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CN118525035A - 抗cldn18.2和4-1bb的双特异性抗原结合蛋白及其用途 - Google Patents

抗cldn18.2和4-1bb的双特异性抗原结合蛋白及其用途 Download PDF

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CN118525035A
CN118525035A CN202380016581.5A CN202380016581A CN118525035A CN 118525035 A CN118525035 A CN 118525035A CN 202380016581 A CN202380016581 A CN 202380016581A CN 118525035 A CN118525035 A CN 118525035A
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CN
China
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seq
amino acid
acid sequence
sequence shown
binding protein
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Pending
Application number
CN202380016581.5A
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杨沙沙
陈晓锐
王华菁
杨焕凤
何晓文
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Oricell Therapeutics Co Ltd
Original Assignee
Oricell Therapeutics Co Ltd
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Abstract

一种分离的抗原结合蛋白及其制备方法和用途。该抗原结合蛋白包括：第一抗原结合域和第二抗原结合域，该第一抗原结合域能够特异性结合紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)，且所述第一抗原结合域包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列中的至少一个CDR。

Description

抗CLDN18.2和4-1BB的双特异性抗原结合蛋白及其用途 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种抗CLDN18.2的双特异性抗原结合蛋白及其用途。
背景技术
CLDN18.2(Claudin 18.2)是形成紧密细胞连接的重要组成部分的一个蛋白质家族。CLDN18.2只表达于分化型胃壁细胞，在正常组织中无表达。最新研究表明，CLDN18.2在77％以上胃癌患者以及80％以上胰腺癌患者中都过表达，此外在肺癌，食管癌以及卵巢癌等实体瘤中过表达。
4-1BB(CD137，肿瘤细胞坏死因子受体超家族9)是TNF受体超家族(TNFRSF)的成员，其为一种共刺激分子，在免疫细胞(固有免疫细胞和适应性免疫细胞)激活后表达。4-1BB在调节多种免疫细胞的活性方面起着重要作用。4-1BB激动剂增强免疫细胞增殖、存活、细胞因子分泌和CD8+T细胞的细胞溶解活性。许多其他研究表明，激活4-1BB可增强免疫反应，消除小鼠肿瘤。因此，4-1BB可能是一种有前途的肿瘤免疫靶分子。
目前已有CLDN18.2抗体，然而，现有抗体在治疗效果及免疫持久性上仍有很大的进步空间，因此，亟需开发更有效的针对CLDN18.2的抗体。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含第一抗原结合域和第二抗原结合域，所述第一抗原结合域能够特异性结合CLDN18.2。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种：1)能够特异性结合CLDN18.2；2)能够特异性结合4-1BB；3)能够特异性结合人、鼠和食蟹猴的CLDN18.2蛋白；4)能够刺激T细胞活化，促进IL-2因子的分泌；5)能够抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖；6)具有肿瘤免疫记忆功能。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包括：第一抗原结合域和第二抗原结合域，所述第一抗原结合域能够特异性结合紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)，且所述第一抗原结合域包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包括HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包括HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:70中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:99(X 1YX 2X 3X 4，其中，X 1为N或R，X 2为G、I或V，X 3为I或M，X 4为H、N或S)所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:99(X 1YX 2X 3X 4，其中，X 1为N或R，X 2为G、I或V，X 3为I或M，X 4为H、N或S)所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1，HCDR2和HCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；以及
(3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含H-FR1， 所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:75中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:72中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:76中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:86中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:77中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1，LCDR2和LCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(2)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(3)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；
(4)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列；以及
(5)所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含L-FR1，所述L-FR1的C端与所述LCDR1的N端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:88中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:89中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；
(4)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含 SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(5)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；以及
(6)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含VH和VL，所述VH和VL选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
(2)所述VH包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
(3)所述VH包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；
(4)所述VH包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
(5)所述VH包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列；以及
(6)所述VH包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含重链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区包含源自人IgG的重链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区包含源自人IgG1的重链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区包含Fc片段。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述Fc片段包含一个或多个突变。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述Fc片段包含N180A、D239E和L241M中的一个或多个突变。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含轻链恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述轻链恒定区包含人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab)’ 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域能够特异性结合4-1BB。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR1， 且所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含重链可变区VH，且所述VH包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含L-FR1，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含L-FR2， 且所述L-FR2包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含L-FR3，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含L-FR4，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含轻链可变区VL，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，其中所述第二抗原结合域包含VH和VL，所述VH和VL选自下述任一组的氨基酸序列：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及
(2)所述VH包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域的VH和VL直接或间接相连。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域的VH和VL通过连接子相连。在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包含scFv。
在某些实施方式中，所述scFv包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域直接或间接相连。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过连接子相连。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述连接子包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域的scFv与所述第一抗原结合域的Fc片段的C端直接或间接相连。
另一方面，本申请还提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含两个第一多肽和两个第二多肽，所述第一多肽从N端到C端依次包含VH，CH1，CH2，CH3和能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv，所述第二多肽包含VL和轻链可变区CL；其中所述VH与所述VL配对且能够特异性结合CLDN18.2。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述CH2和所述CH3构成Fc片段。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述Fc片段包含选自下组的一个或 多个氨基酸突变：N180A，D239E和L241M。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述scFv包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述scFv包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述scFv包含VH，且所述VH包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述scFv包含VL，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请还提供了多肽，其包含本申请所述的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含本申请所述的抗原结合蛋白，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请还提供了制备所述抗原结合蛋白的方法，其包括在使得所述分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述核酸分子，所述载体，所述细胞和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述核酸分子，所述载体，所述细胞和/或所述药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
另一方面，本申请还提供了一种预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述核酸分子，所述载体，所述细胞和/或所述药物组合物。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白的构建示意图；图1B显示的是纯化后抗原结合蛋白的SEC-HPLC纯度检测结果。
图2A显示的是抗原结合蛋白和4-1BB-NFκB-293T细胞的结合活性；图2B显示的是抗原结合蛋白和CHO-hCLDN18.2细胞的结合活性。
图3显示的是流式验证抗原结合蛋白双头同时结合的活性检测。
图4A显示的是抗原结合蛋白和293T-鼠CLDN18.2细胞的流式结合活性；图4B显示的是抗原结合蛋白和293T-食蟹猴CLDN18.2细胞的流式结合活性。
图5显示的是本申请所述抗原结合蛋白的流式竞争结合实验。
图6显示的是荧光素酶活性分析实验结果。
图7A显示的是SEA超抗原激活PBMC条件下的IL-2分泌水平；图7B显示的是抗人CD3抗体激活PBMC条件下的IL-2分泌水平。
图8显示的是抗原结合蛋白在小鼠结肠癌肿瘤模型中的抑瘤活性检测。
图9显示的是给药后小鼠肿瘤体积统计。
图10显示的是本申请所述的CLDN18.2的靶向部分与高表达人CLDN18.2细胞的流式结合活性检测。
图11显示的是本申请所述的CLDN18.2的靶向部分与高表达人CLDN18.1细胞的流式结合活性检测。
图12显示的是本申请所述的CLDN18.2的靶向部分与肿瘤细胞系的流式结合活性检测。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“CLDN18.2”、或“Claudin18.2”可以互换使用，通常指细胞连接密蛋白Claudin18的亚型2。所述术语涵盖“全长”、未加工的CLDN18.2以及由细胞加工所产生的任何形式的CLDN18.2。CLDN18.2可以包括完整的CLDN18.2及其片段，其功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物以及具有至少一个与CLDN18.2共同表位的类似物。CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的氨基酸序列是本领域已知的。例如，人CLDN18.2核苷酸序列可以显示于GeneBank登录号NM_001002026.3下。例如，小鼠CLDN18.2核苷酸序列可以显示于GeneBank登录号NM_001194921.1下。例如，食蟹猴CLDN18.2核苷酸序列可以显示于GeneBank登录号XM_001114708.4下。
在本申请中，属于“4-1BB”，又名4-1BB或TNFRS9，通常是指肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质，是激活诱导的共刺激分子是免疫应答的重要调节剂。研究表明CD137激动型单克隆抗体在许多模型中增加共刺激分子表达，并且显著增强细胞溶解性T淋巴细胞应答，发挥抗肿瘤作用。CD137靶向疗法的抗肿瘤作用可以通过利用激动型抗小鼠CD137单克隆抗体的小鼠体内抗肿瘤疗效研究证实。CD137已经成为免疫细胞的有力激活剂，并成为治疗各种疾病的重要候选抗原。(参见Vinay,Dass S.,and Byoung S.Kwon."4-1BB(CD137),an inducible costimulatory receptor,as a specific target for cancer therapy."BMB reports 47.3(2014):122.)
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常指从天然状态下经人工手段获得的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。参见例如Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。抗原结合蛋白的实例包括但不限于：人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’) 2，F(ab) 2，scFv，di-scFv，dAb，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含不止一个抗原结合域。在本申请中，所述抗原结合域可以靶向不同的抗原。在本申请中，所述抗原结合域可以靶向相同抗原的不同表位。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含第一抗原结合域和第二抗原结合域。例如，所述第一抗原结合域可以靶向CLDN18.2蛋白，例如，所述第二抗原结合域可以靶向4-1BB蛋白。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“V H”和“V L”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区 (CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab') 2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合CLDN18.2)的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能方面的相对小的差异，将γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达下述亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgK1。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变结构域中的区域，其 序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。参见，例如,Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
在本申请中，术语“FR”通常指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。通常，天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4)。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的VL可以包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。本申请所述的分离的抗原结合蛋白的VH可以包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，CLDN18.2)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab) 2、Fv片段、F(ab’) 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(V H)的第一恒定区(C H1)组成。
在本申请中，术语“Fab′片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”通常指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所 来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
术语“全人源抗体”通常指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人源抗体可能含有鼠糖链。 类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术在美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技术，如使用文库，是本领域已知的。
在本申请中，术语“直接相连”与术语“间接相连”相对，术语“直接相连”通常是指直接连接。例如，所述直接相连可以为物质间没有间隔子而直接相连的情况。所述间隔子可以是连接子。例如，所述连接子可以为肽连接子。术语“间接相连”通常是指物质间不直接相连的情况。例如，所述间接相连可以为通过间隔子而连接的情况。例如，在本申请所述的分离的抗原结合蛋白中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端可以直接或间接相连。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞。在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为HEK293细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物 组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“肿瘤”通常指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。在本申请中，肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤。例如，在本申请中，肿瘤可以是CLDN18.2阳性的肿瘤。例如，在本申请中，肿瘤可以是CLDN18.2异常表达相关的疾病和/或病症。
术语“癌症”通常指以异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本申请中的癌症包括但不限于胃癌、结肠癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，例如，两种术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如，弥散型或循环型肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”可以包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CLDN18.2和/或4-1BB蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个 或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CLDN18.2和/或4-1BB蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，例如，所述CDR可以根据Kabat方式进行划分。
第一抗原结合域
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含第一抗原结合域，所述第一抗原结合域能够特异性结合CLDN18.2或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一抗原结合域可以包括抗体或其抗原结合片段或其变体。
本申请中，所述抗体可选自以下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在本申请中，所述的抗原结合片段可选自以下组：Fab，Fab’，Fv片段，F(ab)’ 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，所述第一抗原结合域可以包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包括HCDR3，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包括HCDR3，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR2，且所述HCDR2可包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR2，且所述HCDR2可包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:70中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR1，且所述HCDR1可包含SEQ ID NO:99(X 1YX 2X 3X 4，其中，X 1为N或R，X 2为G、I或V，X 3为I或M，X 4为H、N或S)所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR1，且所述HCDR1可包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:99(X 1YX 2X 3X 4，其中，X 1为N或R，X 2为G、I或V，X 3为I或M，X 4为H、N或S)所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1，HCDR2和HCDR3可包含选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；以及
(3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1可包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:75中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3可包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:72中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含重链可变区VH，所述VH可包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含重链可变区VH，所述VH可包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:76中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR3，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR3，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:86中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:77中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含LCDR1，LCDR2 和LCDR3，所述LCDR1，LCDR2和LCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(2)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(3)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；
(4)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列；以及
(5)所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含L-FR1，所述L-FR1的C端与所述LCDR1的N端直接或间接相连，且所述L-FR1可包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3可包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:88中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含轻链可变区VL， 所述VL可包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含轻链可变区VL，所述VL可包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:89中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3可包含选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；
(4)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(5)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；以及
(6)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含VH和VL，所述VH可包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含VH和VL，所述VH和VL可选自下述任一组氨基酸序列：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
(2)所述VH包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
(3)所述VH包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；
(4)所述VH包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
(5)所述VH包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列；以及
(6)所述VH包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含重链恒定区。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区可包含源自IgG的重链恒定区。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区可包含源自人IgG的重链恒定区。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区可包含源自人IgG1的重链恒定区。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区可包含Fc片段。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述Fc片段可包含一个或多个突变。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述Fc片段可包含N180A、D239E和L241M中的一个或多个突变。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述重链恒定区可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一抗原结合域可包含轻链恒定区。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述轻链恒定区可包含人Igκ恒定区。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一抗原结合域可包含能够结合CLDN18.2的单克隆抗体。
第二抗原结合域
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含第二抗原结合域，所述第二抗原结合域能够特异性结合4-1BB蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二抗原结合域可以包含scFv。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR3，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域包含HCDR1，且所述HCDR1可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1可包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含H-FR2，所述 H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含重链可变区VH，且所述VH可包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含LCDR3，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含L-FR1，且所述L-FR1可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含L-FR2，且所述L-FR2可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含L-FR3，且所述L-FR3可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含L-FR4，且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含轻链可变区VL，且所述VL可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，其中所述第二抗原结合域可包含VH和VL， 所述VH和VL可选自下述任一组的氨基酸序列：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及
(2)所述VH包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域的VH和VL可直接或间接相连。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域的VH和VL可通过连接子相连。在本申请中，所述连接子可包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合片段可包含scFv。
在本申请中，所述scFv可包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二抗原结合域可包含抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，所述框架区可以选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
在本申请中，所述第二抗原结合域可以包括抗体或其抗原结合片段或其变体。
本申请中，所述抗体可选自以下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在本申请中，所述的抗原结合片段可选自以下组：Fab，Fab’，Fv片段，F(ab)’ 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
例如，所述分离的抗原结合蛋白的第二抗原结合域可以为scFv。
分离的抗原结合蛋白
本申请提供了一种抗原结合蛋白，其包括第一抗原结合域和第二抗原结合域。例如，所述第一抗原结合域可以特异性结合CLDN18.2蛋白。例如，所述第二抗原结合域可以特异性结合4-1BB蛋白。
例如，所述第一抗原结合域可以为单克隆抗体。例如，所述第二抗原结合域可以为scFv。
在本申请中，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域可以直接或间接相连。
在本申请中，所述第一抗原结合域可以和所述第二抗原结合域可以通过连接子相连。例如，所述连接子可以为肽接头。例如，所述连接子可以包括SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二抗原结合域的scFv可以与第一抗原结合域的Fc片段的C端通过 连接子相连。例如，所述第二抗原结合域的VH可以与第一抗原结合域的Fc片段的C端通过连接子相连。例如，所述第二抗原结合域的VL可以与第一抗原结合域的Fc片段的C端通过连接子相连。
另一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含两个第一多肽和两个第二多肽。例如，所述第一多肽可以包含能够特异性结合CLDN18.2蛋白的抗原结合蛋白的重链和能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv。例如，所述第二多肽可以包含能够特异性结合CLDN18.2蛋白的抗原结合蛋白的轻链。
例如，所述第一多肽从N端到C端依次包含VH，CH1，CH2，CH3和能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv，所述第二多肽包含VL和轻链可变区CL；其中所述VH与所述VL配对且能够特异性结合CLDN18.2。例如，所述VH可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。例如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。例如，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
例如，所述CH2和所述CH3可构成Fc片段。例如，所述Fc片段可包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：N180A，D239E和L241M。
例如，所述能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv可包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。例 如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
例如，所述能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
例如，所述能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv可包含VH。例如，所述VH包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。例如，所述能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv可包含VL。例如，所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
例如，所述能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白的第一多肽可包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的第二多肽可包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:90中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的两条第一多肽可包含相同的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的两条第二多肽可包含相同的氨基酸序列。
多肽分子、核酸分子、载体、细胞和药物组合物
另一方面，本申请提供了多肽分子，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种或多种核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此 外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽分子、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
制备方法
另一方面，本申请提供了制备所述的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当 的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
方法和用途
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述的多肽分子、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了预防、缓解或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法可以包括向有需要的受试者施用本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述的多肽分子、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。在本申请中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
另一方面，本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述的多肽分子、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物，其可以用于预防、缓解或治疗疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症可以包括CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症可以包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤可以包括CLDN18.2阳性的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤可以包括胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
另一方面，本申请还提供了检测样品中CLDN18.2的方法。所述方法包括施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物。所述方法可以是离体和/或体外方法。
另一方面，本申请还提供了检测样品中CLDN18.2的试剂或试剂盒，其可以包含所述的分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物在制备所述检测CLDN18.2的试剂或试剂盒中的用途。
在本申请中，所述试剂或试剂盒可以用于检测样品中CLDN18.2的存在和/或含量。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1抗CLDN18.2/4-1BB双特异性抗体的生成
采用公司自主研发的人源化Claudin18.2单抗5E6(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)和全人源4-1BB单抗YN006(VH氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，VL氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示)，组合构建形成抗CLDN18.2/4-1BB双特异性抗体。该双抗采用经过了氨基酸突变的人IgG1-Fc骨架，将完整IgG形式的抗CLDN18.2部分连接于Fc段的N端，单链scFv形式的抗4-1BB部分连接于Fc段的C端；其中人IgG1-Fc骨架区的氨基酸突变使该双抗的ADCC等效应功能得以沉默，该氨基酸突变具体为：N180A/D239E/L241M，分子结构如图1A。该双抗在293F瞬时表达体系中，经Protein A一步法亲和层析纯化后，抗体表达量可达到130mg/L左右，SEC-HPLC纯度为96％，该双抗命名为OriAb-362。(如图1B)
实施例2 OriAb-362双抗的抗原结合活性的鉴定
采用流式的方法验证OriAb-362双抗的抗原结合活性，具体方法如下：96孔V底板中均匀铺上过表达人4-1BB的靶细胞(41BB-NFkB-293T)或过表达人CLDN18.2的靶细胞(hCLDN18.2-CHO)；加入梯度稀释的一抗(即OriAb-362双抗和4-1BB亲本单抗YN006；OriAb-362双抗和CLDN18.2亲本单抗5E6)，一抗的起始工作浓度为100nM，3倍比梯度稀释，共形成11个浓度梯度；4℃孵育1h后离心洗板，然后再加入对应的二抗(Goat pAb to human IgG-Dylight 650，abcam，Cat#ab98593)，4℃孵育30min后离心洗板，之后使用iQue Screener流式仪(购自IntelliCyt公司)上机检测荧光信号。结果如图2A，OriAb-362双抗与4-1BB细胞抗原的结合活性较亲本单抗YN006略有下将，EC50值约为2倍左右；结果如图2B，OriAb-362双抗与CLDN18.2细胞抗原的结合活性较亲本单抗5E6相比基本相同，保留了CLDN18.2亲本单抗的抗原结合活性。
实施例3 OriAb-362双抗两头同时结合活性的流式鉴定
采用流式的方法验证OriAb-362双抗的两头同时结合活性，方法如下：选择过表达人CLDN18.2的细胞CHO-hCLDN18.2铺板，随后加入梯度稀释的OriAb-362双抗，抗体从25nM的工作浓度起始进行两倍比梯度稀释，共形成9个浓度梯度，同时设置单抗5E6做为阴性对照，抗体浓度同Ori-Ab362双抗；再加入等体积的固定浓度(1.5ug/ml的工作浓度)的生物素化的4-1BB蛋白(h4-1BB-Biotin)，4℃共孵育1h后离心洗板，加入二抗(BD phamingen APC Streptavidin,Cat#554067)，4℃孵育30min后离心洗板，之后使用iQue Screener流式仪(购自IntelliCyt公司)上机检测荧光信号。结果如图3，OriAb-362双抗可以同时与CHO-CLDN18.2细胞、生物素化的4-1BB蛋白结合，即OriAb-362双抗具有两头同时结合活性。
实施例4 OriAb-362双抗的种属交叉结合活性鉴定
利用本公司的慢病毒包装、感染和稳定细胞株构建体系，筛选获得了过表达鼠CLDN18.2的细胞293T-mouseCLDN18.2和过表达食蟹猴CLDN18.2的细胞293T-macacaCLDN18.2细胞，并利用流式的方法验证了OriAb-362双抗与鼠/食蟹猴CLDN18.2的结合活性：一抗为梯度稀释的OriAb-362双抗和CLDN18.2亲本单抗5E6，抗体从33.3nM的工作浓度起始，3倍比梯度稀释，共形成10个浓度梯度；二抗为Goat pAb to human IgG(Dylight 650)(abcam，Cat#ab98593)，4℃孵育30min后离心，离心后用30ul/孔的流式缓冲液重悬，最后使用iQue Screener流式仪(购自IntelliCyt公司)上机检测荧光信号。结果如图4A，与293T-mouseCLDN18.2细胞的结合活性上，OriAb-362双抗与亲本单抗5E6基本无异，表现为EC50值基本相同；结果如图4B，与293T-macacaCLDN18.2细胞的结合活性上，OriAb-362双抗稍弱于亲本单抗5E6，表现为EC50值为1.5倍关系。所以，OriAb-362双抗基本保留了亲本单抗5E6与鼠/食蟹猴CLDN18.2抗原的结合活性，可以同时与人、鼠、食蟹猴CLDN18.2结合，具有种属交叉结合活性。
实施例5 OriAb-362双抗的流式竞争结合活性分析
首先，用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,Thermo,A39257)标记OriAb-362双抗、人CLDN18.2单抗5E6及人CLDN18.2阳性对照单抗IMAB362(见专利CN103509114A提供的175D10克隆)，各标记500ug，生物素化的抗体分子使用分子相互作用分析仪OctetRED384(sartorius)来测定标记效果，选择SA传感器固化抗体，抗体浓度为100nM,标记180s，标记完成的生物素化抗体命名为Biotin-OriAb362、Biotin-5E6、Biotin-IMAB362。
通过流式细胞荧光分选技术(FACS)，使用iQue Screener流式仪(购自IntelliCyt公司)，用含有0.1％BSA的PBS作为缓冲液检测上述抗体与CHO-humanCLDN18.2细胞的竞争结合活性，具体过程如下：1)配置受试抗体(Biotin-OriAb362、Biotin-5E6、Biotin-IMAB362)，使抗体浓度为1.5μg/ml，30ul/孔，即工作浓度为0.5μg/ml；配置竞争抗体(OriAb-362、5E6、IMAB362)，抗体稀释浓度从6666nM起始，按4倍比梯度稀释抗体，形成9个浓度梯度，设PBS为阴性对照孔，30ul/孔，即抗体工作浓度为2222nM浓度起始；将这两种抗体预先混合 后铺在96孔板中；2)使用缓冲液配置浓度为1x10 6cells/ml的CHO-humanCLDN18.2细胞，加入上述96孔尖底板(corning 3894)，每孔30μl；3)4℃冰箱孵育1小时后离心重悬，加入荧光二抗(BD phamingen APC Streptavidin,Cat#554067)，4℃冰箱孵育30分钟；4)最后每孔加25μl缓冲液混匀后用流式仪器检测。流式竞争结合活性检测的分析结果如图5所示，OriAb-362双抗和5E6单抗存在互相完全竞争的关系，而阳性对照单抗IMAB362始终无法完全竞争OriAb-362双抗或5E6单抗，存在不完全竞争关系。说明OriAb362双抗、5E6单抗与IMAB362单抗可能具有不同的抗原结合表位，在抗原结合活性上OriAb-362双抗比IMAB362更具竞争能力，且OriAb-362双抗完全保留了亲本单抗5E6的抗原结合表位，具有同等竞争结合活性。
实施例6 OriAb-362双抗以CLDN18.2依赖性激活4-1BB信号通路
为了验证OriAb-362双抗激活4-1BB信号通路的激动剂活性，本实施例采用荧光素酶的实验方法进行了检测：1)效应细胞41BB-NFkB-293T为稳定整合了NFkB荧光素酶报告因子且过表达了人4-1BB的293T细胞，胰酶消化细胞并用DMEM+10％FBS培养基重悬，使细胞密度为5*10 5/孔，50ul/孔均匀铺在白底不透光的无菌96孔板中(Nunclon Delta Surface CAT:136101)；2)CHO-hCLDN18.2为慢病毒转染的高表达人CLDN18.2的细胞，NUGC-4为天然低表达人CLDN18.2的人胃癌细胞，本实施例分别选择CHO-hCLDN18.2和NUGC-4作为不同CLDN18.2表达水平的靶细胞，胰酶分别消化CHO-hCLDN18.2和NUGC-4细胞并用DMEM+10％FBS培养基重悬，使细胞密度为5*10 5/孔，50ul/孔均匀铺在上述96板中；3)加入梯度稀释的抗体(YN006，5E6，OriAb-362，YN006+5E6，hIgG-Fc)，抗体起始工作浓度为50nM，5倍比梯度稀释，共6个梯度，50ul/孔铺在上述96孔板中，同时设置不含抗体的对照孔，每个处理设置两个复孔；4)96孔板放入37度细胞培养箱中孵育24h；5)利用荧光素酶检测试剂盒(promega，E6120)，加入荧光素酶底物获得发光，用Tecan酶标仪测定荧光素酶含量；6)数据处理：Fold stimulation＝RLU抗体处理组/RLU不加抗体组。结果如图6，OriAb-362双抗能够刺激靶细胞对4-1BB荧光素酶信号的激活，此激活依赖于CLDN18.2的表达，其激活强度与靶细胞human CLDN18.2表达丰度正相关(图6A，高表达人CLDN18.2的靶细胞，激活倍数约为5倍；图6B，低表达人CLDN18.2的靶细胞，激活倍数约为2倍)，且呈现抗体浓度依赖性，而亲本单抗及其联合应用均不能激活4-1BB荧光素酶信号。
实施例7 OriAb-362双抗可以刺激T细胞活化，促进IL-2因子的分泌
SEA等超级抗原能够交联TCR和MHCII类分子激活CD4+T细胞。本实施例采用SEA超抗原持续刺激人PBMC，利用因子释放实验验证OriAb-362双抗促进人PBMC免疫应答 的活性，具体如下：37度水浴复苏冻存的PBMC，离心润洗两次后，用“X-VIVO+5％FBS+5ug/ml SEA”的培养基重悬，细胞密度为1.25*10 6/孔，100ul细胞悬液/孔，均匀铺在V底的无菌96孔板中；阳性靶细胞为高表达人CLDN18.2的CHO-hCLDN18.2细胞和天然低表达人CLDN18.2的人胃癌细胞NUGC-4，阴性靶细胞为CHO、CHO-hCLDN18.1细胞，细胞按照5*10 5/孔的细胞密度进行重悬(X-VIVO+5％FBS)，50ul/孔铺在上述96孔板中，即效靶比PBMC:靶细胞＝5：1；抗体(YN006，5E6，OriAb-362，YN006+5E6，hIgG-Fc)用X-VIVO+5％FBS培养基进行稀释，50ul/孔铺在上述96孔板中，使抗体工作浓度为100nM、10nM和1nM；将抗体、PBMC和靶细胞在37℃细胞培养箱中共孵育72h，离心后保留细胞培养上清，采用ELISA法检测IL-2水平(R&D，DY202)。
固相结合高密度抗CD3抗体可引起TCR-CD3复合物交联，直接产生活化信号，刺激T细胞活化。本实施例采用固相结合的抗人CD3抗体持续刺激人PBMC，利用因子释放实验验证OriAb-362双抗促进人PBMC免疫应答的活性，具体如下:用可吸附蛋白的无菌96孔板包被抗人CD3抗体，无菌PBS稀释成1μg/mL的浓度，每孔100mL，4℃包被过夜；洗涤CD3蛋白：第二天用吸引器吸去96孔板中的PBS，用X-VIVO+5％FBS的培养基洗涤板子三次；然后依次加入PBMC、靶细胞和抗体，抗体浓度及细胞量同上，重悬缓冲液为X-VIVO+5％FBS；37℃细胞培养箱孵育72h，后用IL-2试剂盒检测因子分泌量。
结果如图7，在SEA超抗原(图7A)或固化抗CD3抗体(图7B)持续刺激人PBMC的情况下，当CHO-hCLDN18.2或NUGC-4细胞存在时，OriAb-362能有效增强T细胞功能，导致IL-2因子的释放，而阴性细胞CHO/CHO-hCLDN18.1的存在不会导致IL-2的释放水平提高，说明这种激活信号是依赖CLDN18.2的；同时只有Ori-Ab362双抗可以有效增强T细胞功能，导致IL-2的释放，对应的亲本单抗及药物组合方式均无法诱导IL-2的分泌。
实施例8 OriAb-362双抗在小鼠结肠癌肿瘤模型中的抑瘤活性
为了研究OriAb-362双抗在小鼠体内的抗肿瘤作用，本实施例选择了人4-1BB转基因C57BL/6小鼠(百奥赛图，110004，B-h4-1BB mice)，通过皮下接瘤过表达人CLDN18.2的小鼠结肠癌细胞，即MC38-hCLDN18.2细胞(1.5*10 6/只)，待小鼠肿瘤平均体积为80mm 3时进行分组，分组情况见下表1，分组当天开始腹腔给药(BIW*3；每周给药两次，给药三周)并记为D1，每周测量三次小鼠体重和肿瘤体积，当小鼠肿瘤体积大于3000mm 3安乐死小鼠。小鼠体重和肿瘤体积持续观察至D30，在整个观察期间小鼠体重正常，见图8A；小鼠抑瘤情况见图8B，相对于Group1：PBS组和Group2：hIgG-Fc组，Group3/Group4/Group5/Group6组均存在显著的抑瘤活性(p＜0.0001)，其中Group3：5E6 单抗组中没有小鼠完全消瘤(0/6)，肿瘤体积抑制率TGI TV(％)为39.22％、Group4：YN006单抗组有4只小鼠完全消瘤(4/6)，TGI TV(％)为102.62％、Group5：OriAb-362双抗组有6只小鼠完全消瘤(6/6)，TGI TV(％)为102.81％、Group6：5E6+YN006联合给药组有5只小鼠完全消瘤(5/6)，TGI TV(％)为98.62％，具体数据见表2。即OriAb-362双抗组在小鼠体内具有极显著的抑瘤活性，且优于5E6亲本单抗、YN006亲本单抗以及联合给药处理。
表1小鼠分组情况
组别 抗体 剂量(mg/kg) 小鼠数量 给药途径&周期
Group1 PBS / 6 IP,Biw*3 weeks
Group2 hIgG-Fc 10 6 IP,Biw*3 weeks
Group3 5E6 10 6 IP,Biw*3 weeks
Group4 YN006 10 6 IP,Biw*3 weeks
Group5 OriAb-362 13.3 6 IP,Biw*3 weeks
Group6 5E6+YN006 10+10 6 IP,Biw*3 weeks
表2抑瘤结果统计
组别 1st给药后30天小鼠消瘤情况 1st给药后30天的TGI TV(％)值
G1,PBS,10ml/kg 0/6 /
G2,hIgG-Fc,10mg/kg 0/6 13.89％
G3,5E6,10mg/kg 0/6 39.22％
G4,YN006,10mg/kg 4/6 102.62％
G5,OriAb362,13.3mg/kg 6/6 102.81％
G6,5E6+YN006,10+10mg/kg 5/6 98.62％
实施例9 OriAb-362双抗在低剂量下的抑瘤活性和肿瘤免疫记忆功能
为了进一步研究低给药剂量下OriAb-362双抗的抑瘤活性，本实施例降低了OriAb-362双抗的给药剂量设计了如下实验方案：小鼠为人4-1BB转基因C57BL/6小鼠(百奥赛图，110004，B-h4-1BB mice)，皮下接瘤过表达人CLDN18.2的小鼠结肠癌细胞，即MC38-hCLDN18.2细胞(1.5*10 6/只)，待小鼠肿瘤平均体积为80mm 3时进行分组，分组情况见表3，分组当天开始腹腔给药(BIW*3；每周给药两次，给药三周)并记为D1，每周测量三次小鼠体重和肿瘤体积，当小鼠肿瘤体积大于3000mm 3安乐死小鼠。对小鼠1st给药后Day31的抑瘤 数据进行分析，每组小鼠的消瘤情况见表4：G2：OriAb-362,13.3mg/kg高剂量组和G3：OriAb-362,3.325mg/kg低剂量组小鼠均全部消瘤(6/6)，G4：5E6+YN006联合给药组有3只小鼠消瘤(3/6)，相对于G1：hIgG-Fc对照组均存在显著的抑瘤活性(p＜0.01)，如图9所示。已经消瘤的小鼠持续观察至Day40，然后对每只小鼠进行皮下对侧接瘤，接瘤所用的肿瘤细胞及接瘤剂量同上(MC38-hCLDN18.2细胞，1.5*10 6/只)，同时选取6只空白未做过任何实验的同品系小鼠做为Naive对照组同时进行皮下接瘤处理，接瘤后观察20天，每周三次测量小鼠肿瘤体积，对侧接瘤后小鼠肿瘤生长情况见图9，只有Naive对照组的6只小鼠全部生成肿瘤，G2/G3/G4三组中之前完全消瘤的小鼠在经过对侧皮下接瘤后依然保持消瘤状态。综上，OriAb-362双抗即使在3.325mg/kg的低剂量下同样可以诱导所有入组小鼠完全消瘤(6/6)，且对已消瘤的小鼠进行对侧再次接瘤，小鼠依然保持消瘤状态，无新肿瘤形成，体现出良好的肿瘤免疫记忆功能，具有长期的保护性免疫记忆。
表3小鼠分组情况
组别 抗体 剂量(mg/kg) 小鼠数量 给药途径&周期
1 hIgG-Fc 10 6 IP,Biw*3 weeks
2 Ori-Ab362 13.3 6 IP,Biw*3 weeks
3 Ori-Ab362 3.325 6 IP,Biw*3 weeks
4 5E6+YN006 10+3 6 IP,Biw*3 weeks
表4小鼠消瘤情况统计
组别 1st给药后31天小鼠消瘤情况
G1：hIgG-Fc,10mg/kg 0/6
G2：OriAb-362,13.3mg/kg 6/6
G3：OriAb-362,3.325mg/kg 6/6
G4：5E6+YN006,10+3mg/kg 3/6
实施例10 CLDN18.2抗原结合蛋白与CLDN18.2特异性结合活性测定
通过流式细胞荧光分选技术(FACS)，使用iQue Screener流式仪(购自IntelliCyt公司)，用含有0.1％BSA的PBS作为缓冲液检测上述嵌合抗体与靶细胞的特异性结合活性，选择三种靶细胞：表达人CLDN18.2的稳转细胞株、表达人CLDN18.1的稳转细胞株以及肿瘤细胞系，分别进行结合活性的测定。
1.本申请的CLDN18.2抗原结合蛋白与高表达人CLDN18.2细胞的流式结合活性检测
构建获得稳定高表达CLDN18的细胞株分别标记为293T-人CLDN18.2、CHO-人CLDN18.2和SP2/0-人CLDN18.2细胞，细胞消化计数，使用流式缓冲液重悬细胞并调整至 1×10 6/ml，30ul/孔加入V底96孔板；30ul/孔加入一抗，抗体以30ug/ml浓度起始，用流式缓冲液按两或三倍比梯度稀释，形成7个梯度，每种抗体设PBS阴性对照，阳性对照抗体为实施例1中纯化获得的zolbetuximab；4℃孵育1小时，流式缓冲液清洗一遍，加入二抗(abcam,Cat#ab98593)，30ul/孔，4℃孵育30分钟；流式缓冲液清洗两遍，细胞震松散，加入25ul/孔流式缓冲液，等待上机。将原始数据代入GraphPad8.0软件作图并计算，结果如图10。
2.本申请的CLDN18.2抗原结合蛋白与高表达人CLDN18.1细胞的流式结合活性检测
阳性对照抗体为市售抗CLDN18抗体(Anti-Claudin18antibody)(abcam,Cat#ab203563)，其抗原结合位点位于CLDN18.2四次胯膜蛋白的胞内部分，需要进行流式胞内染色分析。具体地，细胞为构建的293T-人CLDN18.1和SP2/0-人CLDN18.1细胞，细胞消化计数后进行固定破膜处理，处理后的细胞用流式缓冲液重悬至1×10 6/ml，30ul/孔加入V底96孔板；30ul/孔加入一抗，抗体以30ug/ml浓度起始，用流式缓冲液按三倍比梯度稀释，形成7个梯度，每种抗体设PBS阴性对照，阳性对照抗体稀释条件同上；4℃孵育1小时，流式缓冲液清洗一遍，加入二抗(abcam,Cat#ab98593和Cat#ab150079)，30ul/孔，4℃孵育30分钟；流式缓冲液清洗两遍，细胞震松散，加入25ul/孔流式缓冲液，等待上机。将原始数据代入GraphPad8.0软件作图并计算，结果如图11。
3.本申请的CLDN18.2抗原结合蛋白与肿瘤细胞系的流式结合活性检测
选择构建获得的稳定高表达人CLDN18.2的肿瘤细胞MC38-人CLDN18.2为靶细胞，细胞消化计数，使用流式缓冲液重悬细胞并调整至1×10 6/ml，30ul/孔加入V底96孔板；30ul/孔加入一抗，抗体以30ug/ml浓度起始，用流式缓冲液按三倍比梯度稀释，形成7个梯度，每种抗体设PBS阴性对照，阳性对照抗体为纯化获得的zolbetuximab，稀释条件同上；4℃孵育1小时，流式缓冲液清洗一遍，加入二抗(abcam,Cat#ab98593)，30ul/孔，4℃孵育30分钟；流式缓冲液清洗两遍，细胞震松散，加入25ul/孔流式缓冲液，等待上机。将原始数据代入GraphPad8.0软件作图并计算，结果如图12。
通过以上操作步骤，表达纯化获得5个CLDN18.2抗原结合蛋白(其中，5E6的VH序列如SEQ ID NO:8所示，VL序列如SEQ ID NO:16所示；7E3的VH序列如SEQ ID NO:73所示，VL序列如SEQ ID NO:52所示；3A6的VH序列如SEQ ID NO:62所示，VL序列如SEQ ID NO:66所示；14E12的VH序列如SEQ ID NO:76所示，VL序列如SEQ ID NO:83所示，17B10的VH序列如SEQ ID NO:76所示，VL序列如SEQ ID NO:89所示)，流式验证其抗原结合活性：如图10所示，5个抗原结合蛋白均呈现和人CLDN18.2浓度依赖性结合活性，且大部分强于zolbetuximab阳性抗体，3种细胞的检测结果保持一致；如图11所示， 5个抗原结合蛋白均能特异性与人CLDN18.2结合而不与人CLDN18.1结合；如图12所示，5个抗原结合蛋白均与稳定高表达人CLDN18.2的小鼠结肠癌MC38细胞强结合，结合活性强度呈浓度依赖性，效果与zolbetuximab阳性抗体相当或强于zolbetuximab(重链序列如SEQ ID NO:106所示，轻链序列如SEQ ID NO:107所示)。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (113)

  1. 分离的抗原结合蛋白，其包括：第一抗原结合域和第二抗原结合域，所述第一抗原结合域能够特异性结合紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)，且所述第一抗原结合域包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包括HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包括HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:70中任一项所示的氨基酸序列。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:99(X 1YX 2X 3X 4，其中，X 1为N或R，X 2为G、I或V，X 3为I或M，X 4为H、N或S)所示的氨基酸序列。
  7. 根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:99(X 1YX 2X 3X 4，其中，X 1为N或R，X 2为G、I或V，X 3为I或M，X 4为H、N或S)所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1，HCDR2和HCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
    (1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
    (2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；以及
    (3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
  10. 根据权利要求6-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:75中任一项所示的氨基酸序列。
  11. 根据权利要求6-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
  12. 根据权利要求4-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:72中任一项所示的氨基酸序列。
  13. 根据权利要求2-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列。
  15. 根据权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:76中任一项所示的氨基酸序列。
  16. 根据权利要求1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
  17. 根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:86中任一项所示的氨基酸序列。
  18. 根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列。
  19. 根据权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。
  20. 根据权利要求1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列。
  21. 根据权利要求1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:77中任一项所示的氨基酸序列。
  22. 根据权利要求1-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
  23. 根据权利要求1-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1，LCDR2和LCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
    (1)所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
    (2)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
    (3)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；
    (4)所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列；以及
    (5)所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
  24. 根据权利要求20-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含L-FR1，所述L-FR1的C端与所述LCDR1的N端直接或间接相连，且所述L-FR1包 含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列。
  25. 根据权利要求20-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
  26. 根据权利要求18-25中任一项所示的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81中任一项所示的氨基酸序列。
  27. 根据权利要求16-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:88中任一项所示的氨基酸序列。
  28. 根据权利要求1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
  29. 根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:89中任一项所示的氨基酸序列。
  30. 根据权利要求1-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3包含选自下述任一组氨基酸序列：
    (1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
    (2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
    (3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；
    (4)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
    (5)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；以及
    (6)所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所示LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
  31. 根据权利要求1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
  32. 根据权利要求1-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含VH和VL，所述VH和VL选自下述任一组氨基酸序列：
    (1)所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
    (2)所述VH包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
    (3)所述VH包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；
    (4)所述VH包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
    (5)所述VH包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列；以及
    (6)所述VH包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，且所示VL包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
  33. 根据权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含重链恒定区。
  34. 根据权利要求33所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
  35. 根据权利要求33-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含源自人IgG的重链恒定区。
  36. 根据权利要求33-35中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含源自人IgG1的重链恒定区。
  37. 根据权利要求33-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含Fc片段。
  38. 根据权利要求37所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述Fc片段包含一个或多个突变。
  39. 根据权利要求37-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述Fc片段包含N180A、D239E和L241M中的一个或多个突变。
  40. 根据权利要求33-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
  41. 根据权利要求1-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含轻链恒定区。
  42. 根据权利要求41所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区包含人Igκ恒定区。
  43. 根据权利要求41-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
  44. 根据权利要求41-43中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段。
  45. 根据权利要求44所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体包括单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
  46. 根据权利要求44所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab)’ 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
  47. 根据权利要求1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域能够特异性结合4-1BB。
  48. 根据权利要求1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。
  49. 根据权利要求1-48中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
  50. 根据权利要求1-49中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
  51. 根据权利要求1-50中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
  52. 根据权利要求1-51中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
  53. 根据权利要求51-52中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
  54. 根据权利要求51-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
  55. 根据权利要求50-54中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
  56. 根据权利要求49-55中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
  57. 根据权利要求1-56中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含重链可变区VH，且所述VH包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:92所示的氨基酸序 列。
  58. 根据权利要求1-57中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
  59. 根据权利要求1-58中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
  60. 根据权利要求1-59中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
  61. 根据权利要求1-60中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
  62. 根据权利要求1-61中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含L-FR1，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
  63. 根据权利要求1-62中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含L-FR2，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
  64. 根据权利要求1-63中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含L-FR3，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
  65. 根据权利要求1-64中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含L-FR4，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
  66. 根据权利要求1-65中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含轻链可变区VL，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
  67. 根据权利要求1-66中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含VH和VL，所述VH和VL选自下述任一组的氨基酸序列：
    (1)所述VH包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及
    (2)所述VH包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
  68. 根据权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域的VH和VL直接或间接相连。
  69. 根据权利要求1-68中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域的VH和VL通过连接子相连。
  70. 根据权利要求69所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
  71. 根据权利要求1-70中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段。
  72. 根据权利要求71所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包含scFv。
  73. 根据权利要求72所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述scFv包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
  74. 根据权利要求1-73中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域直接或间接相连。
  75. 根据权利要求1-74中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过连接子相连。
  76. 根据权利要求75所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
  77. 根据权利要求72-76中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合域的scFv与所述第一抗原结合域的Fc片段的C端直接或间接相连。
  78. 分离的抗原结合蛋白，其包含两个第一多肽和两个第二多肽，所述第一多肽从N端到C端依次包含VH，CH1，CH2，CH3和能够特异性结合4-1BB蛋白的scFv，所述第二多肽包含VL和轻链可变区CL；其中所述VH与所述VL配对且能够特异性结合CLDN18.2。
  79. 根据权利要求78所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  80. 根据权利要求78所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
  81. 根据权利要求78所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
  82. 根据权利要求78-81中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨 基酸序列。
  83. 根据权利要求78-81中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
  84. 根据权利要求78-81中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
  85. 根据权利要求78-81中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
  86. 根据权利要求78-81中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所示LCDR3包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
  87. 根据权利要求78-86中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述CH2和所述CH3构成Fc片段。
  88. 根据权利要求87所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述Fc片段包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：N180A，D239E和L241M。
  89. 根据权利要求78-88中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述scFv包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
  90. 根据权利要求78-89中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述scFv包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
  91. 根据权利要求78-90中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述scFv包含VH，且所述VH包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
  92. 根据权利要求78-91中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述scFv包含VL，且所述VL包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
  93. 多肽，其包含权利要求1-92中任一项所述的抗原结合蛋白。
  94. 一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-92中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求93所述的多肽。
  95. 载体，其包含权利要求94所述的核酸分子。
  96. 细胞，其包含权利要求94所述的核酸分子或权利要求95所述的载体。
  97. 药物组合物，其包含权利要求1-92中任一项所述的抗原结合蛋白，以及任选地药学上可接受的载剂。
  98. 制备权利要求1-92中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，其包括在使得所述分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养权利要求96所述的细胞。
  99. 权利要求1-92中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求93所述的多肽、权利要求94所述的核酸分子、权利要求95所述的载体、权利要求96所述的细胞和/或权利要求97所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症。
  100. 根据权利要求99所述的用途，其中所述疾病和/或病症包括CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
  101. 根据权利要求99-100中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包括肿瘤。
  102. 根据权利要求101所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
  103. 根据权利要求101-102中任一项所述的用途，其中所述肿瘤选自胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
  104. 权利要求1-92中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求93所述的多肽、权利要求94所述的核酸分子、权利要求95所述的载体、权利要求96所述的细胞和/或权利要求97所述的药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症。
  105. 根据权利要求104所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物，其中所述疾病和/或病症包括CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
  106. 根据权利要求104-105中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物，其中所述疾病和/或病症包括肿瘤。
  107. 根据权利要求106所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的核酸分子、所述的 载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
  108. 根据权利要求106-107中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物，其中所述肿瘤选自胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
  109. 一种预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求1-92中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求93所述的多肽、权利要求94所述的核酸分子、权利要求95所述的载体、权利要求96所述的细胞和/或权利要求97所述的药物组合物。
  110. 根据权利要求109所述的方法，其中所述疾病和/或病症包括与CLDN18.2表达异常相关的疾病和/或病症。
  111. 根据权利要求109-110中任一项所述的方法，其中所述疾病和/或病症包括肿瘤。
  112. 根据权利要求111所述的方法，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
  113. 根据权利要求111-112中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃食管交界处癌和/或结肠癌。
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