CN118600106B - 用于检测caebv和im的eb病毒基因组差异甲基化基因的物质、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测待测样品基因组中EBNA‑LP 30069bp、EBNA‑3A 53968bp、A73 157064bp、BALF5 15437bp和BNRF1 2422bp位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症产品中的应用。本发明可以通过利用检测物质对上述基因位点的甲基化水平进行检测从而进行CAEBV与IM的早期鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别甲基化差异的引物组和试剂盒，具体地说是一种用于鉴别慢性活动性EB病毒感染(CAEBV)和传染性单核细胞增多症(IM)中EB病毒(EBV)差异甲基化基因的引物组、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，简称为EBV)为疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员，是一种嗜人类淋巴细胞病毒，广泛分布于世界各地，全球范围内约90％以上的健康成人携带该病毒。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染，并可长期潜伏在人体淋巴组织中。EBV感染可表现为增殖性感染和潜伏性感染。不同感染状态表达不同的抗原，增殖性感染期表达的抗原有EBV早期抗原、EBV衣壳蛋白和EBV膜抗原，潜伏感染期表达的抗原有EBV核抗原和潜伏膜蛋白。EBV与多种人类淋巴细胞性和上皮细胞性肿瘤的发生发展有关，如霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和EBV相关胃癌等，是公认的DNA肿瘤病毒。
EBV是传染性单核细胞增多症(infect ious mononucl eos i s，简称为IM)和慢性活动性EBV感染(chronic act ive EBV infect ion，简称为CAEBV)的病原体。IM是一种急性淋巴组织增生性疾病，多见于青春期初次感染EBV后发病，其临床表现为发热、咽炎、淋巴结炎、脾大、肝功能异常、外周血中单核细胞和异型淋巴细胞大量增多。CAEBV是一种EBV感染T淋巴细胞、NK细胞或B淋巴细胞所致的一种淋巴增殖性疾病。CAEBV通常发生于原发性EBV感染后，以发热、淋巴结病和脾肿大为主要特征。实验室检查可发现高拷贝数EBV-DNA和/或异常的EBV相关抗体，病理学检查可以在受损组织内检测到EBV编码的RNA和多种病毒相关蛋白，研究发现，尽早地为患者进行异基因造血干细胞移植是治愈该病的有效方法。
研究发现，表观遗传学修饰尤其是DNA甲基化修饰在EBV感染相关疾病中发挥着重要的作用。EBV感染宿主细胞后，EBV病毒基因可能通过甲基转移酶调控宿主基因DNA甲基化水平，从而参与EBV致病过程。不同EBV相关疾病中EBV基因组甲基化特征不同，因此可通过检测差异DNA甲基化基因来对相应疾病进行识别和诊断。
目前，EBV全基因组DNA甲基化的改变在慢性活动性EBV感染(CAEBV)和传染性单核细胞增多症(IM)的发生和发展中所发挥的潜在作用还尚未被研究。比较CAEBV与IM之间在EBV全基因组中差异甲基化基因，从而筛选可用于临床诊断及预后的DNA甲基化biomarker，可进一步揭示甲基化在该疾病发生发展的机制，并作为疾病早期检测和诊断的依据具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种检测待测样品EB病毒基因组中相关位点甲基化水平的物质在鉴定或辅助鉴定慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症中的新用途。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供用于检测上述相关位点的检测引物组。
为实现上述技术目的，本发明采用以下的技术方案：
检测待测样品EB病毒基因组中EBNA-LP、EBNA-3A、A73、BALF5和BNRF1位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症产品中的应用。
其中较优地，所述物质为引物组。
其中较优地，所述引物组选自由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4的引物对、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的引物对、SEQ ID No.7和SEQID No.8的引物对以及SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的引物对组成的引物组。
一种用于检测慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症的EB病毒基因组中差异甲基化基因的引物组，所述引物组用于检测甲基化位点为EB病毒基因组的EBNA-LP、EBNA-3A、A73、BALF5和BNRF1五个位点的甲基化水平。
其中较优地，所述引物组选自由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4的引物对、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的引物对、SEQ ID No.7和SEQID No.8的引物对以及SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的引物对组成的引物组。
上述引物组在检测或辅助检测慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症的EB病毒基因组中差异甲基化水平的检测试剂或检测试剂盒中的用途。
一种用于检测慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症的EB病毒基因组中差异甲基化基因的试剂盒，其中包括上述的引物组。
与现有技术相比较，本发明具有以下的技术效果：
(1)本发明经过对筛选方法的优化改进，筛选得到了稳定性强特异性显著的CAEBV和IM之间差异甲基化位点。本发明第一次提出了通过检测目的EBV基因甲基化水平来鉴别CAEBV和IM的方法。
(2)本发明提供了位于EB病毒基因组上的5个甲基化位点，由EBV感染引起的上述甲基化位点发生改变与CAEBV相关，可以通过检测上述EB病毒基因组甲基化位点的改变进行CAEBV的早期诊断。
(3)本发明提供的五个CAEBV和IM之间差异甲基化位点，该五个位点特异性佳，稳定性优异，EB病毒基因组的EBNA-LP(30069bp)、EBNA-3A(53968bp)、A73(157064bp)、BALF5(154371bp)及BNRF1(2422bp)处，可以进一步检测上述甲基化位点的改变进行CAEBV与IM的早期鉴别。
(4)本发明提供甲基化位点的检测引物，可以通过所述引物对其序列进行PCR扩增及焦磷酸测序检测，检测相应基因甲基化水平，从而进行CAEBV与IM的早期鉴别。
附图说明
图1为CAEBV及IM组EBV全基因组的甲基化水平图；
图2为CAEBV和IM病例PBMC样本的EBV DNA甲基化水平分析图；
图3为按照第一次筛选标准检测到的CAEBV与IM之间EB病毒基因组中差异甲基化基因的分析图；
图4为按照第二次筛选标准检测到的CAEBV与IM之间EB病毒基因组中差异甲基化基因的分析图；
图5A为优化后的第二次筛选标准筛选出的五个在CAEBV和IM之间存在明显甲基化差异的基因EBNA-LP、EBNA-3A、A73、BALF5及BNRF1的甲基化水平分析图；
图5B为按第一次筛选标准筛选出的五个在CAEBV和IM之间存在明显甲基化差异的基因BcRF1、EBNA1、BPLF1、LMP-2A及BSLF1的甲基化水平分析图。
图6为验证样本集中5例CAEBV患儿及5例IM患儿EBNA-LP、A73、BALF5、BNRF1及EBNA-3A基因甲基化水平。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容进行详细具体的说明。
实施例1CAEBV和IM差异甲基化位点的筛选和分析方法
1.样本来源
36例外周血单个核细胞(PBMC)样本，其中19例来自慢性活动性EBV感染患儿(CAEBV)和17例来自传染性单核细胞增多症(IM)。
2.总DNA的提取
PBMC样本DNA的提取使用磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(Ti angen)提取。检测合格后，对样本DNA进行Bi sul fi te处理(EZ DNA Methy lat i on Go l d Ki t,ZymoRes earch)，经过处理，未发生甲基化的C变成U(PCR扩增后变为T)，而甲基化的C保持不变。
3.EBV甲基化引物Pane l定制平台开发
以EBV(NC_007605.1)基因组作为EBV参考序列，完成98对BS-PCR引物设计和合成。测序完成后的数据质控及比对。
4.通过高保真耐U碱基的DNA聚合酶对Bi sul fi te处理的模版进行BSP扩增
1/20洗脱产物作为模板，使用KAPA HiFi HotStart Urac i l+ReadyMix PCR Kit(KAPA Bi o systems,Wi lmington,MA,USA)进行35次PCR扩增。
5.文库构建
对来自同一样本的BSP扩增产物进行混合，并进行标签引物扩增，带上i l lumina测序接头，最终获得每个样本带不同标签的测序文库，每个样本文库经过纯化、定量及多样本文库混合、质检后上机测序。
6.数据质控及比对(Exce l)
合格的数据是信息分析的基础，因此对测序完成后的数据进行质量控制(qual ity contro l)是数据分析的首要内容，主要包括：
(1)对下机后的数据(raw reads)产量和质量进行基本统计；
(2)使用软件Tr immomat i c-0.36去除测序接头和低质量碱基和reads，使用滑动窗口的方式，4个碱基为一个窗口，若该窗口的平均碱基质量值低于15，则从该处截去reads，参数选择：SL ID INGWINDOW:4:15。得到c l ean reads。
(3)接下来将c l ean data与扩增目标序列进行比对，采用甲基化测序数据比对软件(bsmap，版本v2.73)将c l ean reads和目标序列进行比对分析，比对模式为map to2forward strands,i.e.BSW(++)and BSC(-+)。
7.甲基化位点检测及分析
比对完成后，使用BSMAP自带的计算甲基化的python程序，计算每一个样本的每一个目标序列上CG碱基的甲基化水平，甲基化水平均按如下公式进行计算：
C位点的甲基化水平＝支持甲基化的reads数/(支持甲基化的reads数+支持非甲基化的reads数)。
统计每个位点在每个样本的中甲基化水平，其中如果深度小于30X的，将表示为NA。最后根据以上计算出的甲基化水平，使用R语言进行统计和可视化展示，并且使用双尾t检验进行组间差异分析，当检验结果p值小于0.05，并且组间甲基化水平均值的差异的绝对值大于0.1时，认为该差异是显著的。从而得到全基因组上单位点的有效甲基化信息。
如图3所示，目前筛选方法得到的位点特异性不佳，并不能有效筛选出鉴别CAEBV和IM的特异性差异甲基化基因位点。为了进一步筛选出有效的甲基化位点，发明人对筛选方法进行了如下优化改进。
8.显著差异甲基化位点的筛选
(1)为筛选能有效区别CAEBV和IM的特异性异甲基化基因位点，我们进一步对筛选方案进行优化。以500bp为一个滑动窗口，扫描所述全基因组每一区段的甲基化信息，筛选每段中组间甲基化水平均值的差异绝对值最大的位点，统计各区段的有效甲基化信息。
(2)提高组间差异甲基化位点的筛选阈值再次筛选，筛选条件如下：
1)对于EBV基因组甲基化水平在CAEBV组与IM组存在差异的位点而言，选择CAEBV组甲基化水平均值与IM组均值的差值绝对值大于0.3的位点；
2)评估差异甲基化位点组内的稳定性，即计算差异系数(coeffi c i ent ofvari at i on,CV)，公式为CV＝S/M*100％(S为样本标准差，M为样本平均数)，CV小于等于20％的位点被认为存在稳定性。选择CAEBV组中CV小于等于20％的位点为显著的差异甲基化位点。
9.经过反复试验筛选和验证，得到扩增效率高、特异性好，能够检测CAEBV与IM样本中上述显著差异甲基化基因水平的引物。
实施例2CAEBV和IM差异甲基化位点的筛选和分析结果
1.对19例CAEBV和17例IM样本的甲基化位点进行检测，共检测到1019个差异甲基化位点。
根据测得的1019个差异甲基化位点，对CAEBV和IM样本的甲基化水平进行可视化，以所检测基因区域的绝对坐标为基础，作图展示每个位点在每个样本中的甲基化水平，并按照生物学分组进行不同的颜色标记，并将组内在各位点的平均甲基化水平以点图的形式展现，该形式比较直观地展示差异甲基化在基因上的位置、甲基化水平及差异显著性等，可视化结果如图1所示，图1为CAEBV和IM病例PBMC样本测序数据中全EBV基因组CpG位点的DNA甲基化水平。图中每个点表示相应CpG位点的甲基化水平。图1中显示CAEBV甲基化水平高于IM组。
2.CAEBV与IM之间差异甲基化分析
用t检验检测每个比较组的每个扩增子的每个位点是否有差异，统计每个扩增子的平均甲基化水平，用提琴图展示各区域在组间的甲基化分布情况，并进行组间差异分析，结果如图2所示，图2为CAEBV和IM病例PBMC样本的EBV DNA甲基化水平。图中每个点代表一例样本的平均甲基化水平。CAEBV组EBV基因组甲基化水平为78.4％,IM组EBV基因组甲基化水平为66.7％，CAEBV组EBV基因组甲基化水平高于IM组(P<0.0001)。按第一次筛选标准(使用双尾t检验进行组间差异分析，当检验结果p值小于0.05，并且组间甲基化水平均值的差异的绝对值大于0.1时)进行筛选组间差异甲基化位点，用热图展示各基因在组间的甲基化情况，结果如图3所示。图3为CAEBV和IM病例PBMC样本中EBV基因组差异甲基化基因聚类分析热图。每列代表一个样本。每行代表所有样本中病毒基因组中每个EBV编码基因的平均甲基化水平。所有样本的每个区域对应的甲基化水平用不同的颜色表示。由深到浅的颜色渐变表示基因甲基化程度从低到高的变化。CAEBV：慢性活动性EBV感染；IM：传染性单核细胞增多症。
3.筛选CAEBV与IM之间特异性的差异甲基化位点
由于初步检测到的1019个差异甲基化位点特异性不佳，为进一步筛选出能特异性区分CAEBV和IM的差异甲基化位点，发明人对筛选条件进行了优化，具体优化方法为：
(1)选择两组间甲基化水平均值差异的绝对值大于0.3的位点，共检测到171个EBV差异甲基化位点，用热图展示各基因在组间的甲基化情况，结果如图4所示；图4为按第二次筛选标准CAEBV和IM病例PBMC样本中EBV基因组差异甲基化基因聚类分析热图。图中每列代表一个样本。每行代表所有样本中病毒基因组中每个EBV编码基因的平均甲基化水平。所有样本的每个区域对应的甲基化水平用不同的颜色表示。由蓝到红的颜色渐变表示基因甲基化程度从低到高的变化。CAEBV：慢性活动性EBV感染；IM：传染性单核细胞增多症。
(2)进一步评估171个差异甲基化位点的组内稳定性，即计算差异系数(coeffi ci ent of var iat i on,CV)，公式为CV＝S/M*100％(S为样本标准差，M为样本平均数)，CV小于20％的位点被认为存在稳定性。
方法优化后，共筛选出五个在CAEBV和IM之间存在明显甲基化差异的基因EBNA-LP(30069bp)、EBNA-3A(53968bp)、A73(157064bp)、BALF5(154371bp)及BNRF1(2422bp)各基因甲基化水平和CV值见表1及图5A和图5B所示，图5A和图5B为CAEBV和IM组EBV基因组中代表性差异甲基化基因的甲基化水平，其中图5A为按照优化后的第二次筛选标准筛选出的五个在CAEBV和IM之间存在明显甲基化差异的基因EBNA-LP、EBNA-3A、A73、BALF5及BNRF1的甲基化水平，而图5B为按第一次筛选标准筛选出的五个在CAEBV和IM之间存在甲基化差异的基因BcRF1、EBNA1、BPLF1、LMP-2A及BSLF1的甲基化水平，可见图5A中五个位点的甲基化差异水平明显高于图5B中所示。
表1列举了部分第一次筛选得到的位点数据，表2为第二次优化筛选得到的位点数据，通过di ff值可以明显看出第二次筛选甲基化位点的甲基化水平更高，通过CV值也可以明显看出第二次筛选位点的特异性也远高于其他位点。
表1
表2
实施例2用于检测CAEBV与IM样本中EB病毒基因组显著差异甲基化基因水平的引物及检测方法
1.引物组
发明人针对上述差异甲基化位点设计了扩增效率高、特异性好，能够检测CAEBV与IM样本中上述显著差异甲基化位点基因水平的引物组，各引物序列如下表所示。
表3
2.利用上述引物进行CAEBV和IM样本中目的甲基化水平检测的基本方法：
利用上述引物对CAEBV和IM样本中目的基因甲基化水平进行焦磷酸盐测序PCR检测。
(1)DNA样本准备：使用磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取；
(2)亚硫酸盐转化：使用EZ DNA Methylat ion-Gold Kit D5005试剂盒(ZYMORESEARCH)对提取的DNA样本进行亚硫酸氢钠修饰，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
(3)PCR扩增反应：通过PCR反应将待检测基因片段进行富集扩增，产物长度在200-700bp之间。
a.样本经亚硫酸盐转化低速短暂离心备用。
b.按下表所示配制PCR反应混合液(反应体系配制过程在低温条件下完成，防止在高温中长时间暴露而失活)。
表4甲基化检测扩增PCR反应组分
| 试剂 | 使用量 |
| ddH2O | 5.5μL |
| 2×TaqPCRMasterMix | 12.5μL |
| forwardprimer | 1.5μL |
| reverseprimer | 1.5μL |
| DNAtemplate | 4μL |
| TotalVolume | 25μL |
c.扩增PCR反应程序
按如下温度和时间设置程序：95℃，5min→(94℃，30s→60℃，45s→72℃，45s)40次循环→72℃，10min→10℃，10min。
d.反应结束后，取10μL PCR产物，经2％琼脂糖凝胶电泳45min，电泳结束后紫外拍照，验证BSP反应产物的扩增效果。
(4)焦磷酸盐测序：
a.采用PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪配套的单链纯化装置从PCR产物中分离单链DNA；
b.将测序反应板放置于测序仪中进行测序。
c.数据分析：采用焦磷酸测序仪配套的甲基化分析软件进行甲基化结果分析。
实施例3利用本发明上述引物组检测CAEBV和IM样本中目的基因甲基化水平以进行验证
(1)本发明在上述研究的基础上，使用表3引物组进一步在另一个验证样本集进行验证，该验证样本集来自5例CAEBV患儿及5例IM患儿，通过检测该样本集中EBNA-LP、A73、BALF5、BNRF1及EBNA-3A基因的甲基化水平，以鉴别慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症，进而验证本发明所述甲基化位点的可行性及有效性，检测方法和分析方法如实施例1和实施例2记载。
(2)实验结果
结果如下表5和如图6所示，CAEBV组患儿的PBMC样本中，EBNA-LP、A73、BALF5、BNRF1及EBNA-3A基因的甲基化水平平均值均高于IM组，且差异具有统计学意义。实验结果说明通过检测本发明所述的EB病毒基因组差异甲基化位点的改变可以进行CAEBV与IM的早期鉴别。验证实验表明，本发明灵敏度高、特异性及重复性好。
表5
Claims (1)
1.检测待测样品基因组中EBNA-LP 30069bp、EBNA-3A 53968bp、A73 157064bp、BALF515437bp和BNRF1 2422bp位点甲基化水平的引物组在制备区分或辅助区分慢性活动性EB病毒感染和传染性单核细胞增多症产品中的应用；
所述引物组选自由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物对、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的引物对、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的引物对以及SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的引物对组成的引物组。
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
| ATE429517T1 (de) * | 1998-03-04 | 2009-05-15 | Biomerieux Bv | Vervielfältigung und nachweis von ebv barf1 zur diagnose von nasopharyngealen karzinom |
| CN103642945B (zh) * | 2013-12-30 | 2019-01-08 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒 |
| WO2021081296A1 (en) * | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Joshua Labaer | Novel antibodies for detecting epstein barr virus-positive gastric cancer |
| CN113750173A (zh) * | 2020-06-05 | 2021-12-07 | 贵州益佰制药股份有限公司 | 金莲清热制剂在治疗传染性单核细胞增多症中的应用 |
| CN114457192B (zh) * | 2021-07-07 | 2023-02-07 | 中山大学 | 对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010004251A1 (en) * | 2008-06-16 | 2010-01-14 | Oncomethylome Sciences Sa | Dna methylomes |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EB病毒基因甲基化与肿瘤的关系;路素丽 等;医学综述;20110320;第17卷(第06期);第 838-839 页 * |
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