CN118581135A - 一种杨树cdpk6基因在林木育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杨树CDPK6基因在林木育种中的应用。通过在杨树中过表达CDPK6基因可以获得材质优良的杨树植株。通过检测植株中CDPK6基因的表达水平可以预测杨树植株的发育状况。本发明还提供了一种杨树CDPK6基因，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示或者所编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了一种调控杨树茎部木质部细胞壁厚度和/或木质部细胞层数的方法，以及该方法所用到的转化载体、引物和菌株。本发明首次揭示了CDPK6基因在促进杨树木质部细胞壁增厚的应用特征，在杨树材性相关遗传改良中具有重要意义。

Description

一种杨树CDPK6基因在林木育种中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种杨树CDPK6基因在林木育种中的应用

背景技术

木材作为自然界重要的可再生生物质能源，是替代石油和天然气等化石燃料的潜在自然资源；同时，木材在纸浆造纸、胶合板材和包装材料等领域也具有重要的应用和经济价值。因此，提高木材单位面积蓄积量和改善木材品质已成为林木育种研究的重要目标。木材形成是一复杂的生物学过程，涉及顶端分生组织及维管形成层细胞的连续分裂与分化，再经细胞壁增厚、细胞程序化死亡和心材形成等过程。功能基因组学研究表明，木材形成是由多基因控制的数量性状，受多基因、多层次和多途径协同作用的结果，有着非常复杂的遗传调控机制。

其中，蛋白激酶在植物次生生长和细胞信号转导等系统中形成了复杂的遗传交互网络。在植物中，目前研究较多的蛋白激酶之一是Ca²⁺/CaM依赖蛋白激酶，该激酶包含四个高度保守的结构域，分别是N端可变结构域、激酶结构域、自抑制连接域，以及C端具有EF手型结构的类钙调素调控结构域。此外，Ca²⁺/CaM依赖蛋白激酶主要通过将激酶结构域内的ATP的磷酸基团转移并共价结合到特定蛋白质分子中的特定丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，从而引起蛋白质和酶的构象与活性的改变，进一步影响蛋白对下游基因的调控功能。

杨树(Populus L.)是我国北方主要造林树种，其快速生长特性使其成为观察林木生长发育和生理生化过程的理想选择。作为模式树木，杨树具有完整测序的基因组序列和遗传背景，为基因功能研究提供了强大支持。相较于其它树种，杨树拥有较小的基因组，简化了基因定位、克隆和表达等研究步骤。因此，利用分子生物学和基因工程等技术手段研究影响杨树木材品质的优良基因具有重要应用意义。

发明内容

本发明提供了一种杨树CDPK6基因在林木育种中的应用。

可选的一种应用，通过控制所述基因的表达水平来调控树木木质部的发育情况。

可选的另外一种应用，通过检测植物中CDPK6基因的表达水平来预测树木木质部的发育情况。

本发明还提供了一种调控杨树木质部发育的方法，通过基因工程的手段使得杨树CDPK6基因过表达或者表达受到抑制。

上述可选的一种方法，通过农杆菌转化法将CDPK6过表达载体转化到杨树细胞内获得CDPK6过表达的杨树植株，促进植株木质部的发育。

本发明还提供了一种杨树CDPK6基因，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示或者所编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

一组扩增杨树CDPK6基因的引物组，所述引物组的上、下游引物如序列表SEQ IDNO：3-4所示。

一种含杨树CDPK6基因的载体，所述载体为过表达质粒载体。

可选的，一种上述的载体的构建方法，以pBI121为载体骨架，选择合适的酶切位点将载体骨架线性化，根据酶切位点设计CDPK6基因的5'-3'端同源重组引物，再利用同源重组的方法将CDPK6基因与pBI121载体骨架相连获得重组载体。

一种含上述载体的菌株。

本发明的有益效果：

本发明深度挖掘杨树维管组织转录组数据，筛选并成功克隆出CDPK6基因，并通过叶盘法遗传转化技术对该基因进行功能验证，探究了CDPK6基因的生物学功能，首次揭示了该基因在调控杨树木质部发育中的作用，主要体现在CDPK6基因的对木质部细胞壁厚度、细胞数量、植株高度以及地茎等方面的影响效果，在杨树木材品质遗传改良中发挥重要作用。

附图说明

图1：本发明中pBI121过表达载体的载体图谱展示。

图2：克隆杨树CDPK6基因的PCR产物凝胶电泳结果展示。

图3：杨树CDPK6基因的克隆序列测序比对结果展示。

图4：CDPK6过表达杨树植株的鉴定结果展示。

图5：野生型植株，CDPK6过表达杨树植株的表型展示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

具体实施方式

本发明基于共表达网络分析、组织特异性表达模式和关联分析鉴定到一个参与杨树木材形成的Ca²⁺/CaM依赖蛋白激酶CDPK6，以母本银白杨(Populus alba)和父本腺毛杨(Populus glandulosa)杂交得到的银腺杨(Populus alba x Populus tremulavar.glandulosa,84K)为材料，提取其RNA并反转录获取cDNA，根据CDPK6的特异性引物克隆该基因全长CDS序列，相应核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。CDPK6基因CDS全长1566bp，编码的蛋白质由522个氨基酸残基组成，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该蛋白分子量为57.42KDa，等电点为6.14。

基于该研究发现，本发明提供以下技术方案：

一种杨树CDPK6基因在林木育种中的应用。

优选的，所述杨树指的是杨属植物，包括胡杨、白杨、棉白杨、银腺杨和毛白杨。

一种所述的应用为通过控制所述基因的表达水平来调控树木木质部的发育情况。

可选的，控制基因的表达包括过表达和抑制表达。

另一种应用为通过检测植物中CDPK6基因的表达水平来预测植物木质部的发育情况。

优选的，通过与标准植株中CDPK6基因的表达水平对比，预测待测植株的生物学表型。

可选的，检测植物中CDPK6基因的表达水平的方法包括检测相应的CDPK6基因的拷贝数、CDPK6基因的转录水平和CDPK6基因的翻译水平。

本发明还提供了一种调控杨树木质部发育的方法，通过基因工程的手段使得杨树CDPK6基因过表达或者表达受到抑制。

优选的基因工程手段包括基因编辑技术、基因沉默技术和转基因技术。

更优的，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas基因编辑技术；基因沉默技术包括RNA干扰技术；转基因技术包括农杆菌介导转化技术、电穿孔技术和显微注射技术。

一种促进杨树植株的木质发育的方法，通过农杆菌转化法将CDPK6过表达载体转化到杨树细胞内获得CDPK6过表达杨树植株。

所述促进杨树植株的木质发育的表现形式包括木质部细胞壁厚度增加、细胞数量增多、植株高度增高和地茎增粗的一种或多种。

优选的，上述方法至少包括以下步骤之一：

CDPK6基因片段的克隆：以84K银腺杨为材料，根据CDPK6基因的编码序列，设计特异性引物克隆该片段；

CDPK6过表达载体的构建：将上述CDPK6基因开放阅读框克隆转入一个植物过表达载体，使其受强启动子的驱使表达；

CDPK6过表达载体农杆菌的获取：将构建完毕的CDPK6基因过表达载体，通过热激等方法转入对杨树具有强侵染能力的农杆菌菌株；

CDPK6过表达杨树植株获取：通过农杆菌介导的叶盘转化法将CDPK6基因的过表达载体导入84K银腺杨，进一步获取具有抗生素抗性的CDPK6过表达转基因植株；

CDPK6过表达杨树植株鉴定：通过PCR扩增技术检测转基因植株基因组DNA中的表达载体标签序列和农杆菌序列，并通过实时荧光定量PCR检测CDPK6基因在转基因植株中的表达量；

CDPK6基因过表达杨树植株表型检测：利用间苯三酚染色和扫描电镜观察CDPK6过表达转基因植株的维管组织细胞。

一种杨树CDPK6基因，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示或者所编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

一组扩增CDPK6基因的引物组，所述引物组的上、下游引物如序列表SEQ ID NO：3-4所示。一组检测CDPK6基因的引物组，所述引物组的上、下游引物如序列表SEQ ID NO：5-6所示。

一种含CDPK6基因的载体，所述载体为过表达质粒载体。

可选的，过表达载体包括pCXSN，pCAMBIA1300，pBI121载体。

优选的，过表达载体为pBI121载体。

一种上述载体的构建方法，以pBI121为载体骨架(如图1所示)，选择合适的酶切位点将载体骨架线性化，根据酶切位点设计CDPK6基因的5'-3'端同源重组引物，在利用同源重组方法将CDPK6基因与pBI121载体骨架相连获得重组载体。

可选的，一种上述方法中的所述酶切位点所对应的内切酶为BamHI酶和KpnI酶。

可选的，一种上述方法中所用到的CDPK6基因的5'-3'端同源重组引物组，序列如SEQ ID NO：7-8所示。

一种含上述载体的菌株。

优选的，所述菌株包括大肠杆菌和农杆菌。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

CDPK6基因的克隆

(1)以84K银腺杨组培苗为材料，首先将84K茎段在无菌无酶研钵中充分研磨，使用诺唯赞生物技术公司的离心柱型RNA提取试剂盒进行操作提取植物总RNA；

(2)采用南京诺唯赞公司的反转录cDNA第一链合成试剂盒(R312-01/02)进行反转录，反应体系(按顺序添加)和条件分别为均按照说明书进行操作合成cDNA；

(3)根据CDPK6基因的CDS序列，设计CDPK6基因的上下游引物，PCR反应的5'-3'端引物为：CDPK6-F：ATGGGAAACTGCAACAGCCTC(SEQ ID NO：3)，CDPK6-R：TTTGCGCCGTCTGGTTGG(SEQ ID NO：4)。此外，PCR扩增及反应条件均按照说明书进行；

(4)PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离得到长约1563bp(不含终止子TGA序列)，如图2所示。纯化回收后，送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，测序结果如图3和SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列长度为1566bp，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，由522个氨基酸组成的蛋白质。

实施例2

CDPK6过表达载体的构建

(1)以表达载体pBI121为骨架，使用BamHI酶和KpnI酶将载体骨架线性化，根据酶切位点设计CDPK6基因的5'-3'端同源重组引物为CDPK6-F：cgggggactctagaggatccATGGGAAACTGCAACAGCCTC(SEQ ID NO.7)，CDPK6-R：tgctcaccatggtaccTTTGCGCCGTCTGGTTGG(SEQID NO.8)。

(2)重组反应使用南京诺唯赞生物技术公司的II One StepCloning Kit C112试剂盒。双酶切体系及重组反应体系和反应条件均严格按照说明书进行，通过将连接产物pBI121-CDPK6转化大肠杆菌获得阳性菌株，培养阳性菌株后提取获得pBI121-CDPK6质粒。

实施例3

重组农杆菌的获得

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态(GV3101)于室温或者手心融化至冰水混合状态后插入冰中；

(2)在100μL感受态细胞中加入0.01-1μg质粒DNA(pBI121-CDPK6质粒)，用手轻弹拨打混匀；

(3)依次置于冰上冰浴5min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

(4)加入700μL溶菌肉汤(Luria-Bertani，LB)液体培养基(不含任何抗生素)，于28℃、200rpm，摇菌振荡3h；

(5)6000rpm离心1min；弃部分上清，留取约100-120μL菌液，轻轻吹打混匀重悬菌块，涂布于含相应抗生素的LB(50mg/L卡那霉素)固体平板上，静置15min，待表面菌液晾干；

(6)倒置放于28℃培养箱暗培养42-48h；

(7)利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测阳性菌落，4℃保存，用于后续对杨树叶片的转基因侵染。

实施例4

CDPK6过表达杨树植株获取

(1)将实施例3中检测正确的农杆菌单菌落或甘油保存的农杆菌菌液活化扩繁，放入100mL无菌锥形瓶中，按照1∶50稀释至50mL含抗生素LB液体培养基中(50mg/L卡那霉素，17mg/L利福平)，28℃、200rpm振荡培养24-36h，直至菌液颜色呈现橙黄色，OD值A600为1.0左右；

(2)取400-1000uL的小摇菌液，加至50mL含抗生素(50mg/L卡那霉素，17mg/L利福平)的液体LB培养基中，于28℃，200rpm振荡培养，摇至OD600为0.5-0.6，即可侵染。

(3)选取长势良好的84K组培苗，放置于超净台中，且从无菌组培苗中选取顶端数第4～6片叶，使用无菌手术刀片在叶片主脉上横向划出伤口，放入没有加抗生素的分化培养基上1～2天。

(4)在超净台中将农杆菌液倒入无菌的50ml离心管中，4℃3500rpm离心10分钟，倒掉上清液，加入等体积的无菌重悬液(1/2MS，3％蔗糖，100uMAS)，轻轻晃动使菌体重悬，放入冰中待使用。

(5)将切好的叶片放入重悬的农杆菌菌液中浸染10-15min，期间不断缓慢晃动，利于叶片受伤部位充分接触菌液。

(6)使用无菌镊子取出叶片，置于无菌的滤纸吸去过多的菌液，最后将吸干菌液后的叶片放置在没有加抗生素的共生培养基，叶片正面朝下，在25℃下暗培养60-70h，直至叶片附近长出菌群。

(7)在超净台中将暗处理的共培养的叶片放置于事先灭菌好的滤纸上吸去过多的菌群，再转移至有筛选压(30mg/L卡那霉素)和脱菌(200mg/mL特美汀)的选择培养基进行筛选培养，光照周期为光照16h/黑暗8h，温度25℃，期间每隔8-10天更换一次培养基，直至长出抗性芽，在不定芽长到半公分左右后，使用无菌的镊子或者手术刀切下有不定芽的叶盘，放置新的选择培养基使其继续生长。

(8)当不定芽长至1-2厘米时，在超净台中使用无菌的镊子或者手术刀将不定芽单个切下，并放置含有筛选压(30mg/L卡那霉素)和脱菌(200mg/mL特美汀)的生根培养基上进行生根培养，待两周左右不定芽生根，随后继续进行继代扩繁，其中，第一次继代培养使用含有筛选压(30mg/L卡那霉素)和脱菌(200mg/mL特美汀)的生根培养基，而之后继代培养使用仅含有脱菌(200mg/mL特美汀)的生根培养基。第一次扩繁生根的转基因苗时即可进行叶片的分子检测。

实施例5

(1)通过南京诺唯赞生物科技有限公司的植物DNA提取试剂盒(FastPure PlantDNA Isolation Mini Kit)提取生长1个月的CDPK6过表达杨树无性系的叶片基因组DNA，利用PCR技术检测克隆位点两端载体序列和农杆菌序列，PCR结果中克隆位点两端载体序列存在，条带长度正确，而农杆菌序列条带不存在即为阳性苗。其中5'-3'端引物序列为：pBI121-F：acagttgcgcagcctgaatg(SEQ ID NO.9)，pBI121-R：gatgcatcaggccgacagtc(SEQID NO.10)；GV3101-VirD2-F：TTCGTCACGGCATAGTCCTG(SEQ ID NO.11)，GV3101-VirD2-R：TTGCTCGGTACGGATGGAAG(SEQ ID NO.12)；

结果如图4所示，本发明获取的CDPK6过表达杨树#1，#2，#5，#6，#7，#8和#9株系，PCR克隆位点两端载体序列存在(图4A)，条带长度正确，而农杆菌序列条带不存在(图4B)；

(2)使用诺唯赞生物技术公司的离心柱型RNA提取试剂盒进行操作提取植物总RNA，并进一步利用反转录cDNA第一链合成试剂盒(R312-01/02)进行反转录合成cDNA，随后通过实时荧光定量PCR方法检测CDPK6基因在过表达杨树株系中的表达量，相较于对照植株，CDPK6基因在CDPK6过表达杨树植株中的表达量显著增加，该过表达杨树植株即为阳性植株，CDPK6基因的5'-3'端引物序列为：CDPK6-qPCR-F：

GGACACGGACAACAATGGAACAATC(SEQ ID NO.5)，CDPK6-qPCR-R：CTGCCTCACTTCAGACTCAGAAAGC(SEQ ID NO.6)；实验选择18S作为内参，内参的5'-3'端引物序列为18S-F：GGCATGGAAGGTGATGCAGATC；18S-R：CTGTGTCAAACAAGAACTTGTCC，配置PCR反应体系，轻轻充分混合，并快速离心以免挂壁，随后进行PCR反应，PCR具体程序设置为：①预变性：95℃/30秒；②PCR反应(变性，退火和延伸)：95℃/5秒，60℃/35秒(可根据拷贝数调整)，40个循环；③熔解曲线：95℃/15s，60℃/1min，95℃/15s。

结果如图4C所示，本发明获取的CDPK6过表达杨树#1，#7和#9株系，相较于对照植株，CDPK6基因在以上CDPK6过表达杨树株系中的表达量分别增加了9.33倍，13.02倍和16.18倍。

(3)结合PCR克隆和实时荧光定量PCR结果，本实验获取的CDPK6过表达杨树株系为#1，#7和#9，如图5A所示。

实施例6

CDPK6基因的过表达杨树植株表型检测

(1)首先对CDPK6过表达杨树的生长与生理性状进行测定，主要包括株高、地径、第15节间长度以及第15节间宽度，如图5B-C所示，同对照植株相比较，CDPK6过表达杨树植株中的株高显著增加了26.56％，CDPK6过表达杨树植株中的地径显著增加了12.09％、CDPK6过表达杨树植株中的第15节间长度显著增加了23.56％，以及CDPK6过表达杨树植株中的第15节间宽度显著增加了18.12％。

(2)利用间苯三酚染色和生物扫描电镜技术对CDPK6过表达杨树的木质部细胞形态以及细胞壁厚度进行观察分析，如图5D-F所示，同对照植株相比较，CDPK6过表达杨树株系中的木质部层数和细胞壁厚度分别显著增加了42.10％和18.02％。

(3)除此之外，研究还发现CDPK6基因在过表达植株中的转录水平与过表达植株的生长表型(株高、地径、木质部层数、细胞壁厚度)存在正相关，且相关系数(r)分别为0.98、0.96、0.94、0.97。

综上所述，本发明揭示了CDPK6基因对杨树植株的生长表型(株高、地径、木质部层数、细胞壁厚度)具有正调控功能。本发明提供了通过获取CDPK6过表达杨树植株来获取优良木材品质性状杨树材料的应用，以及通过检测植株叶片中CDPK6基因的表达来预测植株的发育情况从而为优良性状植株的筛选提供技术支持。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种杨树CDPK6基因在林木育种中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过控制所述基因的表达水平来调控树木木质部的发育情况。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过检测林木中CDPK6基因的表达水平来预测树木木质部的发育情况。

4.一种调控杨树木质部发育的方法，其特征在于，通过基因工程的手段使得杨树CDPK6基因过表达或者表达受到抑制。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过农杆菌转化法将CDPK6过表达载体转化到杨树细胞内获得CDPK6过表达的杨树植株，促进植株木质部的发育。

6.一种杨树CDPK6基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示或者所编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

7.一组扩增权利要求6中基因的引物组，其特征在于，所述引物组的上、下游引物如序列表SEQ ID NO：3-4所示。

8.一种含权利要求6中基因的载体，其特征在于，所述载体为过表达质粒载体。

9.如权利要求8中所述的载体的构建方法，其特征在于，以pBI121为载体骨架，选择合适的酶切位点将载体骨架线性化，根据酶切位点设计CDPK6基因的5'-3'端同源重组引物，再利用同源重组的方法将CDPK6基因与pBI121载体骨架相连获得重组载体。

10.一种含权利要求8或者9中构建的载体的菌株。