[go: up one dir, main page]

CN118516408A - 一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用 - Google Patents

一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118516408A
CN118516408A CN202410741957.5A CN202410741957A CN118516408A CN 118516408 A CN118516408 A CN 118516408A CN 202410741957 A CN202410741957 A CN 202410741957A CN 118516408 A CN118516408 A CN 118516408A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pebp4
protein
sirna
gene
prrsv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202410741957.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN118516408B (zh
Inventor
刘雪威
赵微
刘芃利
李焕荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Agriculture
Original Assignee
Beijing University of Agriculture
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Agriculture filed Critical Beijing University of Agriculture
Priority to CN202410741957.5A priority Critical patent/CN118516408B/zh
Publication of CN118516408A publication Critical patent/CN118516408A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN118516408B publication Critical patent/CN118516408B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明过表达PEBP4蛋白促进PRRSV复制；通过设计并筛选干扰PEBP4基因表达的siRNA，能够特异性敲低PEBP4蛋白表达，并有效控制PRRSV感染。本发明证明PEBP4蛋白有望成为开发新型的防治猪繁殖与呼吸综合征的药物及用于抗猪繁殖与呼吸综合征的基因修饰猪的重要宿主靶点，为防控PRRSV奠定基础。

Description

一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的 药物或试剂中的应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，尤其涉及一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是影响世界养猪业的重要传染病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是引起PRRS的病原，主要导致母猪流产、死胎、产木乃伊胎以及引起各年龄猪只呼吸系统疾病。
磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(phosphatidylethanolamine-binding protein 4，PEBP4)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族中的一员，PEBP家族是一个包含400多个成员的超家族，家族成员具有相似的结构域，有两个小的β-折叠分别连接在一个大的β-折叠两侧，C端连接着2个α-螺旋，在结构域中有一个高度保守的磷酸盐结合位点，对于PEBP家族发挥功能具有重要作用。PEBP4家族在人类和细菌进化中高度保守，不同的亚家族具有不同的生物学功能，不同物种间的同源性较低。
大量研究表明，PEBP4在各种癌症组织细胞中呈高表达状态，参与多种信号通路。PEBP4参与AKT信号通路的激活，并且其似乎是癌细胞中AKT信号通路激活的重要因子。AKT信号通路在多种肿瘤细胞中处于激活状态，影响肿瘤的发生发展以及预后不良。Yu和Zhang等人均发现PBEP4通过促进AKT Ser473位点的磷酸化来激活AKT信号通路(D.Zhang,Y.Dai,Y.Cai,et al.PEBP4 promoted the growth and migration ofcancer cells inpancreatic ductal adenocarcinoma[J].Journal,2016,37(Issume):1699-1705.)。另外Li等人发现，缺氧可以增加ROS的积累从而激活AKT通路，但下调PEBP4能够抑制缺氧诱导的AKT激活。(Y.Zhao,X.Hu,Y.Liu,et al.ROS signaling undermetabolic stress:cross-talk between AMPK and AKT pathway[J].Journal,2017,16(Issume):79.)此外，在癌症的放射治疗中，PEBP4充当信号分子，帮助ROS介导AKT的磷酸化，提高癌细胞的存活率和抗凋亡及辐射的能力。以上结果表明，肿瘤细胞中AKT信号通路的激活及细胞对化疗和放疗产生抗性与PEBP4蛋白高度相关。
但目前并没有PEBP4蛋白对于猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的相关研究，因此，急需验证PEBP4对PRRSV增殖的影响，为猪繁殖与呼吸综合征的治疗提供新的途径和方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了过表达PEBP4蛋白在促进PRRSV增殖中的应用。
优选的，所述过表达PEBP4蛋白的方法包括以下步骤：
构建过表达PEBP4蛋白的质粒，将质粒转染至细胞实现PEBP4蛋白的过表达。
优选的，所述质粒为PEBP4-Flag，所述PEBP4-Flag以pCAGGS为初始载体，在pCAGGS载体上的SacI和NheI酶切位点之间克隆有表达PEBP4蛋白的基因片段。
本发明还提供了一种过表达PEBP4蛋白的质粒，所述质粒为PEBP4-Flag，所述PEBP4-Flag以pCAGGS为初始载体，在pCAGGS载体上的SacI和NheI酶切位点之间克隆有表达PEBP4蛋白的基因片段。
本发明还提供了所述的质粒在促进PRRSV增殖中的应用。
本发明还提供了PEBP4蛋白表达抑制剂在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
优选的，所述抑制剂包括siRNA。
本发明还提供了一种干扰PEBP4基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链如SEQ IDNO:11所示，反义链如SEQ ID NO:12所示。
本发明还提供了所述的siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
本发明还提供了PEBP4基因在抗猪繁殖与呼吸综合征基因编辑猪育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现过表达PEBP4蛋白促进PRRSV复制，且通过设计并筛选干扰PEBP4基因表达的siRNA，能够特异性敲低PEBP4蛋白表达，有效控制PRRSV感染，说明PEBP4蛋白是PRRSV复制相关的重要宿主靶点。
附图说明
图1是qRT-PCR检测过表达PEBP4对PRRSV ORF7 mRNA表达水平的影响结果图；
图2是Westernblot检测过表达PEBP4对PRRSV N蛋白表达的影响结果图；
图3是转染PEBP4-Flag对Marc-145细胞培养上清液中PRRSV滴度的影响结果图；
图4是qRT-PCR筛选在PAM细胞中能够有效敲低PEBP4基因表达的siRNA的结果图；
图5是Westernblot筛选在PAM细胞中能够有效敲低PEBP4蛋白表达的siRNA的结果图；
图6是qRT-PCR检测干扰PAMs细胞中的PEBP4对PEBP4 mRNA表达水平的影响结果图；
图7是qRT-PCR检测干扰PAMs细胞中的PEBP4对PRRSV ORF7mRNA表达的影响结果图；
图8是转染siRNA对PAMs细胞培养上清液中PRRSV滴度的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了过表达PEBP4蛋白在促进PRRSV增殖中的应用。
在本发明中，所述过表达PEBP4蛋白的方法包括以下步骤：构建过表达PEBP4蛋白的质粒，将质粒转染至细胞实现PEBP4蛋白的过表达。所述质粒为PEBP4-Flag，所述PEBP4-Flag以pCAGGS为初始载体，在pCAGGS载体上的SacI和NheI酶切位点之间克隆有表达PEBP4蛋白的基因片段。
本发明还提供了一种过表达PEBP4蛋白的质粒，所述质粒为PEBP4-Flag，所述PEBP4-Flag以pCAGGS为初始载体，在pCAGGS载体上的SacI和NheI酶切位点之间克隆有表达PEBP4蛋白的基因片段。
本发明还提供了所述的质粒在促进PRRSV增殖中的应用。
本发明还提供了PEBP4蛋白表达抑制剂在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。在本发明中，所述抑制剂包括siRNA。
本发明还提供了一种干扰PEBP4基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链如SEQ IDNO:11所示，为CUAUGCAGGAACCUAGAAGUUTT，反义链如SEQ ID NO:12所示，为AACUUCUAGGUUCCUGCAUAGTT。
本发明还提供了所述的siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
本发明还提供了PEBP4基因在抗猪繁殖与呼吸综合征基因编辑猪育种中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所用到的实验材料如下：
非洲绿猴肾上皮细胞(Marc-145)，猪肺泡巨噬细胞(PAMs)，
猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的制备具体操作如下：
(1)取肺：选取4～6周龄生长状况良好的健康仔猪肺脏。将仔猪采取臂动脉丛放血处死，打开胸腔同时将肺脏组织与心脏剥离，然后将心脏摘除，小心不要破坏肺脏。
(2)使用加有0.1％双抗(青、链霉素)RPMI-1640培养基冲洗肺脏，清除残留的血块，使用酒精棉球擦拭肺脏表面，放入超净工作台。
(3)通过气管向肺脏注入40～50mL含有0.1％双抗(青、链霉素)RPMI-1640培养基，轻柔、充分的揉搓肺脏，灌洗液经过三层滤纸过滤；重复4～5次，到灌洗液变得清亮。
(4)将过滤后的灌洗液分别分装到无菌的50mL离心管中，4℃2000rpm离心15min，去除上清液。
(5)向离心管中加入3倍体积的红细胞裂解液轻柔吹打使细胞重新悬浮，提前打开水浴锅，然后将离心管置于37℃水浴锅中裂解，当管中的液体由鲜红色变为灰红色时，加入含有0.1％双抗(青、链霉素)的RPMI-1640终止裂解。
(6)4℃离心机2000rpm离心15min，去除上清液。再次加入含有0.1％双抗(青、链霉素)的RPMI-1640培养基轻柔吹打使细胞重新悬浮，经过三次洗涤后，根据细胞量加入10～20mL含有10％胎牛血清和0.1％的青链霉素的RPMI-1640营养液轻柔重悬细胞。
(7)通过细胞计数计算细胞数量，用含有10％胎牛血清和0.1％的青链霉素的RPMI-1640营养液将细胞稀释至密度为2.5×106个/mL，将细胞悬液按照500μL/孔加入24孔细胞板，37℃5％CO2培养箱中培养3～6h待细胞贴壁后进行后续实验。
高致病性PRRSV菌株BB0907(GenBank：HQ315835.1)用于所有实验，并在本文中被命名为PRRSV，由南京农业大学姜平教授赠予。
Lipofectamine 3000、TRIzol购自赛默飞世尔科学公司；
ⅡQ RT SuperMix for qPCR(+g DNA wiper)、FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
Lipofectamine RNAiMAX Reagent购自赛默飞世尔科技公司；
Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；
核酸提取试剂盒、蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、5×SDS上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；
Ligation Protocol with T4 DNA Ligase购自NEW ENGLAND Biolabs；
质粒小提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司；
PEBP4多克隆抗体(ab99468)购自Abcam Plc；
10-250kDa蛋白Marker、12.5％PAGE凝胶快速制备试剂盒、脱脂奶粉购自上海雅酶生物医药科技有限公司。
实施例1
猪源PEBP4真核表达质粒的构建
1、细胞RNA提取
根据RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA，操作步骤如下：
(1)取处理好的24孔板细胞板，每孔中加入200μL TRIzol充分裂解5min，将裂解好的PAMs细胞混合物转移至无RNA酶的EP管中。
(2)每管加入BufferA 500μL，涡旋振荡10s，充分混匀，室温放置10min。
(3)将上述样品转移至吸附柱，13000r/min离心30s，弃去收集管中的液体。
(4)吸附柱内加入600μL BufferB，13000r/min离心30s，弃去收集管中的液体。重复一次该步骤。
(5)13000r/min空柱离心2min，待酒精挥发完全。
(6)将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向离心管中央加入50μL Buffer C，静置2min，13000r/min离心30s，得到RNA。
2、PEBP4 cDNA的合成
将步骤1提取得到的RNA利用HiScript反转录酶进行cDNA的合成，反转录体系如下：RNA模板16μL，5×RT SuperMix 4μL，总体系20μL。涡旋振荡混匀后在PCR仪中进行cDNA合成。反转录程序如下：50℃，15min；85℃，5s。合成的cDNA置于-20℃保存备用。
根据PEBP4利用Primerpremer5软件设计包含PEBP4全长序列的引物，并在引物两端分别加上SacI和NheI酶切位点及保护性碱基，并在3`端连接上Flag标签序列(表1)，通过PCR扩增目的片段。
表1融合PCR引物序列
PCR扩增体系如下：PrimeSTAR Max Premix(2X)，25μL；PEBP4-F，1μL；PEBP4-R，1μL；cDNA，2μL；ddH2O，Up to 50μL。
PCR体系配置好，瞬时离心，放入PCR仪，反应程序为：98℃，ls；98℃，10s；58℃，5s；72℃，50s；72℃，5min。中间三个温度进行35cycls。
3、PCR产物的回收
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，根据诺唯赞胶回收试剂盒回收DNA片段，具体操作如下：
(1)DNA电泳结束后，切下含有目的DNA片段的凝胶，称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μL体积，作为一个凝胶体积。
(2)加入等倍体积Buffer GDP。50～55℃水浴7～10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。
(3)将混合液转移至FastPure DNAMini Columns-G吸附柱中，7000rpm离心1min，弃去收集管中的液体。
(4)加入300μL Buffer GDP至吸附柱中，静置1min。12,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体。
(5)加入700μL Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体。重复该步骤一次。
(6)12,000rpm空柱离心2min，待酒精挥发完全。
(7)将吸附柱置于在1.5ml灭菌的离心管中，加入20μL Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12,000rpm离心1min。
(8)NanoDrop2000测定回收产物浓度，把DNA保存于-20℃备用。
4、目的片段和载体的酶切与连接
将胶回收产物和pCAGGS载体进行双酶切，酶切体系如下：cDNA/pCAGGS，1.5μg；10×酶切Buffer，5μL；SacI内切酶，0.75μL；NheI内切酶，0.75μL；ddH2O，Up to 50μL。
将配制好的酶切体系放入PCR仪中，设置酶切体系为：37℃，1h。酶切后的目的片段和载体进行回收并测定回收产物浓度。酶切后的目的基因与载体根据https://nebiocalculator.neb.com/按照目的片段与线性载体比例7：1来配制连接体系：pCAGGS，40ng；PEBP4，48.45ng；T4 DNALigase，1μL；T4 DNALigase Buffer(10×)，2μL；ddH2O，Up to20μL。
将配制好的连接体系放入PCR仪中，设置酶切体系为：25℃，30min；65℃，10min。
5、转化
(1)将5μL连接产物加入50μL DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30min；
(2)42℃水浴锅中热激90s，然后静置冰浴2min；
(3)冰浴后加入800μL不含抗生素的LB，37℃摇床中200rpm震荡培养45min；
(4)12000rpm离心1min，弃去上清，加入100μL的LB重悬沉淀，将菌液全部均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃细菌培养箱中倒置培养12～16h。
6、菌液PCR鉴定
随机挑取4个单菌落放入含有氨苄抗性的1mL LB的EP管中，37℃摇床培养2h后，通过Taq PCR Mix进行PCR鉴定，PCR体系如下：2×Taqmix，12.5μL；SacI-PEBP4，1μL；PEBP4-Flag-NheI，1μL；cDNA，2μL；ddH2O，Up to 25μL。
将配制好的体系放入PCR仪中，设置反应体系为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，50s；72℃，10min。
扩增好的PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，在核酸成像仪下观察结果。将PCR鉴定阳性的菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序并扩大培养。
实施例2
质粒提取
质粒提取根据索莱宝质粒小提试剂盒说明书进行，步骤如下：
(1)将实施例1中鉴定阳性的菌液培养物加入EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清，重复多次，将菌液沉淀收集到一个EP管中；
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液Ⅰ彻底悬浮细菌细胞沉淀；
(3)向离心管中加入250μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；
(4)向离心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀12000rpm离心10min；
(5)将上述所得上清液加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃去废液；
(6)向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ，12000rpm离心1min，弃去废液；
(7)向吸附柱中加入700μL漂洗液Ⅱ，12000rpm离心1min，弃去废液；
(8)向吸附柱中加入500μL漂洗液Ⅱ，12000rpm离心1min，弃去废液；
(9)12,000rpm空柱离心2min，待酒精挥发完全；
(10)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50～200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。
实施例3
质粒转染
待24孔板中的Marc-145细胞汇合度至80％时，可进行转染。质粒转染根据Lipofectamine3000说明书进行，具体操作如下：
(1)A液：将1.5μL Lipofectamine 3000加入23.5μL无血清DMEM中；
(2)B液：取1μg实施例2提取得到的质粒用无血清DMEM稀释至23.5μL，再加入2μLP3000TM，涡旋混匀；
(3)将A液缓慢加入B液，指腹轻柔混匀，瞬时离心后，室温静置15min；
(4)更换24孔板中的细胞培养液；
(5)将混合好的质粒-脂质体混合物用移液枪逐滴悬空加入到细胞培养液中，37℃，5％CO2培养箱中继续培养24h。转染24h后接种0.1moi的PRRSV菌株BB0907病毒液。同时设未连接PEBP4的pCAGGS载体转染并接种0.1moi的PRRSV菌株BB0907病毒液的Marc-145细胞作为对照，为空载组。
实施例4
荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染质粒后Marc-145细胞中PRRSV ORF7mRNA表达
实施例3中转染质粒后并接种了病毒液的Marc-145细胞和空载组的MARC-145细胞中RNA提取和cDNA的获取参照实施例1。根据艾科瑞Green Premix Pro Taq HSqPCR Kit试剂盒说明书进行qRT-PCR。反应体系20μL：SYBR Green Pro Taq HS Premix(2×)10μL，PCR上游引物0.5μL，PCR下游引物0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O7μL。在Mx3005P荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR，反应条件为：95℃变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，溶解曲线按照系统默认的程序。荧光定量PCR的特异性引物如下表2所示。
表2荧光定量PCR的特异性引物
qRT-PCR的结果采用2-DDCt计算分析，计算方法如下：试验组DCt＝试验组目的基因Ct-试验组内参基因Ct；对照组DCt＝对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct；DDCt＝试验组DCt-对照组DCt；再计算出2-DDCt。
实验结果：如图1所示，PEBP4-Flag组PRRSV ORF7 mRNA表达量均显著高于空载组，表明PRBP4促进PRRSV在Marc-145细胞中病毒基因的表达。
实施例5
Westernblot检测转染质粒后Marc-145细胞中PRRSV的N蛋白表达
(1)样品制备：分别用PBS洗涤24孔板实施例3中转染质粒后并接种了病毒液的Marc-145细胞和空载组的Marc-145细胞表面3次，加入120μL/孔RIPA细胞裂解液，将细胞板至于冰上裂解30min，每5min摇一次。将裂解好的细胞样品收集至EP管中，4℃，12000rpm离心10min，收集上清。
(2)每个样品抽出100μL上清液作为阳性对照(Input)置于新的EP管中，做好标记，放于-20℃留存备用。
(3)向剩余的上清液中加入1μg单克隆抗体，4℃摇床缓慢摇动，孵育8h。
(4)加入40μL的ProteinA+G琼脂糖珠，4℃摇床中继续缓慢摇动孵育3h。
(5)2500rpm离心5min，用预冷的PBS洗涤，弃上清。重复该步骤4次。
(6)加入100μL预冷的PBS重悬沉淀。加入5×Loading Buffer，100℃沸水煮10min，进行Westernblot测定细胞中PRRSV的N蛋白表达情况。
实验结果：如图2所示。PEBP4-Flag组PRRSVN蛋白表达量显著高于空载组，表明PRBP4促进PRRSV在Marc-145细胞中蛋白的表达。
实施例6
TCID50测定转染PEBP4-Flag对Marc-145细胞培养上清液中PRRSV滴度的影响
1.铺板：将胰酶消化好的Marc-145细胞加入适量的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，调整密度为1×105个/ml，加到96孔细胞培养板中，使细胞长成单层；
2.在灭菌EP管中用无血清的DMEM培养基将所收取含有病毒的细胞上清液进行连续10倍稀释，从10-1～10-10，每个稀释要充分混合均匀；
3.按稀释度从高到低依次接种到Marc-145细胞中，每一稀释度接种一纵排8孔，每孔接种100μL，取两纵排为正常细胞对照；
4.从第二天开始逐日进行观察并记录结果，观察5～7天；
5.参照Reed-Muench方法对于TCID50进行计算。
实验结果：如图3所示，转染了空载pCAGGS和PEBP4-Flag的细胞感染PRRSV BB0907毒株24小时后，细胞培养液上清中的PRRSV病毒滴度显示为转染了PEBP4-Flag组明显高于空载pCAGGS组，表明PRBP4促进PRRSV在Marc-145细胞中的增殖。
实施例7
siRNA干扰片段合成及筛选：
靶向猪源PEBP4基因和对照(NC)的小干扰RNA(siRNA)由上海吉玛制药技术有限公司合成，siRNA的序列如表3所示。
表3siRNA的序列
将PAMs细胞培养至24孔板中，细胞汇合度铺到80％，将10nmol干扰片段转染至PAMs细胞中，转染24h后收集细胞核酸样品和蛋白样品，通过qRT-PCR实验检测PEBP4 mRNA的表达情况，通过Westernblotting检测PEBP4蛋白表达情况。从而鉴定有效的干扰片段。
实验结果：如图4所示。与NC相比，三条干扰片段都可以降低PEBP4的基因表达量，但是si-PEBP4-1效果最为明显。
如图5所示，与NC相比，PEBP4的蛋白表达量明显被si-PEBP4-1降低，另外两个干扰片段对PEBP4蛋白表达量的影响效果不明显。因此，si-PEBP4-1是三条干扰片段中更有效的，可以有效敲低PAM细胞中PEBP4的基因和蛋白表达。
实施例8
在PAMs细胞中敲低PEBP4对PRRSV增殖的影响
1、PEBP4的siRNA转染及细胞接毒
(1)铺板：从6周龄的仔猪肺脏组织中分离猪肺泡巨噬细胞，并进行细胞计数与铺板，于37℃5％CO2培养箱中培养；
(2)转染：转染试剂为Life Tech公司的Lipofectamine RNAiMAX Reagent，按照转染试剂的操作步骤进行转染。铺板12h后配制转染混合液(将实施例7筛选得到的干扰效果最好的si-PEBP4-1与Lipofectamine RNAiMAX Reagent分别溶于Opti-MEM中，再将两者混合)室温孵育5min。将24孔板从温箱中取出，用PBS清洗后换成Opti-MEM，将混合物逐滴加入摇晃混匀，置于细胞培养箱中培养；
(3)接毒：转染24h后接毒，以0.1MOI接种HP-PRRSV BB0907毒株，根据公式PFU＝细胞个数×MOI＝0.7×TCID50计算所需的病毒液。将24孔板取出，用PBS清洗后，加入病毒稀释液，37℃培养1h后弃去所接病毒液，换为血清含量3％的1640培养基；
(4)收样：感染后24h收取细胞样品以及细胞培养上清液，-80℃保存。细胞样品用于检测细胞中PEBP4和PRRSV ORF7基因的相对表达水平，细胞培养上清液用于检测释放到培养液上清中病毒基因组的拷贝数以及病毒滴度。
2、RT-qPCR检测PAMs中的PEBP4和PRRSV ORF7 mRNA相对表达水平
RNA提取和cDNA的获取参照实施例1。根据艾科瑞Green Premix Pro TaqHS qPCR Kit试剂盒说明书进行qRT-PCR。反应体系20μL：SYBR Green Pro Taq HS Premix(2×)10μL，PCR上游引物0.5μL，PCR下游引物0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O7μL。在Mx3005P荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR，反应条件为：95℃变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，溶解曲线按照系统默认的程序。
荧光定量PCR的特异性引物如下表4所示。
表4荧光定量PCR的特异性引物
qRT-PCR的结果采用2-DDCt计算分析，计算方法如下：试验组DCt＝试验组目的基因Ct-试验组内参基因Ct；对照组DCt＝对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct；DDCt＝试验组DCt-对照组DCt；再计算出2-DDCt。
实验结果：如图6所示。PEBP4的基因表达量被干扰片段si-PEBP4-1降低，再次说明本实验中PEBP4被si-PEBP4-1明显敲低。
如图7所示，转染了si-PEBP4-1的细胞中PRRSV ORF7 mRNA的表达量显著低于转染了无关干扰片段组。说明敲低PEBP4后抑制了PRRSV在PAMs细胞中的病毒基因的表达。
3、TCID50测定细胞培养上清液中PRRS病毒的滴度
(1)铺板：将胰酶消化好的Marc-145细胞加入适量的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，调整密度为1×105个/mL，加到96孔细胞培养板中，使细胞长成单层；
(2)在灭菌EP管中用无血清的DMEM培养基将所收取含有病毒的细胞上清液进行连续10倍稀释，从10-1～10-10，每个稀释要充分混合均匀；
(3)按稀释度从高到低依次接种到Marc-145细胞中，每一稀释度接种一纵排8孔，每孔接种100μL，取两纵排为正常细胞对照；
(4)从第二天开始逐日进行观察并记录结果，观察5～7天；
(5)参照Reed-Muench方法对于TCID50进行计算。
实验结果：如图8所示，在PAMs中转染针对PEBP4的siRNA后感染HP-PRRSV BB0907毒株时，细胞培养液上清中的病毒滴度在24hpi时明显低于无关干扰片段组。表明敲低PEBP4后抑制了PRRSV在PAMs细胞中的增殖。
由以上实施例可知，本发明表达PEBP4蛋白促进PRRSV复制，干扰PEBP4蛋白表达则可以抑制PRRSV复制，PEBP4蛋白是PRRSV复制相关的重要宿主靶点，通过抑制PEBP4蛋白表达能够有效控制PRRSV感染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.过表达PEBP4蛋白在促进PRRSV增殖中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达PEBP4蛋白的方法包括以下步骤：
构建过表达PEBP4蛋白的质粒，将质粒转染至细胞实现PEBP4蛋白的过表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述质粒为PEBP4-Flag，所述PEBP4-Flag以pCAGGS为初始载体，在pCAGGS载体上的SacI和NheI酶切位点之间克隆有表达PEBP4蛋白的基因片段。
4.一种过表达PEBP4蛋白的质粒，其特征在于，所述质粒为PEBP4-Flag，所述PEBP4-Flag以pCAGGS为初始载体，在pCAGGS载体上的SacI和NheI酶切位点之间克隆有表达PEBP4蛋白的基因片段。
5.权利要求4所述的质粒在促进PRRSV增殖中的应用。
6.PEBP4蛋白表达抑制剂在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括siRNA。
8.一种干扰PEBP4基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO:11所示，反义链如SEQ ID NO:12所示。
9.权利要求8所述的siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用。
10.PEBP4基因在抗猪繁殖与呼吸综合征基因编辑猪育种中的应用。
CN202410741957.5A 2024-06-07 2024-06-07 一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用 Active CN118516408B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410741957.5A CN118516408B (zh) 2024-06-07 2024-06-07 一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410741957.5A CN118516408B (zh) 2024-06-07 2024-06-07 一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN118516408A true CN118516408A (zh) 2024-08-20
CN118516408B CN118516408B (zh) 2024-12-06

Family

ID=92279355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410741957.5A Active CN118516408B (zh) 2024-06-07 2024-06-07 一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118516408B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009030087A1 (fr) * 2007-09-05 2009-03-12 Zhejiang University Fonctions et utilisations de la protéine 4 se liant à la phosphatidyléthanolamine
CN108103099A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 中山大学 一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009030087A1 (fr) * 2007-09-05 2009-03-12 Zhejiang University Fonctions et utilisations de la protéine 4 se liant à la phosphatidyléthanolamine
CN108103099A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 中山大学 一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REYNALDO GARCIA 等: "Regulation of human myoblast differentiation by PEBP4", 《EMBO REP.》, vol. 10, no. 3, 6 February 2009 (2009-02-06), pages 278 - 284, XP072229146, DOI: 10.1038/embor.2009.4 *
焦乐: "PEBP4蛋白在复发性脑胶质瘤患者中的表达及临床意义", 《医学信息》, vol. 33, no. 8, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 131 - 132 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN118516408B (zh) 2024-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114632155B (zh) PKA siRNA在制备治疗新型冠状病毒病药物中的应用
CN106399313B (zh) 一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法
CN105039342B (zh) 能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用
CN113416768B (zh) Prkra基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用
CN102698289A (zh) Pabp抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用
CN116716302B (zh) 一种用于降低食管癌细胞中nek2基因表达的核酸分子
CN118516408A (zh) 一种PEBP4基因及其siRNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物或试剂中的应用
US9434949B2 (en) Uses of the human ZFX gene and drugs associated with same
CN106620703B (zh) Gins2基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN110117593B (zh) 特异性降低fam84b基因表达的核酸、重组载体和重组慢病毒的应用
Wang et al. PPM1D silencing by lentiviral-mediated RNA interference inhibits proliferation and invasion of human glioma cells
CN105779575B (zh) 人eif3a基因的用途及其相关药物
CN103952406B (zh) 抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用
CN110117585B (zh) 一种细菌RNase E截短体及其应用
CN110964727A (zh) 特异抑制c-myc基因表达的shRNA慢病毒表达载体构建方法与应用
CN109988764B (zh) 降低NKIRAS2基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN105803056B (zh) 人iars2基因的用途及其相关药物
CN103421887B (zh) Cit基因的用途及其相关药物
CN109988762B (zh) 降低PSMD12基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN103667424A (zh) 人eif3h基因的用途及其相关药物
CN105648041B (zh) 人kiaa0101基因的用途及其相关药物
CN110129321B (zh) 降低LSG1基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN104774928A (zh) 人rrs1基因的应用以及抑制剂
CN117599176A (zh) 程序性死亡因子4在制备调控猪对蓝耳病病毒抗性的制剂中的应用
CN114480399A (zh) 降低CPB1基因表达的siRNA、重组载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant