CN118613505A - Cd28结合抗体及其抗原结合片段 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种包含CD28抗体及其抗原结合片段的组合物和方法。

Description

CD28结合抗体及其抗原结合片段

对相关申请的引用

本申请要求于2021年12月13日提交的第63/289,060号美国临时申请和于2022年11月15日提交的第63/425,574号美国临时申请的权益，这些申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

在一些方面中，本公开涉及一种结合CD28或其部分的抗体或该抗体的抗原结合片段，以及一种用于检测CD28的方法、系统和试剂盒。在某些方面中，本公开涉及一种用于确定包含或疑似包含CD28的样品中的CD28水平的抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，本公开涉及一种用于诊断或治疗患有或疑似患有与CD28相关联的疾病或病症的个体的抗体或其抗原结合片段。

背景技术

T细胞特异性表面糖蛋白CD28(又被称为CD28)是免疫球蛋白超家族的一员，它作为CD80和CD86的配体。CD28的功能与T细胞活化、细胞增殖诱导、细胞因子产生和T细胞存活促进有关。但是，目前能够获得的抗CD28抗体和相关方法在体外和体内应用方面的范围都有限。因此，仍需要一种用于检测CD28以及诊断和/或治疗CD28相关疾病或病症的试剂、装置和方法。本文提供了满足这样的需求的实施方案。

发明内容

本文提供了一种结合CD28的全部或部分的抗体(包括其抗原结合片段)、一种包含这样的抗体或其抗原结合片段的组合物、一种这样的抗体或其抗原结合片段的组合以及使用方法。在特定实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段用在通过成像检测CD28的存在的方法中，所述成像包括分子、医学和诊断成像。

本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，包括特异性结合至CD28(例如人CD28)的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含特定的互补决定区(CDR)，包括重链CDR(即，CDRH1、CDRH2和/或CDRH3)和轻链CDR(即，CDRL1、CDRL2和/或CDRL3)，例如本文所述的任何一种CDR。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，例如本文所述的任何一种可变结构域。

在一些实施方案中，所述结合CD28或其部分的抗体或其抗原结合片段是分离的，并且包含a)免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含(i)重链互补决定区1(CDRH1)，该重链互补决定区1包含序列X1YX3X4X5(SEQ ID NO:68)，其中X₁是S或D；X₃是T、W、I或N；X₄是M或I；并且X₅是H、N或S；(ii)重链互补决定区2(CDRH2)，该重链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆GX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅KX₁₇(SEQ ID NO:69)，其中X₁是Y、N、W或I；X₂是I或F；X₃是D、Y或S；X₄是P或N；X₅是G或Y；X₆是S、Y或G；X₈是Y、R、S、A或T；X₉是S、T或I；X₁₀是E、I、N、T或Y；X₁₁是F或Y；X₁₂是N、D或P；X₁₃是H、E、Q或D；X₁₄是K、R或T；X₁₅是F或V；并且X₁₇是D、S或G；以及(iii)重链互补决定区3(CDRH3)，该重链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀DY(SEQ ID NO:70)，其中X₁是R、S、F或H；X₂是Q、H、E、G或R；X₃是D、Y、F或P；X₄是N、G、R、Y或T；X₅是S、G或D；X₆是G、S或没有氨基酸；X₇是Y、F或没有氨基酸；X₈是D或没有氨基酸；X₉是S、A或V；并且X₁₀是F、M或L；和

b)免疫球蛋白轻链可变结构域，该免疫球蛋白轻链可变结构域包含(i)轻链互补决定区1(CDRL1)，该轻链互补决定区1包含序列X₁X₂SX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆(SEQID NO:71)，其中X₁是R、H或K；X₂是T、A或S；X₄是E或Q；X₅是N、S或I；X₆是I、L或V；X₇是Y、A或G；X₈是S、V、N或T；X₉是N、W、S或D；X₁₀是L、F或V；X₁₁是A、N或G；X₁₂是N或没有氨基酸；X₁₃是T或没有氨基酸；X₁₄是Y或没有氨基酸；X₁₅是L或没有氨基酸；并且X₁₆是S或没有氨基酸；(ii)轻链互补决定区2(CDRL2)，该轻链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(SEQ ID NO:72)，其中X₁是A、K、G或S；X₂是A或I；X₃是T或S；X₄是N或K；X₅是L或R；X₆是A、H、F或Y；并且X₇是D、T或S；以及(iii)轻链互补决定区3(CDRL3)，该轻链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆PX₈T(SEQ IDNO:73)，其中X₁是Q、L或H；X₂是H或Q；X₃是F、G或Y；X₄是W、Q、T或S；X₅是G、S、H或R；X₆是I、Y、T或Q；并且X₈是W、F或Y。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含：CDRH1，其具有SEQ IDNO:13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14、15、16或17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRH2，其具有SEQ ID NO:18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18、19、20、21或22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；以及CDRH3，其具有SEQ ID NO:23、24、25、26或27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、24、25、26或27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含：CDRL1，其具有SEQ IDNO:28、29、30、31或32中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28、29、30、31或32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRL2，其具有SEQ ID NO:33、34、35、36或37中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33、34、35、36或37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；以及CDRL3，其具有SEQ ID NO:38、39、40、41或42中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38、39、40、41或42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:13、14、15、16或17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRH2包含SEQ ID NO:18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列、或与SEQID NO:18、19、20、21或22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRH3包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:23、24、25、26或27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRL1包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:28、29、30、31或32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRL2包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:33、34、35、36或37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRL3包含SEQ ID NO:38、39、40、41或42中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:38、39、40、41或42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1、3或4中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

在本文中的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:85的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的Fc多肽。

在本文中的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是分离的。在本文中的一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。在本文中的一些实施方案中，所述抗体是鼠抗体。

在本文中的一些实施方案中，所述抗体是其抗原结合片段。在另一些实施方案中，所述抗原结合片段是Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。

在本文中的一些实施方案中，所述抗体是全长或完整的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含样品条形码序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸还包含用于引物的结合位点和锚定结构。

在本文中的一些实施方案中，所述抗体还包含重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域。在另一些实施方案中，所述重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域是鼠或人的。在另一些实施方案中，所述重链恒定结构域是IgG1、IgG2a、IgG2b或IgM。

在本文中的一些实施方案中，所述抗体附接至标记。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段缀合至可检测的标志物或标记。在一些实施方案中，所述可检测的标志物或标记直接缀合至所述抗原或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述可检测的标志物或标记缀合至寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述标记是荧光染料、荧光蛋白、放射性同位素、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、多肽、酶、链霉亲和素、生物素、发光化合物或寡核苷酸。

在另一个方面中，本公开提供了一种特异性结合至CD28的分离抗体，其中该分离抗体与本文所述的抗体竞争与CD28的结合。

在本文所述的抗体的一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗体包含一个或更多个人框架区。

在一些方面中，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段的组合，其中该组合包含两种或更多种本文所述的抗CD28抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗体或抗原结合片段包括一种或更多种结合至CD28内的第一表位或区域的第一抗体或其抗原结合片段；以及一种或更多种结合至CD28内的第二表位或区域的第二抗体或其抗原结合片段。在另一些实施方案中，所述一种或更多种第一抗体或其抗原结合片段以及所述一种或更多种第二抗体或其抗原结合片段结合至CD28(例如人CD28)的非重叠表位或区域和/或不竞争与CD28的结合。此外，在一些实施方案中，所述抗体缀合至可检测的标志物或标记。在一些实施方案中，本文所述的两种或更多种抗CD28抗体或抗原结合片段的组合中的抗体或抗原结合片段中的至少一者(可选地所述一种或更多种第一抗体或其抗原结合片段或所述一种或更多种第二抗体或其抗原结合片段)缀合至标记。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段中的至少一者(可选地所述一种或更多种第一抗体或其抗原结合片段或所述一种或更多种第二抗体或其抗原结合片段)附接或固定至固体支持物。在一些实施方案中，所述一种或更多种第一或第二抗体或抗原结合片段中的一者附接或固定至固体支持物，并且所述一种或更多种第一或第二抗体或抗原结合片段中的另一者缀合至标记。在一些实施方案中，所述标记是荧光染料、荧光蛋白、放射性同位素、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、多肽、酶、链霉亲和素、生物素、发光化合物或寡核苷酸。在一些实施方案中，所述固体支持物是珠、柱、阵列、测定板、微孔、棒、过滤器或条。在某些实施方案中，所述抗体非扩散性地固定在固体支持物上。在另一个实施方案中，所述装置是快速检测装置或快速诊断装置。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种结合至样品上的全部或部分CD28。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种与CD28的结合允许检测样品中的CD28。在一些实施方案中，所述检测可以在细胞的表面上或细胞内进行。在一些实施方案中，所述结合诱导样品中的细胞(例如T细胞)的活化。在一些实施方案中，所述活化包括利用通过TCR诱导的第一信号和通过CD28与B7-1(也称为CD80)或B7-2(也称为CD86)的结合诱导的第二信号活化T细胞。在一些实施方案中，所述活化包括不包含通过TCR诱导的第一信号的T细胞的活化。在一些实施方案中，所述结合增强细胞因子的产生或引发细胞向记忆表型的分化。

在另一些实施方案中，本公开提供了一种包含本文所述的任何特征的诊断抗体或其抗原结合片段。在另一个方面中，本公开的特征在于一种对本文所述的分离抗体编码的分离核酸。在另一个方面中，本公开的特征在于一种分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:43-50中的任何一个中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51-58中的任何一个中所示的核苷酸序列。本公开还提供了一种包含本文所述的核酸的表达载体。此外，本公开还提供了一种包含本文所述的表达载体的分离宿主细胞。

在另一个方面中，本公开提供了一种包含本文所述的分离抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一个方面中，本公开还提供了一种包含本文所述的分离抗体的诊断试剂。

在另一个方面中，本公开还提供了一种包含本文所述的分离抗体或本文所述的诊断试剂的试剂盒。

在又一个方面中，本公开提供了一种检测CD28的方法，该方法包括使已知或疑似包含CD28的样品与本文所述的抗体接触。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法。在另一个实施方案中，本文提供了一种诊断疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所提供的公开内容可用于将CD28的存在或丰度与组织样品的感兴趣位置相关联的方法。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可用于产生包含附接的寡核苷酸的全部或部分序列的核酸分子。在一些实施方案中，所提供的公开内容可用于构建蛋白文库。

在本文中提供的方法的一些实施方案中，可以通过测序来检测所述抗体或其抗原结合部分。在本文中提供的方法的一些实施方案中，可以通过免疫荧光法来检测所述抗体或其抗原结合部分。在本文中提供的方法的一些实施方案中，可以通过流式细胞术来检测所述抗体或其抗原结合部分。

在以下说明、实施例、权利要求和附图中进一步说明了某些实施方案。

附图说明

附图示出了本技术的某些实施方案，但不是限制性的。为了清楚和易于图示，附图不是按比例绘制的，并且，在一些情况下，各个方面可能被夸大或放大显示，以便于理解特定实施方案。

图1A-1B示出了本文中提供的八种不同抗CD28抗体(AB1-8)的免疫球蛋白重链(SEQ ID NO:1-6)和轻链(SEQ ID NO:7-12)的可变结构域的氨基酸序列。每个重链和轻链的CDR区以粗体和下划线示出。在每次比对中，使用三个字符(“*”、“:”和“.”)：“*”表示具有单个完全保守残基的位置；“:”表示下列“强”残基之一是完全保守的：STA；NEQK；NHQK；NDEQ；QHRK；MILV；MILF；HY和FYW；而“.”表示下列“较弱”残基之一是完全保守的：CSA；ATV；SAG；STNK；STPA；SGND；SNDEQK；NDEQHK；NEQHRK；FVLIM和HFY。这些都是出现在GonnetPam250矩阵中的计正分残基。“强”和“弱”残基分别被定义为“强”分数>0.5和“弱”分数<0.5。

图2A-2I示出了使用示例性抗CD28抗体AB1-AB8或市售抗体对照(CA对照)对新鲜人外周血细胞进行表面染色，并通过流式细胞术进行分析。

图3A-3I示出了使用对照或示例性AB1-AB8抗CD28抗体标记并通过流式细胞术分析的固定(顶部)和新鲜(底部)人外周血细胞的直方图叠加结果。

图4A-4J示出了在存在抗CD3(UCHT1)共同刺激的情况下使用示例性AB1-AB8抗CD28抗体孵育并通过流式细胞术评估的纯化和分离T细胞的细胞分裂速率。

图5A和5B示出了在存在抗CD3(OKT3)共同刺激的情况下使用示例性AB1-AB8抗CD28抗体孵育并使用ViCell Blu系统评估的分离T细胞的生长和活性。

图6A-6J示出了在不存在抗CD3共同刺激的情况下使用示例性AB1-AB8抗CD28抗体孵育并通过流式细胞术评估的纯化和分离T细胞的细胞分裂速率。

图7A-7J示出了使用经过用示例性抗CD28抗体AB1-AB8预孵育(顶部)或未经过用抗CD28抗体预孵育(底部)的人CD28以及生物素化的重组CD86+SAV APC转染并通过流式细胞术评估的Ba/F3细胞的直方图叠加结果。

图8A-8C示出了在不存在抗CD3共同刺激的情况下示例性抗CD28抗体AB2诱导T细胞活化标志物IL-2(图8A)和I10(图8B)或支持FOXP3+CD4+T细胞生长(图8C)的能力。

具体实施方案

本文提供了结合CD28的抗体或其抗原结合片段、对这样的抗体及其抗原结合片段编码的核酸、以及细胞，例如用于表达和产生这些能够在生理和/或体外条件下结合至CD28的抗体和抗原结合片段的重组细胞。还提供了产生和使用所述抗体和抗原结合片段的方法，例如用于检测来自个体的样品中的CD28的方法，包括用于实验室/研究目的的方法(例如流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)和/或印迹免疫法)、和/或用于通过递送包含这样的抗体或其抗原结合片段的药物或其它组合物来治疗和/或预防各种疾病或病症的方法。

在本文中引用的所有参考文献(包括专利申请、专利公告、科学文献和数据库)均出于所有目的通过引用整体并入本文，如同每个参考文献被具体且单独地指明通过引用并入本文一样。

详细说明被分成下列小节，以保证公开的清晰性，而不是作为限制。在本文中使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所说明的主题。

I.定义

除了另行限定之外，在本文中使用的所有技术术语、符号以及其它技术和科学术语具有所要求保护的主题所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或便于参考，在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包含这样的定义不应被解释为代表与本领域中通常理解的含义有实质性的不同。应理解，本文提供的公开内容不限于特定的组合物或生物系统。还应理解，本文中所用的术语仅用于说明特定实施方案的目的，而不应被理解为限制性的。

如本文中所用的术语“抗体”包括其保持结合特异性的抗原结合片段。例如，有许多特征明确的抗原结合片段。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中的二硫键的抗体C端从而产生F(ab)'2，该F(ab)'2是Fab的二聚体，其本身是通过二硫键结合至V_H-C_H1的轻链。F(ab)'2可以在温和条件下被还原，从而破坏铰链区的二硫键，由此将(Fab')2二聚体转化为Fab'单体。该Fab'单体本质上是具有铰链区的一部分的Fab(关于其它抗原结合片段的更详细说明，请参考由W.E.Paul编写并由美国纽约的Raven Press于1993年出版的《FundamentalImmunology(基础免疫学)》)。虽然各种抗原结合片段是根据完整抗体的消化来定义的，但是本领域技术人员应理解，片段可以通过化学方法或利用重组DNA方法从头合成。因此，如本文中所用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的或使用重组DNA方法合成的抗原结合片段。

如本文中所述的抗体可以由一种或更多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽组成。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因、以及大量免疫球蛋白可变结构域基因。轻链被分类为κ链或λ链。重链被分类为γ链、μ链、α链、δ链或ε链，它们又分别限定免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在一些实施方案中，所述抗体是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD或IgE。

已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链有一条“轻链”(大约25kD)和一条“重链”(大约50-70kD)。每条链的N端限定由大约100至110个或更多个氨基酸组成的可变结构域，该可变结构域主要负责抗原识别。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别指这些轻链和重链。

在抗体中，取代变体中的至少一个氨基酸残基被去除，并在其位置插入不同的残基。取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑了框架改变。保守取代的实例如上文所述。

抗体的生物学特性的实质性修饰是通过选择在保持(a)取代区域中的多肽主链结构(例如β折叠或螺旋构象)、(b)标靶位点的分子的电荷或疏水性、或(c)大部分侧链的效果方面显著不同的取代来实现的。根据共同的侧链特性，天然存在的残基被分为几组：

(1)非极性：正亮氨酸(Norleucine)、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)；

(2)极性不带电荷：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)；

(3)酸性(带负电荷)：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；

(4)碱性(带正电荷)：赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；

(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；和

(6)芳香族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)。

非保守取代是通过将这些类别之一的某个成员替换为另一个类别来进行的。

可以进行的一种取代是将抗体中的一个或更多个半胱氨酸(其可以是化学反应性的)改变为另一种残基，例如但不限于丙氨酸或丝氨酸。例如，可以有非规范型半胱氨酸的取代。可以在抗体的可变结构域的CDR或框架区中或在恒定区中进行取代。在一些实施方案中，半胱氨酸是规范的(例如参与二硫键的形成)。任何不参与保持抗体的正确构象的半胱氨酸残基也可以被取代，通常用丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。反过来说，可以向抗体添加半胱氨酸键以提高其稳定性，尤其是当抗体是抗原结合片段(例如Fv片段)时。

抗体包括V_H-V_L二聚体，包括单链抗体(作为单个多肽链存在的抗体)，例如其中的可变重域和可变轻域结合在一起(直接结合或通过肽接头结合)从而形成连续多肽的单链Fv抗体(sFv或scFv)。单链Fv抗体是共价连接的V_H-V_L，该共价连接的V_H-V_L可由包含直接结合或通过肽编码接头结合的V_H-和V_L-编码序列的核酸表达(例如Huston等人在1988年第85期《Proc.Nat.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)》的第5879-5883页上发表的论文)。虽然V_H和V_L作为单个多肽链相互连接，但是V_H和V_L域是非共价缔合的。替代地，抗体可以是另一种片段。也可以使用重组技术等产生其它片段，作为可溶性蛋白质或作为从展示方法获得的片段。抗体还可以包括双抗体和微抗体。本公开的抗体还包括重链二聚体，例如来自骆驼的抗体。在一些实施方案中，抗体是二聚的。在其它实施方案中，抗体可以是具有活性同种型的单体形式。在一些实施方案中，抗体是多价形式，例如三价或四价形式。

“抗体片段”或“其抗原结合片段”包含完整抗体的一部分、完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段；双体；线性抗体(参见在1995年第8(10)期《Protein Eng.(蛋白质工程)》杂志的第1057-1062页上公布的Zapata等人的第5,641,870号美国专利中的实施例2)；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)或单链Fab(scFab)；任何上述的抗原结合片段和来自抗体片段的多特异性抗体。

“Fv”由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过非共价缔合连接而成。从这两个域的折叠产生六个互补决定区(CDR)(重链和轻链各3个)，这些互补决定区为抗原结合贡献氨基酸残基，并赋予对抗体的抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然在某些情况下亲和力低于整个结合位点。

“dsFv”指具有工程设计的分子间二硫键的Fv，该分子间二硫键稳定V_H-V_L对。

“Fd片段”是包含抗体重链的可变结构域(V_H)和一个恒定区域(C_HI)的抗体片段。

“Fab片段”是通过使用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白而产生的抗体片段，或者是通过合成方式(例如通过重组方法)产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含V_L和C_L)和另一条链，该另一条链包含重链可变结构域(V_H)和重链恒定区域(C_HI)。

“F(ab')2片段”是通过在pH 4.0-4.5使用胃蛋白酶消化免疫球蛋白而产生的抗体片段，或者是通过合成方式(例如通过重组方法)产生的具有相同结构的片段。F(ab')2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含另外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸残基。

“Fab'片段”是包含F(ab')2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。

“Fd'片段”是包含F(ab')2片段的一个重链部分的抗体片段。

“Fv'片段”是仅包含抗体分子的V_H和V_L域的片段。

“scFv片段”指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)的抗体片段。接头的长度使得这两个可变结构域没有明显干扰地桥接。示例性的接头是其中一些Glu或Lys残基分散在各处以提高溶解度的(Gly-Ser)_n残基。

“双抗体”是二聚scFv；双抗体通常具有比单链抗体短的肽接头，并且优先二聚化。

如本文中所用的术语“可变区”和“可变结构域”指抗体的包含互补决定区(CDR，例如CDRH1、CDRH2、HCR3、CDRL1、CDRL2和CDRL3)和框架区(FR)的氨基酸序列的轻链和重链部分。重链和轻链的可变结构域通常被分别命名为V_H和V_L。可变结构域包含在本文所述的Fab、F(ab’)2、Fv和scFv抗原结合片段上，并参与特异性抗原识别。

如本文中所用的“互补决定区(CDR)”指每条链中的三个高变区，这些高变区中断由轻链可变区和重链可变区建立的四个框架区。CDR主要负责结合至抗原的表位。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，这些CDR从N端开始依次编号，并且通常由特定的CDR所在的链标识。因此，V_H CDR3位于其所在的抗体的重链可变结构域中，而V_L CDR1是其所在的抗体的轻链可变结构域的CDR1。

不同的轻链或重链框架区的序列在一个物种中相对保守。抗体的框架区(即，组成轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和比对CDR。

CDR和框架区的氨基酸序列可以使用本领域中的各种众所周知的定义来确定，例如Kabat、North法(例如参见North等人在2011年第406(2)期《J Mol Biol.(分子生物学杂志)》第228-256页上发表的论文)、Chothia、《国际免疫遗传学数据库(IMGT)》、以及AbM(例如参见上述的Johnson等人的论文；Chothia和Lesk于1987年在第196期《J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)》的第901-917页上发表的论文“Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins(免疫球蛋白的高变区的规范结构)”；Chothia C.等人于1989年在第342期《Nature(自然)》杂志的第877-883页上发表的论文“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions(免疫球蛋白高变区的构象)”；Chothia C.等人于1992年在第227期《J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)》的第799-817页上发表的论文“Structural Repertoire of the Human V_H Segments(人类V_H片段的结构库)”；Al-Lazikani等人在1997年第273(4)期《J.Mol.Biol(分子生物学杂志)》上发表的论文)。在下列文献中也说明了抗原结合位点的定义：Ruiz等人在《国际免疫遗传学数据库(IMGT)》和2000年第28期《Nucleic Acids Res.(核酸研究)》杂志的第219-221页上发表的论文；Lefranc,M.-P.在《国际免疫遗传学数据库(IMGT)》和2001年1月1日的第29(1)期《Nucleic Acids Res.(核酸研究)》杂志的第207-9页上发表的论文；MacCallum等人在1996年第262(5)期《J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)》的第732-745页上发表的论文“Antibody-Antigen Interactions:Contact Analysis and Binding Site Topography(抗体-抗原相互作用：接触分析和结合位点形貌)”；以及Martin等人在1989年第86期《Proc.NatlAcad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)》的第9268-9272页上发表的论文；Martin等人在1991年第203期《Methods Enzymol.(酶学方法)》杂志的第121-153页上发表的论文；Pedersen等人在1992年第1期《Immunomethods(免疫方法)》杂志的第126页上发表的论文；以及Rees等人在由Sternberg M.J.E.编写并由英国牛津市的牛津大学出版社于1996年出版的《Protein Structure Prediction(蛋白质结构预测)》中发表的文章。

如本文中所用的“嵌合抗体”指一种免疫球蛋白分子，其中的(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接至不同的或改变的类别、效应功能和/或种类的恒定区、或为嵌合抗体赋予新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区或其部分改变、替换或交换；或具有来自另一物种或另一抗体类别或亚类的相应序列。

如本文中所用的“人源化抗体”指来自供体抗体的CFR中的免疫球蛋白分子被接枝到人框架序列上。人源化抗体还可以在框架序列中包含供体来源的残基。人源化抗体还可以包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体还可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。可以使用本领域已知的方法进行人源化(例如Jones等人在1986年第321期《Nature(自然)》杂志的第522-525页上发表的论文；Riechmann等人在1988年第332期《Nature(自然)》杂志的第323-327页上发表的论文；Verhoeyen等人在1988年第239期《Science(科学)》杂志的第1534-1536页上发表的论文；Presta在1992年第2期《Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)》的第593-596页上发表的论文；第4,816,567号美国专利)，包括“超人源化”抗体(Tan等人在2002年第169期《J.Immunol.(免疫学杂志)》的第1119页上发表的论文)和“表面重建”(例如Staelens等人在2006年第43期《Mol.Immunol.(分子免疫学)》杂志的第1243页上发表的论文；和Roguska等人在1994年第91期《Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院院刊)》的第969页上发表的论文)等技术。

术语“重组”当用于指细胞、或核酸、蛋白质、或载体等时表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因，或者表达在不重组的情况下被异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。

术语“抗原”、“免疫原”、“抗体标靶”、“标靶分析物”和类似术语在本文中用于指被抗体识别(即，能够被抗体特异性结合)的分子、化合物或复合物。该术语可指能够被抗体特异性识别的任何分子，例如多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、化学部分或它们的组合(例如磷酸化或糖基化多肽等)。本领域技术人员应理解，该术语并非表示该分子在每种情况下都是免疫原性的，而只是表示它能够被抗体靶向。

抗体与抗原上的“表位”结合。表位是抗原上的被抗体识别和结合的定位位点。表位可以包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如5、6个或更多个(例如20个或更多个)氨基酸、或这些氨基酸的部分。在一些情况下，表位包含非蛋白质成分，例如来自碳水化合物、核酸或脂质的成分。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，当标靶是蛋白质时，表位可以由连续的氨基酸组成，或者由来自蛋白质的不同部分的氨基酸组成，这些氨基酸通过蛋白质折叠(例如不连续的表位)而接近。形成三维结构的其它类型的标靶分子也是如此。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个氨基酸，更常见的是包含至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括X射线晶体学和二维核磁共振等。例如，参见由GlennE.Morris编写的《Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(分子生物学方法中的表位作图方案)》的第66卷(1996)。

“标记”或“可检测的部分”是能够通过光谱、放射、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的诊断剂或成分。示例性的标记包括放射性标记(例如¹¹¹In、^99mTc、¹³¹I、⁶⁷Ga)和其它经过FDA核准的成像剂。另外的标记包括32^P、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质、或者其它可检测的实体，例如通过将放射性标记结合到靶向剂中来检测。可以使用本领域中已知的用于将核酸或纳米载体缀合至标记的任何方法，例如使用在由美国圣地亚哥市的Academic Press,Inc.于1996年出版的Hermanson的《生物缀合技术》中所述的方法。

“标记的”抗体或药剂是通过接头或化学键共价结合或通过离子键、范德华键、静电键或氢键非共价结合至标记的抗体或试剂，从而能够通过检测结合至抗体或药剂的标记的存在来检测抗体或药剂的存在。

将可检测的治疗剂与抗体结合的技术是众所周知的(例如参见Arnon等人在由Reisfeld等人编写的《Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)》的第243-56页上发表的文章“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy(用于癌症治疗中的药物免疫靶向的单克隆抗体)”(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人在由Robinson等人编写的《Controlled Drug Delivery(受控药物输送)》(第2版)》的第623-53页上发表的文章“Antibodies For Drug Delivery(用于药物输送的抗体)”(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe在1985年出版的由Pinchera等人编写的《Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(单克隆抗体'84：生物学和临床应用)》的第475-506页上发表的文章“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review(癌症治疗中的细胞毒性剂的抗体载体：综述)”；以及Thorpe等人在1982年第62期《Immunol.Rev.(免疫学评论)》杂志的第119-58页上发表的论文“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates(抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性)”)。

术语“对……是特异性的”、“特异性地结合”和类似术语指与非标靶化合物相比以高至少2倍的亲和力(例如4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍亲和力中的至少任何一个)结合至标靶的分子(例如抗体或抗原结合片段)。例如，与标靶(例如CD28)特异性地结合的抗体通常以比非标靶高至少2倍的亲和力与标靶结合。特异性可以使用标准方法来确定，例如固相ELISA免疫测定法(例如，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的说明，请参考Harlow和Lane的《Using Antibodies,A LaboratoryManual(使用抗体：实验手册)》

(1998))。

相对于抗体标靶(例如抗原、分析物、免疫复合物)的术语“结合”通常表示抗体与纯群体中的大多数抗体标靶结合(假定适当的摩尔比)。例如，与给定抗体标靶结合的抗体通常与溶液中的抗体标靶的至少2/3(例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的至少任何一个)结合。本领域技术人员应认识到，根据确定结合的方法和/或阈值，会出现一些变动。

“对照”样品或值指用作参照物(通常是已知的参照物)的样品，它用于与测试样品进行比较。例如，可以在测试条件下(例如在测试化合物存在的情况下)获取测试样品，并与已知条件下(例如在不存在测试化合物的情况下(阴性对照)，或在存在已知化合物的情况下(阳性对照))的样品进行比较。对照也可以代表从大量测试或结果中收集的平均值或范围。本领域的技术人员应认识到，可以设计对照以用于评估任何数量的参数。例如，可以设计某种对照来基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施(例如益处和/或副作用的比较)比较治疗益处。可以设计对照以用于体外应用。本领域技术人员能理解在给定情况下哪些对照是有价值的，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的显著性也很有价值。例如，如果给定参数的值在对照中变化很大，那么测试样品的变化将不被视为显著的。

在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“相同”或百分比“同一性”指两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性的比较和比对时，在特定区域上具有大约60％的同一性，优选具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用BLAST 2.0序列比较算法和下述默认参数所测量，或通过手动比对和目测所确定(例如参见NCBI网站ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。这样的序列被称为“基本上相同”。如下文所述，优选算法可以考虑到间隙等。优选地，同一性存在于长度为至少大约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或者更优选地，存在于长度为50-100个或更多个氨基酸或核苷酸的区域上。

对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，并且根据需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文中所用的“比较窗口”包括选自由20个至600个连续位置、通常大约50个至大约200个连续位置、更通常大约100个至大约150个连续位置所组成的组中的任何一个的片段，其中在两个序列被最佳地比对后，可以将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。

适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，在Altschul等人在1977年第25期《核酸研究》杂志的第3389-3402页上发表的论文和Altschul等人在1990年第215期《分子生物学杂志》的第403-410页上发表的论文中分别说明了这些算法。使用BLAST和BLAST 2.0和本文所述的参数来确定本公开的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中的长度为W的短词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的词比对时，这些短词匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻近词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻近词命中结果作为种子，用于启动搜索以查找包含它们的更长的HSP。沿着每个序列在两个方向上扩展词的命中结果，直到能够提高累计比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(不匹配残基的惩罚分数；始终<0)计算累计分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累计分数。当出现以下情况时，停止字命中结果在每个方向上的扩展：累计比对分数从其最大实现值下降数量X；由于一个或更多个得负分残基比对的累计，累计得分变为零或更低；或者到达任何一个序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)＝11、期望值(E)＝10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长＝3、期望值(E)＝10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff于1989在第89期《Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)》的第10915页上的论文)的比对(B)＝50、期望值(E)＝10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。

术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物、以及它们的互补物。该术语涵盖包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并且被以与参照核苷酸相似的方式代谢。这样的类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。

除了另有所示之外，特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变化形式(例如简并密码子取代)和互补序列、以及明确示出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中的一个或更多个选定的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人在1991年第19期的《Nucleic Acid Res.(核酸研究)》杂志的第5081页上发表的论文；Ohtsuka等人在1985年第260期《J.Biol.Chem.(生物化学杂志)》的第2605-2608页上发表的论文；Rossolini等人在1994的第8期《Mol.Cell.Probes(分子和细胞探针)》杂志的第91-98页上发表的论文)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语涵盖其中的一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸、以及在功能上与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但在功能上类似于天然存在的氨基酸的化合物。

氨基酸在本文中可以用它们的公知的三字母符号来表示，也可以用IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸也可以用它们的被普遍接受的单字母代码来表示。

如本文中相对于抗体所用的术语“竞争”指第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分竞争结合，其中与第一抗体在第二抗体不存在时与其同源表位的结合相比，第一抗体在第二抗体存在时与其同源表位的结合可检测地降低。另一种情况是，在第一抗体存在时，第二抗体与其表位的结合也可检测地降低，这种情况可以存在，但不是必须的。也就是说，第一抗体能够抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论程度相同、更大或更小，这些抗体都被认为相互“交叉竞争”与其各自的表位的结合。竞争性和交叉竞争性抗体都包含在本公开的范围之内。不论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如空间位阻、构象变化、或与共同表位或其部分的结合等)，基于本文中提供的教导，本领域技术人员应理解，这样的竞争和/或交叉竞争抗体被本文公开的方法涵盖，并且可用于本文公开的方法。

许多类型的竞争性结合测定方法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等人在1983年第9期《Methods in Enzymology(酶学方法)》的第242-253页上发表的论文)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人在1986年第137期《J.Immunol.(免疫学杂志)》的第3614-3619页上发表的论文)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见由Harlow和Lane编写并由Cold Spring Harbor Press于1988年出版的《Antibodies,A LaboratoryManual(抗体：实验手册)》)；使用I-125标记进行固相直接标记RIA(参见Morel等人在1988年第25(1)期《Molec.Immunol.(分子免疫学)》杂志的第7-15页上发表的论文；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Cheung等人在1990年第176期《Virology(病毒学)》杂志的第546-552页上发表的论文)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人在1990年第32期

《Scand.J.Immunol.(斯堪的纳维亚免疫学杂志)》的第77-82页上发表的论文)。典型情况下，这样的测定涉及使用结合至固体表面的纯化抗原或载有未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白的细胞。竞争抑制是通过在测试免疫球蛋白存在的情况下确定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量的。测试免疫球蛋白通常过量存在。通过竞争测定识别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体一样结合至相同表位的抗体、以及结合至足够靠近由参考抗体结合的表位从而产生空间位阻的邻近表位的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，它会将参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50％或75％。

如本文中所用的术语“CD28”指人CD28蛋白、其同种型或变体，包括人CD28的天然变体，例如剪接变体或等位基因变体。在SEQ ID NO:74中示出了一种示例性人CD28的氨基酸序列。在SEQ ID NO:75中示出了另一种示例性人CD28的氨基酸序列。在SEQ ID NO:76中示出了又一种示例性人CD28的氨基酸序列。在SEQ ID NO:77中示出了一种示例性人CD28的氨基酸序列。在SEQ ID NO:78中示出了另一种示例性人CD28的氨基酸序列。在SEQ ID NO:79中示出了又一种示例性人CD28的氨基酸序列。在SEQ ID NO:80中示出了再一种示例性人CD28的氨基酸序列。在一些实施方案中，人CD28可以指与SEQ ID NO:74-80中的任何一个表现出至少或至少大约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的变体，例如等位基因变体或剪接变体。在一些实施方案中，应理解，所提供的抗体或抗原结合片段可以表现出与另一种哺乳动物CD28蛋白(例如鼠CD28或灵长目动物CD28)的交叉反应性结合。

人CD28同种型1的氨基酸序列(SEQ ID NO:74；UniProt P10747-1)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

人CD28同种型2的氨基酸序列(SEQ ID NO:75；UniProt P10747-2)

KHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAA

人CD28同种型3的氨基酸序列(SEQ ID NO:76；UniProt P10747-3)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSYNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP

LFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

人CD28同种型4的氨基酸序列(SEQ ID NO:77；UniProt P10747-4)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSWKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

人CD28同种型5的氨基酸序列(SEQ ID NO:78；UniProt P10747-5)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSYNEKSNGTIIHVKGEE

人CD28同种型6的氨基酸序列(SEQ ID NO:79；UniProt P10747-6)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSYNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP LFPGPSKPYAPPRDFAAYRS

人CD28同种型7的氨基酸序列(SEQID NO:80；UniProt

P10747-7)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

在一些实施方案中，示例性人CD28氨基酸序列中的任何一个还包含胞外域。在一些实施方案中，该胞外域包含SEQ ID NO:81中所示的序列。在一些实施方案中，示例性人CD28氨基酸序列中的任何一个还包含跨膜域。在一些实施方案中，该跨膜域包含SEQ IDNO:82中列出的序列。在一些实施方案中，示例性人CD28氨基酸序列中的任何一个还包含细胞质域。在一些实施方案中，该胞质域包含SEQ ID NO:83中所示的序列。在一些实施方案中，示例性人CD28氨基酸序列中的任何一个还包含信号序列。在一些实施方案中，该信号序列包括SEQ ID NO:84中列出的序列MLRLLLALNLFPSIQVTG。在一些实施方案中，CD28的全部或部分指CD28的胞外域。在一些实施方案中，CD28的全部或部分指CD28的跨膜域。在一些实施方案中，CD28的全部或部分指CD28的细胞质域。

“固体支持物”指根据所提供的公开内容的抗体能够粘附或附接到其上的非水性基质。例如，固体支持物包括但不限于微量滴定板、膜(例如硝酸纤维素)、珠、检棒、薄层色谱板或其它固体介质。

如本文中所用的“个体”或“受试者”是哺乳动物。用于治疗目的的“哺乳动物”包括人类、家畜、以及动物园、比赛或宠物动物，例如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，个体或受试者是人类。

II.结合CD28的抗体

本文提供了一种特异性结合至CD28的抗体，包括其抗原结合片段。在一些实施方案中，所提供的抗体包含结合CD28的单克隆抗体及其抗原结合片段，该单克隆抗体及其抗原结合片段与其它报道的抗体相比提供更好的标靶特异性、信噪比等。本文还提供了一种产生抗CD28抗体的方法、以及一种检测和使用这样的抗体的方法。

CD28是T细胞特异性表面糖蛋白的分化命名簇。CD28是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员，并且在细胞表面上被表达为90kDa二硫键连接的同型二聚体(Yun等人于1998在《Encyclopedia of Immunology(免疫学百科全书)》中发表的论文)。虽然存在七种同种型，但是同种型1被认为是规范序列。CD28参与T细胞活化过程，该过程涉及两种类型的信号，即，在结合至抗原肽主要组织相容性复合物(pMHC)时通过T细胞受体(TCR)诱导的第一种信号、以及通过共同刺激受体诱导的第二种信号，该共同刺激受体的原型是CD28。CD28结合至B7-1(又被称为CD80)或B7-2(又被称为CD86)。通过CD28进行的共同刺激对于幼稚T细胞实现克隆扩增、细胞因子产生以及防止凋亡和失能的保护是至关重要的(Xia等人于2018年在《Front.Immunol.(免疫学前沿)》中发表的论文)。除了其共同刺激作用之外，CD28连接还能够增强各种细胞因子(例如与TCR/CD3连接和CD40L共同刺激结合的IL-2、IL-4和IL-10)的产生，并且在延长活化的T细胞的命运和引发其向记忆表型的分化方面起作用(Chen.等人在2018年第15期《Nature(自然)》杂志的第734-736页上发表的论文)。

虽然经典的T细胞活化过程涉及上述两种类型的共同刺激信号，但是某些单克隆抗体已经被鉴定并称为“超级激动剂”，因为它们能够在缺乏抗原呈递细胞对TCR的共同刺激的情况下活化T调节(TREG)细胞。(Brown等人于2018年在《Diseases(疾病)》杂志中发表的论文)。

在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段中的任何一种结合至CD28的全部或一部分。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种是CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是分离的(例如从其自然环境的成分(例如动物、生物样品)中分离)。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体的衍生物。在一些实施方案中，所述抗体在实验室条件下结合(例如在体外结合，在流式细胞术测定中结合，在ELISA中结合)。在一些实施方案中，所述抗体在生理条件下结合(例如在受试者的细胞中结合)。

总体来说，本文提供的抗体包含至少一个免疫球蛋白重链可变结构域和至少一个免疫球蛋白轻链可变结构域。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域。典型情况下，所述抗体的每个免疫球蛋白重链可变结构域包含第一、第二和第三重链互补决定区(CDR；CDRH1、CDRH2和CDRH3)，并且所述抗体的每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含第一、第二和第三轻链CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。

在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv或scFv。该抗原结合片段可以使用本领域中已知的任何方法产生，包括化学消化(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)和重组方法。分离和制备重组核酸的方法是本领域技术人员已知的(参见Sambrook等人的《Molecular Cloning.A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)》(1989年第2版)；Ausubel等人的《Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)》(1995年))。所述抗体能够在多种宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞，例如COS、CHO和HeLa细胞系以及骨髓瘤细胞系。

本公开提供了一种特异性结合CD28的分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体包含：a)免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含：(i)重链互补决定区1(CDRH1)，该重链互补决定区1包含序列X₁YX₃X₄X₅(SEQ ID NO:68)，其中X₁是S或D；X₃是T、W、I或N；X₄是M或I；并且X₅是H、N或S；(ii)重链互补决定区2(CDRH2)，该重链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆GX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅KX₁₇(SEQ ID NO:69)，其中X₁是Y、N、W或I；X₂是I或F；X₃是D、Y或S；X₄是P或N；X₅是G或Y；X₆是S、Y或G；X₈是Y、R、S、A或T；X₉是S、T或I；X₁₀是E、I、N、T或Y；X₁₁是F或Y；X₁₂是N、D或P；X₁₃是H、E、Q或D；X₁₄是K、R或T；X₁₅是F或V；并且X₁₇是D、S或G；以及(iii)重链互补决定区3(CDRH3)，该重链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀DY(SEQ ID NO:70)，其中X₁是R、S、F或H；X₂是Q、H、E、G或R；X₃是D、Y、F或P；X₄是N、G、R、Y或T；X₅是S、G或D；X₆是G、S或没有氨基酸；X₇是Y、F或没有氨基酸；X₈是D或没有氨基酸；X₉是S、A或V；并且X₁₀是F、M或L；以及b)免疫球蛋白轻链可变结构域，该免疫球蛋白轻链可变结构域包含：(i)轻链互补决定区1(CDRL1)，该轻链互补决定区1包含序列X₁X₂SX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X_{1 4}X₁₅X₁₆(SEQ ID NO:71)，其中X₁是R、H或K；X₂是T、A或S；X₄是E或Q；X₅是N、S或I；X₆是I、L或V；X₇是Y、A或G；X₈是S、V、N或T；X₉是N、W、S或D；X₁₀是L、F或V；X₁₁是A、N或G；X₁₂是N或没有氨基酸；X₁₃是T或没有氨基酸；X₁₄是Y或没有氨基酸；X₁₅是L或没有氨基酸；并且X₁₆是S或没有氨基酸；(ii)轻链互补决定区2(CDRL2)，该轻链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(SEQ ID NO:72)，其中X₁是A、K、G或S；X₂是A或I；X₃是T或S；X₄是N或K；X₅是L或R；X₆是A、H、F或Y；并且X₇是D、T或S；以及(iii)轻链互补决定区3(CDRL3)，该轻链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆PX₈T(SEQ ID NO:73)，其中X₁是Q、L或H；X₂是H或Q；X₃是F、G或Y；X₄是W、Q、T或S；X₅是G、S、H或R；X₆是I、Y、T或Q；并且X₈是W、F或Y。

在一些实施方案中，本公开的抗体可以包含重链互补决定区1(CDRH1)、CDRH2、CDRH3、轻链互补决定区1(CDRL1)、CDRL2、CDRL3的序列。在表1中列出了示例性的CDR氨基酸序列和相关的SEQ ID NO:，在表2中列出了示例性的重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的氨基酸序列和相关的SEQ ID NO:。

表1.根据Kabat编号示出的来自示例性抗CD28抗体的CDR的氨基酸序列。

表2.来自示例性抗CD28抗体的可变重结构域(V_H)和可变轻结构域(V_L)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段中的任何一种包含：(1)具有SEQ ID NO:13、14、15、16或17中的任何一个的序列的CDRH1或其变体，该CDRH1或其变体具有相对于SEQ ID NO:13、14、15、16或17中的任何一个的序列有一个氨基酸取代的序列；(2)具有SEQ ID NO:18、19、20、21或22中的任何一个的序列的CDRH2或其变体，该CDRH2或其变体具有相对于SEQ ID NO:18、19、20、21或22中的任何一个的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列；(3)具有SEQ ID NO:23、24、25、26或27中的任何一个的序列的CDRH3或其变体，该CDRH3或其变体具有相对于SEQ ID NO:23、24、25、26或27中的任何一个的序列有一个或两个氨基酸取代的序列；(4)具有SEQ ID NO:28、29、30、31或32中的任何一个的序列的CDRL1或其变体，该CDRL1或其变体具有相对于SEQ ID NO:28、29、30、31或32中的任何一个的序列有一个或两个氨基酸取代的序列；(5)具有SEQ ID NO:33、34、35、36或37中的任何一个的序列的CDRL2或其变体，该CDRL2或其变体具有相对于SEQ ID NO:33、34、35、36或37中的任何一个的序列有一个取代的序列；以及(6)具有SEQ ID NO:38、39、40、41或42中的任何一个的序列的CDRL3或其变体，该CDRL3或其变体具有相对于SEQ ID NO:38、39、40、41或42的序列有一个或两个氨基酸取代的序列。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白轻链可变结构域，该免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列。

AB1

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:13的序列或相对于SEQ ID NO:13的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:18的序列或相对于SEQ ID NO:18的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:23的序列或相对于SEQ ID NO:23的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:28的序列或相对于SEQ ID NO:28的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:33的序列或相对于SEQ ID NO:33的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:38的序列或相对于SEQ ID NO:38的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:13的序列或与SEQ ID NO:13表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:18的序列或与SEQ ID NO:18表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:23的序列或与SEQ ID NO:23表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:28的序列或与SEQ ID NO:28表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:33的序列或与SEQ ID NO:33表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:38的序列或与SEQ ID NO:38表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:13的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:18的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:23的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:28的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:33的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:38的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:1的序列和与SEQ ID NO:1的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:7的序列和与SEQ ID NO:7的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为13、18和23的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:1的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为28、33和38的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:7的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB2

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:14的序列或相对于SEQ ID NO:14的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:19的序列或相对于SEQ ID NO:19的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:24的序列或相对于SEQ ID NO:24的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:29的序列或相对于SEQ ID NO:29的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:34的序列或相对于SEQ ID NO:34的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:39的序列或相对于SEQ ID NO:39的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:14的序列或与SEQ ID NO:14表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:19的序列或与SEQ ID NO:19表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:24的序列或与SEQ ID NO:24表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:29的序列或与SEQ ID NO:29表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:34的序列或与SEQ ID NO:34表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:39的序列或与SEQ ID NO:39表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:14的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:19的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:24的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:29的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:34的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:39的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:2的序列和与SEQ ID NO:2的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:8的序列和与SEQ ID NO:8的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为14、19和24的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:2的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为29、34和39的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB3

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:15的序列或相对于SEQ ID NO:15的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:20的序列或相对于SEQ ID NO:20的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:25的序列或相对于SEQ ID NO:25的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:30的序列或相对于SEQ ID NO:30的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或相对于SEQ ID NO:35的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列或相对于SEQ ID NO:40的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:15的序列或与SEQ ID NO:15表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:20的序列或与SEQ ID NO:20表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:25的序列或与SEQ ID NO:25表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:30的序列或与SEQ ID NO:30表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:40的序列或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:15的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:20的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:25的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:30的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:3的序列和与SEQ ID NO:3的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:9的序列和与SEQ ID NO:9的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为15、20和25的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:3的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为30、35和40的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:9的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB4

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:16的序列或相对于SEQ ID NO:16的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:21的序列或相对于SEQ ID NO:21的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:26的序列或相对于SEQ ID NO:26的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:30的序列或相对于SEQ ID NO:30的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或相对于SEQ ID NO:35的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列或相对于SEQ ID NO:40的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:16的序列或与SEQ ID NO:16表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:21的序列或与SEQ ID NO:21表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:26的序列或与SEQ ID NO:26表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:30的序列或与SEQ ID NO:30表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:40的序列或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:16的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:21的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:26的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:30的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:4的序列和与SEQ ID NO:4的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:9的序列和与SEQ ID NO:9的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为16、21和26的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:4的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为30、35和40的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:9的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB5

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:16的序列或相对于SEQ ID NO:16的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:21的序列或相对于SEQ ID NO:21的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:26的序列或相对于SEQ ID NO:26的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:31的序列或相对于SEQ ID NO:31的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:36的序列或相对于SEQ ID NO:36的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:41的序列或相对于SEQ ID NO:41的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:16的序列或与SEQ ID NO:16表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:21的序列或与SEQ ID NO:21表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:26的序列或与SEQ ID NO:26表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:31的序列或与SEQ ID NO:31表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:36的序列或与SEQ ID NO:36表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:41的序列或与SEQ ID NO:41表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:16的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:21的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:26的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:31的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:36的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:41的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:10有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:4的序列和与SEQ ID NO:4的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:10的序列和与SEQ ID NO:10的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为16、21和26的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:4的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为31、36和41的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB6

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:15的序列或相对于SEQ ID NO:15的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:20的序列或相对于SEQ ID NO:20的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:25的序列或相对于SEQ ID NO:25的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:30的序列或相对于SEQ ID NO:30的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或相对于SEQ ID NO:35的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列或相对于SEQ ID NO:40的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:15的序列或与SEQ ID NO:15表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:20的序列或与SEQ ID NO:20表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:25的序列或与SEQ ID NO:25表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:30的序列或与SEQ ID NO:30表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:40的序列或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:15的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:20的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:25的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:30的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含

SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:3的序列和与SEQ ID NO:3的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:9的序列和与SEQ ID NO:9的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为15、20和25的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:3的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为30、35和40的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:9的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB7

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:15的序列或相对于SEQ ID NO:15的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:20的序列或相对于SEQ ID NO:20的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:25的序列或相对于SEQ ID NO:25的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:28的序列或相对于SEQ ID NO:28的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或相对于SEQ ID NO:35的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列或相对于SEQ ID NO:40的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:15的序列或与SEQ ID NO:15表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:20的序列或与SEQ ID NO:20表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:25的序列或与SEQ ID NO:25表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:28的序列或与SEQ ID NO:28表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:40的序列或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:15的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:20的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:25的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:28的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:35的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:40的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:11有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:5的序列和与SEQ ID NO:5的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:11的序列和与SEQ ID NO:11的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为15、20和25的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:5的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为28、35和40的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

AB8

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:17的序列或相对于SEQ ID NO:17的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRH1；(2)具有SEQID NO:22的序列或相对于SEQ ID NO:22的序列有一个、两个或三个氨基酸取代的序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:27的序列或相对于SEQ ID NO:27的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:32的序列或相对于SEQ ID NO:32的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:37的序列或相对于SEQ ID NO:37的序列有一个氨基酸取代的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:42的序列或相对于SEQ ID NO:42的序列有一个或两个氨基酸取代的序列的CDRL3。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ IDNO:17的序列或与SEQ ID NO:17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:22的序列或与SEQ ID NO:22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；(3)具有SEQ ID NO:27的序列或与SEQ ID NO:27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(4)具有SEQ ID NO:32的序列或与SEQ ID NO:32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:37的序列或与SEQ ID NO:37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ IDNO:42的序列或与SEQ ID NO:42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以包含：(1)具有SEQ ID NO:17的序列的CDRH1；(2)具有SEQ ID NO:22的序列的CDRH2；(3)具有SEQ IDNO:27的序列的CDRH3；(4)具有SEQ ID NO:32的序列的CDRL1；(5)具有SEQ ID NO:37的序列的CDRL2；以及(6)具有SEQ ID NO:42的序列的CDRL3。

在一些实施方案中，本文公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:12有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，该重链包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:6的序列和与SEQ ID NO:6的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:12的序列和与SEQ ID NO:12的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含(1)重链可变结构域，该重链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为17、22和27的CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且与SEQ IDNO:6的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性；以及(2)轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:分别为32、37和42的CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且与SEQ ID NO:12的序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。这样的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

III.Fc多肽

在一些实施方案中，本文提供的任何抗体或其抗原结合片段可以包含可结晶片段区(Fc区)，该可结晶片段区在本文中又被称为Fc多肽。Fc多肽是抗体中的两条重链中的每一条的一部分，并且能够与某些细胞表面受体和补体系统的某些成分相互作用。Fc多肽通常包含CH2域和CH3域，该CH2域和CH3域是免疫球蛋白恒定区域多肽。在一些实施方案中，本文所述的抗体中的Fc多肽可以是野生型Fc多肽，例如人IgG1 Fc多肽。在某些实施方案中，本文所述的抗体可以包括具有SEQ ID NO:85的序列的野生型Fc多肽：

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。在其它实施方案中，本文所述的抗体可以包括野生型Fc多肽的变体，该变体与野生型Fc多肽(例如SEQ ID NO:85)的序列有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)同一性，并且相对于野生型Fc多肽(例如SEQ ID NO:85)的序列有至少一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，Fc多肽包含一个或更多个修饰(例如相对于可比的野生型Fc区的一个或更多个氨基酸取代、插入或缺失)。相对于包含野生型Fc多肽的抗体，包含修饰的Fc多肽的抗体通常具有改变的表型。例如，包含修饰的Fc多肽的抗体可以具有改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的易感性和/或改变的效应功能(例如，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中所测定)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体中的Fc多肽可以包含调节效应功能的氨基酸取代。在某些实施方案中，本文所述的抗体中的Fc多肽可以包含降低或消除效应功能的氨基酸取代。降低效应功能的示例性Fc多肽氨基酸取代包括但不限于CH2域中的取代，例如在位置4和5(相对于SEQ ID NO:85的序列的位置编号)处的取代(例如参见Lund等人在1991年第147(8)期《J Immunol.(免疫学杂志)》的第2657-62页上发表的论文)。例如，在一些实施方案中，本文所述的抗体中的一种或两种Fc多肽可以包含L4A和L5A取代。

调节效应功能的其它Fc多肽氨基酸取代例如包括在位置99(相对于SEQ ID NO:85序列的位置编号)处的取代。例如，在一些实施方案中，本文所述的抗体中的一种或两种Fc多肽可以包含P99G取代。在某些实施方案中，本文所述的抗体中的一种或两种Fc多肽可以具有L4A、L5A和P99G取代。

在一些实施方案中，Fc多肽包含一种或更多种(相对于野生型Fc多肽)改变经修饰的Fc多肽与活化性FcγR(例如FcγRIIA或FcγRIIIA)的亲和力相对于与抑制性FcγR(例如FcγRIIB)的亲和力的比值的修饰：

在经修饰的Fc多肽具有大于1的亲和力比的情况下，本文的抗体尤其可用于提供对于需要增强由FcγR介导的效应细胞功能(例如ADCC)的功效的疾病、病症或感染(例如癌症或感染性疾病)的治疗性或预防性治疗，或实现其症状的改善。在经修饰的Fc区具有小于1的亲和力比的情况下，本文的抗体尤其可用于提供需要降低由FcγR介导的效应细胞功能的功效的疾病或病症(例如自身免疫性或炎症性病症)的治疗性或预防性治疗，或实现其症状的改善。表3列出了Fc多肽中的单个、两个、三个、四个和五个氨基酸取代的实例，这些氨基酸取代提供大于1或小于1的亲和力比(例如参见PCT公告WO 04/063351；WO 06/088494；WO 07/024249；WO 06/113665；WO 07/021841；WO 07/106707；WO 2008/140603)。氨基酸位置是根据EU编号方案编号的。

IV.与抗CD28抗体竞争性结合的抗体

本文还提供了与本文所述的一种或更多种CD28抗体竞争性结合或能够竞争性结合的抗体(例如竞争抗体)。在某些情况下，当竞争抗体与本文所述的抗体一样结合至相同的一般区域时，可以认为该抗体竞争结合。在某些情况下，当竞争抗体与本文所述的抗体一样结合至完全相同的区域(例如完全相同的肽(线性表位)或完全相同的表面氨基酸(构象表位))时，可认为该抗体竞争结合。在某些情况下，当竞争抗体在适当的试验条件下与本文所述的抗体一样结合至相同一般区域(即，胞外区或富含亮氨酸的结合域)时，可认为该抗体能够竞争结合。在某些情况下，当竞争抗体(即，竞争剂)在适当的试验条件下与本文所述的抗体一样结合至完全相同的区域(例如完全相同的肽(线性表位)或完全相同的表面氨基酸(构象表位))时，可以认为该抗体能够竞争结合。

在某些情况下，例如在适当的试验条件下，当竞争抗体阻断本文所述的一种或更多种抗体与CD28的结合时，可以认为该抗体竞争与CD28的结合。竞争抗体是否阻断本文所述的一种或更多种抗体的结合可以使用适当的竞争试验或阻断试验(例如本文所述的阻断试验)来确定。竞争抗体可能在竞争或阻断试验中将本文所述的一种或更多种抗体的结合阻断50％或更多(例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多、或100％)，反过来说，本文所述的一种或更多种抗体可能在竞争或阻断试验中将竞争抗体的结合阻断大约50％或更多(例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多、或100％)。

在某些情况下，例如在适当的试验条件下，当竞争抗体以与本文所述的一种或更多种抗体相似的亲和力结合至CD28时，可以认为该抗体竞争与CD28的结合。在一些实施方案中，当竞争抗体以本文所述的一种或更多种抗体的亲和力的至少大约50％(例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的亲和力结合时，认为该抗体竞争结合。

本文还提供了一种与本文所述的一种或更多种抗体一样结合或能够结合至相同表位的抗体。具体而言，本文提供了一种与本文所述的一种或更多种抗体竞争与CD28上的相同表位(例如相同的肽(线性表位)或相同的表面氨基酸(构象表位))的结合的抗体。这样的与相同表位结合的抗体可以被称为表位竞争抗体。

V.多克隆和单克隆抗体

通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，能够在动物(脊椎动物或无脊椎动物，包括哺乳动物、鸟类和鱼类，包括软骨鱼)中产生多克隆抗体。使用双功能或衍生试剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)将相关的抗原缀合至在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如钥孔海螺血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)或其它载体可能很有用。非蛋白载体(例如胶体金)也可用于抗体产生。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与三倍体积的弗氏完全佐剂混合，并在多个部位皮内注射该溶液，可以针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物对动物进行免疫。一个月后，通过在多个部位皮下注射，用在弗氏完全佐剂中的五分之一至十分之一原始量的肽或缀合物对动物进行加强。七到十四天后，给动物放血，并测定血清中的抗体滴度。对动物加强免疫，直到滴度达到稳定水平。通常，用相同抗原但缀合至不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂缀合的缀合物对动物进行加强。也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合体来制备缀合物。此外，聚合剂(例如明矾)适合用于增强免疫反应。

单克隆抗体可以使用杂交瘤(例如Kohler等人在1975年第256期《Nature(自然)》杂志的第495页上首次说明的杂交瘤方法)来制备，或者可以通过其它方法(例如重组DNA方法)来制备(例如参见第4,816,567号美国专利)。在杂交瘤方法中，对小鼠或其它适当的宿主动物(例如仓鼠或猕猴)进行免疫，以诱导产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用适当的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(例如参见Goding的《Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)》的第59-103页(学术出版社，1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞接种到适当的培养基中并使其在培养基中生长，该培养基可以包含一种或更多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞是高效融合、支持所选的抗体产生细胞稳定高水平地产生抗体、并且对培养基(例如HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如可以从美国典型培养物保藏中心(美国马里兰州罗克维尔市)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。文献中还说明人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体(Kozbor在1984年第133期《J.Immunol.(免疫学杂志)》的第3001页上发表的论文；Brodeur等人的《Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术和应用)》的第51-63页(美国纽约的Marcel Dekker,Inc.，1987年))。

测定杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀、通过体外结合试验(例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))或通过表达膜抗原的细胞的流式细胞分析来确定。单克隆抗体的结合亲和力例如可以通过Munson等人在1980年第107期《Anal.Biochem.(分析生物化学)》的第220页上公布的Scatchard分析法来确定。

在鉴定出产生所需的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序亚克隆出克隆，并通过标准方法培养(例如参见Goding的《MonoclonalAntibodies:Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)》的第59-103页(Academic Press，1986))。用于此目的适当培养基例如包括D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以在动物体内作为腹水瘤生长杂交瘤细胞。通过常规的免疫球蛋白纯化程序(例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当地分离出来。

使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至对单克隆抗体的重链和轻链编码的基因的寡核苷酸探针)很容易分离对单克隆抗体编码的DNA并对其测序。替代地，可以从mRNA制备cDNA，然后对cDNA进行DNA测序。杂交瘤细胞是用于制备cDNA的这种基因组DNA或RNA的优选来源。在分离后，可以将DNA置于本领域中公知的表达载体中，然后将其转染到在其它情况下不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。

VI.人源化和氨基酸变体

例如，在美国专利号5861155、6479284、6407213、6639055、6500931、5530101、5585089、5693761、5693762、6180370、5714350、6350861、5777085、5834597、5882644、5932448、6013256、6129914、6210671、6329511、5225539、6548640和5624821中说明了抗体人源化的一般方法。在某些实施方案中，可能需要产生这些人源化抗体的氨基酸序列变体，尤其是在这些变体提高抗体的结合亲和力或其它生物学特性(例如半衰期)的情况下。

在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体，即，在保留非人抗体的反应性的同时在人类中免疫原性较低的抗体。例如，这可以通过保留非人CDR区并将抗体的剩余部分替换为人对应物来实现。例如，参见Morrison等人在1984年第81期《PNAS USA(美国国家科学院院刊)》的第6851-6855页上发表的论文；Morrison和Oi在1988年第44期《Adv.Immunol.(免疫学进展)》杂志的第65-92页上发表的论文；Verhoeyen等人在1988年第239期《Science(科学)》杂志的第1534-1536页上发表的论文；Padlan在1991年第28期《Molec.Immun.(分子免疫学)》杂志的第489-498页上发表的论文；Padlan在1994年第31(3)期《Molec.Immun.(分子免疫学)》杂志的第169-217页上发表的论文。人源化抗体的技术在本领域中是公知的，并且在下列文献中有所说明：美国专利号4,816,567、5,530,101、5,859,205、5,585,089、5,693,761、5,693,762、5,777,085、6,180,370、6,210,671和6,329,511；WO

87/02671；第EP专利号0173494；Jones等人在1986年第321期

《Nature(自然)》杂志的第522页上发表的论文；以及Verhoeyen等人在1988年第239期《Science(科学)》杂志的第1534页上发表的论文。人源化抗体例如在Winter和Milstein在1991年第349期《Nature(自然)》杂志的第293页上发表的论文中有进一步说明。例如，包含用于编码人源化免疫球蛋白框架区的第一序列和用于编码所需的免疫球蛋白互补决定区的第二序列组的多核苷酸可以通过合成方式或通过组合适当的cDNA和基因组DNA片段来产生。人恒定区DNA序列可以按照公知的程序从各种人细胞中分离出来。用于产生本公开的免疫球蛋白的CDR可以类似地从能够特异性结合至CD28的单克隆抗体衍生。

抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的核苷酸改变引入抗体DNA中或通过肽合成来制备。这样的变化例如包括在本文的实施例的抗体的氨基酸序列中进行残基删除、和/或插入和/或取代。可以进行删除、插入和取代的任何组合来获得最终构建体，只要最终构建体具有所需的特征。氨基酸改变也可以改变人源化或变体抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。

一种鉴定抗体的某些作为诱变的优选位置的残基或区域的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在1989年第244期《Science(科学)》杂志的第1081-1085页上所述。在此，鉴定一个残基或一组目标残基(例如带电荷的残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选是Ala或聚Ala)取代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在取代位点或针对取代位点引入另一些或其它变体来对那些对取代表现出功能敏感性的氨基酸位点进行精制。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析给定位点处的突变的性能，在目标密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选表达的抗体变体的所需活性。氨基酸序列插入包括长度从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括N端甲硫氨酰残基或与表位标签融合的抗体。其它插入变体包括增加抗体血清的半衰期的酶或多肽与抗体的N端或C端的融合。

另一种类型的变体是氨基酸取代变体。在这些变体中，从抗体分子中移除了至少一个氨基酸残基，并在其位置插入不同的残基。取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑了FR改变。保守取代是优选的，但是可以引入更实质性的改变，并且可以对产物进行筛选。下面列出了取代的实例：

丙氨酸(Ala)(A)：缬氨酸(Val)；亮氨酸(Leu)；异亮氨酸(Ile)；缬氨酸(Val)

精氨酸(Arg)(R)：赖氨酸(Lys)；谷氨酰胺(Gln)；天冬酰胺(Asn)；赖氨酸(Lys)

天冬酰胺(Asn)(N)：谷氨酰胺(Gln)；组氨酸(His)；天冬氨酸(Asp),赖氨酸(Lys)；谷氨酰胺(Gln)；精氨酸(Arg)

天冬氨酸(Asp)(D)：谷氨酸(Glu)；天冬酰胺(Asn)

半胱氨酸(Cys)(C)：丝氨酸(Ser)；丙氨酸(Ala)

谷氨酰胺(Gln)(Q)：天冬酰胺(Asn)；谷氨酸(Glu)

谷氨酸(Glu)(E)：天冬氨酸(Asp)；谷氨酰胺(Gln)

甘氨酸(Gly)(G)：丙氨酸(Ala)

组氨酸(His)(H)：天冬酰胺(Asn)；谷氨酰胺(Gln)；赖氨酸(Lys)；精氨酸(Arg)

异亮氨酸(Ile)(I)：亮氨酸(Leu)；缬氨酸(Val)；蛋氨酸(Met)；丙氨酸(Ala)；亮氨酸(Leu)；苯丙氨酸(Phe)；正亮氨酸(Norleucine)

亮氨酸(Leu)(L)：正亮氨酸(Norleucine)；异亮氨酸(Ile)；缬氨酸(Val)；异亮氨酸(Ile)；蛋氨酸(Met)；丙氨酸(Ala)；苯丙氨酸(Phe)

赖氨酸(Lys)(K)：精氨酸(Arg)；谷氨酰胺(Gln)；天冬酰胺(Asn)

蛋氨酸(Met)(M)：亮氨酸(Leu)；苯丙氨酸(Phe)；异亮氨酸(Ile)

苯丙氨酸(Phe)(F)：亮氨酸(Leu)；缬氨酸(Val)；异亮氨酸(Ile)；丙氨酸(Ala)；酪氨酸(Tyr)

脯氨酸(Pro)(P)：丙氨酸(Ala)

丝氨酸(Ser)(S)：苏氨酸(Thr)

苏氨酸(Thr)(T)：丝氨酸(Ser)

色氨酸(Trp)(W)：酪氨酸(Tyr)；苯丙氨酸(Phe)

酪氨酸(Tyr)(Y)：色氨酸(Trp)；苯丙氨酸(Phe)；苏氨酸(Thr)；丝氨酸(Ser)

缬氨酸(Val)(V)：异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；丙氨酸(Ala)；正亮氨酸(Norleucine)

抗体的生物学特性的实质性修饰是通过选择在保持(a)取代区域中的多肽主链结构(例如折叠或螺旋构象)、(b)目标位点的分子的电荷或疏水性、或(c)大部分侧链的效果方面显著不同的取代来实现的。根据共同的侧链特性，天然存在的残基被分为几组：

(1)疏水性：正亮氨酸(Norleucine)、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)；

(2)中性亲水：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；

(3)酸性：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；

(4)碱性：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；

(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；和

(6)芳香族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)。

非保守取代是通过将上述类别之一的某个成员替换为另一个类别来进行的。

任何不参与保持抗体的正确构象的半胱氨酸残基也可以被取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。反过来说，可以向抗体添加半胱氨酸键以提高其稳定性，尤其是当抗体是抗原结合片段(例如Fv片段)时。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或更多个高变区残基。一般来说，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。产生这种取代变体的一种方便的方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体可以以单价形式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与封装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合体。然后如本文所公开地筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。替代或附加地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文详述的技术，这样的接触残基和邻近残基是取代的候选物。在产生这样的变体后，如本文所述地对该组变体进行筛选，并且可以选择在一种或更多种相关试验中具有优异特性的抗体用于进一步开发。

抗体的另一种类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。改变指删除在抗体中存在的一个或更多个碳水化合物部分，和/或添加一个或更多个在抗体中不存在的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N连接的和/或O连接的。N连接指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促附接的最常见识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列中的任何一个都会产生潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。向抗体添加糖基化位点可以通过改变氨基酸序列使得其包含上述三肽序列中的一个或更多个来实现(对于N连接的糖基化位点)。这种改变也可以通过在原始抗体的序列中添加或取代一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(对于O连接的糖基化位点)。

VII.其它修饰

考虑了抗体或其抗原结合片段的其它修饰。例如，本文中的技术还涉及包含本文所述的抗体的免疫缀合物，该抗体与诸如毒素等细胞毒性剂(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(例如放射性缀合物)或细胞毒性药物缀合。这样的缀合物有时被称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。可以使用多种双官能蛋白质缀合剂来制备缀合物，该缀合剂例如是N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双-(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

在一些实施方案中，可以将本文公开的任何抗体或其抗原结合片段配制成免疫脂质体。包含抗体的脂质体通过本领域中已知的方法制备，例如Epstein等人在1985年第82期《Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)》的第3688页上发表的论文；Hwang等人在1980年第77期《Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)》的第4030页上发表的论文；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述的方法。在美国专利号5,013,556中公开了具有增强循环时间的脂质体。脂质体例如可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。通过规定孔径的过滤器挤出脂质体，以得到具有所需直径的脂质体。本文提供的抗体的Fab'片段可以如Martin等人在1982年第257期《J.Biol.Chem.(生物化学杂志)》的第286-288页上所述地通过二硫键交换反应缀合至脂质体。脂质体中可选地包含另一种活性成分。

酶或其它多肽可以通过本领域中公知的技术共价结合至抗体，例如使用上述异双功能交联剂结合。在一些实施方案中，可以使用本领域中公知的重组DNA技术构造至少包含本文提供的抗体的连接至酶的至少一个功能活性部分的抗原结合区的融合蛋白(例如参见Neuberger等人在1984年第312期《Nature(自然)》杂志的第604-608页上发表的论文)。

在某些实施方案中，可能需要使用抗原结合片段而不是完整抗体来提高对标靶组织和细胞等的渗透。在这种情况下，可能需要修饰抗原结合片段以增加其血清半衰期。例如，这可以通过将挽救受体结合表位结合到抗原结合片段中来实现(例如通过抗原结合片段中的适当区域的突变来实现，或者通过将表位结合到肽标签中来实现，该肽标签然后在末端或中间融合至抗原结合片段(例如通过DNA或肽合成)；例如参见于1996年10月17日公布的WO96/32478)。

在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原片段中的任何一种与寡核苷酸缀合或杂交。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含样品条形码序列、引物的结合位点和锚定结构。在一些实施方案中，所述寡核苷酸能够与本文公开的任何可检测的标志物或标记缀合或杂交。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是聚合序列。在一些实施方案中，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用，指长度为大约2至大约500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸中的任何一种可以是合成的，酶促制备的(例如通过聚合)，或使用“分裂池”法制备的。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸中的任何一种可以包括核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(即，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸中的任何一种可以包括寡核苷酸中的脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的组合(例如脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度可以是4至10、11至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、81至100、101至150、151至200、201至250、251至300、301至350、351至400、或401至500个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸中的任何一种可以包含一个或更多个附接(例如共价或非共价附接)至另一个结构的功能部分。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸中的任何一种可以包含一个或更多个可检测的标记(例如放射性同位素或荧光团)。

在一些实施方案中，所述锚定结构是限定的聚合物，例如多核苷酸或寡核苷酸序列，该多核苷酸或寡核苷酸序列被设计成与互补的寡核苷酸序列杂交。在一些实施方案中，所述锚定结构被设计成用于产生双链构建体寡核苷酸序列的目的。在一些实施方案中，所述锚定结构位于构建体寡核苷酸序列的3’端。在其它实施方案中，所述锚定结构位于构建体寡核苷酸序列的5’端。每个锚定结构对于其预定的互补序列是特异性的。

在一些实施方案中，所述样品条形码序列是聚合物，例如多核苷酸，当该样品条形码序列是功能元件时，它对于单个配体是特异性的。在一些实施方案中，所述样品条形码序列可用于标识特定细胞或底物，例如Drop-seq微珠。在一些实施方案中，所述样品条形码序列可以由DNA、RNA、经修饰的碱基或这些碱基的组合的限定序列以及上文限定的任何其它聚合物形成。在一些实施方案中，所述样品条形码序列的长度是大约2至4个单体成分，例如核苷酸碱基。在其它实施方案中，所述条形码的长度是至少大约1至100个单体成分，例如核苷酸。因此，在各种实施方案中，所述条形码由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、80、91、92、93、94、95、96、97、98、99或最多100个单体成分(例如核酸)的序列形成。在一些实施方案中，所述样品条形码序列可以是相对于其它条形码来说独特的特定条形码。

在一些实施方案中，所述样品条形码序列可以具有多种不同的格式。例如，样品条形码序列可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。样品条形码序列可以以可逆或不可逆的方式附接至分析物或另一部分或结构。在样品测序之前或期间，可以将样品条形码序列添加至脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等样品的片段。样品条形码序列能够允许识别和/或量化各个测序读数(例如，条形码可以是或可以包含独特的分子标识符或“UMI”)。

样品条形码序列例如能够以单细胞分辨率对在生物样品中发现的分子成分进行空间解析(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方案中，条形码包括UMI和空间条形码。在一些实施方案中，条形码包含两个或更多个子条形码，这些子条形码一起用作单个条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或更多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如子条形码)。

在一些实施方案中，引物的结合位点是寡核苷酸的功能成分，该功能成分本身是为寡核苷酸的扩增提供退火位点的寡核苷酸或多核苷酸序列。引物的结合位点可以由DNA、RNA、PNA、经修饰的碱基或这些碱基的组合的聚合物或聚酰胺等形成。在一些实施方案中，引物的结合位点的长度是大约10个这样的单体成分，例如核苷酸碱基。在其它实施方案中，引物的结合位点的长度是至少大约5至100个单体成分，例如核苷酸。因此，在各种实施方案中，引物的结合位点由至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、80、91、92、93、94、95、96、97、98、99或最多100个单体成分(例如核酸)的序列形成。在某些实施方案中，引物的结合位点可以是适合作为多种扩增技术的退火位点的通用序列。扩增技术包括但不限于基于DNA聚合酶的扩增系统(例如聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、环介导的等温扩增(LAMP、MALBAC)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和通过任何数量的DNA聚合酶(例如T4DNA聚合酶、Sulfulobus DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Bst聚合酶、Phi29聚合酶)进行的聚合)、以及基于RNA聚合酶的扩增系统(例如T7-、T3-和SP6-RNA-聚合酶扩增)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)、滚环扩增(RCA)、连接酶链式反应(LCR)、解旋酶依赖性扩增(I)、分枝扩增法和RNA-seq)。用于缀合或杂交寡核苷酸的方法可以按照在WO/2018/144813、WO/2016/018960、WO/2018/089438、WO/2014/182528、WO/2018/026873、WO/2021/188838中所述的方式进行。

在一些实施方案中，可以可选地将修饰引入到抗体中(例如在多肽链内或在N端或C端)，例如以延长体内半衰期，例如聚乙二醇化或结合长链聚乙二醇聚合物(PEG)。PEG或PEG长链聚合物的引入增大多肽的有效分子量，例如以防止快速过滤到尿液中。在一些实施方案中，序列中的赖氨酸残基直接地或通过接头缀合至PEG。这样的接头例如可以是包含用于连接至经适当修饰的PEG链的硫醇官能团的Glu残基或酰基残基。引入PEG链的一种替代方法是首先在C端或暴露于溶剂的残基处引入Cys残基，例如Arg或Lys残基的替代。然后，该Cys残基位点特异性地附接至PEG链，该PEG链例如包含马来酰亚胺官能团。用于结合PEG或PEG长链聚合物的方法在本领域中是已知的(例如在Veronese,F.M.等人在2005年第10期《Drug Disc.Today(今天的药物发现)》杂志的第1451-8页上发表的论文；Greenwald,R.B.等人在2003年第55期《Adv.Drug Deliv.Rev.(先进药物递送综述)》杂志的第217-50页上发表的论文；Roberts,M.J.等人在2002第54期《Adv.Drug Deliv.Rev.(先进药物递送综述)》杂志的第459-76页上发表的论文中所述，这些文献的内容通过引用并入本文)。

抗体的共价修饰也包括在本技术的范围之内。例如，可以通过化学合成或通过抗体的酶或化学切割来进行修饰。通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应，将其它类型的抗体的共价修饰引入分子中。在第5,534,615号美国专利中说明了多肽的共价修饰的实例，该专利的内容通过引入并入本文。抗体的共价修饰的优选类型包括将抗体连接至多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其连接方式例如在第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号美国专利中所述。

VIII.核酸、载体、宿主细胞和重组方法

本公开还提供了一种对抗体编码的分离核酸、一种包含该核酸的载体和宿主细胞，以及一种用于产生该抗体的重组技术。本文中的核酸可以包含一个或更多个子序列，每个子序列被称为多核苷酸。

本文提供了一种包含对抗体或其片段编码的核苷酸序列的核酸(例如分离核酸)。在一些实施方案中，核酸对本文提供中的抗体的免疫球蛋白重链可变结构域编码。在一些实施方案中，核酸对本文中提供的抗体的免疫球蛋白轻链可变结构域编码。在一些实施方案中，核酸对本文提供的抗体的免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域编码。在一些实施方案中，核酸包含对SEQ ID NO:43-50或51-58中的任何一个的氨基酸序列编码的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ IDNO:43-50中的任何一个所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:43中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:44中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:46中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:47中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:48中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:49中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:50中所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51-58中的任何一个中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:52中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:53中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:54中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:55中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:57中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列。

本文提供了一种对本文中提供的任何抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域编码的核苷酸序列。

在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ IDNO:43中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:44中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:45中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:46中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:47中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:48中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:49中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQID NO:50中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ IDNO:43-50中任何一个所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51-58中的任何一个所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸还包含信号序列。在一些实施方案中，所述信号序列包括SEQ ID NO:59-63或64-67中的任何一个中的氨基酸序列。

为了实现抗体的重组产生，可以将对抗体编码的核酸分离并插入到可复制的载体中，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在某些情况下，可以通过同源重组产生抗体。使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至对抗体的重链和轻链编码的基因的寡核苷酸探针)很容易分离对抗体编码的DNA并对其测序。有许多载体可用。载体成分通常包括但不限于以下物质中的一种或更多种：信号序列和复制起点、一个或更多个标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

用于在本文的载体中克隆或表达DNA的适当宿主细胞可以是原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于此目的的适当的原核生物包括真菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌(例如埃希氏杆菌(例如大肠杆菌)、肠杆菌、欧文氏菌、克雷伯杆菌、变形杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌(例如粘质沙雷氏菌)和志贺氏菌)、以及杆菌(例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌)和链霉菌)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然其它菌株(例如B型大肠杆菌、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325))也可能是适当的。这些实例是示例性的，而不是限制性的。

除了原核生物之外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)也是抗体编码载体的适当克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母在低等真核宿主微生物中是最常用的。许多其它的属、种和品系在本文中是通常可获得和有用的，例如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母宿主，例如乳酸克鲁维酵母、脆弱克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、维克拉米克鲁维酵母(ATCC 24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；亚罗酵母属(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母；瑞氏木霉(EP 244,234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母(例如西方许旺酵母)；以及丝状真菌，例如脉孢菌、青霉菌、弯颈霉菌和曲霉菌宿主(例如构巢曲霉和黑曲霉)。

用于表达抗体的适当宿主细胞也可以来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自诸如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕(丝蛾)等宿主的相应宽容昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公开可得的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且，根据本技术，这样的病毒可以用作本文中的病毒，尤其是用于草地贪夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。

用于表达抗体的适当宿主细胞还可以包括脊椎动物细胞(例如哺乳动物细胞)。脊椎动物细胞可以在培养物(组织培养物)中繁殖。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆的293细胞，用于在悬浮培养物中生长，Graham等人在1977年第36期《J.Gen Virol.(普通病毒学杂志)》的第59页上发表的论文)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人在1980年第77期《Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)》的第4216页上发表的论文)；小鼠支持细胞(TM4，Mather在1980年第23期《Biol.Reprod.(生殖生物学)》杂志的第243-251页上发表的论文)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马瑟等人在1982年第383期《Annals N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年报)》的第44-68页上发表的论文)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。

可以用上述的用于抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规营养培养基中培养，该营养培养基被适当改性，以诱导启动子，选择转化体或扩增对期望的序列编码的基因。可以在多种培养基中培养用于产生本文中提供的抗体的宿主细胞。诸如Ham'sF10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco'sModified Eagle's Medium(DMEM)(Sigma)等市售培养基适合用于培养宿主细胞。此外，在Ham等人在1979年第58期《Meth.Enz.(酶学方法)》的第44页上发表的论文、Barnes等人在1980年第102期《Anal.Biochem.(分析生物化学)》的第255页上发表的论文、美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195或美国专利再公告号30,985中说明的培养基中的任何一种可用作宿主细胞。可以根据需要为这些培养基中的任何一种补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN^TM)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能源。也可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其它必要的补充剂。培养条件(例如温度、pH等)是先前用于选择用于表达的宿主细胞的条件，并且对普通技术人员来说是显而易见的。

当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体是在细胞内产生的，那么作为第一步，去除颗粒碎片，无论是宿主细胞还是裂解的片段，例如通过离心或超滤去除。Carter等人在1992第10期《Bio/Technology(生物技术)》的第163-167页上发表的论文中说明了一种分离分泌到大肠杆菌周质空间中的抗体的方法。简而言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下将细胞糊解冻大约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。在抗体被分泌到培养基中的情况下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)对来自这样的表达系统的上清液进行浓缩。在任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂(例如PMSF)以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可以使用羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人重链的抗体(Lindmark等人在1983年第62期《J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)》的第1-13页上发表的论文)。蛋白G被推荐用于所有的小鼠同种型和人类γ3(Guss等人在1986年第5期《EMBO J.(恩博杂志)》的第1567-1575页上发表的论文)。亲和配体所附着的基质通常是琼脂糖，但是也可使用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质(例如受控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3域的情况下，Bakerbond ABX.TM树脂(美国新泽西州菲利普斯堡市的J.T.Baker)可用于纯化。根据待收集的抗体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，例如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶层析、肝素SEPHAROSE^TM层析、阴离子交换树脂或阳离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在进行任何初步纯化步骤之后，可以对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，该层析使用pH例如为大约2.5-4.5的洗脱缓冲液，并且可以在低盐浓度(例如大约0-0.25M盐)下进行。

IX.药物制剂、剂量和给药途径

本公开提供了一种抗体和相关组合物，该抗体和相关组合物例如可用于从体内消除表达CD28的病原体，以及用于鉴定和量化生物样品中的表达病原体的数量。

在一些实施方案中，可以将任何抗体或其抗原结合片段配制在可用于多种目的(包括疾病或病症的治疗)的药物组合物中。可以使用药物装置将包含一种或更多种抗体的药物组合物递送给有需要的患者，并且，根据本技术的一个实施方案，提供了一种包括这样的装置的试剂盒。这样的装置和试剂盒可以被设计用于常规给药，包括本文中的药物组合物的自助给药。

可以通过将具有期望的纯度的药剂或抗体与可选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备抗体的治疗制剂(Osol,A.编写的《Remington’s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)》第16版，(1980))，以供以冻干制剂或水溶液的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，所述疾病或病症与CD28表达相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与异常CD28表达相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与自然杀伤细胞(NK)、α/βT细胞、γ/δT细胞、CD8+T细胞、单核细胞或树突细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与自然杀伤细胞(NK)细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与α/βT细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与γ/δT细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与CD8+T细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与单核细胞相关。在一些实施方案中，所述疾病或病症与树突细胞相关。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、传染性疾病或自身免疫性病症。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是转移性黑色素瘤、实体瘤、膀胱癌、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、结肠来源的肝转移瘤、甲状腺乳头状癌、急性髓细胞白血病或无症状骨髓瘤。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是传染性疾病。在一些实施方案中，所述传染性疾病是人类免疫缺陷病毒(HIV)、慢性丙型肝炎、巨细胞病毒或汉坦病毒。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性病症。在一些实施方案中，所述自身免疫性病症是克罗恩病、多发性硬化、系统性硬化、眼肌型重症肌无力、银屑病或类风湿性关节炎。

本文中的制剂还可以包含不止一种所治疗的特定病症所必需的活性化合物，优选是具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性化合物。这样的分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。

用于体内给药的制剂通常是无菌的。例如，这可以通过无菌过滤膜过滤来实现。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括包含药剂/抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚甲基丙烯酸2-羟乙酯或聚乙烯醇)、聚丙交酯(第3,773,919号美国专利)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如Lupron(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当包封剂/抗体在体内停留很长时间时，它们可能因暴露于37℃的湿气而变性或团聚，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。根据所涉及的机制，可以为稳定化设计合理的策略。例如，如果发现团聚机制是通过硫醇-二硫键互换形成分子间S-S键，那么可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。

对于治疗应用，本文中提供的抗体以药学上可接受的剂型(例如上文中论述的那些剂型)施用于哺乳动物(例如人)，所述剂型包括可以作为弹丸注射或通过在一段时间内连续输注、或通过肌内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用于人的那些剂型。对于疾病的预防或治疗，药剂或抗体的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型(如上文所述)、疾病的严重程度和病程、施用抗体是出于预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医师的判断。可以将抗体一次性地或通过一系列治疗适当地给予患者。

根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg至大约50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体可以是对患者给药的初始候选剂量，无论是通过一次或多次独立给药还是通过连续输注进行。根据上述因素，典型的日剂量或周剂量可在大约1μg/kg至大约20mg/kg或更多的范围内。对于数天或更长时间的重复给药，根据病情重复治疗，直到出现期望的疾病症状抑制。但是，其它剂量方案也可能是有用的。这种治疗的进展很容易通过常规技术和试验来监测，包括放射成像等。可以使用利用抗体来确定体液或组织中的CD28水平的检测方法，以优化患者对治疗性抗体的暴露。

在一些实施方案中，包含本文中的抗体的组合物可以作为单一疗法施用，而在一些实施方案中，包含该抗体的组合物可以作为联合疗法的一部分施用。在一些情况下，通过连续施用抗体或与对这些目的有效的另一种药物(例如用于治疗癌症或微生物感染的化疗药物)组合施用抗体，能够提高抗体在预防或治疗疾病中的有效性。在其它情况下，抗体可以用于增强或敏化细胞对化疗的治疗，从而允许以较低剂量产生疗效，并且毒性较低。除了施用包含减少表达细胞数量的抗体的组合物之外，某些联合疗法还包括执行第二治疗方案，该第二治疗方案选自由化学治疗剂、放射治疗、手术以及它们的任何组合所组成的组。这样的其它药剂可以存在于给药的组合物中，或者可以分开给药。此外，可以适当地连续施用抗体，或与其它药剂或疗法结合施用抗体，所述其它药剂或疗法例如是用于治疗癌症、感染等的化疗药物或放射疗法、或免疫抑制药物。

X.研究和诊断

本文还提供了一种包含本文所述的抗体的诊断试剂。例如，本文提供的抗体可用于从体液或组织中检测和/或纯化CD28。本文还提供了一种检测CD28的方法。例如，方法可以包括使样品(例如已知或疑似包含CD28的生物样品)与本文提供的抗体接触，并且，若样品包含CD28，则检测CD28:抗体复合物。本文还提供了一种包含本文所述的抗体的试剂和一种用于研究目的的检测方法。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够刺激T细胞。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够在共同刺激剂存在的情况下刺激T细胞。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够在共同刺激抗CD3抗体存在的情况下刺激T细胞。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够在共同刺激剂不存在的情况下刺激T细胞。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够在共同刺激抗CD3抗体不存在的情况下刺激T细胞。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种可用于刺激T细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用共同刺激剂或抗体。在一些实施方案中，所述方法包括使用抗CD3共同刺激剂或抗体。在一些实施方案中，所述方法不涉及共同刺激剂或抗体的使用。在一些实施方案中，所述方法不涉及抗CD3共同刺激剂或抗体的使用。

本文公开的抗体或抗原结合片段中的任何一种可用于检测其在特定细胞、组织或体液中的存在的诊断试验。这样的诊断方法可用于诊断过度增殖性疾病或病症等。因此，本文包括临床诊断用途以及研究用途。在一些实施方案中，抗体包含可检测的标志物或标记。在一些实施方案中，抗体缀合至可检测的标志物或标记。例如，对于研究和诊断应用，可以用可检测的部分标记抗体。有许多标记可用，这些标记通常分为以下几类：

(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可以使用由Coligen等人编写并由美国纽约的Wiley-Interscience于1991年出版的《Current Protocols inImmunology(免疫学最新方案)》第1卷和第2卷中说明的技术用放射性同位素标记抗体，并且可以使用闪烁计数来测量放射性。

(b)荧光标记，例如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红和Brilliant Violet^TM。例如，可以使用上述的《Current Protocols in Immunology(免疫学最新方案)》中公开的技术将荧光标记缀合至抗体。可以使用流式细胞仪、成像显微镜或荧光计来量化荧光。

(c)各种酶-底物标记。酶通常催化显色底物的化学变化，可以用各种技术来测量这种变化。例如，酶可以催化底物的颜色变化，可以用分光光度法测量该颜色变化。替代地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。在上文中说明了用于量化荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应被电子激发，然后可以发出能够被测量的光(例如使用化学发光计)或向荧光受体提供能量。酶标记的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。在O'Sullivan等人在美国纽约的Academic press于1981年出版的第73期《Methods in Enzym.(酶学方法)》(由J.Langone和H.Van Vunakis主编)的第147-166页上发表的“Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugatesfor use in Enzyme Immunoassay(用于酶免疫测定的酶-抗体结合物的制备方法)”中说明了使酶与抗体缀合的技术。

酶-底物组合的实例例如包括：

(i)以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；

(ii)以对硝基苯磷酸为显色底物的碱性磷酸酶(AP)；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)及显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形-β-D-半乳糖苷酶。

在某些情况下，标记与药剂或抗体间接地缀合。本领域技术人员应知晓实现这一点的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，上述三大类标记中的任何一类都可以与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，因此，标记可以以这种间接方式与抗体结合。替代地，为了实现标记与抗体的间接缀合，抗体与小半抗原(例如地高辛)缀合，并且上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。因此，能够实现标记与抗体的间接缀合。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段不需要被标记，并且其存在能够被检测，例如使用结合至抗体的被标记抗体检测。

在一些实施方案中，本文的抗体被固定在固体支持物或底物上。在一些实施方案中，本文的抗体非扩散性地固定在固体支持物上(例如，抗体不会从固体支持物上脱离)。固体支持物或底物可以是抗体能够直接或间接地附着的任何物理可分离的固体，包括但不限于由微阵列和微孔提供的表面、以及诸如球珠等颗粒(例如顺磁性珠、磁性珠、微珠、纳米珠)、微粒和纳米颗粒。固体支持物例如还可以包括芯片、柱、光纤、擦拭物、过滤器(例如平面过滤器)、一个或更多个毛细管、玻璃和改性或功能化的玻璃(例如受控多孔玻璃(CPG))、石英、云母、重氮化膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、准金属、半导体材料、量子点、有覆层的珠或颗粒、其它色谱材料、磁性颗粒；塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丁烯、聚氨酯、TEFLON^TM、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、硅土或基于硅土的材料(包括硅、硅胶和改性硅)、 碳、金属(例如钢、金、银、铝、硅和铜)、无机玻璃、导电聚合物(包括聚吡咯和聚吲哚的聚合物等)；微米或纳米结构表面，例如核酸平铺阵列、纳米管、纳米线或纳米颗粒修饰的表面；或多孔表面或凝胶，例如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或其它纤维或多股聚合物。在一些实施方案中，可以用任何数量的材料(包括聚合物，例如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖)使用被动或化学衍生的涂层涂覆所述固体支持物或底物。珠和/或颗粒可以是自由的或彼此连接的(例如烧结的)。在一些实施方案中，固体支持物或底物可以是颗粒的集合。在一些实施方案中，颗粒可以包含硅土，并且硅土可以包括二氧化硅。在一些实施方案中，硅土可以是多孔的，在一些实施方案中，硅土可以是无孔的。在一些实施方案中，颗粒还包含为颗粒赋予顺磁性的药剂。在某些实施方案中，药剂包括金属，并且，在一些实施方案中，药剂是金属氧化物(例如铁或铁氧化物，其中铁氧化物包含Fe²⁺和Fe³⁺的混合物)。抗体可以通过共价键或非共价相互作用连接至固体支持物，并且可以直接地或间接地(例如通过中间药剂，例如间隔分子或生物素)连接至固体支持物。

本文提供的抗体及其抗原结合片段可用于任何已知的测定方法，例如流式细胞术、免疫组织化学法、免疫荧光法、质谱细胞术(例如Cytof仪器)、竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定(Zola的《Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques(单克隆抗体：技术手册)》的第147-158页(CRC Press,Inc.，1987年)。流式细胞术和质谱细胞术测定通常涉及使用单种一抗来特异性地识别在各个细胞的分散悬浮液表面上表达的标靶分子的存在。分散的细胞通常是从生物流体样品(例如血液)获得的，但也可以从由固体组织样品(例如脾或肿瘤活检组织)制备的单细胞分散体获得。一抗可以直接与可检测的部分缀合，该可检测的部分例如是荧光团(例如用于流式细胞术的藻红蛋白)或用于质谱细胞术的重金属螯合物。替代地，一抗可以是未标记的或用不可检测的标签(例如生物素)标记的，然后一抗被可检测地标记的二抗检测，该二抗特异性地识别一抗本身或一抗上的标签。然后在能够进行单细胞检测的仪器(例如流式细胞仪、质量细胞仪、荧光显微镜或亮视野光显微镜)中分析标记的细胞，以识别分散群体或组织样品中的表达被一抗识别的目标的各个细胞。流式细胞术原理的技术基础和实际应用的详细说明例如可以在由Shapiro编写并由Wiley于2003年出版的《Practical Flow Cytometry(实用流式细胞术)》第4版中找到。

夹心测定涉及使用两种抗体，每种抗体能够结合至被检测的蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，测试样品分析物被固定在固体支持物上的第一抗体结合，然后第二抗体结合至分析物，从而形成不溶的三部分复合物。例如，参见第4,376,110号美国专利。第二抗体本身可以用可检测的部分标记(直接夹心测定)，或者可以使用用可检测的部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种夹心测定是ELISA测定，在这种情况下，可检测的部分是酶。在细胞ELISA中，可以使用首先附着于支持物并识别不同细胞表面蛋白的抗体将标靶细胞群附着于固体支持物。这些第一抗体将细胞捕获到支持物上。然后，通过向捕获的细胞中添加本文所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段中的任何一种，并检测附着于细胞的抗CD28抗体或其抗原结合片段的量，能够检测细胞表面上的CD28。在某些情况下，可以使用固定的和渗透化的细胞，在这种情况下，可以检测表面CD28和细胞内CD28。

在一些实施方案中，配制本文提供的任何抗体或其抗原结合片段，用于免疫组织化学分析。在一些实施方案中，免疫组织化学分析包括使用样品。在一些实施方案中，免疫组织化学分析包括使用血液和/或组织样品。在一些实施方案中，所述样品可以是新鲜或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并用防腐剂(例如福尔马林)固定。在一些实施方案中，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品。在一些实施方案中，所述FFPE样品被用福尔马林(即，甲醛)饱和然后包埋在一块石蜡中。在一些实施方案中，所述FFPE样品在室温下是稳定的。在一些实施方案中，所述FFPE样品中的所有结构都受到保护。在一些实施方案中，所述FFPE样品中的细胞内和表面蛋白质受到保护。在一些实施方案中，所述FFPE样品中的mRNA受到保护。在一些实施方案中，所述FFPE样品中的mRNA、细胞内和表面蛋白受到保护。在一些实施方案中，所述FFPE样品中的表面蛋白发生了变性。

在一些实施方案中，本文提供的抗CD28抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测福尔马林固定的石蜡包埋样品中的CD28。在一些实施方案中，本文提供的抗CD28抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测福尔马林固定的石蜡包埋样品中的表面上的CD28。在一些实施方案中，本文提供的抗CD28抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测福尔马林固定的石蜡包埋样品中的细胞内的CD28。在一些实施方案中，本文提供的抗CD28抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测福尔马林固定的石蜡包埋样品中的细胞内的CD28和表面上的CD28。

在一些实施方案中，所述样品是已经冷冻的新鲜样品。在一些实施方案中，所述样品是已经低温冷冻的新鲜样品。在一些实施方案中，所述样品被速冻。在一些实施方案中，所述样品被速冻并在80℃储存。在一些实施方案中，所述速冻样品中的所有结构都受到保护。在一些实施方案中，所述速冻样品中的细胞内和表面蛋白质受到保护。在一些实施方案中，所述速冻样品中的mRNA受到保护。在一些实施方案中，所述速冻样品中的mRNA、细胞内和表面蛋白质受到保护。在一些实施方案中，所述速冻样品中的表面蛋白质发生了变性。

在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测冷冻样品中的CD28。在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测冷冻样品的表面上的CD28。在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测冷冻样品中的细胞内的CD28。在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段中的任何一种能够检测冷冻样品的细胞内的CD28和表面上的CD28。

本文中的抗体也可用于体内诊断实验。通常，所述抗体被用放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记，从而能够用免疫闪烁照相术定位结合的标靶分子。

XI.CD28的检测

本文提供了一种用于检测CD28的抗体和方法。在一些实施方案中，提供了一种用于检测生物样品中的CD28的抗体和方法。在一些实施方案中，在细胞表面上检测CD28。在一些实施方案中，在细胞内检测CD28。在一些实施方案中，CD28的检测是在体外进行的。在一些实施方案中，CD28的检测是在体内进行的。

在一些实施方案中，所述生物样品是固体组织、流体或细胞。所述固体组织可以包括来自脂肪组织、膀胱、骨、脑、乳房、子宫颈、内皮、胆囊、肾、肝、肺、淋巴、卵巢、前列腺、唾液腺、胃、睾丸、甲状腺、尿道、子宫、阴道和外阴中的一种或更多种的固体组织。在一些实施方案中，所述流体包括羊水、胆汁、血液、母乳、乳房液、脑脊液、灌洗液、淋巴液、粘液、血浆、唾液、精液、血清、脊髓液、痰、眼泪、脐带血、尿和阴道液中的一种或更多种。

在一些实施方案中，所述样品包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述样品包含免疫细胞的异质群体。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自B细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)、淋巴细胞、白细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样树突细胞(mDC)、先天淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和外周血单核细胞(PBMC)。

在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段中的任何一种可用于通过基因表达水平和细胞蛋白质的测量来表征单细胞。在适合于与本文所述的抗体或其抗原结合片段整合的此类已知单细胞测序平台中，有Drop-seq方法，包括但不限于微流控方法、基于平板或微孔的方法、Seq-Well^TM方法和基本方案的改编、以及InDrop^TM方法。在另一个实施方案中，适和于与本文所述的抗体或其抗原结合片段整合的单细胞测序平台是运行在Chromium控制器或专用的Chromium单细胞控制器上的l0x基因组单细胞3’方案或单细胞V(D)J方案。其它适当的测序方法包括Wafergen iCell8^TM方法、Microwell-seq方法、Fluidigm CI^TM方法和等效的单细胞产品。可用于本文所述的抗体或其抗原结合片段的其它已知测序方案包括BD Resolve^TM单细胞分析平台和ddSeq(来自Illumina Inc.和Bio-RadLaboratories,Inc.的用于ddSEQ^TM系统的SureCell^TMWTA 3'文库制备套件，2017，公告号1070-2016-014-B)。在另一个实施方案中，本文说明的抗体或其抗原结合片段可与基于组合索引的方法(sci-RNA-seq^TM方法或SPLiT-seq^TM方法)和空间转录组学或同等的空间分辨测序方法结合使用。本文所述的方法和组合物也可以用作基于标准指数分选(FACS)和mRNA测序的方法的附加信息层。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段中的任何一种可用于检测本文所述的各种核酸、蛋白质、靶标、寡核苷酸、扩增产物和条形码的存在、不存在或数量。

在一些实施方案中，所述生物样品来自健康受试者。在一些实施方案中，所述样品来自患有疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，所述CD28的检测指示存在或不存在疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、炎症性疾病、神经性病症或感染。在一些实施方案中，所述癌症是急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、卵巢癌、妇科癌、肝癌、胶质母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌和黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述疾病或病症与CD28表达相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与异常CD28表达相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与自然杀伤细胞(NK)、α/βT细胞、γ/δT细胞、CD8+T细胞、单核细胞或树突细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与自然杀伤细胞(NK)细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与α/βT细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与γ/δT细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与CD8+T细胞相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症与单核细胞相关。在一些实施方案中，所述疾病或病症与树突细胞相关。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自非病毒性癌症、病毒相关性癌症、与HBV感染相关的癌症、与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染相关的癌症、与多瘤病毒感染相关的癌症、麻风性结节性红斑(ENL)、自身免疫性疾病、自身免疫性炎症、自身免疫性甲状腺疾病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、何杰金氏病、急性髓细胞性白血病、急性粒单核细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞大细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、急性白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、B细胞白血病、骨髓增生异常综合征、固相癌症、疱疹病毒感染和/或移植组织或器官的排斥。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是转移性黑色素瘤、实体瘤、膀胱癌、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、结肠来源的肝转移瘤、甲状腺乳头状癌、急性髓细胞白血病或无症状骨髓瘤。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是传染性疾病。在一些实施方案中，所述传染性疾病是人类免疫缺陷病毒(HIV)、慢性丙型肝炎、巨细胞病毒或汉坦病毒。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性病症。在一些实施方案中，所述自身免疫性病症是克罗恩病、多发性硬化、系统性硬化、眼肌型重症肌无力、银屑病或类风湿性关节炎。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至CD28表达细胞，并活化T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞活化包括通过TCR诱导的第一信号和通过CD28与B7-1(也称为CD80)或B7-2(也称为CD86)的结合诱导的第二信号。在一些实施方案中，所述T细胞活化不包括通过TCR诱导的第一信号。在一些实施方案中，所述结合至表达CD28的细胞的抗体或其抗原结合片段增强细胞因子的产生。在一些实施方案中，所述结合至表达CD28的细胞的抗体或其抗原结合片段引发细胞分化成记忆表型。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种可用于产生包含寡核苷酸序列或其互补序列的全部或一部分的核酸分子。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可用于将CD28的存在或丰度与组织样品的感兴趣位置相关联的方法。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段中的任何一种可用于构建蛋白文库。在一些实施方案中，所述蛋白文库的构建包括测序。在一些实施方案中，所述蛋白文库的构建包括使用流式细胞术。

在一些实施方案中，本文提供了一种检测CD28的方法，该方法包括：a)在使抗体或其抗原结合片段结合至样品上的CD28受体的条件下，使所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，其中所述结合产生受体/抗体或其抗原结合片段的复合物；b)检测所述受体/抗体或其抗原结合片段的复合物的存在；c)其中所述检测包括在所述样品上存在或不存在所述CD28受体。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防受试者体内的与CD28相关联的疾病或病症的方法，该方法包括：a)使已知或疑似包含CD28的样品与抗体或其抗原结合片段接触，b)检测包含CD28和所述抗体或其抗原结合片段的复合物的存在；其中所述复合物的存在表明疾病或病症的存在；以及c)向受试者施用所述抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本文提供了一种诊断疾病或病症的方法，该方法包括：a)从受试者中分离样品，b)将样品与抗体或其抗原结合片段一起孵育足以产生CD28:抗CD28复合物的时间；c)检测来自分离组织的CD28:抗CD28复合物存在或不存在，以及d)将CD28的存在或丰度与组织样品的感兴趣位置相关联。

在一些实施方案中，CD28在组织样品的感兴趣位置提高到超过对照水平指示受试者体内有疾病或病症。

在一些实施方案中，所述检测包括可检测的部分与抗体或其抗原结合片段的杂交。在一些实施方案中，所述样品与第二抗体接触。在一些实施方案中，所述第二抗体是包含可检测的部分的抗体。在一些实施方案中，所述可检测的部分包含寡核苷酸。在一些实施方案中，所述可检测的部分包含荧光标记。在一些实施方案中，所述测量包括测序。在一些实施方案中，所述可检测的部分包含免疫荧光。在一些实施方案中，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋样品。在一些实施方案中，所述样品包括细胞。在一些实施方案中，所述样品包括组织样品。

XII.试剂盒

在一些实施方案中，本文中的抗体或其抗原结合片段中的任何一种可以以试剂盒的形式提供，例如，预定量的试剂与使用说明(例如用于进行诊断试验的说明；用于进行实验室试验的说明)的包装组合。在一些实施方案中，所述试剂盒是被配置成检测样品(例如生物样品)的诊断试剂盒。在抗体被荧光团标记的情况下，所述试剂盒可以包含相同的同型阴性对照无关抗体，以控制抗体的非特异性结合。在抗体被酶标记的情况下，所述试剂盒可以包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。可以包含另外的添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以在很大范围内变化，以实现试剂在溶液中的浓度，从而充分优化试验的灵敏度。在某些情况下，试剂可以作为干粉(例如冻干粉末)提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

XIII.示例性实施方案

1.一种结合CD28或其部分的分离抗体或其抗原结合片段，包含：

a)免疫球蛋白重链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含：

(i)重链互补决定区1(CDRH1)，该重链互补决定区1包含序列X₁YX₃X₄X₅(SEQ IDNO:68)，其中X₁是S或D；X₃是T、W、I或N；X₄是M或I；并且X₅是H、N或S；

(ii)重链互补决定区2(CDRH2)，该重链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆GX₈X₉X_{1 0}X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅KX₁₇(SEQ IDNO:69)，其中X₁是Y、N、W或I；X₂是I或F；X₃是D、Y或S；X₄是P或N；X₅是G或Y；X₆是S、Y或G；X₈是Y、R、S、A或T；X₉是S、T或I；X₁₀是E、I、N、T或Y；X₁₁是F或Y；X₁₂是N、D或P；X₁₃是H、E、Q或D；X₁₄是K、R或T；X₁₅是F或V；并且X₁₇是D、S或G；以及

(iii)重链互补决定区3(CDRH3)，该重链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀DY(SEQ ID NO:70)，其中X₁是R、S、F或H；X₂是Q、H、E、G或R；X₃是D、Y、F或P；X₄是N、G、R、Y或T；X₅是S、G或D；X₆是G、S或没有氨基酸；X₇是Y、F或没有氨基酸；X₈是D或没有氨基酸；X₉是S、A或V；并且X₁₀是F、M或L；和

b)免疫球蛋白轻链可变结构域，该免疫球蛋白轻链可变结构域包含：

(i)轻链互补决定区1(CDRL1)，该轻链互补决定区1包含序列X₁X₂SX₄X₅X₆X₇X₈X₉X_{1 0}X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆(SEQ ID NO:71)，其中X₁是R、H或K；X₂是T、A或S；X₄是E或Q；X₅是N、S或I；X₆是I、L或V；X₇是Y、A或G；X₈是S、V、N或T；X₉是N、W、S或D；X₁₀是L、F或V；X₁₁是A、N或G；X₁₂是N或没有氨基酸；X₁₃是T或没有氨基酸；X₁₄是Y或没有氨基酸；X₁₅是L或没有氨基酸；并且X₁₆是S或没有氨基酸；

(ii)轻链互补决定区2(CDRL2)，该轻链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(SEQID NO:72)，其中X₁是A、K、G或S；X₂是A或I；X₃是T或S；X₄是N或K；X₅是L或R；X₆是A、H、F或Y；并且X₇是D、T或S；以及

(iii)轻链互补决定区3(CDRL3)，该轻链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆PX₈T(SEQ ID NO:73)，其中X₁是Q、L或H；X₂是H或Q；X₃是F、G或Y；X₄是W、Q、T或S；X₅是G、S、H或R；X₆是I、Y、T或Q；并且X₈是W、F或Y。

2.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含：包含SEQ ID NO:13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14、15、16或17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH1；包含SEQ ID NO:18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18、19、20、21或22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH2；以及包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、24、25、26或27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRH3。

3.根据实施方案1或实施方案2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含：包含SEQ ID NO:13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列的CDRH1；包含SEQ ID NO:18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列的CDRH2；以及包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27中所示的氨基酸序列的CDRH3。

4.根据实施方案1-3中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含：包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28、29、30、31或32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:33、34、35、36或37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL2；以及包含SEQ ID NO:38、39、40、41或42中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:38、39、40、41或42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的CDRL3。

5.根据实施方案1-4中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含：包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32中所示的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37中所示的氨基酸序列的CDRL2；以及包含SEQ IDNO:38、39、40、41或42中所示的氨基酸序列的CDRL3。

6.根据实施方案1-5中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:13中所示的序列、或与SEQ ID NO:13表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:18中所示的序列、或与SEQ ID NO:18表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:23中所示的序列、或与SEQ ID NO:23表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

7.根据实施方案1-6中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:13中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:18中所示的序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:23中所示的序列。

8.根据实施方案1-5中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:14中所示的序列、或与SEQ ID NO:14表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:19中所示的序列、或与SEQ ID NO:19表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:24中所示的序列、或与SEQ ID NO:24表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

9.根据实施方案1-5和实施方案8中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:14中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:19中所示的序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:24中所示的序列。

10.根据实施方案1-5中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:15中所示的序列、或与SEQ ID NO:15表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:20中所示的序列、或与SEQ ID NO:20表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:25中所示的序列、或与SEQ ID NO:25表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

11.根据实施方案1-5和实施方案10中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:15中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:20中所示的序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:25中所示的序列。

12.根据实施方案1-5中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:16中所示的序列、或与SEQ ID NO:16表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:21中所示的序列、或与SEQ ID NO:21表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:26中所示的序列、或与SEQ ID NO:26表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

13.根据实施方案1-5和实施方案12中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:16中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:21中所示的序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:26中所示的序列。

14.根据实施方案1-5中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:17中所示的序列、或与SEQ ID NO:17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:22中所示的序列、或与SEQ ID NO:22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:27中所示的序列、或与SEQ ID NO:27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

15.根据实施方案1-5和实施方案14中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:17中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:22中所示的序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:27中所示的序列。

16.根据实施方案1-15中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列、或与SEQ ID NO:28表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL2包含SEQ ID NO:33中所示的序列、或与SEQ ID NO:33表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:38中所示的序列、或与SEQ ID NO:38表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

17.根据实施方案1-16中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:33中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:38中所示的序列。

18.根据实施方案1-15中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:29中所示的序列、或与SEQ ID NO:29表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:34中所示的序列、或与SEQ ID NO:34表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:39中所示的序列、或与SEQ ID NO:39表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

19.根据实施方案1-15和实施方案18中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:29中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:34中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:39中所示的序列。

20.根据实施方案1-15中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:30中所示的序列、或与SEQ ID NO:30表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列、或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列、或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

21.根据实施方案1-15和实施方案20中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:30中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列。

22.根据实施方案1-15中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:31中所示的序列、或与SEQ ID NO:31表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:36中所示的序列、或与SEQ ID NO:36表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:41中所示的序列、或与SEQ ID NO:41表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

23.根据实施方案1-15和实施方案22中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:31中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:36中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:41中所示的序列。

24.根据实施方案1-15中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列、或与SEQ ID NO:28表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列、或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列、或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

25.根据实施方案1-15和实施方案24中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列。

26.根据实施方案1-15中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:32中所示的序列、或与SEQ ID NO:32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:37中所示的序列、或与SEQ ID NO:37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:42中所示的序列、或与SEQ ID NO:42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

27.根据实施方案1-15和实施方案26中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:32中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:37中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:42中所示的序列。

28.根据实施方案1-27中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14、15、16或17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18、19、20、21或22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、24、25、26或27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ IDNO:28、29、30、31或32中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28、29、30、31或32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL2包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33、34、35、36或37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL3包含SEQ ID NO:38、39、40、41或42中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38、39、40、41或42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

29.根据实施方案1-28中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27中所示的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32中所示的氨基酸序列；所述CDRL2包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37中所示的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ IDNO:38、39、40、41或42中所示的氨基酸序列。

30.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:13中所示的序列、或与SEQ ID NO:13表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:18中所示的序列、或与SEQ ID NO:18表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:23中所示的序列、或与SEQ ID NO:23表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列、或与SEQ ID NO:28表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:33中所示的序列、或与SEQ ID NO:33表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:38中所示的序列、或与SEQ ID NO:38表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

31.根据实施方案1-30中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:13中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:18中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:23中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:33中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:38中所示的序列。

32.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:14中所示的序列、或与SEQ ID NO:14表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:19中所示的序列、或与SEQ ID NO:19表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:24中所示的序列、或与SEQ ID NO:24表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:29中所示的序列、或与SEQ ID NO:29表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:34中所示的序列、或与SEQ ID NO:34表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:39中所示的序列、或与SEQ ID NO:39表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

33.根据实施方案1-29和实施方案32中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:14中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:119中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:24中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:29中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:34中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:39中所示的序列。

34.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:15中所示的序列、或与SEQ ID NO:15表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:20中所示的序列、或与SEQ ID NO:20表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:25中所示的序列、或与SEQ ID NO:25表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:30中所示的序列、或与SEQ ID NO:30表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列、或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列、或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

35.根据实施方案1-29和实施方案34中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:15中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:20中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:25中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:30中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列。

36.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:16中所示的序列、或与SEQ ID NO:16表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:21中所示的序列、或与SEQ ID NO:21表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:26中所示的序列、或与SEQ ID NO:26表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:30中所示的序列、或与SEQ ID NO:30表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列、或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列、或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

37.根据实施方案1-29和实施方案36中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:16中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:21中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:26中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:30中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列。

38.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:16中所示的序列、或与SEQ ID NO:16表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:21中所示的序列、或与SEQ ID NO:21表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:26中所示的序列、或与SEQ ID NO:26表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:31中所示的序列、或与SEQ ID NO:31表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:36中所示的序列、或与SEQ ID NO:36表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:41中所示的序列、或与SEQ ID NO:41表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

39.根据实施方案1-29和实施方案38中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:16中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:21中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:26中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:31中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:36中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:41中所示的序列。

40.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:15中所示的序列、或与SEQ ID NO:15表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:20中所示的序列、或与SEQ ID NO:20表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:25中所示的序列、或与SEQ ID NO:25表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列、或与SEQ ID NO:28表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列、或与SEQ ID NO:35表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列、或与SEQ ID NO:40表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

41.根据实施方案1-29和实施方案40中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:15中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:20中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:25中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:28中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:35中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:40中所示的序列。

42.根据实施方案1-29中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:17中所示的序列、或与SEQ ID NO:17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:22中所示的序列、或与SEQ ID NO:22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:27中所示的序列、或与SEQ ID NO:27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:32中所示的序列、或与SEQ ID NO:32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:37中所示的序列、或与SEQ ID NO:37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:42中所示的序列、或与SEQ ID NO:42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

43.根据实施方案1-29和实施方案42中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQ ID NO:17中所示的序列，所述CDRH2包含SEQ ID NO:22中所示的序列；所述CDRH3包含SEQ ID NO:27中所示的序列；所述CDRL1包含SEQ ID NO:32中所示的序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:37中所示的序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:42中所示的序列。

44.根据实施方案1-43中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

45.根据实施方案1-44中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个中所示的氨基酸序列。

46.根据实施方案1-45中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

47.根据实施方案1-46中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

48.根据实施方案1-45中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

49.根据实施方案1-45和实施方案48中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

50.根据实施方案1-45中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

51.根据实施方案1-45和实施方案50中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。

52.根据实施方案1-45中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

53.根据实施方案1-45和实施方案52中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

54.根据实施方案1-45中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

55.根据实施方案1-45和实施方案54中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。

56.根据实施方案1-45中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

57.根据实施方案1-45和实施方案56中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。

58.根据实施方案1-57中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

59.根据实施方案1-58中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列。

60.根据实施方案1-59中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

61.根据实施方案1-60中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

62.根据实施方案1-59中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

63.根据实施方案1-59和实施方案62中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。

64.根据实施方案1-59中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

65.根据实施方案1-59和实施方案64中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

66.根据实施方案1-59中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:10有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

67.根据实施方案1-59和实施方案66中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。

68.根据实施方案1-59中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:11有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

69.根据实施方案1-59和实施方案68中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。

70.根据实施方案1-59中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:12有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

71.根据实施方案1-59和实施方案70中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。

72.根据实施方案1-71中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

73.根据实施方案1-72中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个中所示的氨基酸序列。

74.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

75.根据实施方案1-74中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

76.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

77.根据实施方案1-73和实施方案76中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。

78.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

79.根据实施方案1-73和实施方案78中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

80.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

81.根据实施方案1-73和实施方案80中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。

82.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:10有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

83.根据实施方案1-73和实施方案82中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。

84.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:11有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

85.根据实施方案1-73和实施方案84中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。

86.根据实施方案1-73中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:12有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

87.根据实施方案1-73和实施方案86中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。

88.根据实施方案1-87中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，包含一个免疫球蛋白重链可变结构域和一个免疫球蛋白轻链可变结构域。

89.根据实施方案1-88中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域。

90.根据实施方案1-89中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是分离的。

91.根据实施方案1-90中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。

92.根据实施方案1-91中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是缀合的。

93.根据实施方案1-92中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，还包含寡核苷酸。

94.根据实施方案93所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述寡核苷酸包含样品条形码序列。

95.根据实施方案93或实施方案94所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述寡核苷酸包含用于引物的结合位点和锚定结构。

96.根据实施方案1-95中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段缀合至可检测的标志物或标记。

97.根据实施方案96所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测的标志物或标记直接缀合至所述抗原或其抗原结合片段。

98.根据实施方案96所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测的标志物或标记缀合至寡核苷酸。

99.根据实施方案96-98中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测的标志物或标记包含可检测的部分。

100.根据实施方案99所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测的部分是放射性同位素、荧光标记或酶底物标记。

101.根据实施方案1-100中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段非扩散性地固定在固体支持物上。

102.根据实施方案1-101中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是单链片段。

103.根据实施方案102所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述单链片段是单链可变片段(scFv)。

104.根据实施方案1-103中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，用于检测样品中的CD28。

105.根据实施方案1-104中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至样品中的表达CD28的细胞。

106.根据实施方案104或实施方案105所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述样品包含免疫细胞。

107.根据实施方案104-106中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述样品包含异源免疫细胞群。

108.根据实施方案106或实施方案107所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫细胞选自B细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)、淋巴细胞、白细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样树突细胞(mDC)、先天淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和外周血单核细胞(PBMC)。

109.根据实施方案104-108中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述样品包含患有疾病或病症的细胞。

110.根据实施方案109所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、炎症性疾病、神经性病症或感染。

111.根据实施方案110所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌症是急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、卵巢癌、妇科癌、肝癌、胶质母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌和黑色素瘤。

112.根据实施方案104-111中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述检测包括使用单个抗体或其抗原结合片段与CD28的一部分结合。

113.根据实施方案104-112中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述检测包括使用两种抗体或其抗原结合片段，每种抗体或其抗原结合片段能够结合至CD28的不同部分。

114.根据实施方案104-113中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD28的检测在细胞的表面上进行。

115.根据实施方案104-114中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD28的检测在细胞内进行。

116.根据实施方案104-115中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD28的检测指示存在或不存在疾病或病症。

117.根据实施方案104-116中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述检测在体外进行。

118.根据实施方案104-116中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述检测在体内进行。

119.根据实施方案1-118中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至CD28表达细胞，并活化T细胞。

120.根据实施方案119所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞活化包括通过TCR诱导的第一信号和通过CD28与B7-1(也称为CD80)或B7-2(也称为CD86)的结合诱导的第二信号。

121.根据实施方案119所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞活化不包括通过TCR诱导的第一信号。

122.根据实施方案104-121中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述结合至表达CD28的细胞的抗体或其抗原结合片段增强细胞因子的产生。

123.根据实施方案104-122中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述结合至表达CD28的细胞的抗体或其抗原结合片段引发细胞分化成记忆表型。

124.一种诊断抗体或其抗原结合片段，包括根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段。

125.一种试剂盒，包含根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案124所述的诊断抗体或其抗原结合片段。

126.根据实施方案125所述的试剂盒，包括被配置成检测生物样品中的CD28的诊断试剂盒。

127.一种组合物，包含根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂。

128.根据实施方案127所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段用作佐剂或与佐剂结合使用。

129.一种分离核酸，包含对根据实施方案1-123中的任何一个所述的药剂的免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列。

130.根据实施方案129所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:43-50中的任何一个中所示的核苷酸序列。

131.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:43中所示的核苷酸序列。

132.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:44中所示的核苷酸序列。

133.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列。

134.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:46中所示的核苷酸序列。

135.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:47中所示的核苷酸序列。

136.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:48中所示的核苷酸序列。

137.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:49中所示的核苷酸序列。

138.根据实施方案129或实施方案130所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:50中所示的核苷酸序列。

139.一种分离核酸，包含对根据实施方案1-123中的任何一个所述的药剂的免疫球蛋白轻链可变结构域编码的核苷酸序列。

140.根据实施方案139所述的分离核酸分子，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51-58中的任何一个中所示的核苷酸序列。

141.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51中所示的核苷酸序列。

142.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:52中所示的核苷酸序列。

143.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:53中所示的核苷酸序列。

144.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:54中所示的核苷酸序列。

145.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:55中所示的核苷酸序列。

146.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列。

147.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:57中所示的核苷酸序列。

148.根据实施方案139或实施方案140所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列。

149.一种分离核酸，包含根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域编码的核苷酸序列。

150.根据实施方案129-149中的任何一个所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:43-50中的任何一个所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51-58中的任何一个所述的氨基酸序列。

151.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:43中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列。

152.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:44中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。

153.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:45中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列。

154.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:46中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。

155.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:47中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列。

156.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:48中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列。

157.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:49中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列。

158.根据实施方案150所述的分离核酸，其中所述对免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列包括SEQ ID NO:50中所示的序列；并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列。

159.一种重组表达载体，包含根据实施方案129-158中的任何一个所述的分离核酸。

160.一种重组表达载体，包含第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒包含核酸分子，该核酸分子包含对根据实施方案1-123中的任何一个所述的免疫球蛋白重链可变结构域编码的核苷酸序列，并且所述第二表达盒包含核酸分子，该核酸分子包含对根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白轻链可变结构域编码的核苷酸序列。

161.一种重组表达载体，包含第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒包含核酸分子，该核酸分子包含根据实施方案123-158中的任何一个所述的核苷酸序列，并且所述第二表达盒包含核酸分子，该核酸分子包含根据实施方案123-158中的任何一个所述的核苷酸序列。

162.根据实施方案159-161中的任何一个所述的重组表达载体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒包含启动子。

163.一种用根据实施方案159-162中的任何一个所述的重组表达载体转染的宿主细胞。

164.一种药剂-药物缀合物，包含根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段。

165.一种组合物，包含根据实施方案164所述的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体。

166.一种检测CD28的方法，包括：

a)在使根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段结合至样品上的CD28受体的条件下，使所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，其中所述结合产生受体/抗体或其抗原结合片段的复合物；

b)检测所述受体/抗体或其抗原结合片段的复合物的存在；

c)其中所述检测包括在所述样品上存在或不存在所述CD28受体。

167.一种治疗或预防受试者体内的与CD28相关的疾病或病症的方法，包括：

a)使已知或疑似包含CD28的样品与根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段接触，

b)检测包含所述CD28和所述抗体或其抗原结合片段的复合物的存在；其中所述复合物的存在表明疾病或病症的存在；和

c)向受试者施用根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段。

168.一种诊断疾病或病症的方法，包括：

a)从受试者中分离样品；

b)将样品与根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段孵育足以产生CD28:抗CD28复合物的时间；

c)从分离的组织中检测存在或不存在CD28:抗CD28复合物，和

d)将CD28的存在或丰度与组织样品的感兴趣位置相关联。

169.根据实施方案168所述的方法，其中CD28在组织样品的感兴趣位置提高到超过对照水平指示受试者体内有疾病或病症。

170.根据实施方案166-169中的任何一个所述的方法，其中所述方法在体外进行。

171.根据实施方案166-169中的任何一个所述的方法，其中所述方法在体内进行。

172.根据实施方案166-171中的任何一个所述的方法，其中所述检测包括细胞内检测。

173.根据实施方案166-172中的任何一个所述的方法，其中所述检测包括在细胞表面上检测。

174.根据实施方案166-173中的任何一个所述的方法，其中所述检测包括可检测的部分与抗体或其抗原结合片段的杂交。

175.根据实施方案166-174中的任何一个所述的方法，其中所述样品与第二抗体接触。

176.根据实施方案166-175中的任何一个所述的方法，其中所述第二抗体是包含可检测的部分的抗体。

177.根据实施方案166-176中的任何一个所述的方法，其中所述可检测的部分包含寡核苷酸。

178.根据实施方案166-177中的任何一个所述的方法，其中所述可检测的部分包含荧光标记。

179.根据实施方案166-178中的任何一个所述的方法，其中所述测量包括测序。

180.根据实施方案166-179中的任何一个所述的方法，其中所述可检测的部分包含免疫荧光。

181.根据实施方案166-180中的任何一个所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋样品。

182.根据实施方案166-181中的任何一个所述的方法，其中所述样品包含细胞。

183.根据实施方案166-182中的任何一个所述的方法，其中所述样品包括组织样品。

184.根据实施方案166-183中的任何一个所述的方法，其中所述样品包含免疫细胞。

185.根据实施方案184所述的方法，其中所述免疫细胞选自B细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)、淋巴细胞、白细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样树突细胞(mDC)、先天淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和外周血单核细胞(PBMC)。

186.根据实施方案166-185中的任何一个所述的方法，其中所述样品包含与疾病或病症相关联的组织或细胞。

187.根据实施方案166-186中的任何一个所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、炎症性疾病或感染。

188.根据实施方案186或实施方案187所述的方法，其中所述疾病或病症选自非病毒性癌症、病毒相关性癌症、与HBV感染相关的癌症、与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染相关的癌症、与多瘤病毒感染相关的癌症、麻风性结节性红斑(ENL)、自身免疫性疾病、自身免疫性炎症、自身免疫性甲状腺疾病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、何杰金氏病、急性髓细胞性白血病、急性粒单核细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞大细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、急性白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、B细胞白血病、骨髓增生异常综合征、固相癌症、疱疹病毒感染和/或移植组织或器官的排斥。

189.根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，用于将CD28的存在或丰度与组织样品的感兴趣位置相关联的方法。

190.根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，用于检测组织样品中的CD28的方法。

191.根据实施方案189或实施方案190所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述方法包括产生包含寡核苷酸序列或其互补序列的全部或部分的核酸分子。

192.根据实施方案1-123中的任何一个所述的抗体或其抗原结合片段，用于构建蛋白文库。

193.根据实施方案192所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述蛋白文库的构建包括测序。

194.根据实施方案192所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述蛋白文库的构建包括使用流式细胞术。

实施例

实施例1.表达抗CD28抗体的杂交瘤的产生。

这个实施例说明使用鼠模型产生和表征分泌与CD28反应的单克隆抗体的杂交瘤。

简而言之，用CD28免疫原免疫小鼠，使用标准方案将骨髓瘤细胞与脾融合以形成杂交瘤，排出并收获淋巴结细胞。将成功的融合体选入HAT培养基中，并按微量滴定板的每个孔中大约一个细胞进行克隆，之后通过流式细胞术检测培养上清液中表达CD28的细胞转染子。通过评估染色结果图选择孔，然后传代培养到更大的容器中并进行亚克隆。使用CD28转染的细胞通过流式细胞术进一步表征杂交瘤亚克隆。使用各种方法选择和筛选表达示例性抗CD28抗体的候选克隆，包括通过使用流式细胞术对被分成不同亚群(例如淋巴细胞、单核细胞等)的人血细胞进行检测，以及对从患病和/或受感染的人细胞产生的一个或更多个细胞系进行检测。与同种型对照相比，量化每个血细胞亚群中的阳性细胞的百分比。

实施例2.示例性抗CD28抗体可变结构域的测序。

在这个实施例中说明在上述实施例1中产生的示例性抗CD28抗体的测序。

在标准哺乳动物组织培养基中培养上述实施例1中描述的抗CD28杂交瘤细胞系的细胞。使用基于RNeasy Mini Kit(Qiagen)的程序，从来自表达抗CD28单克隆抗体的各种克隆的杂交瘤细胞中分离总RNA。简而言之，使用RNA产生轻链和重链可变结构域的cDNA第一链。通过5’-RACE技术扩增轻链和重链可变结构域cDNA，通过PCR制备阳性克隆，然后进行DNA测序。

图1A和1B示出了八种不同抗体(克隆)的重链和轻链的各个可变结构域(CDR和框架区)(包括CDR1、CDR2和CDR3区)的氨基酸序列，这些抗体被命名为AB 1-8(在本文中也被称为抗体1-8和克隆1-8)。下表E1中示出了各种重链和轻链CDR序列。

实施例3.使用示例性抗CD28抗体检测表达CD28的细胞。

这个实施例描述所产生的示例性抗CD28抗体检测表达CD28的新鲜或固定细胞的能力(通过流式细胞术评估)。

A)新鲜细胞的表面染色

通过静脉穿刺获得新鲜的人外周血细胞，并在黑暗环境中将细胞与FITC标记的抗人CD3抗体(UCHT1；货号319001)和示例性的缀合至PE的抗CD28抗体一起孵育15分钟。使用市售的缀合至PE的抗CD28抗体(CA对照)作为对照。用RBC裂解缓冲液裂解细胞，洗涤，并重悬于Fluorofix溶液(含1％ PFA)中。在BD Canto II仪器上获得数据，并通过FlowJo进行分析。基于CD28和CD3染色模式对T细胞进行门控(图2A-2I)。生成每个细胞群的直方图以量化中值荧光强度(MFI)，并且使用每个示例性抗体和相应对照的MFI计算信噪比(S:N)(表E2)。

如图2A-2I所示，如通过CD28和CD3阳性细胞的数量所测量的，所有示例性的被测抗CD28抗体都能够检测表达CD28的T细胞。此外，如表E2所示，与用作对照的市售抗体相比，示例性抗体AB1-AB7表现出更高的信噪比。

除了另有说明之外，所有使用的试剂均来自BioLegend。

B)固定细胞的表面染色

在类似的实验中，通过静脉穿刺获得新鲜的人外周血细胞，用RBC裂解缓冲液处理，并用PBS洗涤。细胞不固定，或者用4％PFA固定15分钟，并用PBS洗涤以除去PFA。然后在黑暗环境中在细胞染色缓冲液中对细胞进行计数和调整，并用示例性的缀合至PE的抗CD28抗体染色30分钟。使用市售的缀合至PE的抗CD28抗体(CA对照)作为对照。在BD Canto II仪器上获得数据，并通过FlowJo进行分析。

图3A-3I中示出了用对照或示例性抗CD28抗体AB1-AB8标记的固定(顶部)和新鲜(底部)细胞的直方图叠加结果。如图3A-3I所示，染色性能不受固定的影响。此外，如表E3所示，与用作对照的市售抗体相比，示例性抗体AB1-AB7在固定的细胞和未固定的细胞中均表现出增高的信噪比。

这些结果表明了示例性抗CD28抗体以高信噪比识别和检测新鲜和固定的表达CD28的细胞的能力。

实施例4.示例性抗CD28抗体的功能活性评估。

这个实施例通过评估外周血单核细胞(PBMC)在有和没有抗CD3共同刺激的情况下的活化和扩增来说明对示例性抗CD28抗体的功能活性的评估。

为了分离人外周血单核细胞(PBMC)，将来自健康志愿者的全血收集在肝素化细胞制备管中。用2-4倍体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释血液。将稀释的血液悬浮液(35mL)小心地层铺在50mL锥形管中的15mL Lymphopure^TM上，并在无制动器的摇摆桶转子中以400×g离心30至40分钟。将单核细胞层转移到新的50mL锥形管中，与PBS混合，并以300×g离心5分钟。除去上清液，用PBS洗涤沉淀两次，并离心。将所得的沉淀重悬于荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液中。根据制造商的方案(BioLegend)，使用带有阴性选择的Mojo Sort人T细胞分离试剂盒分离总T细胞。然后用细胞内荧光标记羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞以监测细胞分裂，并如下文所述在(A)有抗CD3共同刺激或(B)没有抗CD3共同刺激的情况下进行评估。

A)有抗CD3共同刺激

在存在共同刺激T细胞抗体UCHT1(抗CD3)的情况下，评估示例性抗CD28抗体活化和扩增T细胞的能力。孵育CFSE标记的T细胞，将其接种于包被有抗CD3+同种型对照或包被有抗CD3加抗CD28的12孔板中，并孵育4天。在孵育后，在BD Canto II上获得细胞，并通过FlowJo分析相应的数据。在图4A-4J中示出了结果，在表E4中示出了结果的量化。

如图4A-4J所示，虽然单独的抗CD3(图4A)产生低速率的细胞分裂，但是所有测试的示例性抗体都能够增强T细胞分裂，其中示例性抗体AB6表现出最高的分裂指数。这些结果证明了示例性测试抗体增强与CD3相关的T细胞活化和增殖的能力。

在类似的实验中，将如上所述地分离并经过CD3+分离(MojoSort人CD3选择试剂盒)的PBMC以100万/mL的量接种于与200IU/mL重组人IL-2(791904)和5％人AB血清(Gemini)组合的IMDM培养基(Thermo Fisher)中，并与2μg/mL抗人CD3抗体(OKT3，BioLegend货号#317326)和2.5μg/mL示例性抗人CD28抗体一起孵育。使用市售克隆产物(CA对照)作为阳性对照；并且使用不存在CD28抗体作为阴性对照)。将细胞孵育3-4天，之后使用ViCell Blu系统(Beckman Coulter)对细胞进行计数，并每两至三天稀释至50万细胞/mL，持续10-11天。

在11天的过程中评估T细胞的生长和活性。如图5A所示，与阳性对照相比，示例性抗体AB1、AB2、AB3和AB6、AB7和AB8在第11天表现出T细胞增加，几乎所有示例性抗体在第11天都表现出与对照相当的活性(图5B)。数据是3个独立实验的代表数据。

这些结果表明示例性测试抗体与不同的抗CD3抗体增强T细胞共同刺激的能力。

B)没有抗CD3共同刺激

评估示例性抗CD28抗体在没有共同刺激信号(超激动活性)的情况下活化T细胞的能力。将CFSE标记的T细胞接种于包被有同种型对照或仅包被有示例性抗CD28的12孔板中。在孵育后，在BD Canto II上获得细胞，并通过FlowJo分析相应的数据。在图6A-6J中示出了结果，在表E5中示出了结果的量化。

如图6A-6J所示，虽然单独的抗-CD3(图6A)和市售抗体(图6B)不能诱导T细胞分裂，但是在没有共同刺激抗CD3抗体的情况下，示例性抗体AB2和AB8能够增强T细胞分裂。这些结果表明示例性测试抗体AB2和AB8在没有共同刺激的情况下增强与CD3相关的T细胞活化和增殖的能力。

实施例5.示例性抗CD28抗体的结合特异性的评估

这个实施例说明对产生的示例性抗CD28抗体与CD86竞争结合标靶细胞上的CD28的能力的评估。

使用标准逆转录病毒转导方案用人CD28转染Ba/F3细胞，并在黑暗环境中与或不与70μg纯化的AB1-AB8或市售对照(CA对照)一起孵育15分钟，之后添加1μg生物素化的重组CD86。在孵育15分钟并洗涤后，将细胞与PE缀合的链霉亲和素一起孵育。在BD Canto II上获得数据，并使用FlowJo软件进行分析。

图7A-7J示出了与示例性抗CD28抗体AB1-AB8预孵育的细胞(顶部)和不与抗CD28抗体预孵育的细胞(底部)的直方图叠加结果。通过将与AB1-AB8和CA对照孵育的样品的平均荧光强度(MFI)除以仅与重组CD86孵育的样品的MFI来计算结合减少百分比。从100减去该值，得到减少百分比。公式如下所示，计算结果在表E6中示出。

如图7A-7J和表E3所示，示例性抗体AB1-AB8能够与CD86竞争结合标靶细胞上的CD28。

实施例6.评估示例性抗CD28抗体对非抗CD3介导的T细胞活化标记物的活性

这个实施例说明对产生的示例性抗CD28抗体在没有抗CD3共同刺激的情况下诱导T细胞活化标志物的能力的评估。

简而言之，从新收集的外周血中分离总T细胞。在包被有抗CD3抗体+同型对照、市售抗CD28抗体(CA)、或示例性抗体AB2、或示例性抗体AB2但没有抗CD3的6孔板中对细胞进行培养。在不同的时间点收集细胞培养上清液，用于如下的分析：在培养2天后，收集细胞培养上清液；通过ELISA测定IL-2浓度(图8A)。在培养4天后，收集细胞培养上清液；通过ELISA测定IL-10浓度(图8B)。在培养的第2、4、8或14天，收集细胞并计数，并且进行流式细胞术分析，以确定CD4+FOXP3+T细胞的百分比(图8C)。

如图8A和图8B所示，示例性抗体AB2能够在没有抗CD3共同刺激的情况下分别诱导T细胞介导的IL-2和IL-10的产生。此外，如图8C所示，示例性抗体AB2能够在没有抗CD3共同刺激的情况下支持FOXP3+CD4+T细胞生长。

提供上述实施例仅是为了说明本公开，而不是限制其范围。本公开的其它变化形式对于本领域普通技术人员来说很明显，并且被所附权利要求所包含。本文中引用的所有出版物、数据库、互联网资源、专利、专利申请和登记号均通过引用整体并入本文。

序列表

Claims (30)

1.一种结合CD28或其部分的分离抗体或其抗原结合片段，包含：

a)免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含：

(i)重链互补决定区1(CDRH1)，所述重链互补决定区1包含序列X₁YX₃X₄X₅(SEQ ID NO:68)，其中X₁是S或D；X₃是T、W、I或N；X₄是M或I；并且X₅是H、N或S；

(ii)重链互补决定区2(CDRH2)，所述重链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆GX₈X₉X₁₀X_{1 1}X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅KX₁₇(SEQ ID NO:69)，其中X₁是Y、N、W或I；X₂是I或F；X₃是D、Y或S；X₄是P或N；X₅是G或Y；X₆是S、Y或G；X₈是Y、R、S、A或T；X₉是S、T或I；X₁₀是E、I、N、T或Y；X₁₁是F或Y；X₁₂是N、D或P；X₁₃是H、E、Q或D；X₁₄是K、R或T；X₁₅是F或V；并且X₁₇是D、S或G；以及

(iii)重链互补决定区3(CDRH3)，所述重链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀DY(SEQ ID NO:70)，其中X₁是R、S、F或H；X₂是Q、H、E、G或R；X₃是D、Y、F或P；X₄是N、G、R、Y或T；X₅是S、G或D；X₆是G、S或没有氨基酸；X₇是Y、F或没有氨基酸；X₈是D或没有氨基酸；X₉是S、A或V；并且X₁₀是F、M或L；和

b)免疫球蛋白轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含：

(i)轻链互补决定区1(CDRL1)，所述轻链互补决定区1包含序列X₁X₂SX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X_{1 1}X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆(SEQ ID

NO:71)，其中X₁是R、H或K；X₂是T、A或S；X₄是E或Q；X₅是N、S或I；X₆是I、L或V；X₇是Y、A或G；X₈是S、V、N或T；X₉是N、W、S或D；X₁₀是L、F或V；X₁₁是A、N或G；X₁₂是N或没有氨基酸；X₁₃是T或没有氨基酸；X₁₄是Y或没有氨基酸；X₁₅是L或没有氨基酸；并且X₁₆是S或没有氨基酸；

(ii)轻链互补决定区2(CDRL2)，所述轻链互补决定区2包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(SEQ IDNO:72)，其中X₁是A、K、G或S；X₂是A或I；X₃是T或S；X₄是N或K；X₅是L或R；X₆是A、H、F或Y；并且X₇是D、T或S；以及

(iii)轻链互补决定区3(CDRL3)，所述轻链互补决定区3包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆PX₈T(SEQID NO:73)，其中X₁是Q、L或H；X₂是H或Q；X₃是F、G或Y；X₄是W、Q、T或S；X₅是G、S、H或R；X₆是I、Y、T或Q；并且X₈是W、F或Y。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含：CDRH1，其包含SEQ ID NO:13、14、15、16或17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14、15、16或17表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRH2，其包含SEQ ID NO:18、19、20、21或22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18、19、20、21或22表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；以及CDRH3，其包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、24、25、26或27表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含：CDRL1，其包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28、29、30、31或32表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33、34、35、36或37表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；以及CDRL3，其包含SEQ ID NO:38、39、40、41或42所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38、39、40、41或42表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH1包含SEQID NO:14所示的序列、或与SEQ ID NO:14表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；所述CDRH2包含SEQ ID NO:19所示的序列、或与SEQ ID NO:19表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRH3包含SEQ ID NO:24所示的序列、或与SEQ ID NO:24表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述CDRL1包含SEQ ID NO:29所示的序列、或与SEQ ID NO:29表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，所述CDRL2包含SEQ ID NO:34所示的序列、或与SEQ ID NO:34表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；并且所述CDRL3包含SEQ ID NO:39所示的序列、或与SEQ ID NO:39表现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中的任何一个所示的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:1、2、3、4、5或6中的任何一个有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个所示的氨基酸序列、或与SEQID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包含一个或更多个人框架区。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与可检测的标志物或标记缀合。

12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测的标志物或标记包含可检测的部分。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含寡核苷酸。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段非扩散性地固定在固体支持物上。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是单链片段。

16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述单链片段是单链可变片段(scFv)。

17.一种组合物，包含根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段用作佐剂或与佐剂结合使用。

19.一种分离核酸，所述核酸包含编码根据权利要求1-16中任一项的制剂的免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列。

20.根据权利要求19所述的分离核酸，其中所述免疫球蛋白重链可变结构域包含SEQID NO:43-50中任何一个所示的核苷酸序列。

21.一种分离核酸，包含编码根据权利要求1-16中任一项的制剂的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。

22.根据权利要求21的分离核酸分子，其中所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含SEQID NO:51-58中任何一个所示的核苷酸序列。

23.一种重组表达载体，所述载体包含根据权利要求19-22中任一项所述的分离核酸。

24.一种重组表达载体，所述载体包含第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码根据权利要求1-16中任一项的免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列，并且所述第二表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的重组表达载体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒包含启动子。

26.一种用根据权利要求23-25中任一项所述的重组表达载体转染的宿主细胞。

27.一种检测CD28的方法，包括：

a)在使根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合至样品上的CD28受体的条件下，使所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，其中所述结合产生受体/抗体或其抗原结合片段的复合物；

b)检测所述受体/抗体或其抗原结合片段的复合物的存在；

c)其中所述检测包括检测在所述样品上存在或不存在所述CD28受体。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法在体外进行。

29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述检测包括细胞内检测。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述检测包括在细胞表面上检测。