CN118497335A - 一种宫内发育受限雄性仔猪肝损伤的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于判定新生雄性仔猪受宫内发育受限影响的肝损伤生物标记物。本发明公开了APOA4在作为判断是否为宫内发育受限雄性仔猪的生物标志物中的应用。测定APOA4在待测雄性仔猪血清及肝活检组织样本的表达；当APOA4异常上调时，判定待测雄性仔猪为宫内发育受限雄性仔猪。

Description

一种宫内发育受限雄性仔猪肝损伤的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于判定新生雄性仔猪受宫内发育受限影响的肝损伤生物标记物。

背景技术

近年来，为了追求高产仔率，平均每一窝仔猪出生就有1～3头为IUGR(宫内生长受限)仔猪，发病率约为15％～20％。宫内发育受限会导致新生仔猪较高的死亡率，影响出生后器官的生长发育，如小肠、肝脏、肌肉等，并伴随追赶生长现象最终导致长期发育受损，延长出栏上市时间。目前发现IUGR雄性仔猪遭受的肝脏损伤明显较IUGR雌性仔猪严重。目前一般是刚出生的雄性仔猪进行称重处理，当体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差时(每头雄性仔猪体重与该窝雄性仔猪平均体重的差值平方和除以总样本数减一的算术平方根代表1个标准差)，判定为属于IUGR仔猪，而后对其进行淘汰；但是此存在误差，即某些仔猪可能仅仅是低体重，但是其并不是IUGR仔猪；因此上述造成了严重的资源早期浪费。

营养调控是早期有效预防和调控胎儿宫内发育受限的关键环节，但目前还缺少衡量营养调控是否有效改善宫内发育受限仔猪的生物标记物。因此，迫切需要更深入地研究宫内发育受限的损伤机理，找到新的宫内发育受限相关标记物，促进精准营养调控措施在宫内发育受限仔猪上的应用，真正做到诊断、改善和预防的三位一体。

CN114414339B的发明《一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物的方法》告知：与健康新生羔羊对比，IUGR羔羊血浆中多个代谢物浓度发生改变，主要涉及脂代谢、氨基酸代谢、糖代谢等多条代谢通路。相较于NBW羔羊，IUGR羔羊血浆中多种脂代谢物均出现变化，主要包括低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白(LDL/VLDL)、2-羟基异戊酸、胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的表达上调，以及异戊酸的表达下调。IUGR羔羊血浆中多种氨基酸和糖类含量均显著降低，主要包括葡萄糖、乳酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、酪氨酸、3-甲基组氨酸和N-乙酰半胱氨酸，进一步揭示IUGR胎儿机体内氨基酸来源不足或利用增加。

CN114703277B的发明《ADORA2A基因作为分子标志物在制备预防或缓解IUGR妊娠结局的产品中的应用》告知：Adenosine/ADORA2A信号可以作为缓解母鼠IUGR妊娠结局的分子标志物，为缓解母鼠IUGR妊娠结局的发生提供了有力的理论基础和技术支持。

APOA4是一种血浆脂蛋白，参与许多代谢途径，如脂质代谢和葡萄糖代谢，且APOA4还是一种天然的抗氧化剂，也具有抗炎性质，给予人APOA4后结肠炎炎症情况能够得到缓解。因此，APOA4与一些疾病的潜在联系逐渐被挖掘，血浆中的APOA4可以抗动脉粥样硬化形成。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于判定新生雄性仔猪受宫内发育受限影响的肝损伤生物标记物及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种APOA4在作为判断是否为宫内发育受限雄性仔猪的生物标志物中的应用。

该标志物与宫内发育受限引起的肝损伤具有较高的匹配度，可以应用于指示营养调控干预手段应用于宫内发育受限仔猪的合理性。

作为本发明应用的改进：APOA4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

即，本发明提供一种用于判定新生雄性仔猪受宫内发育受限影响的肝损伤生物标记物，该生物标记物为蛋白质，中文名为载脂蛋白A4，英文全名为Apolipoprotein A-Ⅳ，缩写APOA4，Uniprot序列号为O46409，含有382个氨基酸，预测蛋白分子量为45KDa，具体序列如SEQ ID NO:1所示。

作为本发明应用的进一步改进：测定APOA4在待测雄性仔猪(约出生后7±1天)血清及肝活检组织样本的表达；当APOA4异常上调时，判定待测雄性仔猪为宫内发育受限雄性仔猪。

将待测雄性仔猪的测定值与参考值(正常新生雄性仔猪的测定值)相比较，根据APOA4异常上调程度判断雄性仔猪受宫内发育受限肝损伤程度。

说明：正常新生雄性仔猪与宫内发育受限雄性仔猪应处于相同遗传背景。

作为本发明应用的进一步改进：

对同窝雄性仔猪而言：

将体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差的雄性仔猪定义为疑似IUGR雄性仔猪；反之则定义为正常雄性仔猪；

将正常雄性仔猪血清进行APOA4含量的检测，取平均值；

将疑似IUGR雄性仔猪进行APOA4含量的检测，当APOA4含量超过平均值的1.25倍时，判定为IUGR雄性仔猪，反之则判定为正常雄性仔猪(非IUGR雄性仔猪)。

说明：每头雄性仔猪体重与该窝雄性仔猪平均体重的差值平方和除以样本数减一的算术平方根代表同窝雄性仔猪平均体重的1个标准差，此为常识。

本发明在发明过程中发现：

在宫内发育受限的雄性仔猪中，APOA4在肝脏和血清的蛋白表达水平显著升高，因而可以通过检测APOA4表达水平，来诊断受宫内发育受限引起肝损伤的程度。

本发明是由多维度数据整合并经过试验证明，受宫内发育受限影响的雄性仔猪中血清和肝脏的APOA4表达水平显著上调，因而，采用APOA4对于诊断宫内发育受限雄性仔猪的肝损伤具有价值。

采用本发明的方法，能正确判定IUGR仔猪，避免仅仅是低体重的仔猪被淘汰，有助于减少淘汰率，减轻宫内发育受限现象带来的负面影响，因此能避免资源早期浪费。

进一步而言，可以通过IUGR仔猪占正常仔猪的比例，来判定母猪的营养调控是否合理，从而进一步调整母猪的营养管控，即本发明为开发宫内发育受限雄性仔猪新型营养调控手段提供可靠评价靶标。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1显示转录组与单细胞转录组，宫内发育受限雄性仔猪肝组织的APOA4表达水平较正常雄性仔猪显著提高，并该基因只在肝细胞表达；

图1中：左为转录组测序中载脂蛋白家族基因表达量变化图；中为APOA4在肝脏组织各类细胞类型表达情况图，右为IUGR雄性仔猪与正常雄性仔猪(NBW)APOA4基因表达比较图。

图2显示经Western Blot和Elisa试剂盒试验验证宫内发育受限雄性仔猪肝组织和血清的APOA4水平较正常雄性仔猪显著提高；

图2中：上为APOA4的Western Blot的曝光条带图，中为APOA4在IUGR雄性仔猪与正常雄性组织表达比较基于Western Blot的统计结果图，下为APOA4在IUGR雄性仔猪与正常雄性血清和肝脏组织表达比较基于Elisa试剂盒测定图。

图3显示APOA4-KO的HepG2细胞系的构建过程；

图3中：上为APOA4基因外显子敲除及验证示意图，下为设计引物Region1,2,3的扩增产物的DNA凝胶电泳图。

图4显示经油红O染色和甘油三酯试剂盒试验验证APOA4-KO的HepG2存在更为明显的脂质堆积现象；

图4中：上为缺氧处理下HepG2细胞系和APOA4-KO细胞系经油红O染色的扫描图；下为随着缺氧时间增长，APOA4在HepG2细胞系和APOA4-KO细胞系中甘油三酯的含量变化折线图。

图5显示经RT-qPCR验证APOA4-KO的HepG2和HepG2在缺氧刺激下，相关脂代谢基因的不同变化；

图5中：左为随着缺氧时间增长，脂质的分解相关基因在HepG2细胞系和APOA4-KO细胞系的变化情况热图，右为随着缺氧时间增长，脂质的合成和转运的相关基因在HepG2细胞系和APOA4-KO细胞系的变化情况热图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下文中的雄性仔猪均指出生7天的雄性仔猪。

实验1：

转录组和单细胞转录组检测APOA4在宫内发育受限雄性仔猪和正常雄性仔猪中的表达(图1)。

材料与方法：

1、转录组：下载NCBI数据库项目号为PRJNA597972的fq格式测序原始数据，经过fastp软件质控、HISAT2软件将序列信息与参考基因组比对后得到表达矩阵。将数据进行标准化后提取载脂蛋白家族相关基因数据进行可视化。

2、单细胞转录组：从组织储存液中取出雄性仔猪(出生7天的雄性仔猪)的肝脏组织，经下述方法处理制备单细胞悬液：置于冰上经RPMI 1640培养基清洗并切成小块，用2.0mg/ml胶原酶Ⅳ、0.25mg/ml透明质酸酶和20μl/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ(利用RPMI1640培养基进行配置)于37℃下摇晃1小时进行酶解。消化后使用70μm的叠层过滤器过筛，400g离心10min后去上清。将细胞重悬于红细胞裂解缓冲液(RBC Lysis Buffer)中，再经含0.05％BSA的PBS(PH＝7.2)洗涤后，最后置于36％percoll上以裂解细胞碎片，获取单细胞悬液后进行单细胞的捕获测序。从而获得单细胞层面的肝脏基因转录水平信息。

根据图1可得知：APOA4仅在肝脏的肝细胞中表达，并且宫内发育受限的雄性仔猪肝脏APOA4的mRNA水平相比于正常雄性仔猪明显提高。

说明：此实验中基于体重以及头型来区别正常雄性仔猪和IUGR雄性仔猪。

实验2：检测APOA4在宫内发育受限雄性仔猪和正常雄性仔猪血清和肝脏中的表达(图2)：

具体检测过程为：

Western Blot：称取0.03g肝脏组织，使用RIPA缓冲液并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂获得总蛋白裂解液。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。将等质量的蛋白质经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并在聚偏氟乙烯膜上印迹。用脱脂奶粉封闭液阻断后，与APOA4的一抗在4℃条件过夜孵育。在印迹后的膜用抗体剥离缓冲液洗涤，再用β-actin一抗孵育。用羊抗鼠的二抗在室温条件下孵育1小时。使用ECL显影液检测曝光信号并使用凝胶记录系统进行拍照，最后使用ImageJ软件进行密度分析。

Elisa试剂盒检测(猪载脂蛋白A4(apo-A4)试剂盒(ELISA)，哈灵生物，HLE50184)：称取0.1g肝脏组织，加入900ul PBS(PH＝7.2)进行匀浆，离心后得上清液。通过前腔静脉采集仔猪血液后，离心得血清，血清无需预处理。将标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的APOA4特异性捕获抗体100μL，样本孔中加入待测样本(血清、或血清稀释液、肝脏匀浆上清液)50μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤缓冲液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，15min内，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。

APOA4的Western Blot的曝光条带结果、APOA4在血清和肝脏的含量结果如图2所示。

根据图2，可得知：宫内发育受限的雄性仔猪肝脏和血清的APOA4含量相比于正常雄性仔猪明显提高。

实验3：

利用CRISPR/Cas9技术构建APOA4敲除的HepG2细胞系(图3)，具体构建敲除过程为：利用含有hSpCas9和嵌合引导RNA的CRISPR-Cas9 RNP介导的CRISPR-Cas9成功消融了APOA4基因。从网站(http://crispr.mit.edu)上选取了两种引导RNA，分别靶向APOA4基因的外显子1～外显子3。使用Neon转染系统将携带引导RNA序列的质粒电转染到细胞中。两天后，将单菌落转移到96孔板中。为确认APOA4靶向克隆中是否存在插入或缺失(indels)，使用Quick-DNA Miniprep试剂盒分离基因组DNA，并使用2×Taq Master Mix(Dye Plus)和外显子侧翼引物进行PCR扩增。将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离。从8-10个菌落中分离出质粒，并进行Sanger测序验证。选择两个等位基因都发生突变的克隆进行进一步分析。所有克隆均在与亲本细胞相同的条件下进行培养。经3个区域引物扩增的PCR扩增产物为无片段、无片段、811bp的为APOA4-KO。

扩增体系为50μl反转录体系：2×Taq Plus Master Mix 25μl；Primer-F(10μM)2μl；Primer-R(10μM)2μl；DNA模板1ul，双重去离子水补足50μl，对应引物-F和引物-R如下表1，扩增程序为95℃3分钟(预变性)；进入扩增循环，95℃15秒使模板变性，60℃15秒使得引物和模板充分退火，72℃60秒使得引物在模板上延伸合成DNA，经过35个循环；72℃5分钟使得产物彻底延伸，所得结果如图3所述：sgRNA1被成功切割，sgRNA2被成功切割，外显子1～3片段被成功切割；

根据图3可得知：已成功构建APOA4外显子片段敲除的HepG2细胞系---APOA4-KO的HepG2细胞系。

sgRNA及引物序列如下表1：

表1

sgRNA1	AGTGGTGGCTGTTCCGTGCG TGG
		sgRNA2	TTGGGGACCGAGACGAGTCT GGG
Region1-F	GTCTGCAGTCCTGGATGGTC
		Region1-R	CAGGCAGACCTCATGTCCAG
Region2-F	CATTGAATGCCTCCGATGCG
		Region2-R	AACAGGCTGTGGAGTCGTTT
Region3-F	ACTACCCACTTCGCAAGCAA
		Region3-R	AACAGGCTGTGGAGTCGTTT

实验4：验证APOA4敲除后在缺氧环境下对HepG2脂代谢的影响(图4，图5)。

将实验3所得的APOA4-KO的HepG2细胞系，与HepG2细胞系于缺氧小室进行缺氧试验(1％O₂浓度)，具体操作为缺氧0h，缺氧24h和48h分别进行收样后，进行如下实验：

油红O染色切片制备：细胞爬片经固定15min后，蒸馏水洗；60％异丙醇浸洗，油红O染液染10min；60％异丙醇分色至背景无色，蒸馏水洗；Mayer苏木素复染数分钟，PBS浸洗(蓝化)1-3min；蒸馏水洗后水溶性封片剂封片，普通白光显微镜观察拍照。

甘油三酯含量检测：收集500-1000万细胞于离心管内，离心弃上清，加1mL异丙醇，超声波破碎1min，4℃离心10min，取上清。利用KOH皂化TG后水解生成甘油及脂肪酸，过碘酸氧化甘油生成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色物质其颜色的深浅与TG含量成正比的原理，利用酶标仪在420nm波长测量TG含量。

RT-qPCR：收集500-1000万细胞于离心管内，离心弃上清，加1mL氯仿，使用DNase I去除基因组DNA后通过多次洗柱操作获取RNA。用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA的浓度和质量，并用M-MLV反转录酶将相同质量的RNA反转录成cDNA。将cDNA稀释至2ng/μl，然后使用SYBR Green法在CFX96 Real-Time PCR thermocycle上进行qPCR。RT-qPCR的相对表达水平用2^-(△△CT)计算。引物序列见表2。所得结果为目标基因在各样本中的扩增循环数数Ct值；

反转录体系为20μl(gDNA Clean Reaction Mix 2μl；5X Evo M-MLV RT ReactionMix 4μl；RNA模板1ul，无RNA酶水补足20μl)，程序为37℃15分钟，85℃5秒，最后cDNA于4℃保存。定量PCR反应体系为20μl，2XGreen Pro Taq HS Premix 10μl；cDNA2μl；Primer-F(10μM)0.4μl；Primer-R(10μM)0.4μl，无RNA酶水补足20μl，扩增程序为95℃30秒(预变性)；进入扩增循环，95℃5秒，60℃30秒，经过40个循环；并绘制溶解曲线，程序为95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。所得结果如图5所述。

根据图4、图5，可获得以下总结性结论：HepG2缺失APOA4基因后，受到缺氧引起的脂质堆积更加严重，并且影响一系列脂质代谢相关基因的表达----具体为：导致ANGPTL4和PPARG基因上调影响脂质合成，导致SLC27、PLTP、APOA1基因下调影响脂质的转运，同时调节脂质分解的ACOX1、ACSL4、CPT1A、ACSL5、ACSL1、ACOX3、ACAA1、ACOX2也受到不同程度的影响。

检测所用引物如下表2：

表2

实施例1、对出生后7天的雄性仔猪进行抽血，1体积份血清加入4体积份的PBS(PH＝7.2)进行稀释，得稀释后血清，按照上述实验2方法检测稀释后血清中APOA4含量；

APOA4标准品的浓度与OD值建立相应的曲线方程为y＝2.3563x²+59.533x-2.9098；x是OD值，y是APOA4浓度；再将稀释后血清对应的OD值代入上述曲线方程，从而获得稀释后血清中的APOA4含量，而后再乘5倍的稀释系数，得到血清中APOA4含量。

对同窝雄性仔猪而言：

将体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差的雄性仔猪定义为疑似IUGR雄性仔猪；反之则定义为正常雄性仔猪；

将正常雄性仔猪血清进行APOA4含量的检测，取平均值；

将疑似IUGR雄性仔猪进行APOA4含量的检测，当APOA4含量超过平均值的1.25倍时，判定为IUGR雄性仔猪，反之则判定为正常雄性仔猪。

本发明采用了大量实验验证了上述实施例1的正确性，以下为发明过程的若干实验：

实验1、同一窝雄性仔猪共7只：

体重正常的5只雄性仔猪血清所得的OD值为0.392～0.513，因此对应的APOA4表达量为103.945～141.252；平均值约为120；

体重偏轻(体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差的雄性仔猪)的2只疑似IUGR仔猪血清所得的0.601～0.647，因此对应的APOA4表达量为168.603～182.972；判定该仔猪为IUGR仔猪。

将上述IUGR仔猪和正常仔猪，按照常规方法进行饲养，5个月后，IUGR仔猪的体重约为80～86kg，而正常仔猪的体重约为116～122kg。

实验2、同一窝雄性仔猪共6只：

体重正常的4只雄性仔猪血清所得的OD值为0.4035～0.5215，因此对应的APOA4表达量为107.4765～143.887；平均值约为127；

体重偏轻(体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差的雄性仔猪)的2只疑似IUGR仔猪：

1#疑似IUGR仔猪血清为0.611，因此对应的APOA4表达量为171.722；判定该仔猪为IUGR仔猪。

2#疑似IUGR仔猪血清为0.435，因此对应的APOA4表达量为117.164；判定该仔猪为正常仔猪。

将上述IUGR仔猪和正常仔猪，按照常规方法进行饲养，5个月后，2#疑似IUGR仔猪与正常仔猪的平均体重无显著性差异；而1#疑似IUGR仔猪远远低于正常仔猪的平均体重。

实验3、同一窝雄性仔猪共5只：

体重正常的4只雄性仔猪血清所得的OD值为0.3955～0.5015，因此对应的APOA4表达量为105.019～137.692；平均值约为114；

体重偏轻(体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差的雄性仔猪)的1只疑似IUGR仔猪，出生后很快濒临死亡，其血清中APOA4表达量超过170μmol/L。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.APOA4在作为判断是否为宫内发育受限雄性仔猪的生物标志物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：APOA4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：测定APOA4在待测雄性仔猪血清及肝活检组织样本的表达；当APOA4异常上调时，判定待测雄性仔猪为宫内发育受限雄性仔猪。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

对同窝雄性仔猪而言：

将体重低于同窝雄性仔猪平均体重的两个标准差的雄性仔猪定义为疑似IUGR雄性仔猪；反之则定义为正常雄性仔猪；

将正常雄性仔猪血清进行APOA4含量的检测，取平均值；

将疑似IUGR雄性仔猪进行APOA4含量的检测，当APOA4含量超过平均值的1.25倍时，判定为IUGR雄性仔猪，反之则判定为正常雄性仔猪。