IAA含量 | 11.2435 mg/L |
可以看出，本发明硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens具有较好产IAA能力。
产纤维素酶能力测定
简化细菌产纤维素酶定性分析：以CMC-Na固体培养基平板的正中心为中心，吸取50 µL在TSB培养基中活化后的菌液在距离中心3 cm处的平板上点接，每株细菌在一个培养皿中点接3次，相邻两个点之间距离相等，每个处理重复3次，在30 ℃培养1 d和2d后，用1g/L刚果红染色30 min，再用1 mol/L NaCl溶液洗涤30 min，观察培养基染色情况。
简化细菌产纤维素酶定量分析：（i）葡萄糖标准溶液的测定：吸取10 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5 mL分别加入50 mL容量瓶，用无菌水定容到50 mL摇匀，制备出浓度为0 mg/mL，0.1 mg/mL，0.2 mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL的葡萄糖标准溶液6种，每种吸取2 mL再依次加入2mL无菌水和5 mL的DNS溶液混匀，沸水中煮5 min，无菌水定容至25 mL混匀，每个处理重复3次。（ii）样品的测定：取活化后的TSB菌液10000 r/min离心10 min，取0.5 mL上清液加入0.5mL含1 % CMC-Na的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，50 ℃水浴30min，加入1.25 mL的DNS溶液混匀，沸水中煮5 min，每个处理重复3次。流水冷却后，定显色后的葡萄糖标准溶液和样品溶液在540 nm波长吸光值，绘制葡萄糖标准曲线，利用显色后样品溶液的吸光值、葡萄糖标准曲线以及酶活力公式计算出样品中的酶活力。
表2 本发明硝基还原假单胞菌B1-22的产纤维素酶能力
| 菌株 | 硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens |
| 纤维素酶活 | 8.9692 U/mL |
可以看出，本发明硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens具有较好产纤维素酶能力。
降解磷能力测定
简化细菌解磷功能的定性：以改良SRSM培养基平板的正中心为中心，在距离中心2cm 处吸取50 µL细菌菌液在平板上点3个点，相邻两个点之间距离相等，28 ℃，倒置培养3d后，每个处理重复3次，测量菌落周围平板变色情况。
简化细菌解磷功能的定量：（i）磷标的测定：使用50 mg/L的磷标准溶液稀释10倍为5 mg/L磷标准溶液备用，吸取5 mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8、10 mL分别加入容量瓶，加入蒸馏水稀释至30 mL，向容量瓶中滴加2滴2，4-二硝基酚指示剂后，用滴定管逐滴加入4mol/L的NaOH溶液至液体变为微黄色，逐滴加入1 mol/L的H2S04溶液使黄色恰好消失，加入5 mL钼锑抗显色剂，用无菌水定容到50 mL摇匀，得到一系列浓度为0 mg/L，0.2 mg/L，0.4mg/L，0.6 mg/L，0.8 mg/L，1 mg/L的磷标准溶液。常温放置显色1 h，每个处理重复3次。（ii）样品的测定：取2 mL在TSB培养基中活化后的菌液加入20 mL难溶无机磷发酵培养基中，30 ℃、200 r/min 培养 5 d后，10000 r/min、4 ℃离心10 min，取5 mL上清液到50 mL容量瓶，加入蒸馏水稀释至30 mL，滴加2滴 2，4-二硝基酚指示剂，逐滴加入4 mol/L的NaOH溶液至液体变黄，逐滴加入1 mol/L的H2S04溶液使黄色恰好消失，加入5 mL钼锑抗显色剂，无菌水定容到50 mL摇匀，常温放置显色1 h，每个处理重复3次。测定显色后的磷标溶液和样品溶液在700 nm波长的吸光值，绘制磷标准曲线，利用显色后样品溶液的吸光值和磷标准曲线计算出样品对应的有效磷含量。
表3 本发明硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens降解磷能力
| 菌株 | 硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens |
| 可溶性磷含量 | 7.3677 mg/L |
可以看出，本发明硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens具有较好的将不溶性磷降解为可溶性磷的能力。
抑制病原菌菌丝生长
1、菌落拮抗：将硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens菌株接种于TSB平板上，30 ℃培养48 h备用，植物病原真菌接种于PDA平板上，30 ℃培养72-96 h备用，从植物病原真菌菌落边缘用5 mm的打孔器打取菌饼，转接在TSB平板上的中心，然后在距离平板中心左右各2.5 cm 处用牙签挑取硝基还原假单胞菌B1-22的单菌落画两条5 cm的平行线；将平板置于 30 ℃培养10 d后观察计算抑菌率及重寄生能力，不接硝基还原假单胞菌的，只接病原菌的为对照，试验重复3次。抑菌率及重寄生能力，按以下公式和标准计算：
抑菌率(%)=((对照病原菌半径-对峙病原菌半径)/对照病原菌半径)×100%
2、菌落拮抗：菌落拮抗：将硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens菌株接种于TSB平板上，30℃培养48h备用，植物病原真菌接种于PDA平板上，30℃培养72-96h备用，从植物病原真菌菌落边缘用5mm的打孔器打取菌饼，转接在TSB平板上的中心，然后以该菌饼为中心，在距中心2cm的TSB固体平板上打三个6mm的孔，相邻两个孔之间的距离相等，取三个100µL 菌液滴置在孔中，重复三次。
表4本发明硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens的抑菌效果
| 菌株B1-22 | 抑菌率(%) |
| 菌落 | 28.89 |
| 发酵菌液 | 25.51 |
本发明硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens菌落和发酵菌液对黄瓜枯萎病菌病原菌均具有一定的抑菌效果。
Claims (1)
1.一种硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens，所述硝基还原假单胞菌已于2023年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.29051，其特征在于可抑制黄瓜枯萎病菌生长。
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