CN118599860A - 一种调控溪荪花青素合成的基因mybl1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因育种领域，具体涉及一种调控溪荪花青素合成的MYBL1基因及其应用。所述的溪荪MYBL1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因MYBL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，首次发现该基因能够在烟草花中调控花青素的合成，过表达溪荪MYBL1基因可以使烟草叶片、茎秆、花部等位置的颜色加深，过表达溪荪MYBL1基因可以使溪荪愈伤组织颜色加深。MYBL1基因利用VIGS技术沉默溪荪花部使颜色变浅。本发明提供的溪荪MYBL1基因不仅为研究溪荪花色调控提供理论参考，更是为今后的花色育种工作提供了重要基因资源，而且可以应用到其他花卉植物的育种中去。

Description

一种调控溪荪花青素合成的基因MYBL1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及花青素调控基因，特别涉及一种调控溪荪花青素合成的基因MYBL1及其应用。

背景技术

溪荪(Iris sanguinea Donn ex Hornem.)是一种多年生单子叶植物，其拥有极强的抗寒性和较高的观赏价值，是北方地区常见的园林植物，溪荪在野生种群中以蓝色和白色为主。近年来，通过杂交培育出了多种花色(Fu H,Ye W,Zhao R,Dai Y,Wang L.2022.‘Mini Fen’:A New Iris sanguinea Cultivar.HortScience,57:799-800.)，目前，溪荪花色形成的分子机制尚不清楚，此项研究对溪荪花色定向育种起到了至关重要的作用。

花色是观赏植物最明显的表型之一，是评价花卉花色的形成在根本上是由于花瓣细胞中存在的特定呈色物质导致的，其中最关键的因素是花青素，花青素在植物的生长和发育中发挥着重要作用。它们参与了植物根、茎、叶等器官的发育过程，影响细胞分化、组织形成等生物学过程。这些调控作用对于植物的正常生长至关重要。花青素的存在可以影响花朵的颜色，进而影响传粉者的选择，通过调控花青素的合成可以使植物吸引特定的传粉者，促进植物有性生殖。

花青素的合成在植物发育过程中受到转录因子(TF)的调控，如典型的MBW复合物(Wheeler LC,Walker JF,Ng J,et al.2022.Transcription Factors Evolve FasterThan Their Structural Gene Targets in the Flavonoid Pigment Pathway.MolecularBiology Evolution,39:c44)，其中MYB转录因子是植物花青素合成中最重要的调控因子，例如典型的MBW复合物(Xu W,Grain D,Bobet S,et al.2014.Complexity and robustnessof the flavonoid transcriptional regulatory network revealed by comprehensiveanalyses of MYB-bHLH-WDR complexes and their targets in Arabidopsis seed.TheNew phytologist,202:132-144.)，其在包括矮牵牛属(Petunia hybrida)、拟南芥(Arabidopsis thaliala)在内的双子叶植物和包括百合(Lilium brownii)在内的单子叶植物中被广泛验证。(Yang J,Chen Y,Xiao Z,Shen H,Li Y,Wang Y.2022Multilevelregulation of anthocyanin-promoting R2R3-MYB transcription factors inplants.Front Plant Science,13:1008829.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控溪荪花青素合成的基因MYBL1及其应用，本发明为园林植物花色研究提供了一种新途径，对探究溪荪MYBL1基因的功能，揭示植物花色形成机理具有重要意义，并为溪荪花色的定向分子育种提供了重要参考。

本发明的目的之一在于提供一种溪荪MYBL1基因

本发明的目的之二在于提供如所述溪荪MYBL1基因相关的生物材料。

本发明的目的之三在于获得含有溪荪MYBL1基因的烟草转化植株。

本发明的目的之四在于获得含有溪荪MYBL1基因的溪荪转化愈伤组织。

本发明的目的之五在于提供一种溪荪MYBL1蛋白在调控植物花青素合成中的应用。

本发明的目的将通过以下技术方案实现：

一种溪荪MYBL1基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的溪荪MYBL1基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的溪荪MYBL1基因相关的生物材料，其特征在于，包括如下(A1)至(A3)中的任一种：

(A1)含有溪荪MYBL1基因的植物表达载体；

(A2)含有(A1)所述的植物表达载体的生物工程菌；

(A3)含有(A1)所述的植物表达载体的转基因植物。

所述的与溪荪MYBL1基因相关的生物材料，其特征在于：

所述的植物表达载体为pCAMBIA1300-GFP。

所述的与溪荪MYBL1基因相关的生物材料，其特征在于：

所述生物工程菌为根癌农杆菌GV3101(唯地，中国)。

任一项所述的与溪荪MYBL1基因相关的生物材料在调控植物花青素合成中的应用；

所述的调控植物花青素合成的方法，其特征在于：

(B1)向受体植物中导入上述溪荪MYBL1基因，得到转基因植物；

(B2)将上述溪荪MYBL1基因在受体植物中过量表达；

(B3)在溪荪中沉默或抑制MYBL1基因的表达，所述的沉默基因序列如SEQ IDNO.25所示。

所述的将植物表达载体导入受体植物中的方法，其特征在于：

将含有溪荪MYBL1基因的植物表达载体通过农杆菌介导的方法转化植物组织，并将转化的植物组织培育成植株。

根据本发明的技术方案，其特征在于，所述受体植物为溪荪愈伤组织或普通烟草。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明从溪荪的花瓣中克隆出MYBL1基因，构建了pCAMBIA1300-MYBL1-GFP植物表达载体，通过电击法转化根癌农杆菌GV3101，采用农杆菌转化法将pCAMBIA1300-MYBL1-GFP植物表达载体转化烟草，结果发现MYBL1基因在烟草中过表达使得烟草花色加深；采用农杆菌介导的方法将pCAMBIA1300-MYBL1-GFP植物表达载体转化溪荪，结果发现MYBL1基因在溪荪中过表达，使得溪荪基部花青苷显色加深。

(2)转基因烟草植株花色加深，转基因溪荪基部花青苷显色加深，均说明溪荪MYBL1基因具有调控植株花青素合成的功能。

(3)本发明提供的溪荪MYBL1基因可以作为一个优良的基因资源，可广泛应用到鸢尾属或其他花卉植物的遗传育种领域，对于观赏植物育种具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为IsMYBL1蛋白亚细胞定位图。

图2为转IsMYBL1基因烟草的PCR鉴定电泳图，其中M为DL2000 Maker，1-5为转基因烟草株系。

图3为转IsMYBL1基因烟草表型图，其中WT为野生型烟草植株，OE为T3代转IsMYBL1烟草，其花冠颜色加深，茎变红。

图4为转IsMYBL1基因鸢尾的愈伤组织荧光鉴定图。

图5为溪荪通过VIGS技术获得的IsMYBL1基因沉默溪荪花瓣表型图。

图6为空白对照、空载对照和IsMYBL1基因沉默溪荪花瓣中IsMYBL1基因表达量变化检测图。

图7为酵母双杂实验结果图，显示了IsMYBL1和IsEGL3或IsTTG1之间的相互作用。

图8为双分子荧光互补实验结果图，孵育21h后，在共聚焦激光扫描显微镜下观察荧光，将NLS-RFP作为核标记物，比例尺表示25μm。

图9为酵母单杂实验结果图，显示了IsMYBL1和IsANS之间的调控关系。

图10为双荧光素酶实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种调控溪荪花青素合成的基因MYBL1及其应用。

实施例中相关培养基配制方法如下：

LB液体培养基(100mL)：0.5g酵母提取物+1g胰蛋白胨+1g氯化钠

LB固体培养基(100mL)：0.5g酵母提取物+1g胰蛋白胨+1g氯化钠+1.5g琼脂

YEP液体培养基(100mL)：1g酵母提取物+1g胰蛋白胨+0.5g氯化钠

YEP固体培养基(100mL)：1g酵母提取物+1g胰蛋白胨+0.5g氯化钠+1.5g琼脂

MS1培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L

MS2培养基：1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+Hyg 20mg/L+Timentin 200mg/L

MS3培养基：1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+Hyg 25mg/L+Timentin 200mg/L

MS4培养基：1/2MS+NAA 0.1mg/L+Hyg 25mg/L+Timentin 200mg/L

本实施例具体试验方案如下：

实施例1：基因克隆

1.用于溪荪MYBL1基因克隆的特异性引物序列如下：

MYBL1-F1：ATGGGTCCTCTTCCCTCGGTGGC

MYBL1-R1：TCATAACCCGAAACCTTCCCAA

以溪荪花瓣cDNA为模板，配制50μL的PCR反应体系，其中包括2μL模板cDNA，25μL 2×PCR buffer for KOD FX，10μL 2mM dNTPs，上下游引物各1μL，1μL KOD FX和10μLddH2O，加样操作在冰上进行，加完之后混匀并离心；PCR反应程序为：94℃2min；98℃10s，58℃30s，68℃90s，循环35次；68℃10min。经PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物连接到克隆载体pEASY-Blunt-Zero(全式金，中国)上，转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有100mg/L Amp抗性的LB固体上，在37℃培养箱中倒置培养10-12h，挑取单克隆菌株进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆在含有100mg/L Amp抗性的LB液体培养基中扩大培养10mL，之后送至生物公司测序。

获得溪荪MYBL1基因的核苷酸序列如下所示：

ATGGGTCCTCTTCCCTCGGTGGCGAAACCGCAAGCTCCGGTAGAGGGTCTACGCAAAGGTTC GTGGACTCCTGAAGAAGACGCGATGCTGAGGAAGTGCATGGAGAAGCACGGGGAAGGAAGGTGGTCCAAAGTACCCAGAATGGCAGGGCTCAATAGATGTCCGAAGAGCTGTCGGCTGAGATGGCGCAACTACCTTTCTCCGGCGATCAAACGAGGGAGGTTCGACGCCGAGGAGTTGGACCTTATCATCAGGCTACATAAGCTCCTGGGCAACAGGTGGTCTCTGATTGCTGGTAGACTACCAGGGAGAACGGCAAATGATATCAAGAACTACTGGAATACTCATTTGAGCAGAAAACAACCTAAAGATAAAGGTGAGGAGGCACGGAATCGTTCTCTTCTTGTGAAGGTCTTGAAGCCCAAGCCACAAACCATCCCTCTGAACTGGAGATGGACAAAGGAGGTGCCCAAATCTCAAGAAGAGTCTGCTTCGATACAATCGTTGGATAATCATCACATATCATGCTTAGAAAGTATACTCAACTGCAAGGACCTGAGCCCGATAGTTTCTAACATTGAATTAGGAGATATAGAAGAGCTCCAGAGCATGCTCGTGGCGGCGGAAGCAGTTGAGATTTTGAGACAAACAGATGGACAACCGGCTATCGGAGGACCCATTGGATTTGAATGGGAGGACTTGCATTTTGATTCCAACCTTTGGGAAGGTTTCGGGTTATGA

溪荪MYBL1基因的ORF区包含741个碱基，编码246个氨基酸，氨基酸序列如下所示：

MGPLPSVAKPQAPVEGLRKGSWTPEEDAMLRKCMEKHGEGRWSKVPRMAGLNRCPKSCRLRW RNYLSPAIKRGRFDAEELDLIIRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTANDIKNYWNTHLSRKQPKDKGEEARNRSLLVKVLKPKPQTIPLNWRWTKEVPKSQEESASIQSLDNHHISCLESILNCKDLSPIVSNIELGDIEELQSMLVAAEAVEILRQTDGQPAIGGPIGFEWEDLHFDSNLWEGFGL

2.植物表达载体构建。

利用同源重组的方法，设计分别带有Sal I和BamH I酶切位点的载体同源臂引物，以连接克隆载体的MYBL1质粒为模板，扩增带有pCAMBIA1300载体同源臂的溪荪MYBL1基因，回收目的片段。载体同源臂引物序列如下：

MYBL1-F2：ttgatacatatgcccgtcgac ATGGGTCCTCTTCCCTCGG

MYBL1-R2：cccttgctcaccatggatcc TAACCCGAAACCTTCCCAA

用Sal I和BamH I限制性内切酶，酶切表达载体pCAMBIA1300-GFP质粒，回收载体片段，将线性化载体与加了载体同源臂的MYBL1基因片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5α并涂布在含有100mg/LKana抗性的LB固体上，在37℃培养箱中倒置培养10-12h，挑取单克隆菌株进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆在含有100mg/L Kana抗性的LB液体培养基中扩大培养10mL，之后送至生物公司测序。

3.亚细胞定位。

通过瞬时转化本氏烟草的方法，对MYBL1蛋白进行亚细胞定位检测，亚细胞定位的具体方法如下：

将质粒pCAMBIA1300-MYBL1-GFP通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101(唯地，中国)；获得阳性克隆后，挑取单菌落接种于含有50mg/L Kana、25mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇床中180rpm振荡过夜培养；取50μL新鲜菌液接种于含有50mg/L Kana、25mg/L Rif、10mM MES和40μM AS(乙酰丁香酮)的10mL LB液体培养基中，28℃振荡培养14h，扩大培养至菌株生长对数期；次日，4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，用10mM MgCl₂重悬菌体，并用分光光度计调整每种菌液OD₆₀₀为1.5，所有重悬菌液中加入一定量的AS使终浓度为200μM，室温静置3h；注射前一天要对本氏烟草浇水，注射前烟草尽量置于弱光条件，挑选生长状态良好的烟草叶片，用1mL注射器的针头在叶片背面扎一个洞，去掉针头，吸取混合菌液从烟草背面注射到叶片中；注射过的烟草暗培养12h，取出之后正常光照条件培养3d，撕取注射叶片的下表皮，置于载玻片上，制成临时水装片。采用激光共聚焦显微镜(LSM800 withAiryscan,ZEISS,Germany)观察GFP的表达情况。

实例2遗传转化烟草

1.烟草无菌苗的培养。

将野生型烟草种子若干粒放入无菌的1.5mL的离心管中，在无菌工作台中用75％乙醇消毒1min，无菌水冲洗3次，再用1％的NaClO消毒10min，无菌水冲洗5次，接种于MS培养基上，25℃下光照培养，即可获得烟草无菌苗。

2.生物工程菌的制备。

转化农杆菌，根癌农杆菌感受态为GV3101(唯地，中国)，转化步骤参照说明书。

在转化平板上挑取单菌落至10mL含有50mg/L Kana和25mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养12-16h；吸取1mL菌液加入到50mL含有50mg/L Kana和25mg/LRif的YEP(或者LB)液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养，直至OD₆₀₀达到0.6-0.8；将培养好的菌液4500rpm离心5min，弃去上清，在无菌状态下用等体积(50mL)的1/2MS渗透培养基(pH5.8)重悬菌体，重悬液置于冰上，待侵染烟草用。

3.侵染烟草。

预培养。将无菌的烟草苗叶片剪成1cm×1cm的小方块，置于MS1固体培养基中(叶片上表面朝上)预培养2d；

侵染。在超净工作台中，将重悬好的菌液倒入无菌的小锥形瓶中，取出预培养2d的烟草叶片，放入菌液中，浸泡4min，取出叶片置于无菌的滤纸上吸取叶片表面附着的菌液，同时设置未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照；

共培养。将侵染后的烟草叶片接种在MS1培养基上(叶片上表面朝上)，用封口膜封好，于28℃黑暗共培养2d；

选择培养。共培养过的叶片接种在MS2培养基上光照培养，进行Hyg抗性筛选。非转基因烟草作为对照也接种在含有Hyg抗性培养基上，正常情况下，非转基因烟草叶片会逐渐死亡；

继代培养。约1-2周，将烟草叶片接种在MS3培养基上继代培养；

生根。待叶片边缘长出1cm左右的不定芽时，将不定芽切下并转移到MS4培养基上诱导生根；

移栽。当幼苗长出发达的根系后，开盖培养2d进行炼苗，在培养瓶中加入少量无菌水保持培养基湿润，移栽前清理掉植株根系所带的琼脂，栽植到到盛有灭菌土(园土：蛭石＝3：1)的小盆中，放置于室温中培养；

提取转基因烟草植株的DNA，采用MYBL1同源臂引物进行PCR鉴定，获得转基因阳性烟草植株。

实施例3遗传转化鸢尾愈伤组织。

将重悬液OD值调为0.6，将重悬液在室温下静止2-3h，然后将愈伤组织切成5mm左右小块放入侵染液侵染。

使用MS+AS100μmol/L的固体培养基进行共培养3d，然后使用含有100μmol/L羧卞青霉素的无菌水进行洗菌，转接至含有100μmol/L潮霉素的MS固体培养基中进行筛选培养(暗培养)，2周后进行荧光检测。

实施例4基于TRV构建溪荪花部VIGS体系

确定接种时期：大田溪荪处于花苞未着色时期，接种时间为晴朗无风的下午3点以后；

配制侵染液：挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于1ml YEB液体培养基中，该培养基中含有卡那霉素50μg/mL、利福平20μg/mL，28℃条件下，在带橡胶塞的玻璃试管中200r/min震荡6-8h至浑独而不泛白；将摇至浑浊的菌液分别再用50mL YEB液体培养基培养，该培养基中含有卡娜霉素50μg/mL、利福平20μg/mL，200r/min条件下震荡，在菌液浓度达OD₆₀₀到1.8-2.0时取出；离心收集菌体，均用25mL侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以无菌水作为溶剂，其中含有MES10mM、AS200μM、MgCl₂ 10mM，调节农杆菌液浓度菌液浓度达OD₆₀₀到1.8-2.0，制成农杆菌侵染缓冲液，缓冲液OD₆₀₀为0.8-1.0为最佳；将含有等浓度pTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2^-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，黑暗条件下室温静置，形成两种农杆菌侵染液；

接种部位的选择：选择溪荪未着色时期的花苞为接种部位；

病毒载体的接种：采取1mL注射器，先自花苞顶部扎入一个伤口，再用针头将1mL侵染液注射到溪荪的花苞中，保证花苞直立，菌液不会留出，接种后无需避光，挂牌注明处理组别及处理时间；

基因沉默效率检验：组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组和未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA，进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。

pTRV-IsMYBL1质粒构建，纯化后的PCR基因片段，与经Xba I-Knp I双酶切线性化的pTRV2质粒用诺唯赞同源重组试剂盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115-01)连接酶连接。将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在抗性培养基上筛选并挑取单克隆，鉴定阳性克隆并测序。选择序列正确的阳性克隆提取其质粒，使用冻融法转化根癌农杆菌GV3101感受态，28℃黑暗培养两天后挑选单克隆。检测引物如下：

TRV2-IsMYBL1-F：tgagtaaggttaccgaattctctagaTACTCAACTGCAAGGACCTG

TRV2-IsMYBL1-R：gcctgagacgcgtgagagctcggtaccTAACCCGAAACCTTCCCAA

实例5溪荪MYBL1蛋白与bHLH蛋白和WD40蛋白的相互作用

1.酵母双杂实验

通过同源重组的方式将IsMYBL1的ORF序列构建到pGADT7载体的两个酶切位点EcoR I和BamH I之间，IsTTG1和IsEGL3的ORF序列分别构建到pGBKT7载体的两个酶切位点EcoR I和BamH I之间，获得酵母表达载体pGADT7-IsMYBL1，pGBKT7-IsEGL3和pGBKT7-IsTTG1。酵母表达载体构建引物如下：

pGADT7-IsMYBL1-F：gccatggaggccagtgaattcATGGGTCCTCTTCCCTCGG

pGADT7-IsMYBL1-R：cagctcgagctcgatggatccTAACCCGAAACCTTCCCAA

pGBKT7-IsEGL3-F：atggccatggaggccgaattcATGCCAGGAAGAGCTTTGGC

pGBKT7-IsEGL3-R：ccgctgcaggtcgacggatcACATTTTCCAACCACTCTTTG

pGBKT7-IsTTG1-F：atggccatggaggccgaattcATGGAGAATTCCTCCAAAGAACCC

pGBKT7-IsTTG1-R：ccgctgcaggtcgacggatcGACCCTGAGCAGCTGCACCT

将酵母表达载体pGADT7-IsMYBL1，pGBKT7-IsEGL3和pGBKT7-IsTTG1以及对照pGBKT7质粒分别转化酵母感受态Y2HGold，转化方法参照说明书。

分别将转pGADT7-IsMYBL1质粒与pGBKT7空载体质粒的Y2HGold酵母菌液涂布在SD/-Trp平板上，在28-30℃培养箱中倒置培养2-3d，观察两个平板上的菌落生长状况有无明显差异。

将转化pGADT7-IsMYBL1质粒的Y2HGold酵母菌液涂布在SD/-Trp+X-α-gal固体培养基平板上，在28-30℃培养箱中倒置培养2-3d，观察平板上的菌落是否变蓝。

通过酵母转化方法将pGADT7-IsMYBL1和pGBKT7-IsEGL3、pGADT7-IsMYBL1和pGBKT7-IsTTG1共转化到Y2HGold酵母感受态中。将转化菌液进行梯度稀释后取5μL分别打点培养在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal+AbA固体培养基上，在28-30℃培养箱倒置培养2-3d，观察酵母菌斑的生长情况。

2.双分子荧光互补实验。

通过同源重组的方式将不含终止密码子的IsMYBL1的ORF序列构建到pSPYNE-35S载体的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点之间，将不含终止密码子的IsTTG1和IsEGL3的ORF序列构建到pSPYCE-35S载体的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间。最终IsMYBL1与YFP的N端衔接，IsTTG1和IsEGL3与YFP的C端相融合。载体构建引物如下：

pSPYNE-IsMYBL1-F：tggcgcgccactagtggatccATGGGTCCTCTTCCCTCGG

pSPYNE-IsMYBL1-R：agcggtaccctcgaggtcgacTAACCCGAAACCTTCCCAA

pSPYCE-IsEGL3-F：tggcgcgccactagtggatccATGCCAGGAAGAGCTTTGGC

pSPYCE-IsEGL3-R：atcgtatgggtacatcccgggACATTTTCCAACCACTCTTTG

pSPYCE-IsTTG1-F：tggcgcgccactagtggatccATGGAGAATTCCTCCAAAGAACCC

pSPYCE-IsTTG1-R：atcgtatgggtacatcccgggGACCCTGAGCAGCTGCACCT

通过冻融法将pSPYNE-IsMYBL1、pSPYCE-IsEGL3、pSPYCE-IsTTG1、pSPYNE和pSPYCE分别转化根癌农杆菌GV3101(pSoup-p19)，转化方法参照感受态说明书；获得阳性克隆后，挑取单菌落接种于含有50mg/L Kana、25mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇床中180rpm振荡过夜培养；取50μL新鲜菌液接种于含有50mg/L Kana、25mg/L Rif、10mM MES和40μM AS的10mL LB液体培养基中，28℃振荡培养14h，扩大培养至菌株生长对数期；次日，3000rpm离心10min收集菌体，弃上清，用10mM MgCl₂重悬菌体，并用分光光度计调整每种菌液OD₆₀₀为1.0，调好之后向所有重悬菌液中加入一定量的AS使终浓度为200μM，室温静置3h；注射前一天要对本氏烟草浇足水，注射前烟草尽量置于弱光条件，挑选生长状态良好的烟草叶片，用1mL注射器的针头在叶片背面轻轻扎一个洞，不要将叶片扎破，去掉针头，吸取混合菌液从烟草背面注射到叶片中，注射时用手轻轻抵住叶片；注射过的烟草暗培养12h，之后放置正常光照条件下培养2-3d，撕取注射叶片的下表皮，置于载玻片上，制成临时水装片。采用激光共聚焦显微镜观察YFP荧光。

实例6溪荪MYBL1基因通过调节溪荪ANS控制花朵着色

1.酵母单杂实验。

将IsANS基因启动子连接至酵母单杂“诱饵”载体pBait-AbAi的SacⅠ和SalⅠ之间，重组“诱饵”载体pBait-AbAi命名为pAbAi-P1。载体构建完成之后转化大肠杆菌感受态，并用质粒提取试剂盒进行质粒提取，最终获得重组质粒。

采用限制性内切酶BstB I线性化pBait-AbAi重组质粒和阳性对照p53-AbAi质粒，反应体系和酶切条件参照限制性内切酶BstB I说明书。将线性化的质粒转化Y1HGold酵母感受态，转化步骤参照说明书进行。转化液涂布SD/-Ura平板，30℃倒置培养72h。之后挑取单菌落用Matchmaker Insert Check PCR Mix1试剂进行PCR反应，验证pBait-AbAi整合到Y1HGold基因组中，若扩增出一段约0.75kb+X的片段，表明“诱饵”菌株Y1H转化成功。

从SD/-Ura平板上挑取整合成功的酵母单菌落，用0.9％ NaCl溶液将酵母菌浓度调至OD₆₀₀约为0.002，各取100μL稀释后的菌液涂布含不同AbA浓度的SD/-Ura培养基，30℃倒置培养3-5d后观察酵母菌落的生长情况，确定各重组“诱饵”载体对AbA的敏感性，得到“诱饵”菌株的AbA最小抑制浓度。

“诱饵”酵母菌株感受态的制备方法如下：挑取Y1HGold酵母菌株在YPDA固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3d；当菌株长到合适大小后，挑取单菌落接种到5mL YPDA液体培养基中，30℃振荡培养12h；取10μL振荡培养后的菌液接种到50mL YPDA液体培养基中，继续30℃振荡培养，直至OD₆₀₀为0.15～0.3；将培养到合适OD值的酵母菌液在室温下5000rpm离心4min，弃上清，用100mL YPDA液体培养基重悬菌体，继续30℃振荡培养，直至OD₆₀₀为0.4～0.6；在超净工作台里将培养好的菌液分装至2个50mL离心管中，室温下5000rpm离心4min，弃上清；加入30mL无菌的ddH₂O重悬菌体，室温下4000rpm离心5min，弃上清。重复一次；向每个离心管中分别加入1mL 1.1×TE/LiAc，与菌体混匀，然后转移至1.5mL离心管中，10000rpm离心10s，弃上清。重复一次；最后向每个离心管中加入600μL 1.1×TE/LiAc重悬菌体，用于下一步实验。

将构建好的pGADT7-IsMYBL1载体质粒转入“诱饵”酵母感受态，转化步骤参照酵母转化试剂盒说明书。转化液涂布SD/-Ura-Leu培养基和含AbA最小抑制浓度的SD/-Ura-Leu培养基，30℃倒置培养3-5d。

2.双荧光素酶实验。

通过同源重组的方式分别将IsMYBL1的ORF序列构建到pGreenⅡ62-35S的两个酶切位点BamHⅠ和KpnⅠ之间，获得CaMV35S启动子驱动的重组表达载体IsMYBL1-62SK。将IsANS启动子序构建到pGreenⅡ0800-LUC的两个酶切位点SalⅠ和BamHⅠ之间，获得CaMV35S启动子驱动的重组表达载体IsANS-LUC。引物如下：

IsMYBL1-pGreenⅡ62-SK-F：cgctctagaactagtggatccATGGGTCCTCTTCCCTCGG

IsMYBL1-pGreenⅡ62-SK-R：tcagcgtaccgaattggtaccTAACCCGAAACCTTCCCAA

IsANS-pGreenⅡ0800-LUC-F：gggccccccctcgaggtcgacCTTAATTAGTTCTTAATTCTAGACTTATGTT

IsANS-pGreenⅡ0800-LUC-R：cgctctagaactagtggatccAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTAGTCCT

双荧光素酶载体构建完成之后，转化大肠杆菌DH5ɑ感受态，提质粒。将重组质粒和两个空载体质粒通过冻融法分别转化根癌农杆菌GV3101(pSoup-p19)。采用瞬时转化本氏烟草的方法来检测荧光素酶的活性。LUC侵染液和62SK侵染液按照体积比1：1混合，室温黑暗平衡3h后用于侵染。本实验中空载体pGreenⅡ62-35S+pGreenⅡ0800-LUC作为对照组，设置3个实验组，分别为IsMYBL1-62SK+IsANS-LUC、IsMYBL14-62SK+IsANS-LUC。侵染后暗培养12h，之后正常培养2-3d取样检测。

结果分析。

1.溪荪MYBL1蛋白的亚细胞定位分析。

通过瞬时转化本氏烟草叶片，在激光共聚焦显微镜下观察GFP绿色荧光信号分布情况，发现空载体绿色荧光信号均匀分布在整个细胞，而溪荪MYBL1定位于细胞核(图1)，表明溪荪MYBL1具有转录因子的一般特性，属于转录因子蛋白，在细胞核发挥转录调控功能并参与到特定的生物学过程。

2.转基因阳性烟草植株的鉴定。

对获得的5株转基因烟草植株进行DNA的提取，用同源臂引物(MYBL1-F2和MYBL1-R2)进行PCR鉴定，结果5个转基因烟草株系均含有目的条带，这说明MYBL1基因已经成功插入烟草基因组中(图2)，转IsMYBL1基因烟草花冠相较于野生型花冠颜色加深，茎变红(图3)。

3.转基因阳性鸢尾愈伤组织的鉴定。

过表达IsMYBL1增加了鸢尾愈伤组织中花青素的积累，未过表达的鸢尾愈伤组织(WT，EV)和三个过表达IsMYBL1的鸢尾愈伤组织(OE1，OE2和OE3)花青素积累有明显的表型差异，这说明IsMYBL1基因已经成功插入鸢尾基因组中(图4)。

4.IsMYBL1基因VIGS沉默溪荪花部。

自接种第一日起，10-14天之后，经基因沉默处理的花苞陆续开花，根据所沉默基因IsMYBL1的功能，预测性状改变为花色变浅。与空白对照组相比，病毒空载体处理的样本中无有明显花色变浅表型的花朵，与空白对照组及病毒空载体组相比，在病毒与目的基因复合载体处理的样本中，产生了花色变浅的表型(图5)。

利用2^-ΔΔCT法计算基因相对表达水平，发现IsMYBL1基因在沉默植株的花瓣中表达量显著低于空白对照及空载对照(图6)。表明沉默IsMYBL1成功。

5.溪荪MYBL1蛋白与bHLH蛋白和WD40蛋白互作的鉴定。

(1)如果“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生互作，BD结合结构域(DNA bindingdomain，DNA-BD)和AD激活结构域(activation domain，DNA-AD)在空间上极为接近，酵母转录因子GAL4发生重构，恢复了转录因子的功能，可以激活报告基因的表达。在SD/-Trp-Leu培养基上，所有的酵母都能生长，说明共转化成功，但是只有pGBKT7-IsEGL3+pGADT7-IsMYBL1和pGBKT7-IsTTG1+pGADT7-IsMYBL1共转化的菌株能够在四缺固体培养基SD-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal+AbA上长出蓝色菌落。说明IsMYBL1和IsEGL3、IsTTG1蛋白之间具有相互作用(图7)。

(2)利用瞬时转化本氏烟草的方法，分别将pSPYNE-IsMYBL1和pSPYCE-IsEGL3、pSPYNE-IsMYBL1和pSPYCE-IsTTG1的农杆菌液等体积混合后注射本氏烟草叶片，同时以pSPYNE和pSPYCE、pSPYNE-和pSPYCE-IsEGL3、pSPYNE-IsMYBL1和pSPYCE、pSPYNE和pSPYCE-IsTTG1作为四组对照。在pSPYNE-IsMYBL1和pSPYCE-IsEGL3、pSPYNE-IsMYBL1和pSPYCE-IsTTG1共表达的本氏烟草叶片中观察到荧光信号，其它三组对照中均未检测到荧光。说明IsMYBL1蛋白与IsEGL3蛋白和IsTTG1蛋白之间有相互作用，产生YFP荧光(图8)。

6.溪荪MYBL1基因通过调节溪荪ANS控制花朵着色。

(1)为了探究溪荪MYBL1转录因子是否对IsANS基因具有调控作用，将IsANS基因启动子连接至酵母单杂“诱饵”载体pBait-AbAi的SacⅠ和SalⅠ之间，重组“诱饵”载体pBait-AbAi命名为pAbAi-P1。IsANS-pAbAi重组质粒线性化后转化Y1HGold感受态，从中选择4-5个菌斑进行PCR检测，将阳性克隆的酵母菌株在含不同AbA浓度的SD/-Ura培养基上进行培养，最终筛选400ng/mL AbA为抑制“诱饵”酵母菌株生长的适宜浓度。酵母单杂交实验发现：pAbAi-P1可以在SD/-Ura-Leu+400ng/mL AbA的培养基上生长(图9)。由此表明IsMYBL1可以结合IsANS的启动子来调控其表达。

(2)在本氏烟草中进行了双荧光素酶实验，实验结果表明：与对照组相比，当用pGreenⅡ-IsMYBL1-62SK/pGreenⅡ0800-IsANS-LUC(M4/A)农杆菌菌液注射本氏烟草时，LUC活性显著提高。pGreenⅡ0800-IsANS-LUC(b3/A)农杆菌菌液注射本氏烟草时，LUC活性并没有显著变化。pGreenⅡ-IsMYBL1-62SK/pGreenⅡ0800-IsANS-LUC(M4/b3/A)农杆菌菌液注射本氏烟草时，LUC活性显著提高，高于单个组合的LUC活性(图10)。说明IsMYBL1促进IsANS的转录。

Claims (8)

1.一种调控溪荪花青素合成的基因MYBL1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的溪荪花青素合成的基因MYBL1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.溪荪MYBL1基因在促进溪荪花青素合成中的应用。其特征在于：

(A1)向受体植物中导入编码上述溪荪MYBL1基因；

(A2)将上述溪荪MYBL1基因在受体植物中过量表达；

(A3)在溪荪中沉默或抑制MYBL1基因的表达；

(A4)溪荪MYBL1蛋白与bHLH蛋白和WD40蛋白相互作用；

(A5)溪荪MYBL1基因通过调节溪荪ANS基因控制花朵着色。

4.根据权利要求3所述的将溪荪MYBL1基因在受体植物中过量表达的方法，其特征在于：

所述的溪荪MYBL1基因通过农杆菌介导的方法转化植物组织，并将转化的植物组织培育成植株。

5.根据权利要求3所述的在溪荪中沉默或抑制MYBL1基因表达的方法，其特征在于：

将溪荪花部进行基因沉默或抑制，沉默或抑制的基因为溪荪MYBL1，然后获得溪荪沉默花部的植株，其中沉默MYBL1基因序列如SEQ ID NO.25所示。

6.根据权利要求3所述的溪荪MYBL1蛋白与bHLH蛋白和WD40蛋白相互作用，其特征在于：

所述的溪荪MYBLI基因与bHLH基因和WD40基因形成三元复合体，共同促进溪荪花青素合成。

7.根据权利要求3所述的溪荪MYBL1基因通过调节溪荪ANS控制花朵着色，其特征在于：

所述的溪荪MYBL1基因通过激活ANS基因的启动子从而促进溪荪花青素的合成。

8.根据权利要求3任一项所述的方法，其特征在于，所述受体植物为溪荪、溪荪愈伤组织或普通烟草。