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CN118556071A - 金珊瑚的糖类结合多肽 - Google Patents

金珊瑚的糖类结合多肽 Download PDF

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CN118556071A
CN118556071A CN202180104580.7A CN202180104580A CN118556071A CN 118556071 A CN118556071 A CN 118556071A CN 202180104580 A CN202180104580 A CN 202180104580A CN 118556071 A CN118556071 A CN 118556071A
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CN
China
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polypeptide
lectin
sava
binding
cell
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Pending
Application number
CN202180104580.7A
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English (en)
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U·安德杰尔科维奇
I·武卡西诺维奇
D·斯拉迪科
J·拉赫
M·福诺维奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Belgrade Sav Antiviral Co ltd
Joseph Stephen Institute
School Of Chemistry
College Of Chemistry Technology And Metallurgy
Univerza Ljubljana v Fakulteta za Farmazijo
Original Assignee
Belgrade Sav Antiviral Co ltd
Joseph Stephen Institute
School Of Chemistry
College Of Chemistry Technology And Metallurgy
Univerza Ljubljana v Fakulteta za Farmazijo
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Publication date
Application filed by Belgrade Sav Antiviral Co ltd, Joseph Stephen Institute, School Of Chemistry, College Of Chemistry Technology And Metallurgy, Univerza Ljubljana v Fakulteta za Farmazijo filed Critical Belgrade Sav Antiviral Co ltd
Publication of CN118556071A publication Critical patent/CN118556071A/zh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
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Abstract

本发明涉及一种新的多肽，其显示出特异性糖类结合活性，特别是针对含有甘露糖的聚糖的特异性糖类结合活性，以及其体内和离体使用方法。使用方法包括：在适于多肽结合糖类的条件下，将本发明的多肽施用于例如存在糖类的样本或受试者。糖类可以由病原体表达。本发明涉及具有抗病原体活性(如抗病毒、抗细菌、抗真菌或抗肿瘤活性)的多肽及其组合物。还提供了预防或治疗由表达糖类(例如糖蛋白)的病原体介导的疾病和病症的方法。

Description

金珊瑚的糖类结合多肽
技术领域
本发明涉及一种新的多肽，其显示出特异性糖类结合活性，特别是针对含有甘露糖的聚糖的特异性糖类结合活性，以及其体内和离体使用方法。使用方法包括：在适于多肽结合糖类的条件下，将本发明的多肽施用于例如存在糖类的样本或受试者。糖类可以由病原体表达。本发明涉及具有抗病原体活性(如抗病毒、抗细菌、抗真菌或抗肿瘤活性)的多肽及其组合物。还提供了预防或治疗由表达糖类(例如糖蛋白)的病原体介导的疾病和病症的方法。
背景技术
除了免疫球蛋白和用于转运或趋化性的游离单糖或二糖的受体之外，对所识别的糖(糖类/聚糖)不显示酶活性的糖类结合蛋白被称为凝集素。凝集素存在于几乎所有生物体中：原核生物、海珊瑚、藻类、真菌、高等植物、无脊椎动物、脊椎动物。糖类识别发生在大量不同的生物环境中。因此，凝集素是由许多不相关的蛋白质家族组成的高度多样化的蛋白质组。不同的凝集素家族通常在结构上不相关(BBA 1572 198)。凝集素的糖类特异性是不同的。当通过聚糖阵列分析时，甚至可以分类在例如甘露糖结合凝集素组中的那些凝集素也不表现出完全相同的糖类特异性(功能性糖组学联合会(Consortium for FunctionalGlycomics))。蛋白质和聚糖之间的识别是传递聚糖中编码的生物信息(所谓的“糖代码”)的主要机制。该信息在许多生物过程中是必需的，包括细胞内和细胞间转运过程、先天免疫的传感器分支、细胞-细胞(基质)粘附或迁移的调节以及对分化和恶性肿瘤有影响的阳性/阴性生长控制(BBA 1572165)。
凝集素在医学、生物技术和生命科学中具有许多有用的应用。不同的凝集素表现出抗细菌、抗真菌、抗病毒或抗肿瘤活性。对于不同的植物和动物凝集素，已经观察到特别强的抗病毒活性。作为病毒进入抑制剂的一类明确定义的抗HIV剂是甘露糖结合凝集素。许多甘露糖特异性凝集素(朱顶红杂交体凝集素(Hippeastrum hybrid agglutinin)，雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin)，阿克汀文(actinohivin)，绿色微囊藻凝集素(Microcystis viridis lectinin)，香蕉凝集素，阿氏颤藻凝集素(Oscillatoriaagardhii agglutinin)，大花蕙兰杂交体凝集素(Cymbidium hybrid lectinin)，火烧兰凝集素(Epipactis helleborine lectinin)，卵形对叶兰凝集素(Listera ovate lectin)等)被认为是潜在的抗HIV剂(AR 18 191，AR 71 237，JBC 28041005，COV 0 95)。然而，细胞毒性、人红细胞的凝集、促有丝分裂性(外周血单核细胞的促有丝分裂刺激)、炎症活性或针对突变的HIV菌株的低遗传屏障是大多数天然凝集素(AR 71 237、JV 80 8411)的医学应用的障碍。
尽管如此，两种凝集素蓝藻抗病毒蛋白-N(AMB 86 805)和scytovirin是已经商业化的药物的活性组分，而格瑞弗森(griffithsin)处于临床试验的第三阶段。这些凝集素抑制病毒进入细胞，但也抑制细胞-细胞病毒转移并抑制HIV感染的和未感染的CD4+T淋巴细胞之间的合胞体形成(JAC 69 582)。作用机制包括防止HIV包膜糖蛋白(GP120)与细胞受体蛋白(CD4)和共受体(主要是CXCR4或CCR5)之间的相互作用(JBC 280 41005)。甘露糖特异性凝集素之间的糖类特异性的差异已被用于改善抗HIV活性，因为不同凝集素的组合可以显示出针对HIV的协同活性，即EC50值的改善(ARHR 28 1513)。此外，HIV-1暴露于两种糖类结合剂的组合显著延迟了耐药性发展，并选择了适应性受损的病毒株(JAC 69 582)。此外，逃避凝集素药物的病毒突变，如缺失高度保守的N-糖基化位点，可导致至少部分病毒聚糖屏蔽的丧失，并因此暴露GP120上先前隐藏的免疫原性表位。这可以允许病毒复制的有效免疫抑制和病毒从体循环中清除。换言之，当HIV突变以规避凝集素的作用时，它可能变得对宿主的免疫系统更敏感。
HIV不是唯一的病原体，甚至不是唯一的表达可被凝集素靶向的糖蛋白的病毒。可以用不同甘露糖特异性凝集素中和的人和动物包膜的病毒包括丙型肝炎(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)、甲型和乙型流感病毒、SARS-冠状病毒(SARS-CoV-1和SARS-Cov-2)、埃博拉病毒、登革热病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)和单纯疱疹病毒2(HSV-2)、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人巨细胞病毒(HCMV)、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)(MP 74 330)。
鉴于上述凝集素的多种应用以及考虑到COVID-19的大规模流行特别需要更多更好的抗病毒药物，明确需要这种类型的另外的药物，这些药物表现出抗病毒活性，而没有与一些已知凝集素相关的问题。通常需要能够治疗或预防病毒感染或与病毒感染相关的疾病或并发症的抗病毒剂。
发明内容
本发明人已经鉴定、纯化和表征了一种来自金珊瑚(Savalia(Gerardia)savaglia)的新凝集素。本发明人已经鉴定了该凝集素的四种非常密切相关的同种型(参见表1)。同种型的序列提供为SEQ ID NO：1、2、3和4。SEQ ID NO：1是在金珊瑚中表达的最普遍(显性)形式的序列(如通过质谱法测定的)。凝集素的所有四种同种型具有类似的性质，并且它们可以互换使用或作为混合物使用。凝集素在本文中可称为Sava凝集素或Savalithsin。该术语可用于指包含四种同种型的混合物，其可任选地包括如本文所定义的其他同种型或变体。提及重组产生的Savalithsin通常是指显性形式(dominant form)。
SEQ ID NO：1、2、3和4中的每个与其他已知凝集素具有小于40％的序列同一性。与已知凝集素相比，Sava凝集素表现出与不同聚糖结构的特异性结合。Sava凝集素能够结合到示例性人类病毒的实验室菌株和分离物，典型的是包膜人类病毒，包括HIV、HSV2、Sars-COV-2和甲型流感。抗病毒活性(抑制感染，和/或抑制传播和/或生长)已经得到证实。Sava凝集素表现出对某些细菌和酵母菌种生长的抑制作用，以及与某些酵母的细胞壁结合的能力。Sava凝集素在高达pH 10的碱性环境中具有高稳定性，在高达75℃的温度下具有热稳定性，允许在一系列条件下储存。与大多数已知的植物和动物凝集素不同，Sava凝集素对人外周血单核细胞没有表现出显著的促有丝分裂作用。即使高剂量的Sava凝集素对健康人细胞也不是致死的。总之，这表明Sava凝集素可能特别适用于多种应用，包括作为施用于患者的治疗剂或预防剂和/或用作局部杀微生物剂。
本文提供了：
一种具有特异性糖类(carbohydrate)结合活性的多肽，任选地为工程化多肽，其中，所述多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：
(a)SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列；
(b)氨基酸序列，其为SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列的片段，所述片段包含所述序列中的至少8个连续氨基酸；
(c)与(a)、(b)或(c)中任一项的所述氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列；
任选地，其中，所述多肽被工程化以在N端包括另外的甲硫氨酸和/或在N和/或C端包括蛋白质纯化或其他标签，该标签可以通过接头连接至末端。
多肽可以以组合物提供，该组合物通常包含有效量的防腐剂。所述组合物可适合用作表面杀微生物剂。所述组合物可适于向受试者施用。多肽可以是固定化的。
本发明的多肽可用于结合糖类的各种方法中。因此，本文提供了包括将本发明的多肽施用于例如其中存在糖类的样本或受试者的方法。糖类可以作为在病原体表面上表达的聚糖组分存在。病原体可以是病毒、细菌、真菌或癌细胞。因此，多肽可以具有抗细菌活性、抗真菌活性、抗病毒活性或抗肿瘤活性。所述方法可以是治疗或预防所述病原体的感染或与所述感染相关的疾病或并发症的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的多肽。
本发明提供了编码本发明的多肽的核酸。本发明还提供了包含这种核酸或载体的宿主细胞，如细菌或植物细胞。
附图说明
图1.左：分离和纯化程序的流程图；右：Sava凝集素分离物的SDS-PAGE(线1-MW标志物(makers)，线2和3-Sava凝集素分别为0.1μg/μL和1μg/μL)
图2.Sava凝集素的分子量测定。顶部：MLADI-TOF质谱；底部：在Superdex 75色谱柱上的尺寸排阻色谱显示对于Sava凝集素的Ve为12.7ml，其对应于～16.9kDa的分子量(插图显示用于分子量校准的蛋白质的洗脱体积(Ve))。
图3.一级结构阐明的流程图。
图4.甘露糖和甲基甘露糖苷与Sava凝集素结合的热力学参数。
图5.单独的和在糖类存在下的Sava凝集素的差示扫描量热法热谱图。
图6.GdmCl用于Sava凝集素变性的荧光分光光度分析。
顶部：不同温度下的变性曲线；中间：在不同浓度的GdmCl下与Sava凝集素的混合物中1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)的荧光；底部：单独的和在甘露糖存在下，在不同的Gdmc1溶液中的Sava凝集素的荧光强度。
图7.单独的和在糖类存在下的Sava凝集素(0.6mg/mL)的圆二色性(CD)光谱。顶部：远-UV CD光谱；底部：近-UV CD光谱。
图8.用X射线晶体学方法确定了Sava凝集素的三级结构。
左上：Sava凝集素的晶体和X射线衍射图；中上：Sava凝集素结构的带状图；右上：计算机提出的Sava凝集素二聚体的带状图；下部：来自不同视角的Sava凝集素的空间填充模型。
图9.Sava凝集素结构的计算研究。顶部：具有结合糖类位点和负责糖类结合的氨基酸的带状结构；底部：Sava凝集素多聚化的模型。
图10.Sava凝集素的寡聚化。顶部：Sava凝集素的MLADI-TOF质谱；底部：短暂暴露于交联剂戊二醛的Sava凝集素样本的SDS-PAGE(线1-MW标志物，线2-Sava凝集素10μg/μL，线3-Sava凝集素5μg/μL和线4-Sava凝集素1μg/μL)。
图11.Sava凝集素对PBMC(外周血单核细胞)代谢活性的影响。顶部：实验流程图。
图12.Sava凝集素对TZM-bl细胞系代谢活性的影响。
顶部：实验流程图。
图13.Sava凝集素对CaCo-2细胞系的活力的影响。(人结直肠腺癌细胞的永生化细胞系)。顶部：25000个细胞/孔；中间：10000个细胞/孔。每个图中左侧和右侧的标记组代表两个不同批次的Sava凝集素。每批次以一式三份测定。底部：实验流程图。
图14.Sava凝集素对A549细胞系(腺癌人肺泡的基底上皮细胞)的活力的影响。图中左侧和右侧的标记组代表两个不同批次的Sava凝集素。每批次以一式三份测定。顶部：实验流程图。
图15.Sava凝集素对ELVIS细胞系的活力的影响。左图和右图表示两个不同批次的Sava凝集素。每批次以一式三份测定。顶部：实验流程图。
图16.Sava凝集素对VeroE6细胞系的活力的影响。图中左侧和右侧的标记组代表两个不同批次的Sava凝集素。每批次以一式三份测定。顶部：实验流程图。
图17.Sava凝集素对HIV-1不同菌株感染TZM-bl细胞的抑制作用
顶部：实验流程图。考虑Sava凝集素单体的分子量来计算摩尔浓度。
图18.Sava凝集素对两种不同HIV-1菌株的PBMC感染的抑制作用，左：NL4-3；右：NL4-3 92TH14。顶部：实验流程图。考虑Sava凝集素单体的分子量来计算摩尔浓度。
图19.Sava凝集素对单纯疱疹病毒感染ELVIS细胞的抑制作用。顶部：实验流程图。左：HSV-1；右：HSV-2。每个图中左侧和右侧的标记组代表两个不同批次的Sava凝集素。
图20.Sava凝集素对HSV-2感染Vero细胞的抑制作用。顶部：实验流程图。考虑Sava凝集素单体的分子量来计算摩尔浓度。
图21.Sava凝集素对SARS-CoV-2感染CaCo-2细胞的抑制作用。顶部：实验流程图。左：假型；右：野生型。每个图中左侧和右侧的标记组代表两个不同批次的Sava凝集素。
图22.异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的Sava凝集素与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞壁聚糖相互作用的共聚焦显微镜照片。
图23.通过Sava凝集素进行糖蛋白的蛋白质印迹检测。通过链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)和DAB(3,3'-二氨基联苯胺)可视化生物素标记的Sava凝集素。线1和线2：转化酶(含有甘露糖型N-聚糖的酿酒酵母外部糖蛋白)分别为1μg和0.1μg；线3：来自HeLa细胞的质膜蛋白提取物，10μg总蛋白。
图24.Sava凝集素的表达。顶部：本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达的成功通过共表达绿色荧光蛋白-叶片上可见的亮斑块来证实；底部：大肠杆菌表达的不同时间点的SDS-PAGE，黑色框显示Sava凝集素。
序列的简要说明
SEQ ID NO：1是Sava凝集素的16803Da变体的全长氨基酸序列。它含有149个氨基酸。它是显性形式。
SEQ ID NO：2是Sava凝集素的16769Da变体的全长氨基酸序列。它含有149个氨基酸。相对于SEQ ID NO：1，存在一个替换，即Phe61Leu。
SEQ ID NO：3是Sava凝集素的16617Da变体的全长氨基酸序列。它含有148个氨基酸。除了C端Trp缺失之外，它与SEQ ID NO：1相同。
SEQ ID NO：4是Sava凝集素的16583Da变体的全长氨基酸序列。它含有148个氨基酸。除了C端Trp缺失之外，它与SEQ ID NO：2相同(即它相对于SEQ ID NO：1包括Phe61Leu)。
SEQ ID NO：5是编码具有SEQ ID NO：1的序列的多肽的示例性核苷酸序列。为了在细菌细胞中表达，例如在大肠杆菌中，该序列可以被修饰以包括用于额外的N端甲硫氨酸的额外5'密码子。通常，可以将该序列插入载体中以在细菌细胞中表达。例如，可以使用NcoI/XhoI限制性位点将序列插入载体pET28a+中。
SEQ ID NO：6、7、8和9分别对应于SEQ ID NO：1至4，各自具有另外的N端甲硫氨酸。
具体实施方式
应当理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要进行定制。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而并不旨在进行限制。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，都通过引用的方式以其整体并入本文。
如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种多肽”包括“多种多肽”等。
具有特异性糖类结合活性的多肽
具有特异性糖类结合活性的多肽的功能特征
该部分阐述了具有糖类结合活性的多肽的功能特征，其除了在紧接着的部分中概述的结构特征之外也适用。
多肽优选地表现出以下特征中的一种或多种：
-特异性糖类结合活性，优选对含有甘露糖的聚糖(例如对甘露糖和/或甲基甘露糖苷)的特异性糖类结合活性；和/或
-与表达与多肽特异性结合的糖类的病原体的结合和/或针对其的抗病原体活性。
多肽特异性结合糖类的能力可以通过任何合适的方法评估。一种此类方法涉及将测试多肽固定在例如旋转柱中的琼脂糖凝胶上，然后与含有糖类的样本一起孵育。如果测试多肽具有糖类结合能力，则糖类将可检测地结合到该柱或在随后的洗脱液中。可替代的技术包括等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)、浊度活性测定、微量热泳(microscale thermophoresis，MST)实验、差示扫描量热法、表面等离子体共振、聚糖微阵列或ELISA(例如竞争性ELISA)。实施例中描述了示例性测定方法。如果需要测量对不同靶标的结合特异性，则必须使用相同的测定方法来评估与不同靶标的结合。
出于本公开的目的，如果多肽与特定靶标进行反应或结合比其与可替代的靶标进行反应或结合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称该多肽表现出“特异性结合”。还应理解，例如，特异性结合第一糖类靶标的多肽可以或可以不特异性或优先结合第二糖类靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)专属结合。通常，但不是必需的，提及结合意指优先结合。
本发明的多肽可以表现出与含有甘露糖的聚糖(例如甘露糖和/或甲基甘露糖苷)的特异性结合。当使用相同的测定法评估时，与半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖胺、岩藻糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖相比，它可以表现出对甘露糖和/或甲基甘露糖苷的优先结合。当使用相同的测定法评估时，多肽可以表现出与甘露糖和/或甲基甘露糖苷的高亲和力结合，并且可以表现出与半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖胺、岩藻糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖的非常低的结合或未表现出可检测到的结合。该多肽可表现出与D-甘露糖的结合，结合常数(Kb)为约2500M-1或更高，如约2514M-1；和/或，与甲基α-D-甘露糖苷的结合，Kb为约1200M-1或更高，如约1270M-1，通常当通过等温滴定量热法(ITC)测定时。当使用ITC评估时，优选没有可检测到的与半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖胺、岩藻糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖的结合。
由多肽特异性结合的糖类可以作为在病原体表面上表达的聚糖存在，例如作为糖蛋白的组分掺入。多肽可以与所述病原体结合。多肽优选表现出与病原体的强结合。多肽还可以表现出离体抗病原体活性。对于给定类型的病原体，可以通过任何合适的方法离体评估抗病原体活性。在实施例中针对不同类型的病原体列举了示例性方法。病原体可以是病毒、细菌细胞、真菌细胞或癌细胞。抗病原体活性通常可以指病原体的生长的抑制作用。当病原体是细胞时，抗病原体活性通常是指细胞复制的抑制作用。当病原体是病毒时，抗病原体活性通常是指病毒诱导的细胞活力降低的抑制作用。
病毒通常在其表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。病毒可以在其表面表达高甘露糖聚糖结构。病毒可以是包膜病毒，在这种情况下，聚糖通常存在于包膜中。病毒可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、Sars-CoV-2、Sars-CoV-1、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)、埃博拉病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人巨细胞病毒(HCMV)、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。病毒优选是人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、甲型流感病毒或Sars-冠状病毒，如Sars-CoV-2。
细菌细胞通常在细胞表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。细菌可以在其表面表达高甘露糖聚糖结构。细菌可以是以下物种：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、粪肠球菌(E.faecalis)或鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，并且优选为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
真菌细胞可以是酵母细胞，其通常在细胞表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。真菌可以在其表面表达高甘露糖聚糖结构。真菌可以是以下物种的酵母：酿酒酵母(S.cerevisiae)或白色念珠菌(C.albicans)。
癌细胞通常在细胞表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。癌症优选地比健康细胞以更高的水平表达所述聚糖。癌细胞可以在其表面表达高甘露糖聚糖结构。癌细胞可以是人类的。它可以是肺癌细胞(例如肺泡的基底上皮细胞)或结肠直肠癌细胞(例如肠上皮细胞)。它优选为腺癌细胞。可替代地，癌细胞可以来自骨髓性白血病或淋巴细胞白血病。
多肽优选地对健康人类细胞(如外周血单核细胞(PBMC))具有低促有丝分裂作用或没有促有丝分裂作用。可以通过任何合适的方法评估促有丝分裂作用。实施例中描述了示例性方法。
多肽优选地对健康人类细胞(如外周血单核细胞(PBMC))具有低细胞毒性或没有细胞毒性。可以通过任何合适的方法评估细胞毒性。实施例中描述了示例性方法。
多肽的糖类结合活性优选在宽pH范围内维持，如pH 4.0至10.0、pH 5.0至9.0或pH6.5至pH 9.0，任选地在pH 6.5至7.5的范围内具有最大活性，优选在约pH 7.0具有最大活性。可以通过任何合适的方法评估糖类结合活性在不同pH的稳定性。实施例中描述了示例性方法。
多肽的糖类结合活性优选在宽温度范围内维持，如从约0℃至约75℃。活性的优选范围是约4℃到约45℃。最佳活性通常在37℃。可以通过任何合适的方法评估糖类结合活性在不同温度下的稳定性。实施例中描述了示例性方法。
具有特异性糖类结合活性的多肽的结构特征
该部分阐述了具有特异性糖类结合活性的多肽的结构特征，其也适用于前一部分中概述的功能特征。
多肽的长度通常不长于约200个氨基酸。多肽可以包含SEQ ID NO：1、2、3或4的148或149个氨基酸，并且另外可以被工程化以包括一个或多个另外的氨基酸，直至200个氨基酸的总长度，其中，所述另外的氨基酸通常有助于生产、分离或纯化。因此，所述多肽可以包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列，基本上由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列组成或由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列组成。
多肽可具有190、180、170、160或150个氨基酸的最大长度。
多肽优选地包含来自SEQ ID NO：1、2、3或4的连续氨基酸的任何较短片段，基本上由来自SEQ ID NO：1、2、3或4的连续氨基酸的任何较短片段组成，或由来自SEQ ID NO：1、2、3或4的连续氨基酸的任何较短片段组成，条件是它具有特异性糖类结合活性。多肽可以包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、146、147或148个连续氨基酸；基本上由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、146、147或148个连续氨基酸组成；或由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、141、142、
143、144、145、146、147或148个连续氨基酸组成，条件是所述多肽具有特异性糖类结合活性。当以相同测定法测量时，所述片段优选地以Sava凝集素的四种变体的混合物(即SEQ ID NO：1、2、3和4的多肽的混合物)或由SEQ ID NO：6的序列组成的多肽对甘露糖的亲和力的至少50％的亲和力结合至甘露糖。当以相同测定法测量时，所述片段更优选地以相当于或优于Sava凝集素的四种变体的混合物(即SEQ ID NO：1、2、3和4的多肽的混合物)或由SEQ ID NO：6的序列组成的多肽对甘露糖的亲和力的亲和力结合至甘露糖。
SEQ ID NO：1、2、3或4的序列或SEQ ID NO：1、2、3或4的任何片段可以被工程化以包括一个或多个另外的氨基酸，其中，所述另外的氨基酸通常有助于生产、分离或纯化。例如，可以将序列工程化以包括另外的N端甲硫氨酸。SEQ ID NO：6、7、8和9分别对应于SEQ IDNO：1至4，各自具有另外的N端甲硫氨酸。
可替代地，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列的变体或如上定义的其任何片段，基本上由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列的变体或如上定义的其任何片段组成，或由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列的变体或如上定义的其任何片段组成，条件是该变体具有特异性糖类结合活性。所述变体可以与SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列或如上定义的其任何片段具有至少50％的同一性。所述变体序列可以与SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列或如上定义的其任何片段具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。同一性水平优选为至少85％或更高。相对于SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列或如上定义的其任何片段的同一性，可以在SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个所示的序列或如上定义的其任何片段的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、146、147或148个或更多个连续氨基酸的区域上测量。更优选地，在SEQ IDNO：1、2、3或4中任一个或如上定义的其任何片段的全长上测量同一性。可以在变体的长度上测量与SEQ ID NO：1、2、3或4或其任何片段的同一性，条件是变体的长度比参考序列长或短不超过50个氨基酸，并且优选地具有与参考序列大致(或完全)相同的长度。SEQ ID NO：1、2、3或4是最优选的参考序列。最优选地在SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的全长上测量变体的同一性。
可以使用任何合适的算法计算氨基酸同一性。例如，PILEUP和BLAST算法可用于计算同一性或排列序列(例如鉴定等同的或相应的序列(通常在其默认设置上))，例如，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol215:403-10中所描述的。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSPs)，所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)作为启动搜索以找到包含它们的HSP的种子。该字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，只要可以增加累积的比对得分即可。在以下情况下停止每个方向上的字命中的延伸：累积的比对得分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积的得分变为零或低于零；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用11的字长(W)、50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝4以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；例如参见Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供了两个多核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列比较的最小和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。可替代地，UWGCG包提供了可用于计算同一性的BESTFIT程序(例如在其默认设置下使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12,387-395)。
本发明的多肽的序列可包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列的变体，或如上定义的其任何片段，其具有特异性糖类结合活性，其中，相对于SEQ ID NO：1、2、3或4的序列或所述片段进行修饰，如氨基酸添加、缺失或替换。可以包括另外的氨基酸，例如以有助于生产、分离或纯化。例如，可以将变体的序列工程化以包括另外的N端甲硫氨酸。还可以引入氨基酸替换以改善蛋白质特征，如温度稳定性、pH稳定性、总体稳定性，从而改善糖类结合，或减少与不需要的结合配偶体(如诱导细胞毒性的那些)的结合。
除非另有说明，否则修饰优选是保守氨基酸替换。保守替换用具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸替换氨基酸。引入的氨基酸可以具有与其替换的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替代地，保守替换可以引入另一种芳香族的或脂肪族的氨基酸来代替预先存在的芳香族的或脂肪族的氨基酸。保守氨基酸改变是本领域公知的，并且可以根据下表A中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。在氨基酸具有相似极性的情况下，这可以通过参考表A2中氨基酸侧链的亲水性标度来确定。本发明的多肽的序列可以包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列的变体，其中，进行了多达5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个保守替换。
表A1-氨基酸的化学性质
表A2-亲水性量表
合适的修饰可以用具有相当的特征但不是天然真核生物蛋白质中出现的20种L-构型氨基酸之一的氨基酸替换起始序列中的至少一个氨基酸。例如，至少一个L-构型氨基酸可以用直接对应的非L构型氨基酸(如D-构型氨基酸)或用非L构型氨基酸(其另外是如上定义的保守替换)替换。
本发明的多肽的氨基酸序列可以包含如上所述的氨基酸序列的变体。然而，某些残基优选保留在所述变体序列内。例如，“糖类特异性”和“糖类结合的热力学”的实例中的讨论表明优选保持某些结合位点特征。
包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个或其具有如上定义的特异性糖类结合活性的任何片段或者这些序列中任一个的任何变体的本发明的任何多肽，可以任选地被工程化以在N端包括另外的甲硫氨酸和/或在C端和/或N端包括蛋白质纯化或其他标签。所述标签是一种序列，该序列不作为SEQ ID NO：1、2、3或4中的任一个的Sava凝集素蛋白的连续结构域天然地在金珊瑚中表达。优选的蛋白质纯化标签是组氨酸标签。组氨酸标签优选由六个组氨酸残基组成。组氨酸标签可以通过接头与C端连接，所述接头通常是短的氨基酸序列，如3-5个氨基酸。接头通常主要由甘氨酸和丝氨酸残基组成，并且可以优选地包括序列GSG。例如，GSG和GSGLE是合适的接头。SEQ ID NO：3是工程化的序列的实例。
因此，总之，本文提供了：
一种具有特异性糖类结合活性的多肽，任选地为工程化多肽，其中，所述多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：
(a)SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列；
(b)氨基酸序列，其为SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列的片段，所述片段包含所述序列的至少8个连续氨基酸；
(c)与(a)、(b)或(c)中任一项的所述氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。
任选地，其中，所述多肽被工程化以在N端包括另外的甲硫氨酸和/或在C和/或N端包括蛋白质纯化或其他标签，该标签可以通过接头连接至末端。
一般多肽特征
在本文中以其最广义使用的“多肽”是指两种或更多种亚单元氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列，并且也包括更长的多肽和蛋白质。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。术语“氨基酸”可以指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D或L旋光异构体、氨基酸类似物和模拟肽(peptidomimetics)。
多肽可以通过合适的方法生产，包括重组或合成方法。例如，可以使用本领域已知的标准技术直接合成多肽，如Fmoc固相化学、Boc固相化学或通过溶液相肽合成。可替代地，可以通过用编码所述多肽的核酸分子或载体转化细胞(通常是细菌细胞或植物细胞)来生产多肽。通过在细菌宿主细胞中表达生产多肽描述于下文，并在实施例中举例说明。本发明提供了编码本发明的多肽的核酸分子和载体。本发明还提供了包含这种核酸或载体的宿主细胞。编码本文公开的多肽的示例性多核苷酸分子提供为SEQ ID NO：5。可以修饰任何此类序列以在5'端包括用于N端甲硫氨酸的密码子(ATG)。还可以修饰任何此类序列，使得在3'端的终止密码子(TAA)之前包括用于蛋白质纯化或其他标签的密码子。任选包含另外的甲硫氨酸和标签在本文件的其他地方更详细地讨论。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸编码本发明的多肽，并且可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离是指多肽可以与任何周围培养基基本上但不是完全分离。多核苷酸可以与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合，并且仍然被认为是基本上分离的。“编码”所选多肽的核酸序列是当置于适当的调控序列的控制下(例如在表达载体中)时在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。出于本发明的目的，此类核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。
多核苷酸可以根据本领域熟知的方法合成，如Sambrook等人(1989，MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)中的实例所述。本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，所述表达盒包括与插入序列可操作地连接的控制序列，从而允许本发明的多肽在体内(例如在原核或真核表达系统中)表达。这些表达盒又通常在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内提供。这种表达盒可以直接施用于宿主受试者。可替代地，可以将包含本发明的多核苷酸的载体施用于宿主受试者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许表达本发明的多肽的任何载体。
因此，本发明包括包含此类多核苷酸序列的表达载体。此类表达载体在分子生物学领域中常规构建，并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子和其他元件，如可能是必需的并且以正确方向定位的多腺苷酸化信号，以允许表达本发明的肽。其他合适的载体对于本领域技术人员来说会是显而易见的。作为这方面的进一步示例，我们参考Sambrook等人。
本发明还包括已经被修饰以掺入如上所述的表达载体的细胞。可以使用常规方法培养或生长此类细胞以生产本发明的多肽。此类细胞通常包括原核细胞，如细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、乳杆菌(Lactobacillus)或根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，或植物细胞，如本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的细胞。可以使用例如先前转化的根癌农杆菌的细菌细胞修饰植物细胞以表达多肽。合适的方法公开于实施例中。
可以工程化或修饰多肽以有助于生产、分离或纯化。例如，在通过在细菌宿主细胞中重组表达产生本发明的多肽的情况下，多肽的序列可以在N端包括另外的甲硫氨酸(M)残基以改善表达。作为另一个实例，本发明的多肽可以通过添加蛋白质纯化标签和N端或C端(优选在C端)来工程化或修饰。蛋白质纯化标签优选地为不在金珊瑚中天然表达的部分。蛋白质纯化标签优选地为不存在于如在Savalia物种中表达的野生型多肽链中的部分。蛋白质纯化标签可以是能够直接和特异性结合分离装置的配体。可替代地，蛋白质纯化标签可以是结合对的一个成员，并且分离装置包括包含结合对的另一个成员的试剂。可以使用任何合适的结合对。
在通过添加结合对的一个成员来工程化或修饰多肽的情况下，多肽优选地为组氨酸标签化的或生物素标签化的。通常，在基因水平上包括组氨酸标签的氨基酸编码序列，并且在细菌或植物细胞中重组表达多肽。组氨酸或生物素标签通常存在于多肽的任一端，优选地存在于C端。它可以直接与多肽连接或通过任何合适的接头序列间接连接，该接头序列如3、4或5个甘氨酸残基，或甘氨酸和丝氨酸残基的混合物。组氨酸标签通常由六个组氨酸残基组成，尽管它可以比这更长，通常多达7、8、9、10或20个氨基酸；或更短，例如5、4、3、2或1个氨基酸。
可替代的可用于蛋白质纯化的标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)、泛素(Ub)、小泛素相关修饰剂(SUMO)、可溶性增强子肽序列(SET)和N-利用物质(NusA)。合适的标签也在Costa等人(Front Microbiol.2014；5:63)中论述，其通过引用并入本文，特别包括Costa等人的表1中公开的每个标签。
多肽的氨基酸序列可以被修饰或工程化以包括至少一个非天然存在的氨基酸，例如以增加稳定性。当通过合成方式生产多肽时，可以在生产期间引入此类氨基酸。多肽也可以在合成或重组生产后被修饰。还可以使用D-氨基酸生产多肽。在这种情况下，氨基酸将以C至N方向以反向序列连接。这在本领域中用于生产此类多肽是常规的。本发明的优选多肽可以被工程化以包括至少一个此类非天然或合成氨基酸，或至少一个非L构型氨基酸。
许多侧链修饰是本领域已知的，并且可以对多肽的侧链进行修饰，使得多肽保留如本文可能指定的任何进一步所需的活性或特征。还应当理解，多肽可以被化学修饰，例如翻译后修饰。例如，它们可以是糖基化的、磷酸化的或包含修饰的氨基酸残基。多肽可以是聚乙二醇化的(PEGylated)。
可以以基本上分离的或纯化的形式提供多肽。也就是说，从表达多肽的细胞的细胞提取物中存在的大多数其他组分中分离。多肽可以与不干扰预期用途的载体或稀释剂(如下所述)混合，并且仍然被认为是基本上分离的。它也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它通常构成制剂中蛋白质的至少90％，例如至少95％、98％或99％。当多肽与另外的活性组分(如另一种多肽)在组合物中提供时，每种所述多肽将在以适当的比例混合之前单独纯化至高水平的同质性，用于每种多肽的预期目的。例如，在以1：1的比例组合之前，可以将两种多肽各自纯化至至少90％的同质性。
在特定实施方案中，本发明的多肽可以与另一部分连接(直接或间接)。因此，多肽的糖类结合能力可用于将其他部分靶向特定位置，如上述病原体的体内位置。另一部分可以是治疗剂，如药物。使用凝集素靶向递送药物详细讨论于Bies等人的2004Advanced DrugDelivery Reviews 56；425–435中，其通过引用并入本文。另一部分可以是可检测标记。另一部分可以包含具有可替代的或另外的功能的另外的蛋白质结构域或由具有可替代的或另外的功能的另外的蛋白质结构域组成。另一部分可以是结合部分，如对靶标特异性的抗体或多肽结合结构域，因此缀合的分子可以具有双特异性结合活性。
治疗剂或可检测标记可以例如通过化学缀合直接附接至多肽。将试剂或标记物与多肽缀合的方法是本领域已知的。例如，碳二亚胺缀合(Bauminger S and Wilchek M,1980,Methods Enzymol.,70,151-159)可用于将多种试剂(包括多柔比星)与多肽缀合。水溶性碳二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)特别适用于将官能部分与结合部分缀合。
也可以使用用于将部分与多肽缀合的其他方法。例如，可以使用高碘酸钠氧化，然后进行适当反应物的还原烷基化，也可以使用戊二醛交联。然而，认识到，无论选择哪种生产本发明的缀合物的方法，都必须确定多肽保持其糖类结合能力并且官能部分保持其相关功能。
与多肽连接的治疗剂可以包括具有治疗益处的多肽或编码多肽的多核苷酸。此类多肽的实例包括抗增殖或抗炎症细胞因子。治疗剂可以是抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂或抗癌剂。治疗剂可以是细胞毒性剂。
抗体可以与可检测标记连接。“可检测标记”是指多肽与部分连接，当将多肽施用于患者后，该部分位于靶位点时，通常可以从体外和所在靶位点非侵入性地检测到。因此，多肽可用于成像和诊断。
通常，标记是或包含可用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁扫描研究的99mTc和123I。其他标记包括：例如，用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，如123I(再次)、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然，足够量的适当原子同位素必须与多肽连接，以使分子易于检测。
放射性标记或其他标记可以以已知的方式掺入。例如，多肽可以是生物合成的，或者可以使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，所述氨基酸前体涉及例如氟-19代替氢。标记(如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In)可以例如通过多肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。优选地，可检测标记包含放射性原子，例如锝-99m或碘-123。可替代地，可检测标记可选自：碘-123；碘-131；铟-111；氟-19；碳-13；氮-15；氧-17；钆；锰；铁。
多肽可以直接或间接地选择性结合治疗剂或可检测标记。例如，多肽可以与选择性结合另外的化合物或组分的部分连接，所述化合物或组分是治疗剂或易于检测。
作为另一个实例，本发明的多肽可以与抗体(优选人IgG)的Fc区缀合，以驱动Fc介导的效应子功能，包括ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、体内半衰期增加、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以响应于凝集素介导的糖类结合事件。
多肽可以以冻干形式提供，适于在使用前在水溶液中复原。冻干组合物具有改善的稳定性，使得多肽能够更长时间储存。多肽通常在冷冻干燥之前基本上纯化。本文提供了一种制备冻干形式的多肽的方法，其包括在合适的缓冲液中冷冻干燥所述多肽，所述缓冲液例如为磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲盐水(TBS)或另一种Tris缓冲液。还提供了冻干形式的所得多肽。还提供了一种制备多肽溶液的方法，其包括提供冻干形式的多肽并用合适的载体或稀释剂(如水)复原。
可以使用本领域已知的方法固定化多肽，例如如Datta S等人所述(Enzymeimmobilization:an overview on techniques and support materials,3Biotech,3(1):1-9
(2013))。例如，可以通过吸附、共价结合、亲和力固定化或包埋来固定多肽。可用作支持物的材料包括但不限于，例如，天然支持物(如琼脂糖、琼脂糖凝胶、胶原蛋白、明胶、纤维素、果胶、琼脂糖凝胶)，无机材料(如陶瓷、二氧化硅、玻璃、活性炭或木炭)，或合成聚合物(如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)或胶乳)。这些中的任一种可以作为树脂或以任何其他合适的形式提供。多肽可以固定在磁珠上。多肽可以固定在整料支持物上，其实例公开于等人((2017)Electrophoresis 38,2851-2869(doi:10.1002/elps.201700260))和Kubota等人((2017).New platform for simple and rapidprotein-based affinity reactions.Scientific Reports,7(doi:10.1038/s41598-017-00264-y))的文章中。
出于任何目的，多肽可以固定在支持物上，例如多肽可以固定在装置或装置的组件的表面上：
-用于检测环境中空气传播的病原体或从环境中去除空气传播的病原体；
-用于检测样本(如来自受试者的体液样本)中的病原体或从样本(如来自受试者的体液样本)中去除病原体。
包含多肽的组合物和制剂
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的多肽的组合物。例如，本发明提供了包含一种或多种本发明的多肽、防腐剂和任选的一种或多种载体、赋形剂、稀释剂或媒介物的组合物。通常，最终组合物是无菌且无热原的。防腐剂、载体、赋形剂、稀释剂或媒介物可以优选是药学上可接受的，在与组合物的其他成分相容并且对施用该组合物的受试者无害的意义上。在这种情况下，组合物可以被称为药物组合物。该组合物可适用于无生命物体的杀微生物的灭菌，如医疗用品或设备、实验室设备和用品、仪器、装置。组合物可以配制用作局部杀微生物剂，施用于通常与病原体初始接触的位置，例如阴道的、直肠的、口服的、阴茎的片剂、乳膏、阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂、用于避孕套的抗病毒润滑剂、隔膜、宫颈帽、阴道环和海绵。
合适组合物的配制可以使用标准药物配制化学和方法进行，所有这些都是本领域技术人员容易获得的。例如，试剂可以与防腐剂和一种或多种载体、赋形剂或媒介物组合。辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、还原剂等，可以存在于赋形剂或媒介物中。合适的还原剂包括半胱氨酸、硫代甘油、硫代还原素(thioreducin)、谷胱甘肽等。赋形剂、媒介物和辅助物质通常是在接受组合物的个体中不诱导免疫应答并且可以在没有过度毒性的情况下施用的药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如聚乙二醇、透明质酸、丙三醇、硫代甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中提供了对药学上可接受的赋形剂、载体和辅助物质的深入论述。
此类组合物可以以适合推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射组合物可以以单位剂量形式制备、包装或销售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。组合物包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳液、糊剂和可植入的缓释制剂或可生物降解的制剂。此类组合物还可包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的组合物的一个实施方案中，活性成分以干的(例如粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外施用复原的组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原的水)进行复原。该组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含另外的成分，如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。例如，可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(如，水或1,3-丁二醇)来制备这种无菌可注射制剂。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。
其它有用的可肠胃外施用的组合物包括包含微晶形式、脂质体制剂中的活性成分或作为可生物降解聚合物系统的组分的那些组合物。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合的或疏水的材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。组合物可适于通过任何合适的途径施用，包括：例如，皮内、皮下、经皮、肌肉内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其他合适的施用途径。优选的组合物适于通过静脉内输注施用。
多肽的使用方法
本发明的多肽可用于各种方法中。因此，本文提供了包括向例如样本或受试者施用本发明的多肽的方法。该方法可以是用于特异性结合糖类的方法，并且可以任选地还包括结合产物的检测或分析。该方法可以是治疗或预防疾病的方法，该方法包括向受试者施用本发明的多肽。
例如，本发明的多肽可以为生物技术提供有用的工具。多肽可用于特异性结合糖类的方法中。糖类可以是含有甘露糖(例如甘露糖和/或甲基甘露糖苷)的聚糖。可以将多肽施用于含有糖类的样本，并在允许发生结合的条件下孵育。样本可以是取自受试者的任何体液，如血液、血浆或精液。该方法任选地还包括：确定糖类是否已经结合和/或从所得混合物中分离糖类和任何连接的糖蛋白。
本发明还可以包括用于检测样本中糖类的方法，其中该方法包括使所述样本与本发明的多肽接触，从而允许形成多肽-糖类复合物。本文还提供了所述复合物。该方法可以任选地包括从接触的样本中分离所述多肽并确定分离的多肽是否与糖类结合，从而确定样本中糖类的存在或不存在。该方法还可用于从样本中分离糖类连接的糖蛋白。
在此类方法中，使样本与本发明的多肽在适于多肽与样本中的任何糖类相互作用并适于发生结合的条件下接触。合适的条件包括与本发明的多肽一起孵育至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或更长时间。孵育可以持续5-10分钟，这通常足以评估抗病毒活性。孵育优选在室温下进行，更优选在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，最优选在约37℃。
上述方法可以在任何合适的pH下进行。合适的pH值包括例如约4.0至10.0的pH。本发明多肽的活性的优选pH在6.5至7.5的范围内。该方法可以在任何合适的缓冲液中进行，如tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。本发明的多肽与样本的蛋白质含量的近似比可以是1:1、2:1、4:1、6:1、10:1、15:1、20:1、1:2、1:4，或1:6、1:10、1:15、1:20、1:40、1:100、1:200或1:400(wt:wt)。优选的比率为1:1(wt:wt)。
检测或分析样本以确定糖类是否已经结合可以通过任何合适的分析方法评估，如但不限于质谱、HPLC、亲和色谱、凝胶电泳、SDS-PAGE、ELISA、凝集素印迹、光谱法、毛细管电泳和用于分析的其他标准实验室技术。例如，可以分析糖类和任何连接的糖蛋白的分子量。
结合的糖类和任何连接的糖蛋白与本发明的多肽的分离可以通过任何合适的分离方式进行。例如，分离方式可以包括磁性纳米颗粒的群体。可以使用磁场分离，优选高梯度磁场分离将这些从样本分离。试剂或分离装置的实例是能够与本发明的多肽结合的磁性颗粒的群体。例如，当多肽用组氨酸标签衍生化时，磁性颗粒在其表面上含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。可替代地，当多肽用生物素标签衍生化时，磁性颗粒在其表面上含有链霉亲和素。
分离装置还可以包含固定有本发明的多肽的固体支持物。固体支持物的实例包括前面部分中描述的那些，并且可以包括琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂、交联琼脂糖珠或类似物。支持物可以用作亲和色谱柱中的基质。可替代地，固体支持物可以包括合适的基于二氧化硅的材料或聚苯乙烯，或可以直接吸附本发明的多肽的塑料容器，如微量滴定板或等同物。
可替代的分离方式包括包含对本发明的多肽具有特异性的抗体的试剂，其可以通过本领域的标准方法产生。在这种意义上的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体或人源化抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，如Fab、F(ab')2或Fv片段。如果存在多于一种抗体，则抗体优选具有不同的非重叠决定簇，使得它们可以同时结合本发明的多肽。抗体可以与固体支持物结合，或者可以与另一化学基团或分子标记或缀合以帮助它们的分开或分离。例如，典型的化学基团包括荧光标记(如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE))，或标签(如生物素)。
其他合适的分离方式包括：通过使来自接触样本的多肽与合适的洗脱缓冲液接触，从(通常固定的)多肽洗脱糖类和任何连接的糖蛋白。洗脱缓冲液的选择可取决于蛋白质的酸敏感性。洗脱缓冲液可以包含高摩尔浓度的尿素(通常至少5、6、7或最优选至少8M)或高浓度的洗涤剂(通常至少约1％、5％或10％)。合适的洗涤剂包括Nonidet P40、TritonX-100、Tween 20、CHAPS、脱氧胆酸钠和RapiGest SF表面活性剂，但优选十二烷基硫酸钠(SDS)。高摩尔尿素优于洗涤剂，因为下游程序更可能对洗涤剂的存在敏感。特别优选的洗脱缓冲液是聚糖，如单糖。在本发明的多肽上捕获的聚糖或糖蛋白的洗脱可以优选地用单糖实施。例如，甘露糖可用于洗脱固定化Sava凝集素上捕获的糖蛋白。
任何上述方法中的样本可以是取自患者(优选人类患者)的样本。获得的结果可用于诊断目的，例如用于检测在其表面上表达糖蛋白的病原体的存在，或检测低丰度肿瘤标志物。这种用途可以涉及将从患者样本获得的结果与使用从健康对照获得的样本获得的结果进行比较。
多肽也可用于治疗或预防。在治疗应用中，将多肽或组合物以足以治愈、缓解或部分抑制病症或一种或多种其症状的量施用于已经患有疾病或病症的受试者。这种治疗可以导致疾病症状的严重程度的降低，或无症状期的频率或持续时间的增加。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。在预防性应用中，将多肽或组合物以足以预防或延迟症状发展的量施用于尚未表现出疾病或病症的症状的受试者。此类量被定义为“预防有效量”。受试者可能已经通过任何合适的方式被鉴定为处于发展疾病或病症的风险中。因此，本发明还提供了用于治疗人体或动物体的本发明的多肽。本文还提供了预防或治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括以预防或治疗有效量向受试者施用本发明的多肽。多肽优选通过静脉内输注施用，但可以通过任何合适的途径施用，包括：例如，皮内、皮下、经皮、肌肉内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其他合适的施用途径。施用的所述多肽的量可以在0.01mg/kg BW与2mg/kg BW之间、在0.04mg/kg BW与2mg/kg BW之间、在0.12mg/kg BW与2mg/kg BW之间，优选地在0.24mg/kg BW与2mg/kg BW之间，并且最优选地在1mg/kg BW与2mg/kg BW之间。
本发明的多肽可特别用于治疗或预防由病原体介导的疾病或病症的方法，所述病原体在其表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。本发明还提供了本发明的多肽用于制备药物，所述药物用于治疗或预防由所述病原体介导的疾病或病症的方法中。病原体可以是病毒、细菌、真菌或癌细胞。所述方法可以是治疗或预防所述病原体的感染或与所述感染相关的疾病或并发症的方法，所述方法包括向受试者(通常是人类受试者)施用本发明的多肽。
所述方法可以用于治疗或预防任何病毒感染或与病毒感染相关的疾病或并发症。病毒通常在其表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。病毒优选在其表面表达高甘露糖聚糖结构。病毒可以是包膜病毒，在这种情况下，聚糖通常存在于包膜中。病毒可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、Sars-COV-2、Sars-COV-1、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)、埃博拉病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人巨细胞病毒(HCMV)、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。病毒优选是人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)或Sars-冠状病毒，如SARS-CoV-2。所述方法可以用于治疗或预防由如上所定义的任何病毒引起的疾病或病症。所述方法可用于治疗或预防AIDs、COVID-19或疱疹。
所述方法可以用于治疗或预防细菌感染或与细菌感染相关的疾病或并发症。细菌细胞通常在细胞表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。细菌优选在其表面表达高甘露糖聚糖结构。细菌可以是以下物种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、粪肠球菌或鼠伤寒沙门氏菌，并且优选为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。所述方法可以用于治疗或预防由如上所定义的任何细菌引起的疾病或病症。
所述方法可以用于治疗或预防真菌感染或与真菌感染相关的疾病或并发症。真菌细胞可以是酵母细胞，其通常在细胞表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。真菌优选在其表面表达高甘露糖聚糖结构。真菌可以是以下物种的酵母：酿酒酵母(S.cerevisiae)或白色念珠菌(C.albicans)。所述方法可以用于治疗或预防由如上所定义的任何真菌引起的疾病或病症。
所述方法可以用于治疗或预防癌症。引起癌症的癌细胞通常在细胞表面表达至少一种糖蛋白或掺入由多肽特异性结合的聚糖的其他结构。癌症优选地以比健康细胞更高的水平表达所述聚糖。癌细胞优选在其表面表达高甘露糖聚糖结构。癌细胞可以是人类的。它可以是肺癌细胞(例如肺泡的基底上皮细胞)或结肠直肠癌细胞(例如肠上皮细胞)。它优选为腺癌细胞。可替代地，癌细胞可以来自骨髓性白血病或淋巴细胞白血病。所述方法可以用于治疗或预防由如上定义的任何癌细胞引起的癌症。
以下实施例说明了本发明。
实施例1
结果
引言，基本性质
本研究从珊瑚-金珊瑚中分离出一种新的抗病毒蛋白Sava凝集素。以前，已经描述了一种来自珊瑚-金珊瑚的抗病毒蛋白(甘露糖结合凝集素)(JAIDS1 453)。该蛋白质具有14800Da的分子量，4.8的pI(等电点)，1.27×105M-1cm-1的摩尔消光系数，需要Ca2+以实现完全活性，并且长度为121个氨基酸。未确定一级氨基酸序列(EJB16997)。
本研究中描述的抗病毒蛋白也是甘露糖结合凝集素，但明显地是不同的蛋白。它具有不同的分子量、不同的pI、不同的摩尔消光系数，不需要Ca2+实现活性，并具有不同的氨基酸组成。在蛋白质数据库(Uniprot或NCBI)中未发现新抗病毒蛋白的序列。它显示出与已知序列至多40％的相似性。平均分子量为16583Da至16803Da，参见表1中的一级结构。Sava凝集素的pI为8.9。
纯化
根据图1所示的流程图实施Sava凝集素的纯化。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认Sava凝集素分离物的纯度。根据光密度测定法，获得高纯度>95％的约17kDa的单一蛋白质条带，参见图1。
通过MALDI-TOF质谱法分析的分离的和纯化的Sava凝集素的制剂表现出至少4个不同的分子离子[M+H]+峰，图2。这表明蛋白质的4种天然变体。不能排除序列的其他天然变体的存在。主峰的平均分子量为16803Da。根据强度，接下来的三个是16769Da、16617Da和16583Da。通过尺寸排阻色谱法(图1)和SDS-PAGE(图1)(均为低分辨率技术)测定分子量显示分子量为约17kDa。
根据图3所示的流程图确定了完整的氨基酸序列。用不同的蛋白酶和溴化氰系统地消化蛋白质样本等分试样。通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)和/或基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱法(MALDI-TOF/TOF MS)分析所得肽混合物。通过分析由不同蛋白酶和溴化氰获得的重叠肽获得序列。未观察到糖基化和其他翻译后修饰。
这四个主峰的氨基酸序列示于表1中。占优势的16803Da峰的序列含有149个氨基酸。对应于16769Da峰的序列是相同的，具有一个氨基酸替换Phe61Leu。16617Da的序列与16803Da峰的序列相同，但具有C端Trp的缺失。16583Da的序列与16769Da峰的序列相同，但具有C端Trp的缺失。在每个变体中位置61加下划线。还显示了编码显性变体的示例性核酸序列。该序列用于从细菌细胞(例如大肠杆菌)表达重组Sava凝集素的情况。在这种情况下，修饰序列以包括用于额外的N端甲硫氨酸的额外5'密码子，以优化表达。通常使用NcoI/XhoI限制性位点将优化的序列导入载体pET28a+中。可以任选地包括蛋白质纯化标签，但是重组Sava凝集素也可以通过利用凝集素本身的凝集素结合活性来纯化(例如使用具有糖类靶标的亲和柱)。
表1
糖类特异性
使用不同的技术来探索Sava凝集素的糖类特异性。
用Sava凝集素在pH 7.4在50mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在25℃和在不同的D-糖类(单糖和二糖)存在下实施等温滴定量热法(ITC)实验。
使用ITC，我们没有观察到半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖的结合。
用ITC观察甘露糖和甲基甘露糖苷的结合。通过ITC测定的的结合常数(Kb)：D-甘露糖Kb＝2514M-1和甲基α-D-甘露糖苷Kb＝1270M-1。
为了探讨阳离子对Sava凝集素的糖类结合活性的影响，用三种不同的方法进行糖类的结合：1)在ITC实验之前，用三重蒸馏水对Sava凝集素和糖类进行强烈透析，2)在ITC实验中使用EDTA(乙二胺四乙酸)以结合并从溶液中除去游离阳离子，以及3)在ITC实验中添加无机盐。在存在或不存在阳离子(包括钙离子)的情况下，我们没有观察到Sava凝集素的糖类结合的任何变化。至少一类已知凝集素的糖类结合活性严格依赖于钙离子的存在。
实施浊度活性测定以确认ITC结果。结果得到证实，除了一个例外，观察到D-葡萄糖的弱结合，结合常数比D-甘露糖低两个数量级。这种小的结合常数产生小的热效应，这是ITC无法观察到的。
微量热泳(MST)实验证实了甘露糖和甲基甘露糖苷的结合。甲基α-D-甘露糖苷的解离常数(Kd)测定为13.2+/-1.74mM。在D-甘露糖的情况下，观察到两个结合事件，第一个Kd为26.5+/-1.47μM，第二个Kd为11.2+/-1.12mM。两个Km值表明存在两个结合位点，其可能不同于变构连接。
用差示扫描量热法进行的实验证实了甘露糖和甲基甘露糖苷的结合，参见下文热稳定性的讨论。
糖类结合的热力学
通过基于迭代非线性Levenberg-Marquardtχ2回归程序将模型函数全局拟合到实验ITC热谱图的算法，获得甘露糖和甲基甘露糖苷结合的热力学参数。当假设每个蛋白质分子有两个结合位点时，实现了模型和实验数据之间的最佳一致性。
对于两种糖类，结合由具有不利熵的贡献的大焓的贡献驱动，参见图4。ΔH对-TΔS的曲线产生斜率为1.2的直线，表明低焓-熵补偿。
pH稳定性
在25℃及不同pH值下，使用浊度法测定Sava凝集素活性的稳定性。使用不同的缓冲液，pH范围为3.5-6的是乙酸盐缓冲液，而pH范围为7-8.9的是Tris缓冲液。
在pH7观察到最大糖类结合活性(表2)。在碱性pH下观察到强活性，而在酸性pH范围内的活性略微降低。实验证实了在不同pH值下活性的良好稳定性。关于Sava凝集素作为局部杀微生物剂的潜在用途，它可以用于皮肤表面和黏膜表面(鼻、阴道、直肠和口腔)。
热稳定性
通过差示扫描量热法(DSC)测定热稳定性。实验在pH 7.4的PBS中实施。DSC温谱图(图5)显示了熔点(Tm)为79.17℃的Sava凝集素的高热稳定性。在存在与Sava凝集素结合的糖类的情况下，甲基甘露糖苷的Tm值增加到79.55℃，甘露糖的Tm值增加到79.63℃。增加的Tm表明在结合的糖类存在下蛋白质结构的稳定。在半乳糖(不结合的糖类)存在下，Sava凝集素的Tm与仅用Sava凝集素的实验中相同。
Sava凝集素的热变性是动力学控制的过程，具有低的可逆性(约50％)。热解折叠过程伴随着沉淀相。Sava凝集素的高热稳定性是广泛应用(包括药理学应用)所必需的非常有用的特征。
糖类结合对稳定性的影响
通过DSC证实了Sava凝集素在糖类结合后的稳定性增加，参见图5。通过用氯化胍(GdmCl)变性的Sava凝集素的荧光分光光度研究证实了糖类结合后的稳定化。使用Gdmc1的变性是完全可逆的，并且遵循双状态模型(图6顶部)。在通过Gdmc1变性的该双状态模型中没有观察到中间体的存在(图6中间)。在甘露糖结合时观察到诱导两种状态之间转变所必需的Gdmc1浓度的增加(图6底部)。
二级结构和三级结构
通过远UV范围内的圆二色性(CD)光谱评估二级结构元件(图7顶部)。这种Sava凝集素的CD光谱是β结构蛋白的特征。还可以观察到糖类(甘露糖和甲基甘露糖苷)结合后远UV CD光谱的轻微变化。
近UV CD光谱(图7底部)表明在糖类(甘露糖和甲基甘露糖苷)结合后存在某些构象的变化。在Trp、Tyr和Phe的吸收场中在260nm至285nm处的近UV CD光谱中负椭圆率的降低表明这些氨基酸参与配体结合和/或配体结合时的一些构象的变化。
通过X射线晶体学确定三级结构。在pH 7.4处获得晶体(图8左上)。晶体结构的分辨率为从到显示了Sava凝集素三级结构的示意图。基于晶体结构，显示了Sava凝集素二聚体的计算机建模提出的结构(图8右上)。
独立于X射线结构，我们实施了基于一级结构的计算研究。计算机建模提出了存在两个糖类结合位点和所涉及的氨基酸(图9顶部)。此外，计算机建模提出了Sava凝集素多聚化的机制(图9底部)。
四级结构
使用不同的技术来探索Sava凝集素的四级结构。
Sava凝集素样本在MALDI-TOF质谱仪上的质谱分析显示具有对应于单体Sava凝集素质量倍增的m/z值的峰(图10顶部)。该结果表明存在二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体结构。
另一种方法包括将Sava凝集素溶液短时间暴露于交联剂分子戊二醛。在暴露时，参与溶液中低聚物结构形成的单体变得共价交联，并且可以通过变性电泳观察到。SDS-PAGE分析显示对应于单体Sava凝集素质量倍增的条带(图10底部)。
计算机分子建模方法也表明Sava凝集素的多聚化的可能性(图9底部)。
细胞毒性
使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)测定法量化活细胞来分析Sava凝集素对不同细胞系的细胞毒性。结果示于表3中。
细胞毒性测试显示对从人血液新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)的低细胞毒性作用(图11和表3)。细胞毒性浓度远高于治疗性抗病毒应用所需的Sava凝集素浓度(表5)。用3个不同供体的PBMC分别实施实验，每个实验一式三份地实施。
Sava凝集素对TZM-bl细胞系(用于HIV-1的病毒诊断的遗传改变的HeLa)的细胞毒性作用可以在比抗HIV-1活性所需的浓度高得多的浓度下观察到，图12和表5。
Sava凝集素对ELVIS细胞系(用于诊断HSV-1和HSV-2的遗传改变的幼仓鼠肾细胞)和对Vero E6细胞系(细胞来源是非洲绿猴的肾)的细胞毒性作用(图15和16)，可以在比抗HSV-1和抗HSV-2活性所需的浓度高得多的浓度下观察到(表5)。
Sava凝集素对人类癌细胞系的细胞毒性作用描述于下一部分——抗癌活性。
表3.对不同细胞系没有影响的Sava凝集素的最大浓度
*摩尔浓度是考虑到Sava凝集素单体的分子量来计算的抗癌活性
使用MTT试验评估Sava凝集素对不同人癌细胞系的细胞毒活性。结果示于表3和表4中。某些癌细胞系(如A549)显示出对Sava凝集素的高敏感性，EC50值在若干μg/ml的范围内。该结果使得Sava凝集素成为潜在抗癌候选剂的候选物，特别是因为在该浓度范围内没有观察到Sava凝集素对PBMC的毒性。
癌细胞系(如CaCo-2、Jurkat和U937)对Sava凝集素中度敏感，EC50值在十分之一至数百μg/ml的范围内。癌细胞系(如HeLa和MDA)似乎在高浓度的Sava凝集素中存活，EC50值在几百μg/ml至mg/ml的范围内。为了比较，还用伴刀豆球蛋白A凝集素(JBS16 10,Glycobiology 22 1245)实施了抗癌活性测试。可以看出，ConA对某些癌细胞系具有略微更强的抗癌活性，表4。
以nM为单位给出的最大无毒浓度应根据ConA活性形式是四聚体的知识来考虑，而对于Sava凝集素，考虑单体的分子量进行摩尔计算。
表4.对不同癌细胞系无影响的Sava凝集素和伴刀豆球蛋白A凝集素的最大浓度
*摩尔浓度是考虑到Sava凝集素单体的分子量来计算的促有丝分裂活性
众所周知，凝集素可以诱导细胞增殖。这种性质是凝集素作为杀微生物剂在医学中应用的主要障碍之一。某些化合物的促有丝分裂作用(有丝分裂的诱导)的特征在于增加的DNA合成。应用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入测定来检测DNA合成。使用BrdU测定和外周血单核细胞(PBMC)检查Sava凝集素的促有丝分裂作用。未观察到对PBMC的促有丝分裂作用。
抗病毒活性
在不同细胞中通过不同的包膜病毒和病毒株检查Sava凝集素的潜在抗病毒活性，表5。Sava凝集素表现出对病毒诱导的细胞活力降低的浓度依赖性抑制。这种抑制作用对于所有包膜病毒及其菌株并不是相同的。对于HIV-1的CH058菌株观察到最有效的抑制，抑制浓度在皮摩尔范围内。本研究中使用的HIV-1菌株的EC50抑制浓度范围为0.05-60nM，图17和表5。该结果与最有效的公开的凝集素格瑞弗森(JBC 280 9345)的抗HIV-1活性在相同的范围(0.03-56nM)内。VSV-G(水泡性口腔炎病毒糖蛋白)假型HIV-1Δenv与真正的HIV-1颗粒不同，并且不与CD4和CCR5或CXCR4受体接合以融合和进入细胞(PLoS Pathog 51000633)。因此，Sava凝集素对这种假型的抗病毒活性的缺乏证实了Sava凝集素的抗病毒活性是通过抑制HIV-1gp 120与受体的结合。
对于单纯疱疹病毒，证实了在低纳摩尔范围内的有效抗病毒活性，参见图19和20以及表5。对于严重急性呼吸综合征冠状病毒2，观察到微摩尔范围内的抗病毒活性，图21和表5。
证实了Sava凝集素与甲型流感病毒野生型(Washington)、H1N1(广东-毛南)和H3N2(香港)的强结合(数据未显示)，并且可以预期抗病毒活性。观察到与人HCMV、寨卡(Zika)病毒、麻疹病毒的结合，但抗病毒活性需要非常高浓度的Sava凝集素，即观察到弱的抗病毒活性。在结合的比较中，Sava凝集素显示出比香蕉(Banana)凝集素更强的与甲型流感的结合(数据未显示)，这表明Sava凝集素对甲型流感具有良好的抗病毒性质。香蕉凝集素(H84T型)是有效的抗流感剂。
存在许多其它病毒，其与病毒包膜中的糖蛋白融合并进入细胞，并且基于这些结果和病毒的已知性质，可以预期这些病毒被Sava凝集素抑制。因此，除了上面的直接证明外，预计Sava凝集素将至少对丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)、甲型和乙型流感病菌株、SARS-CoV-1、埃博拉病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猿猴免疫缺陷病毒具有抗病毒作用。
抗细菌和抗酵母活性
探索了Sava凝集素对不同细菌物种的潜在抗菌活性：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、大肠杆菌(ATCC 25922)、蜡状芽孢杆菌(ATCC11778)、粪肠球菌(ATCC 29212)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)。用于测定最小抑制浓度(MIC)的标准测试在0.0625-1mg/ml的浓度范围内未显示抑制。在大肠杆菌中观察到生长的小抑制。然而，该试验是在Luria Bertani培养基中实施的，该培养基含有富含与Sava凝集素强烈结合并因此抑制其活性的高甘露糖聚糖的酿酒酵母(S.cerveisiae)的提取物。当在PBS中实施接触抑制的测试时，其包括将5×105个金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)细胞暴露于0.18mg/ml的Sava凝集素20分钟，显示超过25％的生长抑制。该结果证实Sava凝集素和细菌之间的相互作用可以潜在地用于抑制细菌的生长。这可能有助于将来开发更安全和更有效的微生物控制剂的努力。
探索了Sava凝集素与乳酸杆菌属细菌的几种不同物种的结合。未观察到显著结合。
针对三种物种探索了Sava凝集素对酵母的潜在活性：光滑念珠菌(C.glabrata)(H65BC.g)、白色念珠菌(ATCC 10231)和酿酒酵母(ATCC 9763)。用于测定最小抑制浓度(MIC)的标准测试在0.03125mg/ml至1mg/ml的浓度范围内未显示抑制。如在细菌的MIC测试的情况下，用于酵母生长的培养基的组分(胰蛋白酶的大豆发酵液和蛋白胨10)含有抑制Sava凝集素的活性的聚糖结构。在PBS中实施的接触抑制试验，将2×103个酿酒酵母(ATCC9763)细胞暴露于0.18mg/ml的Sava凝集素20分钟，显示约35％的生长抑制。通过FITC标记的Sava凝集素证实Sava凝集素与酿酒酵母和白色念珠菌的细胞壁甘露聚糖的结合，参见图22。在生命科学和生物技术中的应用
通常，凝集素的分类是根据糖类特异性。然而，来自每个类别的凝集素，例如甘露糖结合凝集素，在糖类结合特异性方面具有细微差异。通过糖类微阵列观察到这些差异。一种此类糖类(聚糖)微阵列由联合会(Consortium)开发用于功能性糖组学(Functionalglycomis)。考虑到此信息，每种新的凝集素为开发特定产品开辟了可能性。
例如，Sung-Mu等人描述了用于检测甲型肝炎病毒的凝集素连接的免疫磁性分离的开发(病毒6 1037)。
我们已经使用FITC标记的Sava凝集素通过共聚焦显微镜和ELISA测定来探索与酿酒酵母和白色念珠菌的结合。两种测定的结果证实了Sava凝集素与这两种酵母的细胞壁的结合。共聚焦显微镜证实Sava凝集素不能进入酵母细胞并保持与细胞表面结合，观察到细胞周围的亮(绿色)环，参见图22。
Sava凝集素可用于检测糖蛋白。对于这种应用，我们已经用生物素标记了Sava凝集素。抗生物素蛋白-生物素是用于偶联许多生物测定中使用的蛋白质的常用生化系统。用生物素化的Sava凝集素对糖蛋白进行蛋白质印迹检测以及随后偶联链霉亲和素-HRP以通过DAB可视化的结果呈现在图23中。该结果证实Sava凝集素可用于亲和标记、结合、捕获的所有不同系统中。
重组生产
在两个标准表达系统大肠杆菌和本氏烟草中实现Sava凝集素的重组生产。根据氨基酸序列合成基因，并添加his标签用于在大肠杆菌中表达。将合成基因掺入适合于表达系统的表达质粒中。
在大肠杆菌的情况下，将纯化的表达质粒(pET28和pMSCG7)分别引入感受态的BL21大肠杆菌细胞中。两次发酵均在37℃实施10小时，并且从收获的细胞中纯化表达的蛋白质。Sava凝集素的产率良好，参见图24底部。然而，具有糖类结合活性的正确折叠的蛋白质的量小。
在本氏烟草的情况下，通过电穿孔将表达载体(pJL-TRBO)引入感受态的实验室菌株根癌农杆菌GV3101中。选择成功转化的根癌农杆菌细胞，并用菌落PCR确认。通过农杆菌渗入法将这些根癌农杆菌细胞引入5周龄的本氏烟草叶中。通过绿色荧光蛋白的共表达确认成功表达，参见图24。5天后收获叶，并从叶中纯化表达的蛋白质。正确折叠的蛋白质的产率比大肠杆菌的情况好得多。
参考文献表
序列表
<110> 贝尔格莱德大学
<120> 糖类结合多肽
<130> Ljubislava Duka / Andjelkovic
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 149
<212> PRT
<213> 金珊瑚（Savalia（Gerardia）savaglia）
<400> 1
Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu His
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val Ala
20 25 30
Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro Ser
35 40 45
Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Phe Tyr Lys Ser
50 55 60
Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu Trp
65 70 75 80
Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly Gly
85 90 95
Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp Gly
100 105 110
His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr Leu
115 120 125
Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu Val
130 135 140
Glu His Pro Ser Trp
145
<210> 2
<211> 149
<212> PRT
<213> 金珊瑚（Savalia（Gerardia）savaglia）
<400> 2
Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu His
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val Ala
20 25 30
Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro Ser
35 40 45
Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Leu Tyr Lys Ser
50 55 60
Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu Trp
65 70 75 80
Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly Gly
85 90 95
Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp Gly
100 105 110
His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr Leu
115 120 125
Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu Val
130 135 140
Glu His Pro Ser Trp
145
<210> 3
<211> 148
<212> PRT
<213> 金珊瑚（Savalia（Gerardia）savaglia）
<400> 3
Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu His
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val Ala
20 25 30
Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro Ser
35 40 45
Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Phe Tyr Lys Ser
50 55 60
Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu Trp
65 70 75 80
Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly Gly
85 90 95
Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp Gly
100 105 110
His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr Leu
115 120 125
Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu Val
130 135 140
Glu His Pro Ser
145
<210> 4
<211> 148
<212> PRT
<213> 金珊瑚（Savalia（Gerardia）savaglia）
<400> 4
Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu His
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val Ala
20 25 30
Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro Ser
35 40 45
Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Leu Tyr Lys Ser
50 55 60
Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu Trp
65 70 75 80
Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly Gly
85 90 95
Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp Gly
100 105 110
His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr Leu
115 120 125
Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu Val
130 135 140
Glu His Pro Ser
145
<210> 5
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Sava凝集素的多核苷酸
<400> 5
agcaacctgc gttgggttgc tacttctggt ggtaaagtcc ctgaacacgc agtagtcggt 60
ggcgaaaact tttctggtga agtgctgtac gtggcacgtg tacgtatcaa ctctggtctg 120
acgccaggca agatggctcc gtcttatcgt gttgcgcata cctcttacgg tggcaaagaa 180
ttctacaaga gcgattacga actgatcact aatccgggct ggaaatccca cattgagtgg 240
aaataccacg agggtcactc caaaccgacc aacgcggttc tgggtggtac cgatcagcgc 300
aacctgtatg tagcccgctt catgtatggt gacggccaca tgctgtccgg caaagttctg 360
ttcgactacg gcaaagcgta tctgggctat aacaacaaag aatacgaatc caccaaattc 420
tacgtgctgg ttgaacatcc gagctgg 447
<210> 6
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有另外的N端Met的SEQ ID NO:1的多肽
<400> 6
Met Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu
1 5 10 15
His Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val
20 25 30
Ala Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro
35 40 45
Ser Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Phe Tyr Lys
50 55 60
Ser Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu
65 70 75 80
Trp Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly
85 90 95
Gly Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp
100 105 110
Gly His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr
115 120 125
Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu
130 135 140
Val Glu His Pro Ser Trp
145 150
<210> 7
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有另外的N端Met的SEQ ID NO:2的多肽
<400> 7
Met Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu
1 5 10 15
His Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val
20 25 30
Ala Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro
35 40 45
Ser Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Leu Tyr Lys
50 55 60
Ser Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu
65 70 75 80
Trp Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly
85 90 95
Gly Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp
100 105 110
Gly His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr
115 120 125
Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu
130 135 140
Val Glu His Pro Ser Trp
145 150
<210> 8
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有另外的N端Met的SEQ ID NO:3的多肽
<400> 8
Met Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu
1 5 10 15
His Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val
20 25 30
Ala Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro
35 40 45
Ser Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Phe Tyr Lys
50 55 60
Ser Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu
65 70 75 80
Trp Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly
85 90 95
Gly Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp
100 105 110
Gly His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr
115 120 125
Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu
130 135 140
Val Glu His Pro Ser
145
<210> 9
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有另外的N端Met的SEQ ID NO:4的多肽
<400> 9
Met Ser Asn Leu Arg Trp Val Ala Thr Ser Gly Gly Lys Val Pro Glu
1 5 10 15
His Ala Val Val Gly Gly Glu Asn Phe Ser Gly Glu Val Leu Tyr Val
20 25 30
Ala Arg Val Arg Ile Asn Ser Gly Leu Thr Pro Gly Lys Met Ala Pro
35 40 45
Ser Tyr Arg Val Ala His Thr Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Leu Tyr Lys
50 55 60
Ser Asp Tyr Glu Leu Ile Thr Asn Pro Gly Trp Lys Ser His Ile Glu
65 70 75 80
Trp Lys Tyr His Glu Gly His Ser Lys Pro Thr Asn Ala Val Leu Gly
85 90 95
Gly Thr Asp Gln Arg Asn Leu Tyr Val Ala Arg Phe Met Tyr Gly Asp
100 105 110
Gly His Met Leu Ser Gly Lys Val Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Ala Tyr
115 120 125
Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Glu Tyr Glu Ser Thr Lys Phe Tyr Val Leu
130 135 140
Val Glu His Pro Ser
145
<210> 10
<211> 447
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Sava凝集素的多核苷酸
<400> 10
agcaacctca gatgggttgc tacctcgggc ggaaaggtgc cggagcatgc tgttgttggt 60
ggagagaatt tttctggtga agtattgtat gtggcccgtg taaggataaa ttctggctta 120
acacccggca aaatggctcc atcctaccga gtagctcaca cttcttatgg ggggaaagaa 180
ttctacaagt cagactatga gctaatcaca aatcctggtt ggaaatctca tattgaatgg 240
aagtatcatg aaggtcacag caaaccaact aatgcagtgc tgggaggaac tgatcaaagg 300
aatctttatg ttgcaagatt catgtatggt gatgggcata tgttgagtgg taaagttctt 360
tttgattatg gaaaagcata ccttggatac aacaacaagg agtatgaatc aacgaagttt 420
tatgtcttag tcgaacatcc ttcatgg 447

Claims (16)

1.一种具有特异性糖类结合活性的多肽，任选地为工程化多肽，其中，所述多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：
(a)SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的氨基酸序列；
(b)氨基酸序列，其为SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个的序列的片段，所述片段包含所述序列的至少30个连续氨基酸；
(c)与(a)、(b)或(c)中任一项的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其被工程化以在N端包括另外的甲硫氨酸和/或在C端包括蛋白质纯化标签或其他标签，所述标签可以通过接头与C端连接。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其包含SEQ ID NO：6、7、8或9的氨基酸序列或由SEQID NO：6、7、8或9的氨基酸序列组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其对含有甘露糖的聚糖具有特异性结合活性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其与另外的部分缀合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其具有针对表达所述多肽特异性结合的糖类的病原体的抗病原体活性，任选地，其中，所述病原体是病毒、细菌细胞、真菌细胞或癌细胞。
7.一种多核苷酸或表达载体，其包含编码前述权利要求中任一项所述的多肽的核酸序列。
8.一种宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的多核苷酸或表达载体，所述宿主细胞优选地为细菌细胞或植物细胞，任选地，其中，所述细菌细胞是大肠杆菌、乳杆菌或优选根癌农杆菌的细胞，和/或其中，所述植物细胞是本氏烟草的细胞。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中，所述多肽以溶液、冻干的或固定的形式提供，任选地与有效量的至少一种防腐剂一起提供。
10.一种组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽以及至少一种防腐剂，以及任选地一种或多种载体、赋形剂、稀释剂或媒介物；任选地，其中，所述组合物是药学上可接受的或适合用作表面杀微生物剂。
11.一种方法，其包括将根据权利要求1至6中任一项所述的多肽施用于存在糖类的样本或受试者。
12.根据权利要求11所述的方法，所述方法用于离体结合样本中的糖类，并且所述方法包括将所述多肽施用于所述样本并在适于发生结合的条件下孵育。
13.根据权利要求12所述的方法，其还包括分离、检测或分析所得的结合产物。
14.根据权利要求11所述的方法，其用于预防或治疗受试者的疾病或病症，并且所述方法包括以预防或治疗有效量向所述受试者施用所述多肽。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述疾病或病症是全部或部分由表达所述多肽特异性结合的糖类的病原体介导的疾病或病症，任选地，其中，所述糖类作为糖蛋白的聚糖组分或存在于所述病原体表面上的其他结构存在。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述病原体是病毒、细菌细胞、真菌细胞或癌细胞。
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