CN118599772A - 工程化免疫细胞、包含其的药物组合物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开工程化免疫细胞、包含其的药物组合物及制备方法和应用。该工程化免疫细胞包括调节性T淋巴细胞，其中，调节性T淋巴细胞的表面具有至少一个与其连接的血小板细胞。本发明的工程化免疫细胞通过采用血小板与免疫细胞偶联，形成具有靶向驻留和免疫抑制功能的复合物，通过分泌抑炎细胞因子，抑制效应细胞增殖活化，并利于免疫细胞释放抗炎介质，进而诱导巨噬细胞向抗炎表型极化，有效降低机体炎症，抑制免疫排斥并提高免疫细胞稳定性。本发明的工程化免疫细胞和药物组合物性质稳定，制备工艺简单，可实现细胞治疗。

Description

工程化免疫细胞、包含其的药物组合物及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物治疗领域，特别是涉及工程化免疫细胞、包含其的药物组合物及制备方法和应用。

背景技术

调节性T细胞(Treg)是一类具有显著免疫抑制功能的CD4⁺T细胞亚群。在介导免疫细胞增殖与代谢、维持免疫环境稳态中发挥着重要作用。Treg作为一类调节免疫细胞功能的T细胞亚群，参与机体免疫稳态调节，目前已应用于多项临床实验研究。截至2022年，全球已有超过1100项Treg临床试验，在器官移植、系统性红斑狼疮等方面开展Treg治疗研究。

然而，Treg缺乏自身抗原特异性、难以识别病灶部位抗原靶点和驻留至病灶部位、以及在炎症环境中的表观遗传学特征不稳定等缺点在很大程度上限制了其在临床领域的应用。目前，Treg在炎症环境中的不稳定性、短效性、高特异性、以及缺乏靶向性等缺点是一直未能解决的难题。

发明内容

为解决上述现有技术中的至少部分问题，本发明使用血小板(PLT)修饰Treg细胞得到免疫抑制复合物PLT-Treg，从而提高了Treg细胞的稳定性及免疫抑制功能。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种工程化免疫细胞，其包括调节性T淋巴细胞，所述调节性T淋巴细胞的表面具有至少一个与其共价连接的血小板细胞。

在某些实施方案中，根据本发明所述的工程化免疫细胞，其中，所述连接通过点击化学反应实现。

在某些实施方案中，根据本发明所述的工程化免疫细胞，其中，所述血小板细胞和调节性T淋巴细胞的比例为(1-10)：1。

本发明的第二方面，提供一种根据本发明所述的工程化免疫细胞的制备方法，其包括使所述血小板细胞和调节性T淋巴细胞进行点击化学反应的步骤。

在某些实施方案中，根据本发明所述的工程化免疫细胞的制备方法，其中，所述点击化学反应包括以下步骤：

(1) 将叠氮乙酰基乙酰化甘露糖胺(Ac₄GalNAz)引入调节性T淋巴细胞表面糖基中，得到具有反应性偶氮基团的调节性T淋巴细胞；

(2) 通过二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯(DBCO-PEG₄-NHS)共轭修饰将二苯并环辛炔基团引入血小板细胞得到修饰后的血小板细胞；

(3) 使所述修饰后的血小板细胞和所述具有反应性偶氮基团的调节性T淋巴细胞进行点击化学反应。

在某些实施方案中，根据本发明所述的工程化免疫细胞的制备方法，其中，从脾脏、骨髓、血液、血浆或其组合获得所述调节性T淋巴细胞。

本发明的第三方面，提供药物组合物，其包括根据本发明所述的工程化免疫细胞。

在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，进一步包括药学上可接受的载体。

本发明的第四方面，提供本发明所述的工程化免疫细胞或所述药物组合物在制备诱导对移植物的耐受性、预防和/或治疗细胞和/或体液移植排斥、预防和/或治疗移植物抗宿主病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的药物中的应用。

在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，其中，所述移植物选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物和皮肤移植物中的至少一种。

本发明的工程化免疫细胞通过采用血小板与Treg细胞偶联，形成具有靶向驻留和免疫抑制功能的复合物PLT-Treg，通过分泌抑炎细胞因子，抑制效应细胞增殖活化，并利于Treg细胞释放抗炎介质IL-10和TGF-β，进而诱导巨噬细胞向抗炎表型极化，有效降低机体炎症，抑制免疫排斥并提高Treg细胞稳定性。本发明的工程化免疫细胞性质稳定，制备工艺简单，可实现细胞治疗。

附图说明

图1的A为PLT-Treg采用点击化学一步合成法制备示意图，B为扫描电镜表征血小板形貌。

图2为共聚焦表征不同比例血小板与Treg连接定量分析。

图3为不同比例血小板与Treg连接在炎症环境中稳定性评价。

图4示出了PLT-Treg偶联物对同种异体免疫排斥的体内治疗作用。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

工程化免疫细胞

本发明的一个方面，提供一种工程化免疫细胞，其包括调节性T淋巴细胞，所述调节性T淋巴细胞的表面具有至少一个与其共价连接的血小板细胞。

在一个优选的实施方案中，所述连接通过点击化学反应实现。

在一个优选的实施方案中，所述血小板细胞和调节性T淋巴细胞的比例为(1-10)：1，优选(2-9)：1，还优选(2-8)：1，进一步优选(2-7)：1，更优选(2-6)：1，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1。

本发明中，“调节性T淋巴细胞”与“调节性T细胞”或“Treg细胞”可互换使用，其能够分泌TGF-β、IL-10、CXCR-6等抑炎细胞因子来抑制效应T细胞的增殖或活化，还能够受炎症趋化因子引导，自主靶向至炎症部位。

本发明人经过研究发现，血小板与Treg细胞能够通过点击化学反应进行偶联，形成具有免疫抑制功能的工程化免疫细胞复合物PLT-Treg，两细胞间通过相互作用，能够造成Treg细胞FOXP3蛋白表达上调和免疫调节功能增强，以及IL-17A、IFN-γ等促炎细胞因子的表达下调，有效抑制免疫排斥反应或免疫应激反应。此外，PLT-Treg能够主动趋向到移植器官，靶向缓解移植物抗宿主病。基于此，本发明还提供一种体外提高Treg细胞FOXP3蛋白表达的方法；本发明进一步提供体外下调IL-17A、IFN-γ等促炎细胞因子表达的方法。

本发明中，血小板细胞积极参与免疫细胞募集和宿主防御，在炎症消退阶段血小板P-选择素能够与Treg细胞上的PSGL-1结合，形成聚集体招募至炎症部位，进而提高Treg细胞的免疫抑制调节作用。

本发明中，血小板修饰不仅不会影响Treg的体外存活和功能，且其自然损伤保留能力能够增强Treg的血管递送和免疫抑制功能。

制备方法

本发明的一个方面，提供一种工程化免疫细胞的制备方法，其包括使所述血小板细胞和调节性T淋巴细胞进行点击化学反应的步骤。

在一个优选的实施方案中，所述点击化学反应包括以下步骤：

(1) 将Ac₄GalNAz引入调节性T淋巴细胞表面糖基中，得到具有反应性偶氮基团的调节性T淋巴细胞，其中，所述引入通过糖代谢标记实现；

(2) 通过DBCO-PEG₄-NHS共轭修饰将二苯并环辛炔基团引入血小板细胞得到修饰后的血小板细胞；

(3) 使所述修饰后的血小板细胞和所述具有反应性偶氮基团的调节性T淋巴细胞进行点击化学反应。

在一个具体的实施方案中，所述点击化学反应包括：

(1) 使Treg细胞在含有20-60 μM (优选22-58 μM，进一步优选24-56 μM，更优选26-54 μM，更优选28-52 μM，更优选30-50 μM，例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 μM) Ac₄GalNAz的Treg培养基培养60-85 h (优选61-84h，还优选62-83 h，进一步优选63-82 h，更优选64-81 h，更优选65-80 h，例如65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 h)表达叠氮基团；

(2) 将(1-9)×10⁶(例如1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶)血小板与10-30 μM(优选11-29 μM，进一步优选12-28 μM，更优选13-27 μM，更优选14-26 μM，更优选15-25 μM，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 μM) DBCO-PEG₄-NHS酯在室温下孵育10-50 min(优选11-49 min，还优选12-48 min，进一步优选13-47min，更优选14-46 min，更优选15-45 min，例如15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45 min)获得DBCO标记的血小板；

(3) 将(1-9)×10⁷(例如1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷)的DBCO功能化血小板与(1-9)×10⁶(例如1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶)经Ac₄GalNAz处理的Treg混合，并在30-40℃(例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃)下孵育0.5-2 h(优选0.5-1.9h，还优选0.5-1.8 h，进一步优选0.5-1.7 h，更优选0.5-1.6 h，更优选0.5-1.5 h，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 h)，将过量的叠氮-PEG(例如40、42、45、47、50、52、55、57、60 μM)加入到Treg/血小板混合物中，300-500 g(优选310-490 g，还优选320-480 g，进一步优选330-470 g，更优选340-460 g，更优选350-450 g，例如350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450 g)下离心3-8 min(例如3、4、5、6、7、8 min)后，得到PLT-Treg。

在一个优选的实施方案中，本发明的制备方法进一步包括使过量的含叠氮基团的高分子聚合物，例如叠氮-PEG和Treg/血小板混合物混合，发生点击化学反应，稳定偶联效果。叠氮-PEG的浓度不特别限定，优选20-100 μM，还优选40-80 μM，例如40、50、60、70、80 μM。

药物组合物

本发明的一个方面，提供药物组合物，其包括根据本发明所述的工程化免疫细胞。

在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。

本发明中，“药学上可接受的载体”包括水性溶剂(例如，水，醇/水溶液，盐溶液，肠胃外媒介物，例如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水性溶剂(例如，丙二醇，聚乙二醇，植物油和可注射的有机酯)、分散介质、敷料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂和营养补充剂中的一种或多种。

本发明的药物组合物具有以下优势：

(1) 免疫调节：Treg细胞能够抑制过度的免疫反应，血小板能够在包括伤口愈合和血管修复等方面显示出在调节免疫反应中的作用；

(2) 减少炎症反应：Treg细胞通过分泌抗炎细胞因子(如IL-10和TGF-β)来减少炎症，血小板能够通过释放微粒和调节细胞因子来辅助这一过程；

(3) 促进耐受：Treg细胞促进免疫耐受，有助于防止免疫系统攻击身体自身的组织，血小板可能通过与其他免疫细胞的相互作用来增强这种耐受效应；

(4) 细胞间相互作用：血小板和Treg细胞之间的相互作用，可以增强Treg细胞的抑制功能；

(5) 低风险：同源的血小板和Treg细胞可以减少外来物质的引入，从而降低免疫排斥的风险。

应用

本发明的一个方面，提供本发明所述的工程化免疫细胞在制备诱导对移植物的耐受性、预防和/或治疗细胞和/或体液移植排斥、预防和/或治疗移植物抗宿主病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述移植物选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物和皮肤移植物中的至少一种。

本发明中，自身免疫性疾病包括移植物抗宿主病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、自身免疫性肝病、甲状腺功能亢进/格雷夫斯病、甲状腺功能减退/桥本病、银屑病、皮肌炎、硬皮病、多发硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、葡萄膜炎、Ⅷ因子抑制物综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病、寻常型天胞疮、狼疮肾炎、多肌炎、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎、自身免疫性肾小球肾炎、原发性胆汁性胆管炎、肺肾出血性综合症、白塞病、强直性脊柱炎、肉芽肿样多血管炎、肾病综合征、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症、复发性流产、复发性多软骨炎、自身免疫性脱发、免疫相关不良事件、丙型肝炎诱发的脉管炎、系统性血管炎、风湿热、结节病、自身免疫性心肌炎、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性大疤性类天疤疮、脑脊髓炎、各种皮炎、爱迪生氏病、慢性疲劳综合征、川畸病、格林-巴利综合征、韦格纳病、骨髓增生异常综合征、埃文综合征、帕金森病、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病和特发性肺纤维化中的一种或多种。

本发明中，过敏性疾病包括过敏性呼吸系统疾病(例如过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性气管炎等)、过敏性皮肤疾病(例如过敏性皮炎包括药疹、接触性皮炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏等)、过敏性眼睛疾病(例如过敏性结膜炎)、过敏性消化道疾病和严重过敏性疾病(例如过敏性紫癜、过敏性休克等)中的一种或多种。

实施例1

1、PLT-Treg的制备

如图1所示，收集野生型DBA/1小鼠脾脏通过研磨、离心和磁珠分选，获得CD4⁺NaïveT淋巴细胞，使用含anti-CD3(4 μg/ml)、anti-CD28(4 μg/ml)的RPMI-1640培养基培养细胞，诱导NaïveT细胞定向分化为CD4⁺CD25⁺Treg细胞并进行扩增，利用CD25阳性分选磁珠进行分选，即可获得纯化的Treg细胞，将纯化Treg细胞在含有40 μM Ac₄GalNAz的Treg培养基培养72 h表达叠氮基团。收集C57BL/6小鼠富血小板血浆(PRP)。将PRP加入终浓度为1 µM的前列腺素1(PGE1)中，随后800 g，离心20 min收集血小板。1×10⁶血小板与20 μM DBCO-PEG₄-NHS酯在室温下处理30 min获得DBCO标记的血小板。将1×10⁷DBCO功能化血小板与2.5×10⁶个经Ac₄GalNAz处理的Treg混合，并在37℃下孵育1 h。将过量的叠氮-PEG(50 μM)加入到Treg/血小板混合物中，发生点击化学反应，稳定偶联效果。400 g下离心5 min后，得到PLT-Treg。

2、PLT-Treg的形貌表征

利用共聚焦显微镜(SEM)对PLT-Treg进行表征，通过SEM对PLT-Treg不同比例下连接情况分析，其中，血小板在4：1比例下超过44%的Treg与血小板之间偶联。

3、PLT-Treg的免疫抑制功能评估

血小板在激活下会释放TGF-β，进而提高Treg细胞Foxp3表达水平，阻断炎症环境下Treg细胞向Th17细胞转变，维持Treg细胞的免疫调节功能。因此，Foxp3，IL-17，IFN-γ可以作为Treg免疫抑制功能的评价指标。如图3所示，随着血小板比例升高，Treg细胞内含IFN-γ及IL-17A的比例下降，而Foxp3的比例上升。

实施例2

本实施例示出了PLT-Treg偶联物对同种异体免疫排斥的体内治疗作用。

为了研究PLT-Treg偶联物在延长皮肤移植物存活率方面的潜力，使用移植有1 cm² MHC不匹配BABL/c小鼠皮肤的C57BL/6小鼠建立了免疫排斥模型。分别在第0天和第3天将生理盐水和PLT-Treg偶联物尾静脉注射小鼠，并在第8天收集小鼠组织进行分析。如图4所示，皮肤移植物图像表明，与移植后8天的对照组相比，PLT-Treg缀合物在治疗的小鼠中有效地防止了皮肤排斥反应。过继转移后，用PLT-Treg治疗的小鼠80%的皮肤移植物得到保护，0%的对照组得到保护。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种工程化免疫细胞，其特征在于，其包括调节性T淋巴细胞，所述调节性T淋巴细胞的表面具有至少一个与其连接的血小板细胞。

2.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述连接通过点击化学反应实现。

3.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述血小板细胞和调节性T淋巴细胞的比例为(1-10)：1。

4.一种根据权利要求1-3任一项所述的工程化免疫细胞的制备方法，其特征在于，其包括使所述血小板细胞和调节性T淋巴细胞进行点击化学反应的步骤。

5.根据权利要求4所述的工程化免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述点击化学反应包括以下步骤：

(1) 将Ac₄GalNAz引入调节性T淋巴细胞表面，得到具有反应性偶氮基团的调节性T淋巴细胞；

(2) 通过DBCO-PEG₄-NHS共轭修饰将二苯并环辛炔基团引入血小板细胞得到修饰后的血小板细胞；

(3) 使所述修饰后的血小板细胞和所述具有反应性偶氮基团的调节性T淋巴细胞进行点击化学反应。

6.根据权利要求4所述的工程化免疫细胞的制备方法，其特征在于，从脾脏、骨髓、血液、血浆或其组合获得所述调节性T淋巴细胞。

7.药物组合物，其特征在于，其包括根据权利要求1-3任一项所述的工程化免疫细胞。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1-3任一项所述的工程化免疫细胞在制备诱导对移植物的耐受性、预防和/或治疗细胞和/或体液移植排斥、预防和/或治疗移植物抗宿主病、自身免疫性疾病或过敏性疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述移植物选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物和皮肤移植物中的至少一种。