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CN118451197A - 用于滚环扩增的方法和组合物 - Google Patents

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CN118451197A
CN118451197A CN202280084508.7A CN202280084508A CN118451197A CN 118451197 A CN118451197 A CN 118451197A CN 202280084508 A CN202280084508 A CN 202280084508A CN 118451197 A CN118451197 A CN 118451197A
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CN
China
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probe
nucleotide
rca
modified
rca product
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280084508.7A
Other languages
English (en)
Inventor
J·科斯塔
豪尔赫·伊万·埃尔南德斯·纽塔
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10X Genomics Inc
Original Assignee
10X Genomics Inc
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Publication date
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Abstract

本公开在一些方面涉及用于通过滚环扩增(RCA)来检测和定量生物样品中存在的多种分析物的方法和组合物。在一些方面，本文提供的方法和组合物解决了与控制样品中RCA产物(RCP)的信号斑点大小和强度相关联的问题。在一些方面，本文提供了用于减缓RCA和/或减小RCA产物大小的方法和组合物(例如，探针和/或反应混合物)。在一些实施方案中，具有疏水基团(例如，碱基上的疏水性修饰)的核苷酸或核苷酸类似物被包含在用于RCA的核苷酸中并被掺入到所述RCP产物中，导致RCP大小减小，而无需使掺入的疏水核苷酸或核苷酸类似物与所述RCP自身或另一分子交联。

Description

用于滚环扩增的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年12月27日提交的名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FORSLOWING ROLLING CIRCLE AMPLIFICATION”的美国临时专利申请号63/294,037和2022年3月16日提交的名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR ROLLING CIRCLE AMPLIFICATIONSLOWING OR COMPACTION”的美国临时专利申请号63/320,645的优先权，这些专利申请中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于滚环扩增(RCA)(例如通过RCA原位检测分析物)的方法和组合物。
背景技术
使用显微成像对细胞和组织样品进行基因组、转录组和蛋白质组分析可以同时解析多种感兴趣的分析物，从而提供有关分析物丰度和原位定位的有价值信息。因此，原位测定(例如基于滚环扩增(RCA)的方法)是例如用于了解细胞身份的分子基础和开发疾病治疗的重要工具。然而，检测到的RCA产物的大小可能会限制解析对应于靶分析物的单独RCA产物的能力。大信号斑点可能彼此重叠和/或掩盖相邻的较小信号斑点，使得信号斑点不可分辨。此外，一些分析物可能与亮信号斑点相关联(例如，由于高分析物丰度和/或优先信号放大)，而其他分析物可能与太暗而不能与亮信号斑点同时检测到的信号斑点相关联。需要新的和改进的原位测定方法。本公开解决了这些和其他需求。
发明内容
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的反应混合物接触，该一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含具有疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的RCA产物，其中RCA产物未经由掺入到RCA产物中的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物进行交联，以及(c)检测生物样品中一定位置处未经由一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物交联的RCA产物。
在一些实施方案中，RCA产物未经由掺入到RCA产物中的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物来与另一分子交联。在一些实施方案中，RCA产物未经由掺入到RCA产物中的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物来与其自身、生物样品中的另一分子或包埋生物样品的基质交联。
在一些实施方案中，疏水性修饰是碱基修饰。在一些实施方案中，疏水性修饰包括碳链和/或烃环。在一些实施方案中，疏水性修饰包括三键。在一些实施方案中，疏水性修饰包括乙烯基或乙炔基基团。在一些实施方案中，包含疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP。在一些实施方案中，包含疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。
在一些实施方案中，使用一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的直径小于在反应混合物中不包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物。
在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以至少1μM、至少1.25μM、至少2.5μM、至少5μM、至少10μM、至少40μM、至少80μM或至少100μM的浓度添加到生物样品中。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是经修饰的dUTP，并且反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约1:99之间。在一些实施方案中，反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约40:60之间。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以约50μM至约100μM的浓度添加到生物样品中。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以约80μM至约100μM的浓度添加到生物样品中。
在一些实施方案中，使用一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于在反应混合物中不包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径。在一些实施方案中，使用一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于500nm。在一些实施方案中，使用一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径是在反应混合物中不包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径的不超过90％或不超过80％。
在一些实施方案中，掺入了一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度与在反应混合物中不包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异。
在一些实施方案中，将一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物掺入到RCA产物中增加了RCA产物的整体疏水性。在一些实施方案中，将一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物掺入到RCA产物中促进了RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用。
在一些实施方案中，掺入到RCA产物中的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物不包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。在一些实施方案中，检测RCA产物包括使生物样品与能与RCA产物杂交的核酸探针接触。在一些实施方案中，核酸探针包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。在一些实施方案中，核酸探针是中间探针，并且该方法包括使生物样品与能与中间探针杂交的可检测地标记的探针接触。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的反应混合物接触，(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，其中一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含：(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，该不可掺入的核苷酸或其类似物未被聚合酶掺入，和/或(ii)可掺入的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，该可掺入的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入，以及(c)检测生物样品中一定位置处未经由经修饰的核苷酸或核苷酸类似物交联的RCA产物。
在一些实施方案中，RCA产物未经由掺入到RCA产物中的任何经修饰的核苷酸或核苷酸类似物来与RCA产物自身、生物样品中的另一分子或包埋生物样品的基质交联。在一些实施方案中，掺入到RCA产物中的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物不包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。
在一些实施方案中，检测RCA产物包括使生物样品与能与RCA产物杂交的核酸探针接触。在一些实施方案中，核酸探针包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。在一些实施方案中，核酸探针是中间探针，并且该方法包括使生物样品与能与中间探针杂交的可检测地标记的探针接触
在一些实施方案中，与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的参考反应混合物相比，反应混合物中一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的存在降低了聚合酶的聚合速率和/或RCA产物的大小。在一些实施方案中，参考反应混合物仅包含未经修饰的dATP、dTTP和/或dUTP、dCTP和dGTP。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组接触，其中环状探针或可环化探针或探针组包含与生物样品中的靶核酸杂交的杂交区，并且其中一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基在杂交区之外，以及(b)使用聚合酶对环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了聚合酶在环状或环化探针上的聚合速率和/或RCA产物的大小。
在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含经修饰的脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA类似物残基。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含经修饰的核糖核苷酸(RNA)或RNA类似物残基。在一些实施方案中，该方法包括检测生物样品中一定位置处的RCA产物。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组接触，其中环状探针或可环化探针或探针组与生物样品中的靶核酸杂交，以及(b)使用聚合酶对环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了聚合酶在环状或环化探针上的聚合速率。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含糖修饰的核苷酸。在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含C2‘修饰的核苷酸。在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以具有C3‘内折叠(endo pucker)构象。
在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含一个或多个经修饰的核糖核苷酸残基。在一些实施方案中，环状探针或环化探针不包含未经修饰的核糖核苷酸残基。可替代地，在一些实施方案中，环状探针或环化探针可以包含一个或多个未经修饰的核糖核苷酸残基。在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以选自由以下项组成的组：2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-氟核糖核酸(2′-F RNA)以及它们的组合。在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含2′-OMeRNA。在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含经修饰的脱氧核糖核苷酸残基。在任何前述实施方案中，环状探针或环化探针可以主要由脱氧核糖核苷酸残基构成。在一些实施方案中，环状探针或环化探针可以由脱氧核糖核苷酸残基组成。在任何前述实施方案中，环状探针或环化探针可以包含不超过20％、不超过10％、不超过5％或不超过1％的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或经修饰或未经修饰的核糖核苷酸残基。在任何前述实施方案中，环状探针或环化探针可以包含不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个连续的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在任何前述实施方案中，环状探针或环化探针可以包含不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个连续的经修饰或未经修饰的核糖核苷酸残基。在任何前述实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含一个或多个三唑或硫醇基键，而不是磷酸二酯基团。在任何前述实施方案中，环状或可环化模板可以在残基之间包含一个或多个硫醇键，该一个或多个硫醇键选自硫逐磷酸酯(phosphorothioate)和硫代磷酸酯(thiophosphate)键。在任何前述实施方案中，该方法可以包括使生物样品与包含一个或多个硫醇键的可环化探针或探针组接触，其中一个或多个硫醇键不位于可环化探针或探针组的5‘或3‘末端。在任何前述实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组可以包含两个或更多个三唑键。在任何前述实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组可以包含两个或更多个硫醇键。在任何前述实施方案中，两个或更多个三唑键或两个或更多个硫醇键中的至少两者可以被少于100个核苷酸分开。在任何前述实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组可以是与样品中的第一靶核酸杂交的第一环状探针或可环化探针或探针组，并且该方法还可以包括：使生物样品与第二环状或可环化探针或探针组接触，其中第二环状或可环化探针或探针组与生物样品中的第二靶核酸杂交；以及使用聚合酶对第二环状探针或由第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第二RCA产物。在一些实施方案中，第二环状探针或可环化探针或探针组可以不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，第二环状探针或可环化探针或探针组可以包含比第一环状探针或可环化探针或探针组更少的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，第二环状探针或可环化探针或探针组可以包含与第一环状探针或可环化探针或探针组不同的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，第二环状探针或可环化探针或探针组不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在任何前述实施方案中，聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率可以慢于聚合酶在第二环状或环化探针上的聚合速率。在任何前述实施方案中，该方法可以包括使生物样品与包含一个或多个核苷酸和/或核苷酸类似物的反应混合物接触，其中一个或多个核苷酸和/或核苷酸类似物包含：(i)不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物与聚合酶短暂结合但未被聚合酶掺入，和/或(ii)可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该可掺入的核苷酸或核苷酸类似物以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个核苷酸或其类似物的反应混合物接触，以及(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，其中一个或多个核苷酸或其类似物包含：(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，该不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入，和/或(ii)可掺入的核苷酸或其类似物，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸或其类似物可以包含：不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入；以及可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。在任何前述实施方案中，聚合期间聚合酶掺入可掺入的核苷酸或其类似物的平均开放时间可以比掺入对应核苷酸三磷酸(例如未经修饰的dNTP，诸如dATP、dTTP、dUTP、dCTP或dGTP)的平均开放时间更长。在一些实施方案中，聚合期间聚合酶掺入可掺入的核苷酸的平均开放时间为掺入对应核苷三磷酸的平均开放时间的至少125％、150％、200％、225％或250％。在任何前述实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物可以包含α-硫醇核苷酸。另外地或可替代地，在任何前述实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物可以包含二磷酸核苷酸。另外地或可替代地，在任何前述实施方案中，可掺入的核苷酸可以包含叠氮化物修饰的核苷酸或核苷酸类似物和/或炔烃修饰的核苷酸或核苷酸类似物。在一个或多个可掺入的核苷酸包含点击官能化的核苷酸的一些实施方案中，该方法不包括进行点击反应。在任何前述实施方案中，反应混合物可以包含一个或多个可掺入的核苷酸或可掺入的核苷酸类似物，其中可掺入的核苷酸或可掺入的核苷酸类似物选自α硫醇核苷酸、二磷酸核苷酸、叠氮化物修饰的核苷酸或核苷酸类似物、炔烃修饰的核苷酸或核苷酸类似物以及它们的组合。在一些实施方案中，反应混合物不包含未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。在一些实施方案中，该方法不包括使生物样品与未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸接触。在一些实施方案中，反应混合物中不超过50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的核苷酸或其类似物是不可掺入的核苷酸或其类似物和/或可掺入的核苷酸或其类似物。例如，反应混合物中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的核苷酸或其类似物可以是未经修饰的脱氧核糖核苷酸。在任何前述实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物可以是一磷酸核苷酸。在任何前述实施方案中，不可掺入的核苷酸类似物可从聚合酶解离。在任何前述实施方案中，聚合酶在滚环扩增中的平均聚合速率可以与反应混合物中一个或多个可掺入或不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物的浓度成反比。在任何前述实施方案中，聚合酶在滚环扩增中的平均聚合速率可以小于2280nt/min、小于2000nt/min、小于1500nt/min、小于1250nt/min、小于1000nt/min、小于750nt/min、小于500nt/min或小于250nt/min。在任何前述实施方案中，滚环扩增可以在18℃和30℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，滚环扩增在30℃下进行。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个核苷酸类似物的反应混合物接触，以及(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了一个或多个核苷酸类似物的RCA产物，其中一个或多个核苷酸类似物包含含有疏水性修饰的核苷酸类似物。在一些实施方案中，疏水性修饰可以是碱基修饰。在一些实施方案中，疏水性修饰可以包括碳链。在一些实施方案中，疏水性修饰可以包括三键。在一些实施方案中，疏水性修饰可以包括乙烯基或乙炔基基团。在一些实施方案中，包含疏水性修饰的核苷酸类似物可以是乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP。在一些此类实施方案中，包含疏水性修饰的核苷酸类似物是5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的直径可以小于在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物。在一些实施方案中，可以将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以至少1μM、至少1.25μM、至少2.5μM、至少5μM、至少10μM、至少40μM、至少80μM或至少100μM的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，核苷酸类似物可以是经修饰的dUTP，并且反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率可以在约80:20与约1:99之间，任选地其中反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率可以在约80:20与约40:60之间。在一些实施方案中，可以将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以约50μM至约100μM的浓度添加到样品中，任选地其中可以将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以约80μM至约100μM的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径可以小于在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径。在一些此类实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径可以小于500nm。在一些实施方案中，RCA产物可以是纳米球的形式，该纳米球的直径在约0.1μm与约3μm之间，任选地其中直径在约0.1μm与约0.5μm之间、在约0.5μm与约1μm之间、在约0.8μm与约1.3μm之间或在约1μm与约1.5μm之间。在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径可以是在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径的不超过90％或不超过80％。在一些实施方案中，掺入了一个或多个核苷酸类似物的RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度可以与在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异。在一些实施方案中，RCA产物的直径小于参考RCA产物的直径。在一些实施方案中，RCA产物的直径是平均直径，并且参考RCA产物的直径是平均直径。在一些实施方案中，RCA产物的直径是参考RCA产物的直径的不超过90％、不超过80％或不超过70％。在一些实施方案中，RCA产物的直径小于700nm、小于600nm或小于500nm。在一些实施方案中，该方法包括检测与RCA产物相关联的RCA产物信号，并且基于RCA产物信号来确定RCA产物的大小。在一些实施方案中，该方法不包括在确定RCA产物的直径之前，使RCA产物与其自身交联、与生物样品中的一个或多个其他分子交联和/或与包埋生物样品或其分子的基质交联。在一些实施方案中，该方法不包括使RCA产物交联。在一些实施方案中，RCA产物信号的平均强度、平均信噪比和/或密度与和参考RCA产物相关联的参考RCA产物信号的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异。在一些实施方案中，与参考RCA产物相比，RCA产物中的一个或多个核苷酸类似物增加了RCA产物的整体疏水性。在一些实施方案中，将一个或多个核苷酸类似物掺入到RCA产物中可以增加RCA产物的整体疏水性。在一些实施方案中，将一个或多个核苷酸类似物掺入到RCA产物中可以促进RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用。在任何前述实施方案中，可以使用线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合生成RCA产物。在任何前述实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的聚合酶生成RCA产物：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。在一些实施方案中，聚合酶是Phi29聚合酶、Vent DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是Phi29聚合酶。在任何前述实施方案中，RCA产物可以在生物样品中或在包埋生物样品或其分子的基质中原位生成。在任何前述实施方案中，RCA产物可以与在生物样品中和/或在包埋生物样品或其分子的基质中的一个或多个其他分子交联。在任何前述实施方案中，该方法可以包括在生物样品中或在包埋生物样品或其分子的基质中原位检测RCA产物。在一些实施方案中，检测RCA产物可以包括使生物样品与一个或多个可检测地标记的探针接触，该一个或多个可检测地标记的探针直接或间接与RCA产物所包含的一个或多个条形码序列杂交。在一些实施方案中，与RCA产物相关联的信号可以在生物样品中或在包埋生物样品或其分子的基质中原位放大。在一些实施方案中，信号放大可以包括直接或间接与滚环扩增(RCA)产物结合的探针的RCA；直接或间接在RCA产物上的杂交链反应(HCR)；直接或间接在RCA产物上的线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)；直接或间接在RCA产物上的引物交换反应(PER)；直接或间接在RCA产物上组装分支结构；直接或间接在RCA产物上杂交多个可检测探针，或它们的任何组合。在任何前述实施方案中，该方法还可以包括通过热变性或通过使生物样品与聚合酶抑制剂接触来终止滚环扩增。在一些实施方案中，终止滚环扩增可以包括使生物样品与聚合酶抑制剂接触，该聚合酶抑制剂选自由焦磷酸类似物、聚合酶变构抑制剂、与聚合酶结合的非催化离子和链终止核苷酸组成的组。在任何前述实施方案中，环状核酸模板可以是环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针，其中环状探针或可环化探针或探针组与生物样品中的靶核酸杂交。在一些实施方案中，可以使用靶核酸作为连接模板由可环化探针或探针组生成环化探针。在一些实施方案中，可环化探针组可以包含两个、三个或更多个探针。在一些实施方案中，可以使用酶促连接和/或化学连接来生成环化探针。在一些实施方案中，可以使用模板依赖性连接和/或非模板依赖性连接来生成环化探针。在任何前述实施方案中，可以使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶来生成环化探针。在任何前述实施方案中，可以使用选自由小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶组成的组的连接酶来生成环化探针。在一些实施方案中，使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物来生成环化探针。在任何前述实施方案中，RCA产物可以包含一个或多个条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，一个或多个条形码序列或其互补序列对应于靶核酸或其一部分。在任何前述实施方案中，RCA产物可以包含约10个与约100个之间、约100个与约1,000个之间、约1,000个与约5,000个之间、约5,000个与约10,000个之间或超过10,000个拷贝的环状核酸模板或环状或环化探针。在任何前述实施方案中，RCA产物可以是纳米球的形式，该纳米球的直径在约0.1μm与约3μm之间，任选地其中直径在约0.1μm与约0.5μm之间、在约0.5μm与约1μm之间、在约0.8μm与约1.3μm之间或在约1μm与约1.5μm之间。在任何前述实施方案中，RCA产物的长度可以在约1千碱基与约15千碱基之间、在约15千碱基与约25千碱基之间、在约25千碱基与约35千碱基之间、在约35千碱基与约45千碱基之间、在约45千碱基与约55千碱基之间、在约55千碱基与约65千碱基之间、在约65千碱基与约75千碱基之间或超过75千碱基。在任何前述实施方案中，靶核酸可以包含DNA和/或RNA。在一些实施方案中，靶核酸可以是基因组DNA/RNA、mRNA、cDNA或直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂的报告寡核苷酸。在任何前述实施方案中，该方法还可以包括使RCA产物与其自身交联、与生物样品中的一个或多个其他分子交联和/或与包埋生物样品或其分子的基质交联。在一些实施方案中，该交联降低了扩增产物在生物样品中和/或基质中的迁移率。在任何前述实施方案中，生物样品可以是固定的和/或透化的生物样品。在任何前述实施方案中，生物样品可以是非均质化的组织样品或组织切片。在一些实施方案中，生物样品可以是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品、冷冻组织样品或新鲜组织样品。在一些实施方案中，生物样品可以是厚度在约1μm与约50μm之间的组织切片，任选地其中该组织切片的厚度在约5μm与约35μm之间。在一些实施方案中，生物样品可以发生交联。在一些实施方案中，可以将生物样品包埋在基质中，任选地其中基质是水凝胶。在一些实施方案中，可以使生物样品透明化。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与以下物质接触：(i)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的第一环状探针或可环化探针或探针组，其中第一环状探针或可环化探针或探针组与生物样品中的第一靶核酸杂交，和(ii)第二环状探针或可环化探针或探针组，其中第二环状探针或可环化探针或探针组与生物样品中的第二靶核酸杂交，以及(b)(i)使用聚合酶对第一环状探针或由第一可环化探针或探针组生成的第一环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第一RCA产物，和(ii)使用聚合酶对第二环状探针或由第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第二RCA产物。在一些实施方案中，与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率。在一些实施方案中，聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率慢于聚合酶在第二环状或环化探针上的聚合速率。
在一些实施方案中，第二环状探针或可环化探针或探针组不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，第二环状探针或可环化探针或探针组包含比第一环状探针或可环化探针或探针组更少的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，第一靶核酸在生物样品中比第二靶核酸更丰富。
在一些方面，本文提供了一种用于进行滚环扩增的试剂盒，该试剂盒包含：(a)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组，其中环状探针或可环化探针或探针组包含与靶核酸的靶序列互补的靶杂交区；以及(b)聚合酶；其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基降低了聚合酶在环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针上的滚环扩增反应中的聚合速率。在一些实施方案中，试剂盒还可以包含用于由可环化探针或探针组生成环化探针的连接酶。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含修饰了糖的核苷酸残基和/或修饰了骨架的核苷酸残基。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以选自由以下项组成的组：2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-氟核糖核酸(2′-F RNA)、硫逐磷酸酯骨架核苷酸、硫代磷酸酯骨架核苷酸、三唑修饰的核苷酸以及它们的组合。在任何前述实施方案中，试剂盒还可以包含：一个或多个不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该一个或多个不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入；和/或一个或多个可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该一个或多个可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入，任选地其中一个或多个不可掺入的核苷酸。在一些方面，本文提供了一种用于滚环扩增的试剂盒，该试剂盒包含：(a)聚合酶；(b)一个或多个不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该一个或多个不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入；和/或一个或多个可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该一个或多个可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入；以及(c)用于生成作为滚环扩增模板的环化探针的一个或多个环状探针或可环化探针或探针组，或用于生成滚环扩增的环化模板的一种或多种试剂。在任何前述实施方案中，一个或多个不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物和/或一个或多个可掺入的核苷酸或核苷酸类似物可以包含α-硫醇核苷酸、二磷酸核苷酸和/或一磷酸核苷酸。在任何前述实施方案中，该试剂盒还可以包含未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。在试剂盒的任何前述实施方案中，一个或多个不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物、一个或多个可掺入的核苷酸或核苷酸类似物和/或未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的组合可以被用于滚环扩增的反应混合物所包含。在一些方面，本文提供了一种用于进行滚环扩增的试剂盒，该试剂盒包含：(a)聚合酶；(b)包含一个或多个疏水性修饰并被配置为被聚合酶掺入的一个或多个核苷酸类似物；以及(c)用于生成作为滚环扩增模板的环化探针的一个或多个环状探针或可环化探针或探针组，或用于生成滚环扩增的环化模板的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸类似物可以包含选自乙炔基-dUTP和/或乙烯基dUTP的经修饰的dUTP。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸类似物可以作为包含一个或多个核苷酸类似物和未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的反应混合物提供。在一些实施方案中，反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dTTP的比率可以为至少约80:20。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。
图1A至图1B显示了说明具有(图1A)或不具有(图1B)一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的示例性环状或环化探针以及探针的滚环扩增(RCA)的示意图。一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以降低RCA过程中的聚合速率，从而在其他方面相同的RCA条件下(例如，反应温度、时间等)与在探针中对应位置处具有未经修饰的核苷酸残基(例如，具有A、T、C或G碱基和未经修饰的/天然的糖磷酸骨架的残基)的探针相比，产生更小的RCA产物。图1C显示了未经修饰的DNA残基和具有经修饰的糖部分的示例性经修饰的RNA残基(2‘-OMeRNA)的结构。图1D显示了示例性经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基或核苷酸类似物的结构，其包含与另一个残基形成三唑键的经修饰的骨架。
图2A显示了说明使用RCA与反应混合物分析生物样品的示例性方法的示意图，该反应混合物包含(i)不可掺入的核苷酸(例如，dNMP或经修饰的核苷酸)或核苷酸类似物，该不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物未被掺入(例如，该不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为仅与聚合酶短暂结合而未被掺入到RCA产物中)，和/或(ii)可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，该可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸(例如，具有A、T/U、C或G碱基和未经修饰的/天然的糖磷酸骨架的dNTP)更慢的速率被聚合酶掺入。如图所示，反应混合物可以包含未经修饰的dNTP。图2B显示了以下物质的示例性结构：(i)示例性不可掺入的核苷酸(例如，脱氧核糖核苷一磷酸，dNMP)，该不可掺入的核苷酸可与聚合酶短暂结合并与其他可掺入的核苷酸竞争结合聚合酶，以及(ii)示例性可掺入的核苷酸或核苷酸类似物(例如，脱氧核糖核苷二磷酸(dNDP)和α硫醇核苷酸)，该可掺入的核苷酸或核苷酸类似物以比对应dNTP更慢的速率被聚合酶掺入。
图3显示了指示在指示的实验条件下检测到的原位RCA产物的密度(每单位细胞核面积的检测到的对象计数)的图。经修饰的dNTP(5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP)的浓度显示为总dNTP的百分比。点代表实验重复的密度。
图4显示了指示在指示的实验条件下检测到的原位RCA产物信号的平均大小的图。经修饰的dNTP(5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP)的浓度显示为总dNTP的百分比。点代表实验重复的平均大小。
图5显示了指示在指示的实验条件下原位RCA产物信号高于局部背景的平均信号强度的图。经修饰的dNTP(5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP)的浓度显示为总dNTP的百分比。点代表实验重复的平均强度。
图6A显示了在本文所述的原位RCA和定量RCA实验中使用的经修饰的dNTP 5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP的分子结构。图6B显示了加入0％、50％或100％的指示的dNTP(单独或组合的5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP)和阴性对照时定量滚环扩增(qRCA)的结果。y轴对应于相对荧光单位(RFU)，x轴对应于随时间推移的成像循环。
图7显示了在本文所述的原位RCA实验中使用的经修饰的dNTP 5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)和5-乙烯基-dUTP的分子结构。虚线圆圈指示增加的疏水性修饰(例如，疏水基团)。
图8A至图8D显示了加入指示浓度的经修饰的dNTP：5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)或5-乙烯基-dUTP时RCA实验的结果。对照(Ctrl)条件不包括经修饰的dNTP。图8A显示了指示在指示的实验条件下检测到的RCA产物的密度(单位成像细胞核面积检测到的RCA产物)的条形图。40μM 5-EdUTP条件没有数据。图8B显示了指示在指示的实验条件下检测到的RCA产物的信号强度(高于局部背景的平均信号强度)的条形图。图8C显示了指示在指示的实验条件下检测到的RCA产物的信噪比(平均局部信噪比平均值)的条形图。图8D显示了指示在指示的实验条件下检测到的RCA产物的信号强度(平均信号背景比平均值)的条形图。
图9A至图9B显示了加入指示浓度的经修饰的dNTP：5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP，图9A)或5-乙烯基-dUTP(图9B)时RCA实验的结果。对照(Ctrl)条件不包括经修饰的dNTP。小提琴图指示了在指示的实验条件下检测到的RCA产物的大小。点代表单个检测到的RCA产物的大小，形状代表大小分布。
图10A至图10B显示了加入指示浓度的经修饰的dNTP：5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP，图10A)或5-乙烯基-dUTP(图10B)时RCA实验的结果。对照(Ctrl)条件不包括经修饰的dNTP。图以概率(上图)和累积概率(中图)的形式表示在指示的条件下检测到的RCA产物的大小分布。表格(下图)显示了每个条件下重复的汇总统计数据。结果表明包含疏水性修饰的经修饰的dNTP会降低RCA产物大小。
具体实施方式
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)均出于所有目的全文以引用方式并入本文中，并入程度如同每一单独的出版物均以引用方式单独地并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、专利申请、已公布的专利申请和其他出版物中阐述的定义相反或者说相矛盾，则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文中的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.概述
在涉及原位滚环扩增(RCA)的测定中，滚环扩增产物(RCP)的大小和强度分布不均会导致灵敏度损失，因为与某些RCP相关联的弱信号可能不会超过用于图像分析的RCP信号(例如“斑点”)检测的检测阈值，而与非常接近的某些RCP相关联的强信号可能导致光学拥挤以及不能检测到附近较弱的信号斑点。未检测到的弱RCP和过度拥挤的大RCP都可能导致灵敏度损失。在一些方面，调整聚合速率的能力将允许对RCA反应和RCP信号斑点的所得直径进行更多的控制。例如，增加对RCA速率的控制可以使得更容易在RCA产物达到用于检测的最佳大小(例如，检测限所允许的那样小)的时间点终止RCA反应。
出于多种原因，控制RCA反应(例如，在生物样品诸如组织样品中原位进行的RCA反应)的聚合速率可能具有挑战性。聚合速率可能取决于温度。例如，Phi29聚合酶在30℃下的速率为约2280nt/min，在15℃下为约1490nt/min，并且在4℃下为约290nt/min(Soengas等人，1995J.Mol.Biol.253(4):517-529，该文献的内容全文以引用方式并入本文)。因此，降低RCA的反应温度在理论上对聚合速率有显著的影响。然而，对于一些应用，可能希望在不改变温度的情况下控制RCA的聚合速率，例如，以降低控制温度所需的仪器的复杂性，和/或调整在相同温度下对多个样品进行的RCA的聚合速率。另外，在一些较低的温度下进行RCA可能不可行，例如因为缓冲液或样品防腐剂组分(例如，组织防腐剂或透明化剂)会沉淀。
在一些方面，本公开提供了使用包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的RCA模板(例如，环状或环化探针)来改变滚环扩增速率的方法和组合物，其中一个或多个经修饰的核苷酸减缓聚合酶在模板上的聚合速率。在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组接触，其中环状探针或可环化探针或探针组与生物样品中的靶核酸杂交，以及(b)使用聚合酶对环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，环状探针或环化探针中一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了使用环状探针或环化探针作为模板的聚合酶的聚合速率。在一些实施方案中，参考环状模板是不包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，但在其他方面与环状或环化探针相同的模板。例如，参考环状模板可以具有与环状或环化探针相同的序列，但是包含未经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，以取代环状或环化探针的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含例如糖修饰的核苷酸和/或具有三唑或硫醇基键的核苷酸残基。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸可以包含C2‘修饰的核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以具有C3‘内折叠构象。一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含一个或多个经修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基。糖修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的实例包括但不限于2′-OMeRNA、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-F RNA以及它们的组合。在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组在残基之间包含一个或多个硫醇键，诸如硫逐磷酸酯或硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组包含两个或更多个三唑键和/或硫醇键。在一些实施方案中，两个或更多个三唑键和/或硫醇键被少于100个核苷酸分开。
在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包括2‘-OMeRNA(例如，1、2、3、4个或更多个2‘-OMeRNA残基)。示例性环状模板中包含的单个2′-OMeRNA残基已经显示出对于Phi29聚合酶降低滚环扩增速率约90％，对于Vent DNA聚合酶降低滚环扩增速率约40％，并且对于Bst DNA聚合酶降低滚环扩增速率约30％。因此，建议在RCA应用中应避免使用2‘-OMeRNA。参见例如Tang等人(2016)Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,80:8,1555-1561，该文献的内容全文以引用方式并入本文。因此，本公开的一些方面部分基于这样的认识，即，使用包含2‘-OMeRNA的模板对聚合速率的强烈抑制在某些应用中可能是有利的，诸如通过RCA对分析物进行原位检测。在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组包含等于或约等于以下任一者之间的2′-OMeRNA残基：1与10之间、1与5之间、1与4之间、1与3之间、1与2之间、2与10之间、2与5之间、2与4之间、或5与10之间。在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个2′-OMeRNA残基。
在一些方面，本公开提供了促进在不同环状探针或可环化探针或探针组之间差异性调整RCA反应中的聚合速率的方法，因为RCA反应中的聚合速率可以与RCA模板自身中的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基(诸如本文所述的任何经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，例如包含经修饰的糖、硫醇键和/或三唑键)相关联。在一些实施方案中，包含不同经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或不同数量的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组可以被设计成与不同靶核酸杂交。例如，与样品中第一靶核酸杂交的环状或可环化探针或探针组可以被设计成提供以比与第二靶核酸杂交的环状或环化探针更慢的速率扩增的环状或环化探针。在这样的实例中，第一靶核酸可能比第二靶核酸更丰富。在一些实施方案中，本文提供的方法包括：使生物样品与第一环状探针或可环化探针或探针组接触，该第一环状探针或可环化探针或探针组与样品中的第一靶核酸杂交；以及使生物样品与第二环状或可环化探针或探针组接触，其中第二环状或可环化探针或探针组与生物样品中的第二靶核酸杂交；以及使用聚合酶对(i)第一环状探针或由第一可环化探针或探针组生成的第一环化探针和(ii)第二环状探针或由第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第一RCA产物和第二RCA产物。在一些实施方案中，聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率慢于聚合酶在第二环状或环化探针上的聚合速率。在一些实施方案中，第一RCA产物小于第二RCA产物。在一些实施方案中，第一环状探针或可环化探针或探针组包含一个或多个经修饰的核苷酸，并且第二环状探针或可环化探针或探针组不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在其他实施方案中，第一和第二环状探针或可环化探针或探针组都可以包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，第二环状探针或环化探针包含比第一环状探针或环化探针更少的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，第二环状探针或环化探针包含与第一环状探针或环化探针不同的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
在一些方面，本公开提供了通过在反应混合物中包含一个或多个降低聚合速率的分子来调整聚合酶在RCA反应中的聚合速率的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个核苷酸或其类似物的反应混合物接触，以及(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，其中一个或多个核苷酸或其类似物包含：(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，该不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入，和/或(ii)可掺入的核苷酸或其类似物，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。环状模板可以是用于滚环扩增的任何合适的环状模板，诸如环状探针、由可环化探针或探针组生成的环化探针或环化cDNA分子。环化cDNA分子在诸如FISSEQ的方法中用作RCA的环状核酸模板，例如如Lee等人,Science.2014；343(6177):1360-1363所述，该文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法和组合物的任何组合来修改RCA的速率。所提供的用于分析生物样品的方法可以包括(a)使用环状或环化探针作为包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的RCA模板，其中与参考环状模板相比，模板中包含经修饰的核苷酸降低了使用环状或环化探针作为模板的聚合酶的聚合速率；(b)使生物样品与用于滚环扩增的反应混合物接触，该反应混合物包含一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物(例如，自身不可掺入的类似物)，其中不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合但未被聚合酶掺入；和/或(c)使生物样品与用于滚环扩增的反应混合物接触，该反应混合物包含可掺入的核苷酸或其类似物(例如，自身可掺入的类似物)，其中可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入，该方法要么单独包括(a)、(b)和(c)，要么包括(a)、(b)和(c)的任何组合。
在一些实施方案中，本公开提供了通过在RCA的反应混合物中包含一个或多个包含疏水性修饰的核苷酸类似物来调整RCA产物大小的方法。在一些实施方案中，RCA产物掺入了一个或多个包含疏水性修饰的核苷酸类似物，并且例如与在不存在核苷酸类似物的情况下生成的参考RCA产物相比，RCA产物内的疏水性修饰导致RCA产物的总体大小减小。在一些实施方案中，将一个或多个核苷酸类似物掺入到RCA产物中可以促进RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用，从而减小RCA产物的总体大小。在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个核苷酸类似物的反应混合物接触，以及(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了一个或多个核苷酸类似物的RCA产物，其中一个或多个核苷酸类似物包含含有疏水性修饰的核苷酸类似物。在一些实施方案中，疏水性修饰是碱基修饰。在一些实施方案中，疏水性修饰包括碳链和/或烃环、三键和/或乙烯基或乙炔基基团。在一些实施方案中，包含疏水性修饰的核苷酸类似物是乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP，诸如分别为5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。
在以下章节中，提供了本文公开的方法、组合物和试剂盒的各个方面的额外描述。第II节描述了示例性生物样品以及分析物(例如，内源分析物、标记剂或内源核酸分析物的产物)，其可以使用本文所述的分析生物样品的方法进行检测(例如，通过检测作为分析物的或与分析物相关联的靶核酸)。第III节描述了示例性环状探针或可环化探针或探针组，其可以根据本文提供的方法进行环化以用作RCA模板。第IV节描述了RCA反应和反应混合物。第V节描述了与本文所述的方法和组合物相关的核苷酸、核苷酸类似物和核苷酸修饰。第VI节描述了用于检测样品中的RCA产物的方法。第VII节提供了根据本公开的试剂盒。第VIII节描述了本方法、组合物和试剂盒的示例性应用。如上所述，本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
II.样品、分析物和靶序列
A.样品
本文公开的样品可以是或源自任何生物样品。本文所公开的方法和组合物可以用于分析生物样品，该生物样品可以使用多种技术(包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM))中的任何一种从受试者获得，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。除了上文所述的受试者之外，生物样品可以从原核生物(诸如细菌、古细菌、病毒或类病毒)获得。生物样品也可以从非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、节肢动物、线虫、真菌或两栖动物)获得。生物样品也可以从真核生物获得，诸如组织样品、患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)。来自生物体的生物样品可以包含一种或多种其他生物体或其组分。例如，除了哺乳动物细胞和非细胞组织组分之外，哺乳动物组织切片可以包含朊病毒、类病毒、病毒、细菌、真菌或来自其他生物体的组分。可以从其获得生物样品的受试者可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，患有疾病诸如癌症的患者)或易患上疾病的个体、和/或需要疗法或怀疑需要疗法的个体。
生物样品可以包括任意数量的大分子，例如，细胞大分子和细胞器(例如，线粒体和细胞核)。生物样品可以包含核酸(诸如DNA或RNA)、蛋白质/多肽、碳水化合物和/或脂质。生物样品可以作为组织样品(诸如组织切片、活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物)获得。样品可以是流体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品(例如，全血或血液衍生制品、血细胞或培养的组织或细胞，包括细胞悬浮液)。在一些实施方案中，生物样品可以包含沉积在表面上的细胞。
无细胞生物样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，该身体样品例如为血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。
生物样品可以源自本文提及的受试者或生物体的均质培养物或群体，或者可替代地源自几种不同生物体的集合，例如，在群落或生态系统中。
生物样品可以包括一个或多个患病细胞。患病细胞可能具有改变的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态学特征。疾病的实例包括炎症性障碍、代谢性障碍、神经系统障碍和癌症。癌细胞可以源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或者作为循环肿瘤细胞获得。生物样品还可以包括胎儿细胞和免疫细胞。
生物样品可以包括包埋在3D基质中的分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)。在一些实施方案中，源自分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)或与之相关的扩增子(例如，滚环扩增产物)可以包埋在3D基质中。在一些实施方案中，3D基质可以包含通过化学和/或以酶促方式连接(例如，通过交联)的天然分子和/或合成分子网络。在一些实施方案中，3D基质可以包含合成的聚合物。在一些实施方案中，3D基质包含水凝胶。
在一些实施方案中，本文的基底可以是不溶于水性液体的任何支持物，并且允许在所述支持物上定位生物样品、分析物、特征和/或试剂(例如，探针)。在一些实施方案中，生物样品可以附着到基底上。生物样品的附着可以是不可逆的或可逆的，这取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。在某些实施方案中，通过将合适的聚合物涂层应用到基底上并且使样品与所述聚合物涂层接触，可以使样品可逆地附着到基底上。然后，例如使用至少部分溶解聚合物涂层的有机溶剂，可以将样品从基底上分离。水凝胶是适合用于此目的的聚合物的实例。
在一些实施方案中，基底可以用一种或多种物质涂覆或功能化，以促进样品附着到基底上。可以用于涂覆或功能化基底的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。
可以执行各种步骤来为测定和/或在测定期间制备或处理生物样品。除非另有说明，否则下文所述的制备或处理步骤通常可以以任何方式和以任何顺序组合，以适当地制备或处理特定样品用于和/或进行分析。
(i)组织切片
生物样品可以从受试者获得(例如，通过手术活检、整个受试者切片)或在生长基质或培养皿上体外生长为细胞群，并且作为组织薄片或组织切片制备用于分析。生长的样品可以足够薄，而无需进一步的处理步骤即可进行分析。可替代地，生长的样品和经由活检或切片获得的样品可以使用机械切割装置诸如振动切片机(vibrating blade microtome)制备成薄的组织切片。作为另一种替代方案，在一些实施方案中，薄的组织切片可以通过将生物样品的触摸印记施加到合适的基底材料上来制备。
组织切片的厚度可以是细胞最大横截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大横截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用冷冻切片(cryostat section)，其可以是例如10-20μm厚。
更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，因此可以制备和使用具有各种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。如果需要或方便，也可以使用更厚的切片，例如至少70、80、90或100μm或更厚。通常，组织切片的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm、3-7μm或4-6μm之间，但是如上文所提及，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。
也可以从单个生物样品中获得多个切片。例如，通过使用切片刀片对活检样品进行系列切片，可以从手术活检样品获得多个组织切片。系列切片之间的空间信息可以以这种方式保存，并且可以连续分析所述切片以获得关于生物样品的三维信息。
(ii)冷冻
在一些实施方案中，可以通过在适合于维持或保存组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下深度冷冻来制备生物样品(例如，如上文所述的组织切片)。可以使用任何数量的合适方法将冷冻组织样品切片(例如切薄片)到基底表面上。例如，可以使用设置在适合于保持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学特性的温度的冷冻切片机(例如，低温恒温器)制备组织样品。这样的温度可以是例如低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃。
(iii)固定和后固定
在一些实施方案中，可以使用已建立的方法福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来制备生物样品。在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋来制备细胞悬浮液和其他非组织样品。在固定样品并包埋在石蜡或树脂块中后，可以如上文所述对样品进行切片。在分析之前，可以通过在适当的溶剂(例如，二甲苯)中温育组织切片，然后冲洗(例如，99.5％乙醇持续2分钟，96％乙醇持续2分钟，和70％乙醇持续2分钟)，从组织切片中去除石蜡包埋材料(例如，脱蜡)。
作为上文所述的福尔马林固定的替代方案，可以将生物样品固定在多种其他固定剂中的任何一种中，以在分析之前保存样品的生物结构。例如，可以通过浸泡在乙醇、甲醇、丙酮、多聚甲醛(PFA)-Triton以及它们的组合中来固定样品。
在一些实施方案中，丙酮固定用于新鲜冷冻的样品，其可以包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后脑和乳腺癌样品。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(如下文所述)。可替代地，丙酮固定可以与透化步骤结合进行。
在一些实施方案中，本文所提供的方法包括一个或多个后固定(post-fixing)(也称为后固定(postfixation))步骤。在一些实施方案中，在使样品与本文所公开的多核苷酸(例如，一个或多个探针，诸如环状或可环化探针，诸如如挂锁探针)接触之后进行一个或多个后固定步骤。在一些实施方案中，在包含探针和靶的杂交复合物在样品中形成之后进行一个或多个后固定步骤。在一些实施方案中，在本文所公开的连接反应(诸如使可环化探针(诸如，挂锁探针)环化的连接)之前进行一个或多个后固定步骤。
在一些实施方案中，在使样品与非核酸分析物诸如蛋白质分析物的结合剂或标记剂(例如，抗体或其抗原结合片段)接触之后进行一个或多个后固定步骤。标记剂可以包含核酸分子(例如，报告寡核苷酸)，其包含与标记剂对应并且因此与分析物对应(例如，唯一地鉴定)的序列。在一些实施方案中，标记剂可以包含含有一个或多个条形码序列的报告寡核苷酸。
可以使用本文公开的任何合适的固定试剂(例如，在DEPC-PBS中的3％(w/v)多聚甲醛)进行后固定步骤。
(iv)包埋
作为上文所述的石蜡包埋的替代方案，可以将生物样品包埋在多种其他包埋材料中的任何一种中，以在切片和其他处理步骤之前为样品提供结构基底。在一些情况下，可以例如在分析从样品获得的组织切片之前去除包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如，甲基丙烯酸树脂)、环氧树脂和琼脂。
在一些实施方案中，可以将生物样品包埋在基质(例如，水凝胶基质)中。以这种方式包埋样品通常涉及将生物样品与水凝胶接触，使得生物样品变得被水凝胶包围。例如，可以通过使样品与合适的聚合物材料接触并且活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方案中，形成水凝胶使得水凝胶在生物样品中内化。
在一些实施方案中，生物样品通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或光化学方式进行，或者可替代地通过任何其他合适的水凝胶形成方法进行。
水凝胶-基质的组成和对生物样品的应用通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片的、非切片的、固定类型)。作为一个实例，在生物样品是组织切片时，水凝胶-基质可以包括单体溶液和过硫酸铵(APS)引发剂/四甲基乙二胺(TEMED)加速剂溶液。作为另一个实例，在生物样品由细胞(例如，培养的细胞或从组织样品解离的细胞)组成时，细胞可以与单体溶液和APS/TEMED溶液一起温育。对于细胞，水凝胶-基质凝胶在隔室中形成，所述隔室包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的设备。例如，可以用添加到隔室中的单体溶液加APS/TEMED形成水凝胶-基质至约0.1μm至约2mm的深度范围。
生物样品的水凝胶包埋的另外的方法和方面描述于例如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015，其全部内容以引用方式并入本文。
(v)染色和免疫组织化学(IHC)
为了便于显现，可以使用各种染色剂和染色技术对生物样品进行染色。例如，在一些实施方案中，可以使用任何数量的染色剂和/或免疫组织化学试剂对样品进行染色。可以执行一个或多个染色步骤来制备或处理用于本文所述的测定的生物样品，或者可以在测定期间和/或之后执行。在一些实施方案中，可以使样品与一种或多种核酸染色剂、膜染色剂(例如，细胞膜或核膜)、细胞学染色剂或它们的组合接触。在一些实例中，染色可以是对蛋白质、磷脂、DNA(例如，dsDNA、ssDNA)、RNA、细胞器或细胞的隔室特异的。可以使样品与一种或多种标记的抗体(例如，对感兴趣的分析物特异的第一抗体和对第一抗体特异的标记的第二抗体)接触。在一些实施方案中，可以使用对染色样品拍摄的一个或多个图像来分割样品中的细胞。
在一些实施方案中，使用亲脂性染料进行染色。在一些实例中，用亲脂性碳菁或氨基苯乙烯染料或它们的类似物(例如，DiI、DiO、DiR、DiD)进行染色。其他细胞膜染色剂可以包括FM和RH染料或对细胞膜蛋白特异的免疫组织化学试剂。在一些实例中，染色剂可以包括但不限于吖啶橙、酸性品红、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、钌红、碘化丙锭、罗丹明(例如，罗丹明B)或番红或它们的衍生物。在一些实施方案中，可以用苏木精和曙红(H&E)对样品进行染色。
可以使用苏木精和曙红(H&E)染色技术、使用帕帕尼科拉乌染色(Papanicolaoustaining)技术、马松三色染色(Masson‘s trichrome staining)技术、银染色技术、苏丹染色技术和/或使用高碘酸希夫(PAS)染色技术对样品进行染色。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定之后进行。在一些实施方案中，可以使用罗曼诺夫斯基染色剂(包括瑞氏染色剂(Wright‘s stain)、詹纳尔氏染色剂(Jenner‘s stain)、坎-格二氏染色剂(Can-Grunwaldstain)、利什曼染色剂(Leishman stain)和吉姆萨染色剂(Giemsa stain))对样品进行染色。
在一些实施方案中，可以将生物样品脱色。可以利用任何合适的使生物样品脱去染色或脱色的方法，并且这些方法通常取决于施加到样品上的染色剂的性质。例如，在一些实施方案中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂应用于样品。可以使用诸如通过用还原剂和去污剂洗涤处理来切割二硫键、离液盐处理、用抗原修复溶液处理和用酸性甘氨酸缓冲液处理等技术来去除此类染色剂。用于多重染色和脱去染色的方法描述于例如Bolognesi等人,J.Histochem.Cytochem.2017；65(8):431-444；Lin等人,NatCommun.2015；6:8390；Pirici等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:567–75；以及Glass等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:899–905中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
(vi)等容膨胀(Isometric Expansion)
在一些实施方案中，可以将包埋在基质(例如，水凝胶)中的生物样品等容膨胀。可以使用的等容膨胀方法包括水合，其是膨胀显微术中的一个制备步骤，如(例如)Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015和美国专利10,059,990中所述，这些专利各自全文以引用方式并入本文。
可以通过以下方式来进行等容膨胀：将生物样品的一种或多种组分锚定到凝胶上，然后凝胶形成、蛋白质水解和溶胀。在一些实施方案中，可以将样品中的分析物、分析物的产物和/或与样品中的分析物缔合的探针锚定到基质(例如，水凝胶)上。生物样品的等容膨胀可以发生在将生物样品固定在基底上之前或者发生在将生物样品固定在基底上之后。在一些实施方案中，可以在使基底与本文公开的探针接触之前，从基底上去除等容膨胀的生物样品。
通常，用于进行生物样品的等容膨胀的步骤可以取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或感兴趣的分析物(例如，将RNA、DNA和蛋白质锚定到凝胶上的不同条件)。
在一些实施方案中，生物样品中的蛋白质被锚定到可溶胀的凝胶(诸如聚电解质凝胶)上。抗体可以在锚定到可溶胀凝胶上之前、之后或结合锚定到可溶胀凝胶上被引导至蛋白质。生物样品中的DNA和/或RNA也可以通过合适的接头锚定到可溶胀凝胶上。此类接头的实例包括但不限于6-((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基-X SE)(可获自ThermoFisher,Waltham,MA)、Label-IT胺(可获自MirusBio,Madison,WI)和Label X(例如描述于Chen等人,Nat.Methods 13:679-684,2016和美国专利10,059,990中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文)。
样品的等容膨胀可以增加样品的后续分析的空间分辨率。空间分布中分辨率的增加可以通过比较等容膨胀的样品和尚未等容膨胀的样品来确定。
在一些实施方案中，生物样品被等容膨胀至如下尺寸：其未膨胀尺寸的至少2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.1x、3.2x、3.3x、3.4x、3.5x、3.6x、3.7x、3.8x、3.9x、4x、4.1x、4.2x、4.3x、4.4x、4.5x、4.6x、4.7x、4.8x或4.9x。在一些实施方案中，样品被等容膨胀至其未膨胀尺寸的至少2x且小于20x。
(vii)交联和解交联
在一些实施方案中，在原位测定之前或期间将生物样品可逆地交联。在一些方面，可以将分析物、多核苷酸和/或分析物的扩增产物(例如，扩增子)或与其结合的探针锚定到聚合物基质上。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以对一种或多种多核苷酸探针和/或其扩增产物(例如，扩增子)进行修饰以含有官能团，该官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物连接到聚合物基质的锚定位点。在一些实施方案中，包含寡dT的经修饰的探针可以用于结合感兴趣的mRNA分子，随后是mRNA分子的可逆或不可逆交联。
在一些实施方案中，生物样品通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而被固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或光化学方式进行，或者可替代地通过任何其他合适的水凝胶形成方法进行。水凝胶可以包括含有网络的大分子聚合物凝胶。在网状系统中，一些聚合物链可以任选地被交联，但是交联并不总是发生。
在一些实施方案中，水凝胶可以包括水凝胶亚单位，诸如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如，PEG-丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(MeHA)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、海藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等、以及它们的组合。
在一些实施方案中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物的要素。合适的水凝胶的实例描述于例如美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，水凝胶可以形成基底。在一些实施方案中，基底包括水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方案中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料的顶部。例如，水凝胶可以预先形成，然后放置在一种或多种第二材料的顶部、底部或与一种或多种第二材料的任何其他构型中。在一些实施方案中，水凝胶形成发生在基底形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基底上的结构(例如，孔、脊、突起和/或纹理)内。
在一些实施方案中，在向样品提供探针之前、同时或之后，发生基底上的水凝胶形成。例如，水凝胶形成可以在已经含有探针的基底上进行。
在一些实施方案中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方案中，生物样品(例如，组织切片)被包埋在水凝胶中。在一些实施方案中，水凝胶亚单位被注入到生物样品中，并且水凝胶的聚合由外部或内部刺激引发。
在生物样品内形成水凝胶的实施方案中，可以使用官能化化学。在一些实施方案中，官能化化学包括水凝胶-组织化学(HTC)。适合于HTC的任何水凝胶-组织骨架(例如，合成的或天然的)都可以用于锚定生物大分子和调节官能化。使用HTC骨架变体的方法的非限制性实例包括CLARITY、PACT、ExM、SWITCH和ePACT。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是永久性的。例如，生物大分子可以永久粘附到水凝胶上，允许多个回合的询问。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将另外的试剂添加到水凝胶亚单位中。例如，另外的试剂可以包括但不限于寡核苷酸(例如，探针)、片段DNA的核酸内切酶、DNA的片段化缓冲液、DNA聚合酶、用于扩增核酸并将条形码连接到扩增片段上的dNTP。可以使用其他酶，包括但不限于RNA聚合酶、连接酶、蛋白酶K和DNA酶。另外的试剂还可以包括逆转录酶(包括具有末端转移酶活性的酶)、引物和开关寡核苷酸。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将光学标记添加到水凝胶亚单位中。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将HTC试剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞标记剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞渗透剂添加到水凝胶中。
可以使用任何合适的方法使包埋在生物样品中的水凝胶透明化。例如，电泳组织透明化方法可以用于从水凝胶包埋的样品中去除生物大分子。在一些实施方案中，水凝胶包埋的样品在水凝胶透明化之前或之后储存在介质(例如，固定介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括使可逆交联的生物样品解交联。解交联不需要是完全的。在一些实施方案中，可逆交联的生物样品中只有一部分交联分子被解交联并允许迁移。
(viii)组织透化和处理
在一些实施方案中，生物样品可以被透化以促进物类(诸如探针)转移到样品中。如果样品没有被充分透化，则物类(诸如探针)转移到样品中的量可能太低而不能够进行充分的分析。相反，如果组织样品渗透性太强，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丧失。因此，在充分透化组织样品以获得良好的信号强度的同时仍然保持样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。
通常，生物样品可以通过将样品暴露于一种或多种透化剂来进行透化。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、去污剂(例如，皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM)和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶)。在一些实施方案中，可以将生物样品与细胞透化剂一起温育，以促进样品的透化。用于样品透化的另外的方法描述于例如Jamur等人,Method Mol.Biol.588:63-66,2010，其全部内容以引用方式并入本文。任何合适的样品透化方法通常都可以与本文所述的样品结合使用。
在一些实施方案中，可以通过向样品中添加一种或多种裂解剂来透化生物样品。合适的裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂，诸如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和各种其他可商购获得的裂解酶。
可以另外地或可替代地将其他裂解剂添加到生物样品中以促进透化。例如，基于表面活性剂的裂解溶液可以用于裂解样品细胞。裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可以包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液剂。
在一些实施方案中，生物样品可以通过非化学透化方法进行透化。例如，可以使用的非化学透化方法包括但不限于物理裂解技术，诸如电穿孔、机械透化方法(例如，使用均化器和研磨球进行珠敲打以机械地破坏样品组织结构)、声学透化(例如，超声处理)和热裂解技术(诸如加热以诱导样品的热透化)。
在分析样品之前，可以向生物样品中添加另外的试剂以执行各种功能。在一些实施方案中，可以向样品中添加DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂(诸如蛋白酶K)和/或螯合剂(诸如EDTA)。例如，本文所公开的方法可以包括增加用于结合的核酸的可及性的步骤，例如，打开细胞中的DNA用于探针杂交的变性步骤。例如，蛋白酶K处理可以用于释放结合有蛋白质的DNA。
(ix)RNA物类的选择性富集
在一些实施方案中，当RNA是分析物时，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的RNA分析物物类。例如，可以通过向样品中添加一种或多种寡核苷酸来选择一种或多种感兴趣的RNA物类。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸是用于通过酶(例如，聚合酶)引发反应的序列。例如，可以使用与一种或多种感兴趣的RNA具有序列互补性的一种或多种引物序列来扩增一种或多种感兴趣的RNA，例如，以生成cDNA，从而选择性地富集这些RNA。
在一些方面，当分析两种或更多种分析物时，可以使用对每种RNA或cDNA分析物具有特异性(例如，特异性杂交)的第一探针和第二探针。例如，在本文所提供的方法的一些实施方案中，模板化连接用于检测生物样品中的基因表达。可以靶向分析被标记剂或结合剂(例如，抗体或其表位结合片段)结合的感兴趣的分析物(诸如蛋白质)，其中结合剂与包含鉴定结合剂的报告序列的报告寡核苷酸缀合或以其他方式缔合。探针可以与报告寡核苷酸杂交，并在模板化连接反应中连接以生成用于分析的产物。在一些实施方案中，在连接之前，可以首先使用例如Mu聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶和/或它们的任何组合、衍生物和变体(例如，工程化突变体)来填充探针寡核苷酸之间的缺口。在一些实施方案中，该测定还可以包括模板化连接产物的延伸或扩增(例如，通过在模板化连接反应中生成的环状产物的滚环扩增)。
生物样品可以包含一种或多种感兴趣的分析物。提供了用于进行多重测定以分析单个生物样品中的两种或更多种不同分析物的方法。
B.分析物
可以使用本文公开的方法和组合物来检测和分析多种不同的分析物。在一些方面，分析物可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。在一些方面，本文公开的靶可以类似地包括任何感兴趣的分析物。在一些实例中，可以直接或间接检测靶或分析物。
分析物可以源自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区域。例如，分析物可以源自胞质溶胶、源自细胞核、源自线粒体、源自微粒体，并且更一般地，源自细胞的任何其他隔室、细胞器或部分。特异性地靶向某些细胞隔室和细胞器的透化剂可以用于从细胞中选择性地释放出分析物以进行分析，和/或允许一种或多种试剂(例如，用于分析物检测的探针)接近细胞或细胞隔室或细胞器中的分析物。
分析物可以包括任何生物分子或化学化合物，包括大分子(诸如蛋白质或肽、脂质或核酸分子)或者小分子(包括有机或无机分子)。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。分析物可以是任何物质或实体，可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。这样的特异性结合配偶体可以是核酸探针(用于核酸分析物)并且可以直接导致RCA模板(例如挂锁或其他可环化探针)的生成。可替代地，可以将特异性结合配偶体偶联到核酸上，所述核酸可以使用RCA策略进行检测，例如在使用或生成可以作为RCA模板的环状核酸分子的测定中。
特别感兴趣的分析物可以包括核酸分子，诸如DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA(例如，mRNA、微小RNA、rRNA、snRNA、病毒RNA等)；以及合成的和/或经修饰的核酸分子(例如，包括包含合成的或经修饰的核苷酸诸如LNA、PNA、吗啉代等或由这些物质组成的核酸结构域)；蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒、或者包括蛋白质或多肽组分等的任何分子、或其片段；或脂质或碳水化合物分子或包含脂质或碳水化合物组分的任何分子。分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚单位的复合物，所述分子亚单位例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物，所述分子亚单位可以或可以不彼此共价结合并且它们可以是相同的或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合分析物也可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用物。因此，这样的复合物或相互作用可以是同源多聚体或异源多聚体。分子(例如蛋白质)的聚集体也可以是靶分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是蛋白质或肽与核酸分子(诸如DNA或RNA)之间的复合物，例如蛋白质与核酸(例如，调控因子(诸如转录因子)与DNA或RNA)之间的相互作用物。
(i)内源分析物
在一些实施方案中，本文的分析物对于生物样品而言是内源的，并且可以包括核酸分析物和非核酸分析物。可以将本文公开的方法和组合物以任何合适的组合用于分析核酸分析物(例如，使用直接或间接与核酸分析物杂交的核酸探针或探针组)和/或非核酸分析物(例如，使用包含报告寡核苷酸并且直接或间接与非核酸分析物结合的标记剂)。
非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接的或O-连接的)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒衣壳蛋白、细胞外蛋白质和细胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物在细胞内部或在细胞表面上，诸如跨膜分析物或附着于细胞膜的分析物。在一些实施方案中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。在一些实施方案中，分析物是细胞外分析物，诸如分泌的分析物。示例性分析物包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、细胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂化)状态、缺口连接或粘附连接。
核酸分析物的实例包括DNA分析物，诸如单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、基因组DNA、甲基化DNA、特定甲基化DNA序列、片段化DNA、线粒体DNA、原位合成的PCR产物和RNA/DNA杂合体。DNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如mRNA))的转录物。
核酸分析物的实例还包括RNA分析物，诸如各种类型的编码和非编码RNA。不同类型的RNA分析物的实例包括信使RNA(mRNA)，包括新生RNA、前mRNA、初级转录RNA以及加工的RNA(诸如加帽的mRNA(例如，具有5'7-甲基鸟苷帽)、聚腺苷酸化mRNA(在3'末端的聚A尾)和一个或多个内含子已去除的剪接mRNA)。本文公开的分析物中还包括未加帽的mRNA、未聚腺苷酸化的mRNA和未剪接的mRNA。RNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如病毒RNA))的转录物。不翻译成蛋白质的非编码RNA(ncRNA)的实例包括转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及小的非编码RNA，诸如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、细胞外RNA(exRNA)、小卡哈尔体(Cajal body)特异性RNA(scaRNA)和长ncRNA(诸如Xist和HOTAIR)。RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。小RNA的实例包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。RNA可以是细菌rRNA(例如，16srRNA或23s rRNA)。
在本文所述的一些实施方案中，分析物可以是变性核酸，其中所得的变性核酸是单链的。核酸可以是变性的，例如，任选地使用甲酰胺、热或者甲酰胺和热两者变性的。在一些实施方案中，核酸没有被变性而用于本文公开的方法中。
在某些实施方案中，可以从活细胞中提取分析物。可以调整处理条件，以确保生物样品在分析期间保持活的，并且从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞来源的分析物只能从样品中获得一次，或者可以从持续保持活的状态的样品中以一定间隔获得。
本文公开的方法和组合物可以用于分析任何数量的分析物。例如，被分析的分析物的数量可以是存在于样品的一个区域中或基底的单独特征内的至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种、至少约10种、至少约11种、至少约12种、至少约13种、至少约14种、至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种、至少约40种、至少约50种、至少约100种、至少约1,000种、至少约10,000种、至少约100,000种或更多种不同的分析物。
在本文所述的任何实施方案中，分析物包含靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以是样品的内源序列、在样品中生成的序列、添加到样品中的序列或与样品中的分析物缔合的序列。在一些实施方案中，靶序列是单链靶序列(例如，滚环扩增产物中的序列)。在一些实施方案中，分析物包含一个或多个单链靶序列。在一个方面，第一单链靶序列与第二单链靶序列不同。在另一个方面，第一单链靶序列与一个或多个第二单链靶序列相同。在一些实施方案中，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列相同的分析物(例如，核酸)中。可替代地，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列不同的分析物(例如，核酸)中。
(ii)标记剂
在一些实施方案中，本文提供了使用一种或多种标记剂分析样品中的内源分析物(例如，RNA、ssDNA和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)的方法和组合物。在一些实施方案中，分析物标记剂可以包括与分析物(例如，样品中的内源分析物)相互作用的试剂。在一些实施方案中，标记剂可以包含指示与标记剂相互作用的分析物或其部分的报告寡核苷酸。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。在一些情况下，被标记剂接触的样品可以进一步与探针(例如，单链探针序列)接触，所述探针与标记剂的报告寡核苷酸杂交，以便鉴定与标记剂缔合的分析物。在一些实施方案中，分析物标记剂包含分析物结合部分和标记剂条形码结构域，所述标记剂条形码结构域包含一个或多个条形码序列，例如与分析物结合部分和/或分析物对应的条形码序列。分析物结合部分条形码包括与分析物结合部分缔合或以其他方式鉴定分析物结合部分的条形码。在一些实施方案中，通过鉴定其相关的分析物结合部分条形码来鉴定分析物结合部分，也可以鉴定分析物结合部分所结合的分析物。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分缔合的序列。分析物结合部分条形码通常可以包括本文所述的条形码的方面中的任何一个。
在一些实施方案中，所述方法包括在使样品与一种或多种标记剂接触之后的一个或多个后固定步骤。
在本文所述的方法和系统中，能够结合于或以其他方式偶联至一个或多个特征的一种或多种标记剂可以用于表征分析物、细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。分析物可以包括但不限于蛋白质、受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、缺口连接、粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。
在一些实施方案中，分析物结合部分可以包括能够结合分析物(例如，生物分析物，例如，大分子成分)的任何分子或部分。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969，这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，分析物结合部分包括一种或多种抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可以特异性地结合靶分析物。在一些实施方案中，分析物是蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或细胞内蛋白质)。在一些实施方案中，包含多个分析物结合部分的多个分析物标记剂结合生物样品中存在的多种分析物。在一些实施方案中，多种分析物包括分析物的单种物类(例如，多肽的单种物类)。在其中多种分析物包括分析物的单种物类的一些实施方案中，多种分析物标记剂的分析物结合部分是相同的。在其中多种分析物包括分析物的单种物类的一些实施方案中，多种分析物标记剂的分析物结合部分是不同的(例如，多种分析物标记剂的成员可以具有分析物结合部分的两种或更多种物类，其中分析物结合部分的两种或更多种物类中的每种物类结合分析物的单种物类，例如在不同的结合位点)。在一些实施方案中，多种分析物包括分析物的多种不同物类(例如，多肽的多种不同物类)。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。
在一些方面，这些报告寡核苷酸可以包含一定核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。将寡核苷酸选择为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面生成显著多样性，同时还可易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且易于进行检测(例如，使用测序或阵列技术)。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的Lightning-抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，其出于所有目的以引用方式并入本文。此外，点击反应化学可以用于将报告寡核苷酸偶联到标记剂上。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及其他合适的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接(例如，经由杂交)偶联至报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴别该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。在一些情况下，本文所述的报告寡核苷酸可以包括一个或多个可以用于后续加工的功能序列。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标记。标记可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标记可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(例如，标记可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标记缀合至与报告寡核苷酸的序列互补(例如，杂交)的第一寡核苷酸。
在一些实施方案中，来自生物样品的分析物(例如，多肽)的多种不同物类可以随后与生物样品的一种或多种物理特性相关联。例如，分析物的多种不同物类可以与生物样品中分析物的位置相关联。这样的信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组信息)可以与其他空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，诸如DNA序列信息、转录组信息(例如，转录物序列)或两者)结合使用。例如，细胞的细胞表面蛋白可以与细胞的一种或多种物理特性(例如，细胞的形状、尺寸、活性或类型)相关联。所述一种或多种物理特性可以通过对细胞成像来表征。细胞可以被分析物标记剂结合，所述标记剂包含结合细胞表面蛋白的分析物结合部分和鉴定该分析物结合部分的分析物结合部分条形码。样品(例如，组织样品或细胞)中的蛋白质分析结果可以与样品中的DNA和/或RNA分析相关联。
(iii)内源分析物和/或标记剂的产物
在一些实施方案中，本文提供了用于分析生物样品中内源分析物和/或标记剂的一种或多种产物的方法和组合物。在一些实施方案中，分析内源分析物(例如，病毒或细胞DNA或RNA)或其产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物(诸如滚环扩增(RCA)产物))。在一些实施方案中，分析直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂。在一些实施方案中，分析直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂的产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物(诸如滚环扩增(RCA)产物))。
C.靶序列
本文公开的探针(例如，环状探针或可环化探针或探针组)的靶序列可以包含在本文公开的任何分析物中，所述分析物包括内源分析物(例如，病毒或细胞核酸)、标记剂、或内源分析物和/或标记剂的产物。在一些实施方案中，本文公开的探针(例如，环状探针或可环化探针或探针组或环化探针)的靶序列被靶核酸所包含。
在一些方面，靶序列中的一个或多个包含一个或多个条形码，例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个条形码。条形码可以在空间上解析生物样品中发现的分子组分，例如在细胞或组织样品内的分子组分。可以将条形码以可逆或不可逆方式连接至分析物或另一个部分或结构。可以在样品测序之前或期间将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独测序读段(例如，条形码可以是或可以包括独特的分子标识符或“UMI”)。在一些方面，条形码包含约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或超过30个核苷酸。
在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。在一些实施方案中，一个或多个条形码还可以提供用于靶向功能的平台，诸如寡核苷酸、寡核苷酸-抗体缀合物、寡核苷酸-链霉亲和素缀合物、经修饰的寡核苷酸、亲和纯化、可检测部分、酶、用于检测测定或其他功能的酶、和/或用于多核苷酸的检测和鉴定的酶。
在一些实施方案中，条形码或其互补序列(例如，本文RCA产物所包含的条形码序列或其互补序列)可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)，包括本文描述的那些，诸如RNA序贯靶标探测(RNA SPOT)、序贯荧光原位杂交(seqFISH)、单分子荧光原位杂交(smFISH)、多重错误稳健荧光原位杂交(MERFISH)、原位测序、基于杂交的原位测序(HybISS)、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)、边合成边测序(SBS)、边连接边测序(SBL)、边杂交边测序(SBH)或空间分辨转录物扩增子读段作图(spatially-resolvedtranscript amplicon readout mapping，STARmap)。在任何前述实施方案中，本文所提供的方法可以包括通过用多个标记的探针(例如，检测寡聚物)进行序贯杂交和检测来分析条形码。
在一些实施方案中，在条形码测序方法中，检测条形码序列以鉴定包含比条形码序列本身更长的核酸分子(DNA或RNA)的其他分子，这与直接测序更长的核酸分子相反。在一些实施方案中，给定N个碱基的测序读段，N聚体条形码序列包含4N的复杂性，并且与非条形码测序方法诸如直接测序相比，分子鉴定可能需要短得多的测序读段。例如，使用5个核苷酸的条形码序列可以鉴定1024种分子物类(45＝1024)，而8个核苷酸的条形码可以用于鉴定多达65,536种分子物类，这个数字大于人类基因组中不同基因的总数。在一些实施方案中，检测包含在探针或RCP中的条形码序列，而不是内源序列，内源序列可以是每个测序循环的信息方面的有效读出。因为条形码序列是预先确定的，所以它们也可以被设计成具有错误检测和纠正机制，参见例如US2019/0055594和US2021/0164039，这些专利据此全文以引用方式并入。
III.环状或可环化探针或探针组
在一些方面，本文提供的方法包括对由可环化探针或探针组生成的环状探针或环化探针进行滚环扩增(RCA)。在一些方面，环状探针或环化探针包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，该一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基降低了使用环状探针或环化探针作为RCA模板的聚合酶的聚合速率。在其他实施方案中，环状探针或环化探针不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使生物样品与能与样品中的靶核酸杂交的环状探针或可环化探针或探针组接触。在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，该方法包括由可环化探针或探针组生成环化探针。在一些实施方案中，环化探针包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些实施方案中，环状或环化探针是用于滚环扩增的模板。图1A显示了包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的示例性第一环状探针或环化探针。在一些方面，与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，环状或环化探针中一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了使用环状或环化探针作为模板的聚合酶的聚合速率。在一些实施方案中，参考环状模板在其他方面与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状或环化探针相同。例如，参考环状模板可以具有与环状或环化探针相同的核苷酸序列，但是包含未经修饰的核苷酸残基，以取代环状或环化探针的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
可用于生成环化探针(诸如图1A所示的示例性探针)的可环化探针或探针组可以是可以通过连接而环化的任何线型探针或线型探针组，诸如下述任何可环化探针或探针组。在一些实施方案中，该方法还包括使样品与引物接触，该引物与环状探针、可环化探针或探针组或环化探针杂交以进行RCA(例如，如图1A所示)。任选地，引物也可以包含与靶核酸杂交的区域，例如如图1A中的虚线所示。在其他实施方案中，靶核酸自身可以引发环状探针或环化探针的滚环扩增(例如，如在RollFISH中。参见例如Wu等人,Commun Biol 1,209(2018)，该文献据此全文以引用方式并入)。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括对不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状或环化探针进行RCA。图1B显示了不包含任何经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的示例性第二环状或环化探针。在某些方面，图1B所示的环状或环化探针可以是参考环状模板，其中聚合酶在包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的对应环状或环化模板上的聚合速率慢于在参考模板上的速率。
在一些实施方案中，本文提供了一种方法，该方法包括对与第一靶核酸杂交且包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的第一环状或环化探针(例如，如图1A所示)和与第二靶核酸杂交且不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的第二环状或环化探针(例如，如图1B所示)进行RCA。在一些实施方案中，聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率比聚合酶在第二环状或环化探针上的聚合速率慢(例如，至少慢10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者)。在一些实施方案中，聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率比聚合酶在第二环状或环化探针上的聚合速率慢不超过95％、50％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％中的任何一者。在一些实施方案中，聚合酶在第一环状或环化探针上的聚合速率比聚合酶在第二环状或环化探针上的聚合速率慢5％-15％、10％-15％、10％-20％、15％-20％、10％-30％、15％-30％、10％-50％、10％-70％、10％-90％、30％-50％、30％-90％、50％-70％、70％-90％或50％-90％。在一些实施方案中，聚合酶的聚合速率是每分钟掺入到例如RCA产物中的核苷酸数量(nt/min)。在一些实施方案中，聚合速率是平均聚合速率。例如，使用包含经修饰和未经修饰的核苷酸残基的环状探针作为模板的聚合酶在使用经修饰的残基作为模板时掺入核苷酸的速率可能比使用未经修饰的残基作为模板时慢。在这样的实例中，例如与使用缺乏经修饰的残基的参考模板的平均聚合速率相比，使用整体具有经修饰和未经修饰的残基的模板的平均聚合速率将会降低。在一些实施方案中，较慢或降低的聚合速率(诸如降低的平均速率)导致较小的RCA产物。
在一些方面，与由第二环状或环化探针产生的第二RCA产物相比，该方法导致由第一环状或环化探针产生的第一RCA产物更小(例如，更短)。在任何前述实施方案中，第一RCA产物和/或第二RCA产物可以包含约10个与约100个之间、约100个与约1,000个之间、约1,000个与约5,000个之间、约5,000个与约10,000个之间或超过10,000个拷贝的环状或环化探针。在一些实施方案中，与第二RCA产物相比，第一RCA产物包含更少拷贝(例如，至少少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％拷贝中的任何一者)的环状或环化探针。在一些实施方案中，与第二RCA产物相比，第一RCA产物包含少不超过95％、50％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％拷贝的环状或环化探针。在一些实施方案中，与第二RCA产物相比，第一RCA产物包含少5％-15％、10％-15％、10％-20％、15％-20％、10％-30％、15％-30％、10％-50％、10％-70％、10％-90％、30％-50％、30％-90％、50％-70％、70％-90％或50％-90％拷贝的环状或环化探针。
在任何前述实施方案中，第一RCA产物和/或第二RCA产物可以是纳米球的形式，该纳米球的直径在约0.1μm与约3μm之间，任选地其中直径在约0.1μm与约0.5μm之间、在约0.5μm与约1μm之间、在约0.8μm与约1.3μm之间或在约1μm与约1.5μm之间。在一些实施方案中，第一RCA产物的直径小于第二RCA产物的直径(例如，至少比第二RCA产物的直径小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者)。在一些实施方案中，第一RCA产物的直径比第二RCA产物的直径小不超过95％、50％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。在一些实施方案中，第一RCA产物的直径比第二RCA产物的直径小5％-15％、10％-15％、10％-20％、15％-20％、10％-30％、15％-30％、10％-50％、10％-70％、10％-90％、30％-50％、30％-90％、50％-70％、70％-90％或50％-90％。在一些方面，RCA产物的所确定的直径可以根据三维RCA产物的测量方式而变化。在一些方面，RCA产物的所确定的直径由RCA产物的最大测量直径、最小测量直径、平均测量直径或任何其他合适的测量RCA产物直径的方法来表示。在一些方面，基于由RCA产物生成的信号(例如，荧光信号)来测量RCA产物的大小(例如，直径)。
在任何前述实施方案中，RCA产物的长度可以在约1千碱基与约15千碱基之间、在约15千碱基与约25千碱基之间、在约25千碱基与约35千碱基之间、在约35千碱基与约45千碱基之间、在约45千碱基与约55千碱基之间、在约55千碱基与约65千碱基之间、在约65千碱基与约75千碱基之间或超过75千碱基。在一些实施方案中，第一RCA产物的长度比第二RCA产物的长度短(例如，至少短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者)。在一些实施方案中，第一RCA产物的长度比第二RCA产物的长度短不超过95％、50％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％中的任何一者。在一些实施方案中，第一RCA产物的长度比第二RCA产物的长度短5％-15％、10％-15％、10％-20％、15％-20％、10％-30％、15％-30％、10％-50％、10％-70％、10％-90％、30％-50％、30％-90％、50％-70％、70％-90％或50％-90％。
在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组包含1、2、3、4、5、6个或更多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。合适的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的实例包括糖修饰的核苷酸，诸如2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-氟核糖核酸(2′-FRNA)或它们的任何组合。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含以下的一种或多种：糖修饰的核苷酸、C2‘修饰的核苷酸、具有C3‘内折叠构象的核苷酸、经修饰的核糖核苷酸残基、经修饰的脱氧核糖核苷酸残基、包含三唑或硫醇基键而不是磷酸二酯键的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，和/或包含硫代磷酸酯键的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含任何合适的修饰(例如，糖、碱基和/或键修饰)，诸如本文或以下文献中所述的任何修饰：Ochoa和Milam,Molecules,25(20):4659(2020)；和McKenzie等人,Chem Soc Rev.,50(8):5126-5164(2021)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，环状探针、可环化探针或探针组或环化探针主要由脱氧核糖核苷酸残基构成。在一些实施方案中，探针主要由脱氧核糖核苷酸残基构成，超过50％的核苷酸残基是脱氧核糖核苷酸残基。
图1C描绘了示例性经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的结构，其可以降低聚合酶在包含所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基(2‘-OMeRNA)的环状或环化探针上的聚合速率。在一些实施方案中，与对应参考模板上的聚合速率相比，模板中(例如，环状或环化探针中)包含单个2‘-OMeRNA残基将聚合速率至少降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者。
在一些实施方案中，环状探针或环化探针可以包含环状探针或环化探针中的残基总数的不超过20％、15％、10％、5％、2％或1％中的任何一者的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或经修饰或未经修饰的核糖核苷酸残基。在一些实施方案中，环状探针或环化探针可以包含环状探针或环化探针中的残基总数的至少1％、2％、3％、4％、5％或10％中的任何一者的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或经修饰或未经修饰的核糖核苷酸残基。在一些实施方案中，环状探针或环化探针可以包含环状探针或环化探针中的残基总数的1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-5％、5％-10％、5％-20％或10％-20％的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或经修饰或未经修饰的核糖核苷酸残基。
在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含一个或多个骨架修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。例如，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含一个或多个硫醇键和/或一个或多个三唑键。图1D中显示了三唑键的示例性结构。在一些实施方案中，硫醇和/或三唑键是内部键(例如，不是在由可环化探针或探针组生成环化探针的连接点处形成的)。在一些实施方案中，方法包括使生物样品与包含一个、两个或更多个硫醇和/或三唑键的环状探针或可环化探针或探针组接触。在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组包含两个或更多个硫醇和/或三唑键。在一些实施方案中，两个或更多个硫醇和/或三唑键中的至少两者被少于100个核苷酸(nt)残基分开。在一些实施方案中，两个或更多个硫醇和/或三唑键中的至少两者被少于90nt残基、少于80nt残基、少于70nt残基、少于60nt残基、少于50nt残基、少于40nt残基、少于30nt残基、少于20nt残基、少于10nt残基或少于5nt残基分开。在一些实施方案中，一个或多个硫醇键包含一个或多个硫逐磷酸酯和/或硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，一个或多个骨架修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含本文或以下文献中所述的任何键和/或修饰：Ochoa和Milam,Molecules,25(20):4659(2020)；和McKenzie等人,Chem Soc Rev.,50(8):5126-5164(2021)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包括一个或多个包含除A、T、G、C或U以外的碱基的核苷酸残基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含通用或半通用碱基。在一些实施方案中，通用碱基是5-硝基吲哚。在一些实施方案中，5-硝基吲哚指导在RCA产物中随机掺入核苷酸或可掺入的核苷酸类似物。在一些实施方案中，半通用碱基是脱氧肌苷。脱氧肌苷可以指导在RCA产物中部分随机掺入核苷酸或可掺入的核苷酸类似物(例如，有一些偏向于掺入胞嘧啶核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，通用碱基和/或半通用碱基位于环状或可环化探针或探针组所包含的条形码序列或靶杂交序列之外。
在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基(例如，5-硝基吲哚)降低了聚合酶的持续合成能力。持续合成能力是DNA聚合酶在模板DNA上进行连续DNA合成而不频繁解离的能力。持续合成能力可以通过DNA聚合酶在单次缔合/解离事件中掺入的核苷酸平均数来度量。因此，在一些方面，使用包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状或环化探针作为模板的聚合酶的聚合速率通过增加缔合/解离事件的数量或频率而降低。经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以作为“减速带”，减缓聚合酶在RCA模板上的聚合。
在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组与生物样品中的靶核酸杂交。在一些实施方案中，靶核酸是内源分析物或与内源分析物相关联(例如，是标记剂或其组分)，如上文第II节所述。在一些实施方案中，与生物样品中的靶核酸杂交包括两个不同分子或分子组(其中一者是内源分析物或标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)，另一者是环状探针或可环化探针或探针组)内基本上互补或互补的核酸序列的配对。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。出于杂交的目的，如果两个核酸序列各自单独的碱基的至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)彼此互补，则这两个核酸序列是“基本上互补的”。
在一些实施方案中，本文提供的可环化探针或探针组能够进行DNA模板化连接(诸如从cDNA分子)。参见例如美国专利8,551,710，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行RNA模板化连接的可环化探针或探针组。参见例如美国专利公开2020/0224244，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，可环化探针组是SNAIL探针组。参见例如美国专利公开20190055594，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了多重邻近连接测定。参见例如美国专利公开20140194311，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行邻近连接的可环化探针或探针组，例如RNA邻近连接测定(例如，PLAYR)探针组。参见例如美国专利公开20160108458，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，环状探针可以间接与靶核酸杂交。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行邻近连接的可环化探针组(例如邻近连接原位杂交(PLISH)探针组)形成。参见例如美国专利公开2020/0224243，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供的可环化探针或探针组的靶核酸是与样品中的分析物(诸如mRNA分子)杂交的探针(诸如L形探针)，诸如在RollFISH测定中。参见例如Wu等人,Commun Biol 1,209(2018)，该文献据此全文以引用方式并入。
可以使用任何合适的可环化探针或探针组或实际上更一般地可环化报告分子来生成用于生成RCA产物的RCA模板。本文所述的任何可环化探针或探针组可以被修饰以包含本文所述的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，以便降低使用由其生成的环化探针作为模板的聚合酶的聚合速率。所谓“可环化”意指探针或报告子(RCA模板)是具有可连接末端的线性分子形式，其可以通过将末端(例如)彼此直接或间接连接在一起或连接到插入(“缺口”)寡核苷酸的相应末端或连接到可环化RCA模板的延伸3‘末端而环化。可环化探针或模板也可以以两个或更多个部分提供，即可以连接在一起形成环的两个或更多个分子(例如寡核苷酸)。当所述探针或RCA模板是可环化的时，其在RCA之前通过连接环化。可以使用连接模板对连接进行模板化，并且在可环化探针(诸如挂锁探针和分子倒置探针)的情况下，靶分析物可以提供连接模板，或者连接模板可以单独提供。可环化探针或RCA模板(或其部分或一部分)将在其相应的3‘和5‘末端区域处包含与连接模板中的对应同源互补区域(或结合位点)的互补性，所述互补区域可以与末端彼此直接连接的地方相邻，或者不相邻，具有介于中间的“缺口”序列，在这里将发生间接连接。
在可环化探针(诸如挂锁探针)的情况下，在一个实施方案中，探针的末端可以通过与靶核酸分子(诸如靶分析物)上的相邻序列杂交而彼此邻近，靶核酸分子充当连接模板，因此允许末端连接在一起形成环状核酸分子，从而允许环化的探针充当RCA反应的模板。在这样的实例中，与靶核酸分子杂交的探针的末端序列将对所讨论的靶分析物具有特异性，并且将在RCA产物中重复复制。因此，它们可以充当指示该靶分析物的标记序列。因此，可以看出，RCA产物中的标记序列可以等同于靶分析物本身中存在的序列。可替代地，可以在探针的非靶互补部分中提供标记物序列(例如，标签或条形码序列)。在还进一步的实施方案中，标记物序列可以存在于在探针的相应杂交末端之间杂交的缺口寡核苷酸中，在这里它们与靶分子中的不相邻序列杂交。此类缺口填充探针类似于分子倒置探针。
在一些实施方案中，可以使用分子倒置探针(一种可环化探针)生成适合作为RCA模板分子的类似环化探针。与挂锁探针一样，这些通常也是能够与靶核酸分子(如靶分析物)杂交并被环化的线型核酸分子。分子倒置探针的两个末端可以在彼此接近但不直接相邻的位点处与靶核酸分子杂交，从而在两个末端之间产生缺口。在一些实施方案中，该缺口的大小可以在从一些实施方案中仅单个核苷酸到其他实施方案中100至500个核苷酸或更长的更大缺口的范围内。因此，有必要提供聚合酶和核苷酸(或核苷酸类似物)源或附加的缺口填充寡核苷酸来填充分子倒置探针的两个末端之间的缺口，使得其可以被环化。和挂锁探针一样，与靶核酸分子杂交的分子倒置探针的末端序列以及它们之间的序列对于所讨论的靶分析物将是特异性的，并将在RCA产物中重复复制。因此，它们可以充当指示该靶分析物的标记序列。可替代地，可以在分子倒置探针的非靶互补部分中提供标记物序列(例如，标签或条形码序列)。
在一些实施方案中，可以通过在可环化探针的缺口填充期间掺入经修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物来生成包含经修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物的环化探针。
在一些实施方案中，本文公开的探针可以是入侵探针，例如以生成环状核酸如环化探针。这样的探针在单核苷酸多态性的检测中特别有用。因此，本公开提供的分析生物样品的方法可以用于检测靶核酸序列中的单核苷酸多态性或实际上任何变体碱基。可以设计用于这种方法的探针，使得探针组的可环化探针或探针部分的3‘可连接末端与感兴趣的靶分子中的核苷酸(变异核苷酸)互补并能够杂交，并且可环化探针5‘末端或可环化探针组的另一不同探针部分5‘末端的5‘附加序列的3‘末端的核苷酸与相同的所述核苷酸互补，但被3‘可连接末端阻止与其杂交(例如，它是置换的核苷酸)。切割探针以去除附加序列将提供5‘可连接末端，如果3‘可连接末端与靶核酸分子正确地杂交(例如与靶核酸分子互补)，则该5‘可连接末端可以与探针或探针部分的3‘可连接末端连接。根据此原理设计的探针在感兴趣的位置处的不同变体之间提供高度区分，因为只有其中3‘可连接末端与感兴趣的位置处的核苷酸互补的探针才可以参与连接反应。在一个实施方案中，探针以单个部分提供，并且3‘和5‘可连接末端由同一探针提供。在一些实施方案中，入侵探针是挂锁探针(入侵挂锁或“iLock”)，例如如Krzywkowski等人,Nucleic Acids Research 45,e161,2017和US2020/0224244中所述，这些文献全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，连接涉及化学连接。在一些实施方案中，连接涉及模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及非模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及酶促连接。
在一些实施方案中，酶促连接涉及连接酶的使用。在一些方面，本文所用的连接酶包括通常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸末端的酶。RNA连接酶、DNA连接酶或另一种连接酶可以用于将两个核苷酸序列连接在一起。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD-i依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如在EC6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)中所述的任何一种连接酶。连接酶的具体实例包括细菌连接酶(诸如大肠杆菌DNA连接酶)、Tth DNA连接酶、热球菌属(Thermococcus)物种(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTMDNA连接酶，NewEngland Biolabs)、Taq DNA连接酶、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和噬菌体连接酶(诸如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶)以及它们的突变体。在一些实施方案中，连接酶是T4RNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是splintR连接酶。在一些实施方案中，连接酶是单链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是T4DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是具有DNA夹板化DNA连接酶活性的连接酶。在一些实施方案中，连接酶是具有RNA夹板化DNA连接酶活性的连接酶。在一些实施方案中，连接酶具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性。在一些实施方案中，连接酶是小球藻病毒DNA连接酶(也称为PBCV-1DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶或单链DNA(ssDNA)连接酶。在一些实施方案中，连接酶是PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(也称为T4 Rnl2)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，本文的连接是直接连接。在一些实施方案中，本文的连接是间接连接。“直接连接”意指多核苷酸的末端彼此紧邻杂交以形成连接酶的底物，从而导致它们彼此连接(分子内连接)。可替代地，“间接”意指多核苷酸的末端彼此不相邻地杂交，例如被一个或多个插入核苷酸或“缺口”隔开。在一些实施方案中，所述末端不直接彼此连接，而是通过一个或多个插入(所谓的“缺口”或“填充缺口的”(寡)核苷酸)的中间物或通过延伸探针的3'末端来“填充”与所述插入核苷酸对应的“缺口”而发生(分子间连接)。在一些情况下，多核苷酸杂交末端之间的一个或多个核苷酸的缺口可以被与夹板、可环化探针(诸如挂锁探针)或靶核酸互补的一个或多个“缺口”(寡)核苷酸“填充”。缺口可以是1个至60个核苷酸的缺口或1个至40个核苷酸的缺口或3个至40个核苷酸的缺口。在具体实施方案中，缺口可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸的缺口、在所示值之间的任何整数(或整数范围)个的核苷酸的缺口。在一些实施方案中，所述末端区域之间的缺口可以通过缺口寡核苷酸或通过延伸多核苷酸的3'末端来填充。在一些情况下，连接涉及将探针的末端连接到至少一个缺口(寡)核苷酸上，使得缺口(寡)核苷酸掺入到所得的多核苷酸中。在一些实施方案中，在本文的连接之前进行缺口填充。在其他实施方案中，本文的连接不需要缺口填充。
在一些实施方案中，本文公开的探针(例如，可环化探针或探针组)可以包含5‘侧翼，其可以被结构特异性切割酶识别，例如能够识别单链5‘突出端和DNA双链体之间的接合点并切割单链突出端的酶。应理解，为结构特异性切割酶的底物的支化三链结构可以由一个探针部分的5‘末端和另一个探针部分的3‘末端(当二者均已与靶核酸分子杂交时)以及由单部分探针的5‘和3‘末端形成。适合于此类切割的酶包括侧翼核酸内切酶(FENS)，其是一类具有核酸内切活性并且能够催化单链与双链DNA的衔接点处磷酸二酯键的水解切割的酶。因此，在一些实施方案中，通过结构特异性切割酶(例如，侧翼核酸内切酶)进行在第一靶特异性结合位点的5‘处的附加序列的切割。合适的侧翼核酸内切酶在以下文献中进行了描述：例如Ma等人,2000.JBC 275,24693-24700和US2020/0224244，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文，并且可以包括P.furiosus(Pfu)、A.fulgidus(Afu)、M.jannaschii(Mja)或M.thermoautotrophicum(Mth)。在其他实施方案中，能够识别和降解具有游离5‘末端的单链寡核苷酸的酶可以用于从如上所述的结构切割附加序列(5‘侧翼)。因此，具有5‘核酸酶活性的酶可以用于切割5‘附加序列。这样的5‘核酸酶活性可以是5‘核酸外切酶活性和/或5‘核酸内切酶活性。5‘核酸酶能够识别单链寡核苷酸的游离5‘末端并降解所述单链寡核苷酸。5‘核酸外切酶通过将寡核苷酸从其5‘末端降解成组成单核苷酸来降解具有游离5‘末端的单链寡核苷酸。5‘核酸内切酶活性可以在一个或多个核苷酸处内部切割5‘侧翼序列。一旦该酶识别出游离5‘末端，该酶就会穿过单链寡核苷酸到达双链体区域，并将单链区域切割成较大的组成核苷酸(例如，二核苷酸或三核苷酸)，或切割整个5‘单链区域，从而发生5‘核酸酶活性，例如如Lyamichev等人,1999.PNAS 96,6143-6148针对Taq DNA聚合酶及其5‘核酸酶所描述的，该文献的内容全文以引用方式并入本文。具有5‘核酸酶活性的优选酶包括核酸外切酶VIII，或来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌或黄色栖热菌的天然或重组DNA聚合酶，或来自其的核酸酶结构域。
在一些实施方案中，多核苷酸连接产生的多核苷酸的解链温度高于未连接的多核苷酸的解链温度。因此，在一些方面，在后续步骤(包括扩增和检测)之前，连接稳定了含有连接的多核苷酸的杂交复合物。
在一些方面，使用高保真连接酶，诸如热稳定的DNA连接酶(例如，Taq DNA连接酶)。热稳定的DNA连接酶在升高的温度下有活性，允许通过在接近DNA链的解链温度(Tm)的温度下温育连接来进一步区分。与退火的完全碱基配对的底物相比，这选择性地降低了退火的错配底物的浓度(预期在错配周围具有稍低的Tm)。因此，高保真连接可以通过连接酶活性位点的固有选择性和平衡条件的组合来实现，以降低退火错配dsDNA的发生率。
在一些实施方案中，RCA模板可以包含靶分析物或其一部分，其中靶分析物是核酸，或者RCA模板可以作为分析物的替代物或标记物来提供或生成。如上所述，任何合适的测定可以用于检测多种不同的分析物，它们使用基于RCA的检测系统，例如，其中通过由测定中提供或生成的环状RCA模板生成RCP来提供信号，并且检测RCP以检测分析物。因此，RCP可被视为报告分子，通过检测它来检测靶分析物。然而，RCA模板也可以被视为靶分析物的报告分子；RCP是基于RCA模板生成的，并且包含RCA模板的互补拷贝。RCA模板决定了被检测到的信号，并且因此指示靶分析物。如下文将更详细描述的，RCA模板可以是探针或探针的一部分或组分，或者可以由探针生成，或者可以是检测测定的组分(例如，检测测定中的试剂)，其用作测定的报告分子、或报告分子的一部分、或信号生成系统。因此，用于生成RCP的RCA模板可以是环状(例如，环化的)报告核酸分子，即来自任何基于RCA的检测测定，所述检测测定使用或生成环状核酸分子作为测定的报告分子。因为RCA模板生成RCP报告分子，所以其可以被视为测定的报告系统的一部分。在一些实施方案中，RCA模板可以包含如上所述的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在其他实施方案中，RCA模板不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
IV.滚环扩增
在一些实施方案中，本文公开的探针通过滚环扩增(RCA)进行扩增。在一些实施方案中，环状或可环化探针或探针组(诸如挂锁探针或包含挂锁探针的探针组)包含一个或多个条形码或其互补序列。
在一些实施方案中，添加RCA引物以引发RCA，例如如图1A所示。在一些实施方案中，在探针杂交和/或环化后添加RCA引物。在一些实施方案中，将扩增引物与环状或可环化探针或探针组一起添加。在一些实施方案中，RCA引物与环状或环化探针互补并杂交。在一些实施方案中，RCA引物也可以与靶核酸互补，该靶核酸诸如为与环状或环化探针杂交的靶核酸部分相邻的靶核酸部分，例如如图1A所示。在一些情况下，RCA引物可以与靶核酸和可环化探针(例如，SNAIL探针)都互补。在一些情况下，靶核酸是也可以用作引物(例如，如在RollFISH中)的探针(诸如L形探针)。在一些实施方案中，进行洗涤步骤以去除任何未结合的探针、引物等。在一些实施方案中，洗涤为严格洗涤。可以在本文所述方法期间的任何时间点进行洗涤步骤，以根据需要去除反应的任何组分。例如，洗涤步骤可以用于去除未杂交的探针、非特异性结合的探针、尚未连接的探针、或存在于反应混合物和/或生物样品中或者与反应混合物和/或生物样品接触的其他组分。
在一些情况下，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，RCA引物通过环状模板的多个拷贝的复制而被延长。扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在形成杂交复合物和任何随后的环化(诸如连接例如挂锁探针)之后，环化探针发生滚环扩增而生成包含环状模板(例如，环状探针或环化探针)的互补序列的多个拷贝的RCA产物(例如，扩增子)。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA。在一些实施方案中，RCA包括分支RCA。在一些实施方案中，RCA包括树状RCA。在一些实施方案中，RCA包括前述的任何组合。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTMDNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Hot Start Taq DNA聚合酶、CrimsonTaq DNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶、Quick-DNA聚合酶、HemoDNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
在一些实施方案中，滚环扩增产物使用选自以下的聚合酶生成：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(外切-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶以及任何前述的变体或衍生物。
在一些实施方案中，扩增在等于或约等于20℃与60℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，扩增在等于或约等于30℃与40℃之间的温度下进行。在一些方面，扩增步骤(诸如滚环扩增(RCA))在等于或约等于25℃与等于或约等于50℃之间的温度(诸如等于或约等于25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃或49℃)下进行。在一些实施方案中，RCA在18℃与30℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，RCA在30℃下进行。
在一些方面，可以将多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)锚定到聚合物基质上。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以对一个或多个多核苷酸探针进行修饰以含有官能团，所述官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物附着到聚合物基质上的锚定位点。根据所提供的实施方案可以采用的示例性修饰和聚合物基质包括例如在US 2016/0024555、US2018/0251833和US2017/0219465中描述的那些，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实例中，支架还包含能够与探针组或扩增产物的修饰或官能团反应或掺入探针组或扩增产物的修饰或官能团的修饰或官能团。在一些实例中，支架可以包含寡核苷酸、聚合物或化学基团，以提供基质和/或支持结构。
在一些实施方案中，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，引物被延伸以产生环状模板的多个拷贝。该扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在杂交复合物形成和扩增探针结合后，杂交复合物发生滚环扩增而生成包含多拷贝cDNA的cDNA纳米球(例如，扩增子)。用于滚环扩增(RCA)的技术包括线性RCA、分支RCA、树状RCA以及它们的组合。参见例如Baner等人,Nucleic Acids Research,26:5073-5078,1998；Lizardi等人,Nature Genetics19:226,1998；Mohsen等人,Acc ChemRes.2016年11月15日；49(11):2540–2550；Schweitzer等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 97:101 13-1 19,2000；Faruqi等人,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur等人,Nucl.AcidsRes.29:el 18,2001；Dean等人,Genome Res.1 1:l095-1099,2001；Schweitzer等人,Nature Biotech.20:359-365,2002；以及美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。用于RCA的示例性聚合酶包括DNA聚合酶，诸如phi29聚合酶、Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶(BST)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I。在一些方面，可以采用已经被工程化或突变以具有期待的特征的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是phi29 DNA聚合酶。
扩增产物可以固定在基质内，通常在核酸被扩增的位置，从而产生扩增子的局部集落。扩增产物可以通过空间因素固定在基质内。扩增产物也可以通过共价键或非共价键固定在基质内。以这种方式，可以认为扩增产物连接到基质上。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，保持了原始扩增子的尺寸和空间关系。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，扩增产物对机械应力下移动或散开有抗性。
在一些方面，扩增产物共聚合和/或共价连接到周围的基质上，从而保留了它们的空间关系和任何其固有的信息。例如，如果扩增产物是由在基质中包埋的细胞内的DNA或RNA生成的那些，则扩增产物也可以被官能化以形成与基质的共价连接，保留它们在细胞内的空间信息，从而提供亚细胞定位分布模式。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在水凝胶亚单位的存在下包埋一个或多个多核苷酸探针组和/或扩增产物，以形成一种或多种水凝胶包埋的扩增产物。在一些实施方案中，所描述的水凝胶-组织化学包括将核酸共价连接到用于组织透明化、酶扩散和多循环测序的原位合成水凝胶上，而现有的水凝胶-组织化学方法则不能。在一些实施方案中，为了使扩增产物能够包埋在组织-水凝胶设置中，将胺修饰的核苷酸包含在扩增步骤(例如，RCA)中，使用丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯官能化为丙烯酰胺部分，并且与丙烯酰胺单体共聚合以形成水凝胶。
扩增后，例如通过使用可检测地标记的探针和成像来确定或以其他方式分析扩增子(例如，RCA产物)或其部分的序列，如第VI节所述。扩增产物的测序或分析可以包括边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序，和/或其中原位杂交包括序贯荧光原位杂交。
A.用于减缓RCA的反应混合物
如上文第III节所讨论，在一些方面，可以通过在RCA模板中(例如，在环状探针或用于生成环化探针的可环化探针或探针组中)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基来降低RCA速率。环状或环化探针中的一个或多个经修饰的核苷酸可以有效地起到“减速带”的作用，以减慢聚合酶和/或降低聚合酶的持续合成能力。另外地或可替代地，本文提供的方法可以包括使样品与被设计成降低聚合酶聚合速率的反应混合物接触。在一些实施方案中，反应混合物包含一个或多个核苷酸或其类似物。在一些实施方案中，核苷酸或其类似物包含不可掺入的核苷酸或其类似物，该不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入。在一些实施方案中，核苷酸或其类似物包含可掺入的核苷酸或其类似物，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，核苷酸或类似物可以包含本文或以下文献中所述的任何核苷酸或其类似物或任何核苷酸修饰：Ochoa和Milam,Molecules,25(20):4659(2020)；和McKenzie等人,Chem Soc Rev.,50(8):5126-5164(2021)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
如本文所公开的，降低RCA中的聚合速率(例如通过使样品与包含核苷酸或其类似物的反应混合物接触)可以提供几个优点。例如，在一些实施方案中，可以改变RCA速率，使得很少有大信号斑点(例如，即使对于高表达的基因)彼此重叠和/或掩盖相邻的较小信号斑点，从而改善光学拥挤的问题，并允许相邻斑点彼此区分和/或更好地分辨，例如，当RCA产物的大小和亮度在相同的显微镜视野中变得更均匀时。在一些实施方案中，可以调整RCA速率，使得很少有非常亮的信号斑点，从而允许相对暗的斑点与亮斑点同时被检测到。在一些实施方案中，调整RCA中的聚合速率(例如通过使样品与反应混合物接触)可以允许相邻的反应以不同的速率进行，同时在相同的温度和/或相同的时间量内进行，因此例如降低了仪器和/或实验装置的复杂性。在这样的实例中，在平行反应中，第一反应可以仅包括未经修饰的dNTP，并且第二反应还可以包括核苷酸或其类似物(例如，不可掺入的核苷酸和/或可掺入的核苷酸或其类似物，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入)，这导致RCA中的聚合速率降低。在一些实施方案中，可以基于一个或多个核苷酸或其类似物的浓度来控制聚合速率以减缓聚合。
如图2A所示，在一些实施方案中，用于分析生物样品的方法可以包括使生物样品与反应混合物接触，该反应混合物包含(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，该不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入，和/或(ii)可掺入的核苷酸或其类似物，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。任选地，反应混合物另外包含未经修饰的dNTP，如图所示。
在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物是聚合酶不可掺入或基本上不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶结合，但未被掺入到正由聚合酶生成的RCA产物中。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物不可由聚合酶掺入。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合，这意味着它可以从聚合酶解离。因此，不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶的结合不会终止RCA反应。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物是核苷酸一磷酸(例如，脱氧核糖核苷一磷酸(dNMP))或其类似物，例如如图2B所示。在一些实施方案中，一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物包含AMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dGMP、dCMP和/或dTMP中的一者或多者。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物与一个或多个NTP和/或dNTP竞争结合聚合酶，从而降低聚合速率。
在一些实施方案中，被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入的可掺入的核苷酸或其类似物是除未经修饰的NTP/dNTP以外的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸构型的改变会影响聚合酶的掺入速率。例如，限速步骤(诸如NTP或dNTP识别)可能对核碱基和骨架修饰都敏感。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以低于对应核苷三磷酸掺入速率的80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％中任何一者的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以对应核苷三磷酸掺入速率的至少5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％中中任何一者的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以对应核苷三磷酸掺入速率的5％-10％、5％-20％、5％-30％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、10％-50％、10％-20％、20％-30％、20％-80％、40％-80％、50％-80％、40％-50％、50％-60％、60％-70％或70％-80％中任何一者的速率被聚合酶掺入。
在一些实施方案中，被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入的可掺入的核苷酸或其类似物对应于下列核苷三磷酸中的任何一者：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、GTP、CTP和UTP。通常，可掺入的核苷酸或其类似物对应于具有最相似结构和/或相同或相似核碱基的核苷三磷酸。例如，在一些实施方案中，α-硫代-dATP(dATP的α-硫代衍生物)对应于dATP。类似地，在一些实施方案中，α-硫代-dTTP对应于dTTP，α-硫代-dCTP对应于dCTP，α-硫代-GTP对应于dGTP，以此类推。可以看出，在一些方面，对于本文所述的给定的可掺入的核苷酸或其类似物，对应的核苷三磷酸将容易被识别。在一些实施方案中，对应核苷三磷酸是天然存在的。
在一些实施方案中，反应混合物具有的一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物(例如，α-硫代-dNTP)与未经修饰的dNTP的比率为至少1∶1000、1∶100、1∶50、1∶20、1∶10、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、100∶1或1000∶1中的任何一者。在一些实施方案中，反应混合物包含一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物，并且不包含任何未经修饰的dNTP。在一些实施方案中，反应混合物具有的一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物(例如，α-硫代-dNTP)与未经修饰的dNTP的比率为不超过1∶1000、1∶100、1∶50、1∶20、1∶10、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、100∶1或1000∶1中的任何一者。在一些实施方案中，反应混合物具有的一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物(例如，α-硫代-dNTP)与未经修饰的dNTP的比率为不超过1:1000 -1:100、1:1000-1:50、1:1000 -1:20、1:1000 -1:1、1:2-100:1、1:2-1000:1或1:10-10:1中的任何一者。
在一些实施方案中，反应混合物具有的一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物(例如，NMP/dNMP)与未经修饰的dNTP的比率为至少1:1000、1:100、1:50、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1或100:1中的任何一者。在一些实施方案中，反应混合物具有的一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物(例如，NMP/dNMP)与未经修饰的dNTP的比率为不超过1:1000、1:100、1:50、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、100:1或1000:1中的任何一者。在一些实施方案中，反应混合物具有的一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物(例如，NMP/dNMP)与未经修饰的dNTP的比率为不超过1:1000-1:100、1:1000-1:50、1:1000-1:20、1:1000-1:1、1:2-100:1、1:2-1000:1或1:10-10:1中的任何一者。
在一些实施方案中，在反应混合物中包含核苷二磷酸(例如，ADP、GDP、CDP、UDP、dADP、dGDP、dCDP和/或dUDP)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使样品与反应混合物接触，该反应混合物包含除未经修饰的dNTP以外的一个或多个可掺入的核苷酸，该一个或多个可掺入的核苷酸被配置为以比未经修饰的dNTP更慢的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸可以是NDP/dNDP。在一些实施方案中，NDP/dNDP可以以比未经修饰的NDP/dNDP更慢的速率被聚合酶掺入(例如，如Cassandra等人,PNAS2018,115(5)980-985，Varela等人,Biochemistry 2021,60(5)373-380，Garforth等人,PLoS One.2008,3(4):e2074中所述，每篇文献的内容全文以引用方式并入本文)。例如，NDP/dNDP的掺入速率可以比对应未经修饰的dNTP的掺入速率慢至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少30倍。然而，通过在反应混合物中包含NDP/dNDP来减缓聚合酶的聚合速率并不需要将NDP/dNDP掺入到RCA产物中。在一些情况下，NDP/dNDP与聚合酶短暂结合，并在没有被掺入的情况下解离。因此，NDP/dNDP可以通过与其他核苷酸(诸如dNTP)竞争结合聚合酶来减缓聚合速率。在一些实施方案中，反应混合物包含选自dADP、dGDP、dCDP、dTDP以及它们的组合的一个或多个dNDP。在一些实施方案中，反应混合物包含选自ADP、GDP、CDP、UDP以及它们的组合的一个或多个NDP。在一些实施方案中，反应混合物包含NDP/dNDP和dNTP。在一些实施方案中，聚合酶的聚合速率与反应混合物中NDP和/或dNDP的浓度和/或反应混合物中dNDP与dNTP的比率成反比。
在被配置为以比核苷三磷酸(例如，dATP、dTTP、dUTP、dCTP或dUTP)更慢的速率被聚合酶掺入的可掺入的核苷酸或其类似物的另一实例中，可以在反应混合物中包含可掺入的α硫醇核苷酸类似物。图2B中显示了α硫醇核苷酸的结构，其在α磷酸酯位置处包含硫以取代氧。已经描述了α硫醇dNTP对Klenow片段聚合速率的影响。参见例如Pugliese等人,J AmChem Soc.2015；137(30):9587-9594，该文献的内容全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，α硫醇核苷酸被配置为以低于对应核苷三磷酸掺入速率的80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％中任何一者的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，α硫醇核苷酸被配置为以对应核苷三磷酸掺入速率的至少5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％中中任何一者的速率被聚合酶掺入。在一些实施方案中，α硫醇核苷酸被配置为以对应核苷三磷酸掺入速率的5％-10％、5％-20％、5％-30％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、10％-50％、10％-20％、20％-30％、20％-80％、40％-80％、50％-80％、40％-50％、50％-60％、60％-70％或70％-80％中任何一者的速率被聚合酶掺入。对应核苷三磷酸是具有与α硫醇相同的碱基的dNTP(例如，α-硫代-dATP对应于dATP，α-硫代-dGTP对应于dGTP，以此类推)。
在一些实施方案中，与对应的未经修饰的核苷三磷酸相比，α硫醇核苷酸会增加聚合酶在处理α硫醇核苷酸时处于开放构象的时间量(τopen)。在一些实施方案中，与未经修饰的核苷三磷酸的τopen相比，α硫醇核苷酸被配置为将τopen增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍或3倍中的任何一者。在一些实施方案中，聚合期间聚合酶掺入可掺入的核苷酸(例如，α硫醇核苷酸)的平均开放时间为掺入对应核苷三磷酸的平均开放时间的至少125％、150％、200％、225％或250％。
在一些实施方案中，一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物包含γ硫醇修饰的核苷酸。在一些实施方案中，γ硫醇修饰的核苷酸选自γ-硫代-dATP、γ-硫代-dGTP、γ-硫代-dTTP和γ-硫代-dCTP。在一些实施方案中，γ硫醇修饰的核苷酸是γ-硫代-dATP。
在一些实施方案中，被配置为以比核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入的一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物包含一个或多个具有修饰碱基的核苷酸。在一些实例中，选自dATP、dGTP、dTTP和dCTP的一个或多个未经修饰的dNTP被至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的对应经修饰的核苷酸或其类似物取代。在一些实施方案中，选自dATP、dGTP、dTTP和dCTP的一个或多个未经修饰的dNTP被不超过90％、不超过80％、不超过75％、不超过60％、不超过50％、不超过40％或不超过30％的对应经修饰的核苷酸或其类似物取代。也可以使用这些范围端点的任何组合，诸如在例如25％与75％之间，30％与60％之间，或者70％与90％之间的取代。在一些实施方案中，选自dATP、dGTP、dTTP和dCTP的多个未经修饰的dNTP被反应混合物中经修饰的核苷酸或其类似物部分或完全取代。在一些实施方案中，用经修饰的核苷酸取代多个不同核苷酸的效果是累加的。
在一些实施方案中，一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物包含一个或多个叠氮化物修饰的核苷酸和/或一个或多个炔烃修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反应混合物包含至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的叠氮化物修饰的dNTP，其取代了对应未经修饰的dNTP。在一些实施方案中，反应混合物包含不超过90％、不超过80％、不超过75％、不超过60％、不超过50％、不超过40％或不超过30％的叠氮化物修饰的dNTP，其取代了对应未经修饰的dNTP。示例性叠氮化物修饰的dNTP包括但不限于5-叠氮甲基-dUTP、叠氮化物-PEG4-氨基烯丙基-dUTP和5-叠氮基-PEG4-dCTP。在一些实施方案中，反应混合物包含至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的炔烃修饰的dNTP，其取代了对应未经修饰的dNTP。在一些实施方案中，反应混合物包含不超过90％、不超过80％、不超过75％、不超过60％、不超过50％、不超过40％或不超过30％的炔烃修饰的dNTP，其取代了对应未经修饰的dNTP。示例性炔烃修饰的核苷酸包括但不限于5-乙炔基-dUTP和C8-炔烃-dCTP。在一些实施方案中，本文所述的方法包括将一个或多个叠氮化物和/或炔烃修饰的dNTP掺入到RCA产物中，其中该方法不包括进行点击反应或铜催化反应。
在一些实施方案中，一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物包含一个或多个具有碱基修饰的经修饰的核苷酸。除了上述示例性叠氮化物和/或炔烃碱基修饰之外，示例性碱基修饰还可以包括二苄基环辛基(DBCO)修饰、乙烯基修饰、反式环辛烯(TCO)等等。在核苷酸修饰包含适于进行点击反应的官能团的一些实施方案中，该方法不包括在成像以检测RCA产物之前对生物样品进行点击反应。
在一些方面，反应混合物不包含胺修饰的核苷酸。在一些方面，反应混合物不包含用荧光团修饰的核苷酸。在一些方面，反应混合物不包含胺修饰的核苷酸或荧光修饰的核苷酸。在一些方面，扩增产物(例如，RCA产物)不包含胺修饰的核苷酸或荧光修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在其他实施方案中，一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物可以包括一个或多个胺修饰的核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物可以被官能化，例如用于将所生成的扩增产物(例如，纳米球)锚定或交联到支架、细胞结构和/或其他扩增产物(例如，其他纳米球)上。在一些方面，扩增产物包含经修饰的核苷酸，诸如胺修饰的核苷酸。其他胺修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP部分修饰、5-炔丙基氨基-dCTP部分修饰、N6-6-氨基己基-dATP部分修饰或7-脱氮杂-7-炔丙基氨基-dATP部分修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含丙烯酸或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分修饰。
在一些实施方案中，聚合酶在滚环扩增中的平均聚合速率小于2280nt/min、小于2000nt/min、小于1500nt/min、小于1250nt/min、小于1000nt/min、小于750nt/min、小于500nt/min或小于250nt/min，任选地其中聚合速率在30℃下测量。在一些实施方案中，聚合酶在滚环扩增中的平均聚合速率为至少100、200、250、500、750、1000、1250、1500或2000nt/min中的任何一者，任选地其中聚合速率在30℃下测量。在一些实施方案中，聚合酶的平均聚合速率在100nt/min-2280nt/min、100nt/min-2000nt/min、100nt/min-1500nt/min、200nt/min-2280nt/min、200nt/min-2000nt/min、200nt/min-1500nt/min、200nt/min-1000nt/min、500nt/min-1000nt/min、1000nt/min-1500nt/min、1250nt/min-2000nt/min和1500nt/min-2000nt/min中的任何一者内。
在一些实施方案中，可以同时终止样品中多个环状模板的RCA反应，以提供多个滚环扩增产物。在一些实施方案中，可以通过使样品与包含EDTA的缓冲液(例如，Tris-EDTA或TE缓冲液)接触来终止RCA反应。
B.用于减小RCA产物大小的反应混合物
如上文第III节和第IV.A.节中所讨论，本文提供了减缓或降低聚合酶聚合RCA产物的速率的各种方法。在一些方面，减缓RCA产物的聚合减小了RCA产物的大小。在一些方面，本文提供了不依赖于对聚合的减缓效应而减小RCA产物大小的方法(例如，通过促进RCA产物的压缩和/或RCA产物内的碱基堆积相互作用)。在一些方面，减小RCA产物的大小(例如，平均直径)可以减少光学拥挤。在一些方面，本文提供了在不显著降低样品中RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或平均密度的情况下减小RCA产物的大小(例如，平均直径)的方法。
在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含一个或多个核苷酸类似物的反应混合物接触，以及(b)使用聚合酶对生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了一个或多个核苷酸类似物的RCA产物，其中一个或多个核苷酸类似物包含含有疏水性修饰的核苷酸类似物。在一些实施方案中，疏水性修饰是碱基修饰。在一些实施方案中，疏水性修饰包括碳链和/或烃环。在一些实施方案中，疏水性修饰包括三键。在一些实施方案中，疏水性修饰包括乙烯基或乙炔基基团。包含疏水性修饰的示例性核苷酸类似物包括但不限于乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP。如例如图7所示，5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)和5-乙烯基-dUTP包含疏水性修饰(图中的虚线圆圈)。在一些实施方案中，包含疏水性修饰的核苷酸类似物是5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。在一些方面，将一个或多个核苷酸类似物掺入到RCA产物中增加了RCA产物的整体疏水性。实施例5提供的数据证明了掺入到RCA产物中的示例性核苷酸类似物5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP的压缩效应。
不受理论的束缚，在一些方面，将一个或多个核苷酸类似物掺入到RCA产物中促进了RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用，从而促进RCA产物折叠成更小的结构。例如，在水性环境中，RCA产物(RCP)的疏水性部分将有利地向内朝向RCP的中心定位，形成疏水核心，而带电基团(例如，磷酸基团)将倾向于位于RCP的外侧。
在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的直径小于在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物。在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径。在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于500nm。在一些实施方案中，在相同条件下在不含核苷酸类似物(例如，仅含未经修饰的dNTP)的情况下生成的RCA产物的中值直径为至少600nm、至少700nm或至少800nm。在一些实施方案中，使用一个或多个核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径是在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径的不超过90％或不超过80％。在一些方面，掺入了一个或多个核苷酸类似物的RCA产物的平均直径减小，但是掺入了一个或多个核苷酸类似物的RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度与在反应混合物中不包含一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异。可以使用用于确定数值差异的显著性的任何合适的方法。例如，在一些实施方案中，使用双尾或单尾t检验，显著差异可以被定义为小于或等于0.05的p值。在一些实施方案中，一种或多种RCA产物的大小(例如，直径)通过任何合适的手段来确定，诸如在第III节中描述的那些手段。
在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以至少1μM、至少1.25μM、至少2.5μM、至少5μM、至少10μM、至少20μM、至少40μM、至少80μM或至少100μM的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以不超过1mM、不超过750μM、不超过500μM、200μM、不超过150μM、不超过100μM、不超过80μM、不超过60μM或不超过40μM的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以等于或约等于以下任一者之间的浓度添加到样品中：1μM与200μM之间、1μM与150μM之间、1μM与100μM之间、1μM与80μM之间、10μM与200μM之间、10μM与150μM之间、10μM与100μM之间、10μM与80μM之间、50μM与200μM之间、50μM与100μM之间、50μM与80μM之间、60μM与200μM之间、60μM与100μM之间、60μM与80μM之间、或80μM与100μM之间。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以约60μM与约100μM之间或约80μM与约100μM之间的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以约80μM或至少约80μM的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以等于或约等于1μM、等于或约等于1.25μM、等于或约等于2.5μM、等于或约等于5μM、等于或约等于10μM、等于或约等于20μM、等于或约等于40μM、等于或约等于80μM或等于或约等于100μM的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，将包含疏水性修饰的核苷酸类似物以100μM的浓度添加到样品中。
在一些实施方案中，核苷酸类似物是经修饰的dUTP，并且反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约1:99之间，任选地其中反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约40:60之间。
在根据本文所述的用于减缓RCA和/或减小RCA产物大小的任何方法的一些实施方案中，多种RCA产物可以具有约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm、约1.0μm、约1.1μm、约1.2μm、约1.3μm、约1.4μm或约1.5μm或任何前述值之间的平均或中值直径。在一些实施方案中，多种滚环扩增产物可以具有小于0.25μm的平均或中值直径。
在一些实施方案中，多种RCA产物可以具有约1kb、约2kb、约5kb、约10kb、约20kb、约30kb、约40kb、约50kb、约60kb或约70kb或任何前述值之间的平均或中值长度。在一些实施方案中，多种滚环扩增产物可以具有小于20kb或小于10kb的平均或中值长度。
在一些实施方案中，多种RCA产物中与环状核酸互补的单位序列的平均或中值拷贝数可以为约10、约50、约100、约500、约1,000、约5,000或约10,000或更多。
在一些实施方案中，多种滚环扩增产物中与环状核酸互补的单位序列的平均或中值拷贝数可以小于100或小于1,000。
在一些实施方案中，聚合酶延伸(例如，RCA)可以进行不超过3小时。在一些实施方案中，聚合酶延伸可以进行不超过2小时。在一些实施方案中，聚合酶延伸可以进行不超过1小时。在一些实施方案中，聚合酶延伸可以进行不超过30分钟。在这里的任何实施方案中，聚合酶延伸(例如，RCA)可以在约20℃至约40℃之间、例如在约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃下进行小于约5分钟、小于约10分钟、小于约15分钟、小于约20分钟、小于约25分钟、小于约30分钟、小于约35分钟、小于约40分钟、小于约45分钟、小于约50分钟、小于约55分钟、小于约60分钟、小于约65分钟、小于约70分钟、小于约75分钟、小于约80分钟、小于约85分钟、小于约90分钟、小于约95分钟、小于约100分钟、小于约105分钟、小于约110分钟、小于约115分钟、小于约120分钟。在一些实施方案中，聚合酶延伸可以进行小于约1小时、小于约2小时、小于约3小时、小于约4小时、小于约5小时、小于约6小时、小于约7小时、小于约8小时、小于约9小时、小于约10小时、小于约11小时、小于约12小时、小于约13小时、小于约14小时、小于约15小时、小于约16小时、小于约17小时、小于约18小时、小于约19小时、小于约20小时、小于约21小时、小于约22小时、小于约23小时、小于约24小时、小于约30小时、小于约35小时、或小于约40小时。在一个具体实施方案中，聚合酶延伸可以进行约10至24小时之间。
V.核苷酸、核苷酸类似物和修饰
在一些方面，本文提供了核苷酸、核苷酸类似物和经修饰的核苷酸，以与本文所述的任何方法和组合物结合使用。
在一些方面，核苷酸，诸如天然存在的/未经修饰的核苷酸，包含(i)五碳糖(例如，糖部分或糖环)，例如核糖核苷酸的核糖或脱氧核糖核苷酸的脱氧核糖，(ii)核碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)，和(iii)一个或多个磷酸基团。核苷酸可以作为不被更大的核酸分子所包含的单体存在，诸如核苷三磷酸。在一些方面，核苷酸可以是核酸分子(例如，多核苷酸或寡核苷酸)中的核苷酸残基。在一些方面，在核酸分子中，多个核苷酸(例如，核苷酸残基)通过糖-磷酸骨架共价连接，每个核苷酸通过磷酸二酯键连接到下一个核苷酸。未经修饰的核苷酸、核苷酸残基和核酸的结构已例如在Alberts等人,Molecular Biology of the Cell,第七版(W.W.Norton&Company,2022)中详细描述。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸(例如，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，或核苷酸类似物)是例如与未经修饰的核苷酸(诸如未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)相比包含修饰的任何合适的核苷酸。在一些方面，经修饰的核苷酸是核苷酸类似物。在一些实施方案中，修饰是经修饰的核苷酸与未经修饰的核苷酸(例如，对应的未经修饰的核苷酸)之间的化学和/或结构差异。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含对核碱基、糖部分、一个或多个磷酸基团和/或磷酸二酯键的修饰(在核苷酸残基的情况下)。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含自然界中存在的修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含自然界中不存在的修饰。在一些实施方案中，与不包含经修饰的核苷酸中的修饰的对应未经修饰的核苷酸(例如，未经修饰的dATP、dTTP、dUTP、dCTP或dGTP)相比，包含天然不存在的修饰的经修饰的核苷酸被聚合酶(其可以是天然存在的或通过蛋白质工程修饰的)掺入的效率更低和/或速率更慢。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸可以包含任何合适的修饰或它们的组合，诸如本文所述的任何修饰或例如以下文献中所述的任何修饰：Ochoa和Milam,Molecules,25(20):4659(2020)；和McKenzie等人,Chem Soc Rev.,50(8):5126-5164(2021)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，核苷三磷酸是脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、或脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、胸苷三磷酸(TTP)和尿苷三磷酸(UTP)。在一些实施方案中，未经修饰的核苷酸残基是聚合酶将核苷三磷酸掺入到核酸中而产生的核苷酸残基，或者是与聚合酶将核苷三磷酸掺入核酸中而产生的核苷酸残基具有相同结构的核苷酸残基。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含对糖-磷酸骨架的修饰。在一些实施方案中，骨架修饰的核苷酸或修饰了骨架的核苷酸是包含糖和/或磷酸修饰(例如对糖磷酸骨架的修饰)的核苷酸，诸如核苷酸残基。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是糖修饰的核苷酸或修饰了糖的核苷酸。在一些实施方案中，糖修饰的核苷酸包含对糖部分的修饰。在一些方面，糖修饰的核苷酸包含糖部分的特定碳原子上的修饰，并以此命名。在一些方面，核苷酸的糖部分的碳原子编号为1至5(例如，C1‘、C2‘、C3‘、C4‘、C5‘)。因此，在一些实施方案中，C2‘修饰的核苷酸是糖部分的C2‘碳上有修饰的糖修饰的核苷酸；C3‘修饰的核苷酸是糖部分的C3‘碳上有修饰的糖修饰的核苷酸；以此类推。例如，C2‘碳可以连接到氟，例如在2‘-氟核糖核酸(2‘-F RNA)的情况下。可替代地，C2‘碳可以连接到甲氧基/OMe(-OCH3)基团，例如在2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)的情况下。其他示例性C2‘修饰包括连接到C2‘碳的氨基(-NH2)基团或叠氮基(-N3)基团。
在一些实施方案中，糖修饰的核苷酸是具有C3‘内折叠构象的核苷酸。在一些实施方案中，折叠(puckering)是指糖环的非平面构象，诸如在核苷酸中。在折叠中，原子可以从糖环平面移位。在一些实施方案中，折叠构象由C2‘和/或C3‘原子相对于由糖环的C1‘、O4‘和C4‘原子形成的平面的位置来定义。在“内”折叠中，位移发生在环的β面，即在C4‘-C5‘键和基底的同一侧。在外折叠中，位移发生在环的α面，即在C4'-C5‘键的平面的相对侧。因此，在一些实施方案中，在具有C3‘内折叠构象的核苷酸中，相对于糖环的C1‘、O4‘和C4‘原子形成的平面，C3‘碳移位到C4‘-C5‘键的同一侧。图1C例如显示了2‘-OMeRNA，一种具有3‘内折叠构象的示例性核苷酸。
在一些实施方案中，核苷酸类似物是锁定核酸(LNA)核苷酸。在一些实施方案中，LNA核苷酸也称为桥接核酸(BNA)核苷酸。在一些实施方案中，LNA核苷酸是在糖环的2‘O与4‘C之间包含亚甲基桥的核苷酸。在一些实施方案中，亚甲基桥在构象上将糖锁定为N型折叠构象。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸和/或包含经修饰的核苷酸的探针(诸如本文所述的任何环状探针、可环化探针或探针组或环化探针)包含经修饰的键。在一些实施方案中，经修饰的键是与未经修饰的(例如，天然存在的)磷酸二酯键(例如在DNA和RNA中观察到的)不同的任何键。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是通过经修饰的键与相邻核苷酸连接但在其他方面未被修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，键是三唑键或三唑基键。在一些实施方案中，三唑是包含三个氮原子和两个碳原子的五元环。在一些实施方案中，两个残基之间的键包含三唑。图1D显示了包含三唑键的示例性经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在一些方面，氮原子在不同三唑环内的定位可以不同。在一些实施方案中，键是硫醇键或硫醇基键。在一些实施方案中，键是硫代磷酸酯或硫逐磷酸酯键。在一些实施方案中，硫代磷酸酯、硫逐磷酸酯键或硫逐磷酸酯核苷酸间键是其中一个磷酸氧(例如，非连接氧)被硫原子取代的键。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸(诸如核苷酸残基)包含硫逐磷酸酯骨架核苷酸、硫代磷酸酯骨架核苷酸和/或三唑修饰的核苷酸。在一些实施方案中，硫逐磷酸酯骨架核苷酸是包含硫逐磷酸酯键的核苷酸残基。在一些实施方案中，硫代磷酸酯骨架核苷酸是包含硫代磷酸酯键的核苷酸残基。在一些实施方案中，三唑修饰的核苷酸是包含三唑基键的核苷酸残基。
在一些实施方案中，核苷酸或其类似物是本文所述的任何核苷酸，诸如未经修饰的核苷酸或经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸类似物是经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物是能够被聚合酶掺入到核酸中(例如通过使用环化探针作为模板的phi29DNA聚合酶在RCA产物的3‘末端掺入)的核苷酸或其类似物(诸如经修饰的核苷酸)。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物是不能够被聚合酶掺入到核酸中(例如通过使用环化探针作为模板的phi29 DNA聚合酶在RCA产物的3‘末端掺入)的核苷酸或其类似物(诸如经修饰的核苷酸)。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸或其类似物包含一磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一磷酸核苷酸是具有单个磷酸的核苷酸单体(例如，未掺入的核苷酸)，例如如图2B(左)所示，该图显示了脱氧核糖核苷一磷酸的结构。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸或其类似物包含二磷酸核苷酸。在一些实施方案中，二磷酸核苷酸是具有两个磷酸的核苷酸单体(例如，未掺入的核苷酸)，例如如图2B(中)所示，该图显示了脱氧核糖核苷酸二磷酸的结构。可掺入和不可掺入的核苷酸或其类似物在例如第IV.A.节中进一步描述。
在一些实施方案中，本文提供的核苷酸(诸如经修饰的核苷酸或可掺入的核苷酸或其类似物)是α-硫醇核苷酸。在一些方面，从最接近核糖的基团开始，核苷三磷酸的磷酰基基团分别称为α磷酸、β磷酸和γ磷酸。在一些实施方案中，α-硫醇核苷酸是其中与α磷酸结合的一个氧被硫原子取代的核苷酸。图2B(右)中显示了α硫醇核苷酸的示例性结构。图中的“碱基”可以是任何未经修饰或经修饰的核碱基，诸如本文所述的任何核碱基。在一些实施方案中，α-硫醇核苷酸可以是α-硫代-dATP、α-硫代-dTTP、α-硫代-dCTP或α-硫代-dGTP。
在一些实施方案中，本文提供的核苷酸(诸如经修饰的核苷酸或可掺入的核苷酸或其类似物)是炔烃修饰的核苷酸。在一些方面，炔烃是含有至少一个碳-碳三键的不饱和烃。在一些实施方案中，炔烃修饰的核苷酸包含炔烃。在一些实施方案中，未经修饰的核碱基(及其对应的核苷酸)不包含炔烃。在一些实施方案中，炔烃修饰的核苷酸包含核碱基上的炔烃修饰。炔烃修饰的核苷酸的实例包括5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)(例如，如图6A所示)。
在一些实施方案中，本文提供的核苷酸(诸如经修饰的核苷酸或可掺入的核苷酸或其类似物)是叠氮化物修饰的核苷酸。在一些方面，叠氮化物修饰的核苷酸是包含叠氮化物的核苷酸。在一些方面，叠氮化物修饰的核苷酸是包含叠氮化物修饰的核苷酸。在一些方面，叠氮化物修饰位于核苷酸的任何合适的部分上。例如，在一些实施方案中，8-叠氮基-腺嘌呤是在核碱基中具有叠氮化物修饰的叠氮化物修饰的腺嘌呤核苷酸。在另一个实例中，2‘-叠氮基核苷酸在糖部分中包含叠氮化物修饰。在另一个实例中，可以对核苷三磷酸的磷酸酯进行叠氮化物修饰(例如，叠氮化物可以替换磷酸酯)。在一些实施方案中，叠氮化物修饰的核苷酸包含5-叠氮基-PEG4-dCTP(例如，如图6A所示)。可以看出，经修饰的核苷酸可以包含超过一个修饰。例如，5-叠氮基-PEG4-dCTP包含叠氮化物修饰和炔烃修饰。
在一些实施方案中，核苷酸或其类似物(诸如经修饰的核苷酸)包含疏水性修饰。在一些实施方案中，疏水性修饰位于核苷酸的任何合适的部分上，诸如碱基、糖部分和/或一个或多个磷酸基团。在一些实施方案中，疏水性修饰是碱基修饰，并且可以在核苷酸的碱基上的任何一个或多个位置处。
在一些实施方案中，疏水性修饰是增加核苷酸疏水性的修饰。在一些实施方案中，疏水性增加是由于添加了非极性基团或分子，诸如碳链和/或烃环。在一些实施方案中，疏水性修饰可以包括碳链和/或烃环。在一些实施方案中，疏水性修饰包括双键和/或三键，诸如两个碳原子之间的双键或三键。在一些实施方案中，疏水性修饰包括乙烯基或乙炔基基团。在一些实施方案中，乙烯基基团是具有式-CH＝CH2的官能团。在一些实施方案中，乙烯基基团连接到核苷酸或其类似物的核碱基，诸如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的任何一者。在一些实施方案中，核苷酸或其类似物是乙烯基-dNTP，诸如乙烯基-dUTP。在一些实施方案中，乙烯基-dUTP是具有乙烯基修饰的dUTP，例如包含乙烯基基团的dUTP。在一些实施方案中，核苷酸或其类似物是5-乙烯基-脱氧尿苷三磷酸，例如如图7所示。在一些实施方案中，疏水性修饰包括乙炔基基团。在一些实施方案中，乙炔基基团是具有式-C≡CH的官能团。在一些实施方案中，乙炔基基团连接到核苷酸或其类似物的核碱基，包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的任何一者。在一些实施方案中，核苷酸或其类似物是乙炔基-dNTP，诸如乙炔基-dUTP。在一些实施方案中，核苷酸或其类似物是5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)，例如如图7所示。
在一些实施方案中，例如与不包含核苷酸类似物的参考RCA产物相比，在RCA产物中掺入一个或多个包含疏水性修饰的核苷酸类似物增加了RCA产物的整体疏水性。在一些实施方案中，在RCA产物中掺入一个或多个包含疏水性修饰的核苷酸类似物促进了RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用。在一些方面，碱基堆积是指在核酸的三维结构中发现的核碱基的排列，其中两个或更多个平面碱基以堆积构型紧密排列。在一些方面，碱基堆积导致排斥水，并且增加的碱基疏水性(例如，经由疏水性修饰)可以进一步促进碱基堆积。在一些方面，碱基堆积有助于RCA产物的形状和/或大小。在一些实施方案中，促进RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积(例如，通过包含含有疏水性修饰的核苷酸类似物)可导致RCA产物大小(例如，直径)减小。
VI.信号放大、检测和分析
在一些方面，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)环状RCA模板(例如，环状探针或环化探针)中和/或其RCA产物中存在的一个或多个序列。在一些情况下，对捕获的一个或多个图像进行分析，并且可以包括处理所述一个或多个图像和/或量化观察到的信号。例如，分析可以包括处理在样品的特定区域中检测到的一种或多种细胞类型、一种或多种类型的生物标志物、生物标志物的数量或水平、和/或细胞的数量或水平的信息。在一些实施方案中，分析包括检测序列，例如样品中存在的条形码。在一些实施方案中，分析包括小点(puncta)的定量(例如，如果检测到扩增产物)。在一些情况下，分析包括确定是否存在与来自特定面板的一种或多种生物标志物相关的特定细胞和/或信号。在一些实施方案中，可以将获得的信息与阳性和阴性对照相比较，或与特征的阈值相比较以确定样品是否表现出某种特征或表型。在一些情况下，信息可以包括来自细胞、区域的信号，和/或包括来自多个可检测标记的读数。在一些情况下，分析还包括显示来自分析或检测步骤的信息。在一些实施方案中，可以使用软件来使数据的处理、分析和/或显示自动化。
在一些实施方案中，检测生物样品中的RCA产物包括使样品与能与RCA产物杂交的核酸探针接触。在使核酸探针与样品接触之后，可以通过确定可检测标记(如果存在)来直接检测所述探针，和/或通过使用直接或间接与所述探针或其产物结合的一个或多个其他探针来检测所述探针。该一个或多个其他探针可以包含可检测标记。例如，第一核酸探针可以结合样品中的RCA产物，并且可以引入第二核酸探针以结合第一核酸探针，其中随后可以使用可检测地标记的探针检测第二核酸探针或其产物。也可以使用直接或间接与第二核酸探针或其产物结合的更高级探针，并然后可以使用可检测地标记的探针来检测所述更高级探针或其产物。
在一些实施方案中，检测可以是空间的，例如，二维的或三维的。在一些实施方案中，检测可以是定量的，例如，可以确定RCA产物(和对应靶核酸)的量或浓度。在一些实施方案中，取决于应用，一级探针、二级探针、更高级探针和/或可检测地标记的探针可以包含能够与核酸杂交的多种实体中的任一种，例如，DNA、RNA、LNA和/或PNA等。
检测探针可以包含与RCA产物中的序列杂交(例如，与RCA产物所包含的条形码序列或其互补序列杂交)的识别序列。识别序列可以具有任何长度，并且相同或不同的二级核酸探针中的多个识别序列可以具有相同或不同的长度。如果使用多于一个识别序列，则识别序列可以独立地具有相同或不同的长度。例如，识别序列的长度可以是至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40或至少50个核苷酸。在一些实施方案中，识别序列的长度可以不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16、不超过12、不超过10、不超过8或不超过6个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，识别序列可以具有5至8个核苷酸之间、6至12个核苷酸之间或7至15个核苷酸之间等的长度。在一个实施方案中，识别序列具有与环状或环化探针或其产物的条形码序列或其互补序列相同的长度。在一些实施方案中，识别序列可以与条形码序列或其互补序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％互补。
在一些实施方案中，根据本文所述的方法生成的RCA产物可以用包括信号放大的方法检测。示例性的信号放大方法包括可检测反应性分子在探针杂交位点周围的靶向沉积、分支结构的靶向组装(例如，bDNA或使用锁定核酸(LNA)的分支测定)、通过酶促滚环扩增(RCA)的多联体的程序化原位生长(例如，如在US2019/0055594中所述，该专利的内容全文以引用方式并入本文)、杂交链反应、使用连续几轮化学连接的拓扑连环DNA结构的组装(clampFISH)、通过发夹介导的连环化的信号放大(例如，如在US 2020/0362398中所述，该专利的内容全文以引用方式并入本文)，例如引物交换反应，诸如通过交换反应的信号放大(SABER)或具有DNA交换的SABER(交换-SABER)。在一些实施方案中，可以使用非酶促信号放大方法。
在一些实施方案中，可以使用杂交链反应(HCR)实现信号放大。HCR是一种基于核酸分子的杂交触发链的无酶核酸扩增，从HCR单体开始，这些单体彼此杂交形成带切口的核酸聚合物。该聚合物是HCR反应的产物，其最终被检测以指示靶分析物的存在。HCR在Dirks和Pierce,2004,PNAS,101(43),15275-15278中以及在US 7,632,641和US 7,721,721中详细描述，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。也参见US 2006/00234261；Chemeris等人,2008Doklady Biochemistry and Biophysics,419,53-55；Niu等人,2010,46,3089-3091；Choi等人,2010,Nat.Biotechnol.28(11),1208-1212；以及Song等人,2012,Analyst,137,1396-1401，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。HCR单体通常包含发夹或其他亚稳态核酸结构。在最简单的HCR形式中，当引入“引发剂”核酸分子时，两种不同类型的稳定发夹单体(这里称为第一和第二HCR单体)经历杂交链反应事件，形成带长切口的双链DNA分子。HCR单体具有发夹结构，该发夹结构包含双链茎区、连接茎区的两条链的环区和在双链茎区的一端处的单链区。当单体处于发夹结构中时暴露(并因此可用于与另一分子例如引发剂或其他HCR单体杂交)的单链区可以被称为“立足点区”(或“输入结构域”)。第一HCR单体各自还包含与第二HCR单体的暴露的立足点区中的序列互补的序列。第一HCR单体中的这种互补性序列可以被称为“相互作用区”(或“输出结构域”)。类似地，第二HCR单体各自包含相互作用区(输出结构域)，例如与第一HCR单体的暴露的立足点区(输入结构域)互补的序列。在不存在HCR引发剂的情况下，这些相互作用区受到二级结构的保护(例如，它们不暴露)，因此发夹单体是稳定的或动力学被困的(也称为“亚稳态”)，并保持为单体(例如，防止系统快速平衡)，因为第一和第二组HCR单体不能彼此杂交。然而，一旦引入引发剂，它就能够与第一HCR单体的暴露的立足点区杂交，并侵入它，导致其打开。这将暴露第一HCR单体的相互作用区(例如，与第二HCR单体的立足点区互补的序列)，从而允许其与立足点区处的第二HCR单体杂交并侵入第二HCR单体。这种杂交和侵入进而打开第二HCR单体，暴露其相互作用区(其与第一HCR单体的立足点区互补)，并允许其与另一第一HCR单体杂交并侵入另一第一HCR单体。反应以这种方式继续，直至所有HCR单体都被耗尽(例如，所有HCR单体都并入到聚合物链中)。最终，该链反应导致形成第一和第二单体物种的交替单元的带切口的链。因此需要HCR引发剂的存在以便通过与第一HCR单体杂交并侵入第一HCR单体来触发HCR反应。第一和第二HCR单体被设计成彼此杂交并因此可以定义为彼此同源。它们还与给定的HCR引发剂序列同源。彼此相互作用(杂交)的HCR单体可以被描述为一组HCR单体、或者HCR单体或发夹系统。
HCR反应可以用超过两种种类或类型的HCR单体进行。例如，可以使用涉及三种HCR单体的系统。在这样的系统中，每个第一HCR单体可以包含与第二HCR单体的立足点区结合的相互作用区；每个第二HCR可以包含与第三HCR单体的立足点区结合的相互作用区；并且每个第三HCR单体可以包含与第一HCR单体的立足点区结合的相互作用区。然后，HCR聚合反应将如上文所述进行，除了所得产物将是具有连续的第一、第二和第三单体的重复单元的聚合物。可以容易地想到具有大量的HCR单体组的相应系统。
在一些实施方案中，类似于使用发夹单体的HCR反应，线性寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)也可用于信号放大。在一些实施方案中，本文提供了一种检测样品中的分析物的方法，其包括：(i)进行线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)，其中使引发剂与至少第一和第二物种的多种LO-HCR单体接触以生成与靶核酸分子杂交的聚合LO-HCR产物，其中第一物种包含与引发剂互补的第一杂交区和与第二物种互补的第二杂交区，其中第一物种和第二物种是线型的单链核酸分子；其中所述引发剂以一个或多个部分提供，并且直接或间接与靶核酸分子杂交或包含在靶核酸分子中；以及(ii)检测聚合物产物，从而检测分析物。在一些实施方案中，第一物种和/或第二物种可以不包含发夹结构。在一些实施方案中，所述多种LO-HCR单体可以不包含亚稳态二级结构。在一些实施方案中，LO-HCR聚合物可以不包含分支结构。在一些实施方案中，进行线型寡核苷酸杂交链反应包括使靶核酸分子与引发剂接触以提供与靶核酸分子杂交的引发剂。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子和/或分析物可以是RCA产物。
在一些实施方案中，核酸序列的原位检测包括本文所述的RCA方法与用于分支信号放大的组件的组合。在一些实施方案中，组件复合物包含直接或间接(通过一个或多个寡核苷酸)与RCA产物的序列杂交的放大器。在一些实施方案中，组件包括一个或多个放大器，每个放大器包括放大器重复序列。在一些方面，标记所述一个或多个放大器。本文描述了使用前述组件的方法，该方法包括例如在多重错误稳健荧光原位杂交(MERFISH)应用中使用该组件，其中分支DNA扩增用于信号读出。在一些实施方案中，放大器重复序列为约5-30个核苷酸，并且在放大器中重复N次。在一些实施方案中，放大器重复序列为约20个核苷酸，并且在放大器中重复至少两次。在一些方面，标记所述一个或多个放大器重复序列。对于示例性的分支信号放大，参见例如美国专利公开号US2020/0399689和US 2022/0064697以及Xia等人,Multiplexed Detection of RNA using MERFISH and branched DNAamplification,Scientific Reports(2019)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以用包括通过进行引物交换反应(PER)进行信号放大的方法来检测RCA产物。在各种实施方案中，在其3‘末端上具有结构域的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域。例如，在其3'末端具有结构域1的引物与催化发夹结合，并且通过链置换聚合酶延伸新的结构域1，重复循环生成重复结构域1序列的多联体。在各种实施方案中，链置换聚合酶是Bst。在各种实施方案中，催化发夹包括释放链置换聚合酶的停止器(stopper)。在各种实施方案中，分支迁移置换延伸的引物，然后延伸的引物可以解离。在各种实施方案中，引物经历重复循环而形成多联体引物。在各种实施方案中，使多种多联体引物与包含使用本文所述的方法生成的RCA产物的样品接触。在各种实施方案中，可以使RCA产物与多个多联体引物和多个标记的探针接触。关于示例性的分子和PER反应组分，参见例如美国专利公开号US20190106733，其以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，RCA产物可以通过提供检测探针如用于进行形成扩增产物的链反应(例如，HCR)的探针来检测。在一些实施方案中，分析包括确定扩增产物的全部或一部分的序列。在一些实施方案中，分析包括检测扩增产物中存在的序列。在一些实施方案中，扩增产物的全部或一部分的序列指示靶核酸中感兴趣的区域的身份。在其他实施方案中，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)存在于多核苷酸探针中的一个或多个序列(例如，存在于第一和/或第二探针的突出端区域中的条形码序列)。
在一些实施方案中，该方法包括对RCA产物的全部或一部分(诸如RCA产物中存在的一个或多个条形码序列)进行测序。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括对RCA产物或探针的全部或一部分进行测序和/或对RCA产物或探针进行原位杂交。在一些实施方案中，测序步骤涉及边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序、基于杂交的原位测序和/或其中原位杂交包括序贯荧光原位杂交。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括检测通过杂交链反应(HCR)反应生成的聚合物，对于示例性的探针和HCR反应组分，参见例如US2017/0009278，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，检测或确定包括使用荧光团、同位素、质量标签或其组合标记的检测寡核苷酸与扩增产物杂交。在一些实施方案中，检测或确定包括对扩增产物成像。在一些实施方案中，靶核酸为组织样品中的mRNA，并且在靶核酸和/或扩增产物位于组织样品中原位时进行检测或确定。
在一些方面，所提供的方法包括对扩增产物(例如，扩增子)和/或多核苷酸的一个或多个部分成像，例如，通过检测探针的结合并检测可检测标记。在一些实施方案中，检测探针包含可以测量和定量的可检测标记。标记和可检测标记包括与待检测的分子缔合(例如，缀合)的直接或间接可检测的部分，例如可检测的探针，包括但不限于荧光团、放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素或半抗原)等。
荧光团包含能够在可检测范围内显示荧光的物质或其一部分。可以根据所提供的实施方案使用的标记的特定实例包括但不限于藻红蛋白、Alexa染料、荧光素、YPet、CyPet、Cascade blue、别藻蓝蛋白、Cy3、Cy5、Cy7、罗丹明、丹酰、伞形酮、Texas red、鲁米诺、吖啶酯、生物素、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和脲酶。
组织样品中的荧光检测通常可能受到强背景荧光存在的阻碍。自体荧光是用于将背景荧光(其可以由多种来源(包括醛固定、细胞外基质组分、红细胞、脂褐素等)引起)与来自荧光标记的抗体或探针的期望免疫荧光区分开的术语。组织自体荧光可能导致难以将由于荧光抗体或探针引起的信号与一般背景区分开。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种试剂来减少组织自发荧光，例如自发荧光消除剂(Sigma/EMD Millipore)、TrueBlack脂褐素自发荧光淬灭剂(Biotium)、MaxBlock自发荧光减少试剂盒(MaxVisionBiosciences)和/或非常强烈的黑色染料(例如，苏丹黑或相当的深色发色团)。
在一些实施方案中，可以使用含有可检测标记的可检测探针来检测本文所述的一种或多种多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)。在一些实施方案中，所述方法涉及将含有可检测标记的可检测探针与样品一起温育，洗涤未结合的可检测探针，和例如通过成像来检测标记。
可检测标记的实例包括但不限于各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标记、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对和蛋白质-抗体结合对。荧光蛋白的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白。
生物发光标记物的实例包括但不限于荧光素酶(例如，细菌、萤火虫和叩头虫)、荧光素、水母发光蛋白等。具有视觉可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶(glucorimidase)、磷酸酶、过氧化物酶和胆碱酯酶。可鉴定的标记物还包括放射性化合物，诸如125I、35S、14C或3H。可鉴定的标记物可从多种来源商购获得。
荧光标记以及与此类荧光标记缀合的核苷酸和/或多核苷酸的实例包括在以下文献中描述的那些：例如Hoagland,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals,第九版(Molecular Probes,Inc.,Eugene,2002)；Keller和Manak,DNA Probes,第2版(Stockton Press,New York,1993)；Eckstein，编辑,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；以及Wetmur,CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227-259(1991)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，适用于所提供的实施方案的示例性技术、方法和方法论包括例如US 4,757,141、US 5,151,507和US 5,091,519中描述的那些，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，一种或多种荧光染料用作标记的靶序列的标记，例如，如以下文献中所述：US 5,188,934(4,7-二氯荧光素染料)；US 5,366,860(光谱可分辨罗丹明染料)；US 5,847,162(4,7-二氯罗丹明染料)；US 4,318,846(醚取代的荧光素染料)；US 5,800,996(能量转移染料)；US 5,066,580(黄嘌呤染料)；以及US 5,688,648(能量转移染料)，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。也可以用量子点进行标记，如US 6,322,901、US 6,576,291、US 6,423,551、US 6,251,303、US 6,319,426、US 6,426,513、US 6,444,143、US 5,990,479、US 6,207,392、US2002/0045045和US2003/0017264中所描述，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，荧光标记是信号传导部分，该信号传导部分通过一个或多个分子的荧光吸收和/或发射特性来传达信息。示例性荧光特性包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特性和能量转移。
容易掺入核苷酸和/或多核苷酸序列中的可商购获得的荧光核苷酸类似物的实例包括但不限于：Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS REDTM-5-dUTP、CASCADEBLUETM-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHODAMINE GREENTM-5-dUTP、OREGON GREENRTM488-5-dUTP、TEXAS REDTM-l2-dUTP、BODIPYTM630/650-14-dUTP、BODIPYTM650/665-14-dUTP、ALEXA FLUORTM488-5-dUTP、ALEXA FLUORTM532-5-dUTP、ALEXA FLUORTM568-5-dUTP、ALEXA FLUORTM594-5-dUTP、ALEXA FLUORTM546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、TEXAS REDTM-5-UTP、mCherry、CASCADE BLUETM-7-UTP、BODIPYTMFL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPYTMTR-14-UTP、RHOD AMINE GREENTM-5-UTP、ALEXA FLUORTM488-5-UTP和ALEXA FLUORTM546-14-UTP(Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.)。用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方法在例如Henegariu等人,(2000)Nature Biotechnol.18:345中描述，该文献的内容全文以引用方式并入本文。
可得到的用于合成后连接的其他荧光团包括但不限于ALEXA FLUORTM350、ALEXAFLUORTM532、ALEXA FLUORTM546、ALEXA FLUORTM568、ALEXA FLUORTM594、ALEXA FLUORTM647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、丹酰、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、太平洋蓝、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、德克萨斯红(可得自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)。也可以使用FRET串联荧光团，包括但不限于PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)和APC-Alexa染料。
在一些情况下，金属银或金颗粒可以用于增强来自荧光标记的核苷酸和/或多核苷酸序列的信号。参见例如Lakowicz等人,(2003)Bio Techniques 34:62，该文献的内容全文以引用方式并入本文。
生物素或其衍生物也可以用作核苷酸和/或多核苷酸序列上的标记，并且随后被可检测地标记的抗生物素蛋白/链霉亲和素衍生物(例如，藻红蛋白缀合的链霉亲和素)或可检测地标记的抗生物素抗体结合。地高辛配基可以作为标记掺入，并且随后被可检测地标记的抗地高辛配基抗体(例如，荧光素化的抗地高辛配基)结合。可以将氨基烯丙基-dUTP残基掺入多核苷酸序列中，并且随后偶联到N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生的荧光染料上。一般来说，只要可检测地标记的缀合配偶体可以被结合以允许检测，缀合物对的任何成员就可以掺入到检测多核苷酸中。在一些实施方案中，抗体是任何类别的抗体分子或其任何亚片段，诸如Fab。
多核苷酸序列的其他合适的标记可以包括荧光素(FAM)、地高辛配基、二硝基苯酚(DNP)、丹酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6xHis)和磷光体-氨基酸(例如，P-tyr、P-ser、P-thr)。在一些实施方案中，使用以下半抗原/抗体对进行检测，其中每种抗体都用可检测标记衍生化：生物素/a-生物素、地高辛配基/a-地高辛配基、二硝基苯酚(DNP)/a-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/a-FAM。
在一些实施方案中，核苷酸和/或多核苷酸序列可以被间接标记，特别是用半抗原标记，然后该半抗原被捕获剂结合，例如如US 5,344,757、US 5,702,888、US 5,354,657、US5,198,537、US 4,849,336和US 5,073,562中所公开，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。许多不同的半抗原-捕获剂对可供使用。示例性半抗原包括但不限于生物素、去生物素(des-biotin)和其他衍生物、二硝基酚、丹酰、荧光素、Cy5和地高辛配基。对于生物素，捕获剂可以是抗生物素蛋白、链霉亲和素或抗体。抗体可以用作其他半抗原的捕获剂(许多染料-抗体对可商购获得，例如，Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。
在一些方面，分析和/或序列确定可以在室温下进行，以在低背景噪声和减少错误的情况下最好地保存组织形态。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括随着测序的进行消除错误累积。
在一些实施方案中，分析和/或序列确定涉及洗涤以去除未结合的多核苷酸，其后显露荧光产物以便成像。
在一些方面，检测涉及使用检测方法，诸如流式细胞术；测序；探针结合和电化学检测；pH变化；由与DNA标签结合的酶诱导的催化作用；量子纠缠；拉曼光谱；太赫兹波技术；和/或扫描电子显微术。在一些方面，流式细胞术是质量细胞术或荧光激活流式细胞术。在一些方面，检测包括进行显微术、扫描质谱或本文所述的其他成像技术。在这些方面，检测包括确定信号，例如荧光信号。
在一些方面，使用许多不同类型的显微术中的任何一种来进行检测(包括成像)，例如共聚焦显微术、双光子显微术、光场显微术、完整组织扩张显微术和/或CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)。
在一些实施方案中，使用荧光显微术来进行检测探针的检测和成像。在一些方面，荧光显微镜为光学显微镜，其使用荧光和磷光代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。在荧光显微术中，用在样品中激发荧光的波长的光照射样品。然后通过显微镜物镜对荧光成像，荧光波长通常比照射波长长。该技术中可以使用两个滤光片；照射(或激发)滤光片，其确保照射接近单色且在正确的波长下，和第二发射(或屏障)滤光片，其确保没有激发光源到达检测器。可替代地，这些功能都可以由单个二向色滤光片实现。“荧光显微镜”包括使用荧光来生成图像的任何显微镜，无论其是像落射荧光显微镜这样的更简单的装置，还是像共聚焦显微镜这样的更复杂的设计，其都使用光学切片来获得荧光图像的更好分辨率。
在一些实施方案中，使用共聚焦显微术来进行检测探针的检测和成像。共聚焦显微镜使用点照射和检测器前方光学共轭平面中的针孔来消除离焦信号。由于只能检测到非常靠近焦平面的荧光产生的光，故图像的光学分辨率，特别是在样品深度方向上，比宽视场显微镜要好得多。然而，由于来自样品荧光的许多光在针孔处被阻挡，故分辨率的这种提高是以信号强度的降低为代价的——因此通常需要长的曝光时间。由于一次仅照射样品中的一个点，故2D或3D成像需要在试样中以规则光栅(例如，平行扫描线的矩形图案)扫描。焦平面的可实现厚度主要由所用光的波长除以物镜的数值孔径限定，但也由试样的光学性质限定。薄光学切片使得这些类型的显微镜在样品的3D成像和表面轮廓分析方面特别好。CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)提供了用于大型澄清样品的快速3D成像的替代显微术。COLM询问大型免疫染色组织，允许提高采集速度并产生更高质量的生成数据。
可以采用的其他类型的显微术包括明场显微术、斜照显微术、暗场显微术、相差显微术、微分干涉差(DIC)显微术、干涉反射显微术(也称为反射干涉差或RIC)、单平面照明显微术(SPIM)、超高分辨率显微术、激光显微术、电子显微术(EM)、透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、反射电子显微术(REM)、扫描透射电子显微术(STEM)和低电压电子显微术(LVEM)、扫描探针显微术(SPM)、原子力显微术(ATM)、弹道电子发射显微术(BEEM)、化学力显微术(CFM)、导电原子力显微术(C-AFM)、电化学扫描隧道显微镜(ECSTM)、静电力显微术(EFM)、流体力显微镜(FluidFM)、力调制显微术(FMM)、特征导向扫描探针显微术(FOSPM)、开尔文探针力显微术(KPFM)、磁力显微术(MFM)、磁共振力显微术(MRFM)、近场扫描光学显微术(NSOM)(或SNOM、扫描近场光学显微术、SNOM、压电响应力显微术(PFM)、PSTM、光子扫描隧道显微术(PSTM)、PTMS、光热显微光谱/显微术(PTMS)、SCM、扫描电容显微术(SCM)、SECM、扫描电化学显微术(SECM)、SGM、扫描门显微术(SGM)、SHPM、扫描霍尔探针显微术(SHPM)、SICM、扫描离子电导显微术(SICM)、SPSM自旋偏振扫描隧道显微术(SPSM)、SSRM、扫描扩散电阻显微术(SSRM)、SThM、扫描热显微术(SThM)、STM、扫描隧道显微术(STM)、STP、扫描隧道电位法(STP)、SVM、扫描电压显微术(SVM)、同步加速器x-射线扫描隧道显微术(SXSTM)和完整组织扩张显微术(exM)。
在一些实施方案中，诸如环状探针或可环化探针或探针组之类的核酸探针或与RCA产物杂交的核酸探针可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个、20个或更多个、32个或更多个、40个或更多个、或50个或更多个条形码序列。条形码序列可以位于核酸探针内的任何位置。如果存在多于一个条形码序列，则条形码序列可以彼此相邻定位，和/或与其他序列穿插。在一些实施方案中，条形码序列中的两个或更多个也可以至少部分地重叠。在一些实施方案中，同一探针中的两个或更多个条形码序列不重叠。在一些实施方案中，同一探针中的所有条形码序列由至少一个磷酸二酯键彼此分开(例如，它们可以彼此紧邻但不重叠)，如分开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。
如果存在，条形码序列可以具有任何长度。如果使用多于一个条形码序列，则条形码序列可以独立地具有相同或不同的长度，如长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50个核苷酸。在一些实施方案中，条形码序列的长度可以不超过120、不超过112、不超过104、不超过96、不超过88、不超过80、不超过72、不超过64、不超过56、不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16或不超过8个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，条形码序列可以在5至10个核苷酸之间、8至15个核苷酸之间等。
条形码序列可以是任意的或随机的。在某些情况下，条形码序列选择为减少或最小化与样品中其他组分的同源性，例如，使得条形码序列本身不与怀疑在细胞或其他样品内的其他核酸结合或杂交。在一些实施方案中，在特定的条形码序列与另一序列(例如，样品中的细胞核酸序列或添加到样品中的探针中的其他条形码序列)之间，同源性可以小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方案中，同源性可以小于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基，并且在一些实施方案中，所述碱基为连续碱基。
在一些实施方案中，环状探针或可环化探针或探针组的群体中的不同条形码序列的数量小于核酸探针的不同靶(例如，核酸分析物和/或蛋白质分析物)的数量，但不同的靶仍然可以例如通过用条形码序列的不同组合编码探针而从彼此唯一地鉴定。然而，并非需要使用给定的一组条形码序列的所有可能组合。例如，每种探针可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等或更多个条形码序列。在一些实施方案中，核酸探针的群体可以各自含有相同数量的条形码序列，但在其他情况下，各种探针上可以存在不同数量的条形码序列。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括生物样品的多重分析，包括探针杂交于RCA产物、荧光成像和信号去除的连续循环，其中信号去除包括从荧光团标记的反应性分子(例如，酪胺)去除荧光团。示例性可检测反应性试剂和方法描述于US 6,828,109、US2019/0376956、US 2019/0376956、US2022/0026433、US2022/0128565和US2021/0222234中，所述专利中的每一者均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，检测样品中的RCA产物可以包括对RCA产物的全部或一部分进行测序(例如，RCA产物所包含的一个或多个条形码序列或其互补序列)。在一些实施方案中，测序可以原位进行。原位测序通常涉及以序贯的、模板依赖性方式掺入标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)或使标记的引物(例如，标记的无规六聚体)与核酸模板杂交使得可以确定掺入的核苷酸或标记的引物延伸产物的身份(例如，核苷酸序列)，并因此确定相应的模板核酸的核苷酸序列。原位测序的方面见述于例如Mitra等人,(2003)Anal.Biochem.320,55-65以及Lee等人,(2014)Science,343(6177),1360-1363，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。此外，用于进行原位测序的方法和系统的实例描述于US 2016/0024555、US2019/0194709中以及US10,138,509、US10,494,662和US.10,179,932中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。用于原位测序的示例性技术包括但不限于STARmap(描述于例如Wang等人,(2018)Science,361(6499)5691中，该文献的内容全文以引用方式并入本文)、MERFISH(描述于例如Moffitt,(2016)Methods in Enzymology,572,1-49，该文献的内容全文以引用方式并入本文)、基于杂交的原位测序(HybISS)(描述于例如Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112，该文献的内容全文以引用方式并入本文)和FISSEQ(描述于例如US2019/0032121中，该文献的内容全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，测序可以通过边合成边测序(SBS)来进行。在一些实施方案中，测序引物与一个或多个条形码处或附近的序列互补。在此类实施方案中，合成测序可以包括逆转录和/或扩增，以便生成引物序列可以结合的模板序列。示例性SBS方法包括例如但不限于US 2007/0166705、US2006/0188901、US 7,057,026、US2006/0240439、US 2006/0281109、US2011/005986、US2005/0100900、US 9,217,178、US 2009/0118128、US2012/0270305、US2013/0260372和US2013/0079232描述的那些，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，测序可以通过序贯荧光杂交进行(例如，边杂交边测序)。序贯荧光杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的检测探针的序贯杂交。
在一些实施方案中，测序可以使用单个分子边连接边测序来进行。这样的技术利用DNA连接酶来并入寡核苷酸并鉴别这样的寡核苷酸的并入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸与之杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关的不同标记。边连接边测序中涉及的方面和特征见述于例如Shendure等人,Science(2005),309:1728-1732中，以及US 5,599,675；US5,750,341；US 6,969,488；US 6,172,218；和US 6,306,597，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，RCA产物或与之杂交的一个或多个探针所包含的条形码或其互补序列被可检测地标记的检测寡核苷酸(诸如荧光标记的寡核苷酸)靶向。在一些实施方案中，一种或多种解码方案用于解码信号(诸如荧光)，用于序列确定。在本文的任何实施方案中，可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)条形码，该方法或技术包括本文所述的那些，诸如RNA序贯靶标探测(RNA SPOT)、序贯荧光原位杂交(seqFISH)、单分子荧光原位杂交(smFISH)、多重错误稳健荧光原位杂交(MERFISH)、基于杂交的原位测序(HybISS)、原位测序、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)、或空间分辨转录物扩增子读段作图(spatially-resolved transcript amplicon readout mapping，STARmap)。在一些实施方案中，本文所提供的方法包括通过用多个标记的探针(例如，检测寡核苷酸)进行序贯杂交和检测来分析条形码。示例性解码方案见述于Eng等人,“Transcriptome-scaleSuper-Resolved Imaging in Tissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatially resolved,highly multiplexed RNA profiling insingle cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112；US10,457,980B2；US2016/0369329A1；WO 2018/026873A1；和US2017/0220733A1中，这些文献中的每一者均全文以引用方式并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，可以使用核酸杂交来进行测序。这些方法利用与条形码序列的至少一部分互补的标记的核酸解码器探针。可以用具有可区分标记的许多不同探针的池来进行多路复用解码。核酸杂交测序的非限制性实例描述于例如US 8,460,865和Gunderson等人,Genome Research14:870--877(2004)中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，在测序期间可以使用DNA聚合酶活性的实时监测。例如，可以通过荧光共振能量转移(FRET)来检测核苷酸掺入，如例如Levene等人,Science(2003),299,682-686、Lundquist等人,Opt.Lett.(2008),33,1026-1028和Korlach等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008),105,1176-1181中所述，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，核酸(例如，包含条形码序列的核酸，诸如探针或RCP)的序列分析可以通过序贯杂交(例如，边杂交边测序和/或序贯原位荧光杂交)进行。序贯荧光杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的可检测探针的序贯杂交。在一些实施方案中，本文公开的方法包括本文公开的可检测探针的序贯杂交，包括可检测地标记的探针(例如，荧光团缀合寡核苷酸)和/或本身未被可检测地标记但能够结合可检测地标记的探针(例如，经由核酸杂交)并被可检测地标记的探针检测的探针。包含可检测探针的顺序荧光杂交的示例性方法见述于US2019/0161796、US 2020/0224244、US2022/0010358、US2021/0340618和WO 2021/138676中，所有这些文献均以引用方式并入本文。在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括通过用多个标记的探针(例如，检测寡核苷酸)序贯杂交和检测来分析标识符序列(例如，分析物序列或条形码序列)。
在一些实施方案中，序列检测包括：使生物样品与一个或多个直接或间接与RCP杂交的中间探针接触，其中一个或多个中间探针可使用一个或多个可检测地标记的探针(例如，包含分支接头的探针，诸如第II.B节中描述的探针)进行检测；以及从滚环扩增产物中去杂交一个或多个中间探针和/或一个或多个可检测地标记的探针。在一些方面，使探针去杂交包括从RCP中去除探针。在一些实施方案中，该一个或多个中间探针包含一个或多个突出端区域(例如，探针的不与滚环扩增产物杂交的5'和/或3'末端)。包含单个突出端区域的探针可以被称为“L-形探针”，包含两个突出端的探针可以被称为“U-形探针”。在一些情况下，突出端区域包含用于结合一个或多个可检测地标记的探针的结合区域。在一些实施方案中，检测包括使生物样品与对应于不同条形码序列或其部分的中间探针池和对应于不同的可检测标记的可检测地标记的探针池接触。在一些实施方案中，使生物样品依次与不同的中间探针池接触。在一些情况下，在多个序贯杂交步骤(例如，用不同的中间探针池)中使用共同或通用的可检测地标记的探针池。
在一些实施方案中，通过探针与条形码序列或其互补序列的序贯杂交并检测探针与条形码序列或其互补序列形成的复合物来进行条形码序列的检测。在一些情况下，每个条形码序列或其互补序列被分配一个鉴定条形码序列或其互补序列的信号码序列(例如，鉴定分析物的时间信号特征或码)，并且检测条形码序列或其互补序列可以包括通过检测从序贯杂交、检测和去除中间探针的连续池和可检测地标记的探针的通用池检测到的信号码的对应序列来解码条形码序列或其互补序列。在一些情况下，信号码序列可以是分配给对应条形码序列或其互补序列的荧光团序列。在一些实施方案中，可检测地标记的探针是荧光标记的。在一些实施方案中，条形码序列或其互补序列通过序贯探针杂交进行解码，如US2021/0340618中所述，该文献的内容全文以引用方式并入本文。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括：使生物样品与一个或多个直接或间接与条形码序列或其互补序列(例如，在使用探针或探针组生成的扩增产物中)杂交的可检测地标记的探针接触，以及使一个或多个可检测地标记的探针去杂交。在本文的任何实施方案中，可以用直接或间接与条形码序列或其互补序列杂交的一个或多个可检测地标记的探针和/或一个或多个其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。在一些方面，该方法包括可检测地标记的探针的序贯杂交，以产生鉴定分析物的时空信号特征或码。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品与一个或多个直接与多个探针或探针组杂交的第一可检测地标记的探针接触。在一些情况下，检测步骤可以包括使生物样品与一个或多个间接与多个探针或探针组杂交的第一可检测地标记的探针接触。在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品与一个或多个直接或间接与多个探针或探针组杂交的第二可检测地标记的探针接触。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品与一个或多个直接或间接与条形码序列或其互补序列(例如，多个探针或探针组的或使用多个探针或探针组生成的滚环扩增产物的条形码序列或其互补序列)杂交的中间探针接触，其中使用一个或多个可检测地标记的探针可检测一个或多个中间探针。在本文的任何实施方案中，检测步骤还可以包括从条形码序列或其互补序列(例如，多个探针或探针组的或使用多个探针或探针组生成的滚环扩增产物的条形码序列或其互补序列)中去杂交一个或多个中间探针和/或一个或多个可检测地标记的探针。在本文的任何实施方案中，可以用一个或多个中间探针、一个或多个可检测地标记的探针、一个或多个其他中间探针和/或一个或多个其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在一些方面，本文提供了一种检测RCP和解码RCP中的标识符序列的方法，该方法包括：a)提供中间探针和荧光标记的探针，以及细胞或组织样品(例如，固定样品、FFPE样品或水凝胶包埋和透明化的样品)中的RCP，每个RCP包含多个拷贝的标识符序列，该标识符序列具有来自码本的分配信号码序列；b)在第一循环中，将第一多个中间探针/荧光标记的探针对递送(例如，使用仪器或系统的流控模块)到细胞或组织样品，其中每对中的中间探针和荧光标记的探针形成复合物，该复合物包含与多个RCP中的RCP杂交的中间探针和与中间探针杂交的荧光标记的探针，其中中间探针包含(i)与RCP中的标识符序列互补的识别序列和(ii)突出端序列，并且其中荧光标记的探针包含(i)与突出端序列互补的序列和(ii)荧光标记；c)在固相支持物上的多个位置处检测(例如，使用仪器或系统的光学模块)与第一多个探针对的荧光标记相关联的第一信号(或其缺失)，其中在特定位置处检测到的第一信号或其缺失对应于向特定位置处的RCP中的标识符序列分配的信号码序列中的第一信号码；d)在第二循环中，将第二多个中间探针/荧光标记的探针对递送(例如，使用仪器或系统的流控模块)到细胞或组织样品，其中每对中的中间探针和荧光标记的探针形成复合物，该复合物包含与多个RCP中的RCP杂交的中间探针和与中间探针杂交的荧光标记的探针，其中中间探针包含(i)与RCP中的标识符序列互补的识别序列和(ii)突出端序列，并且其中荧光标记的探针包含(i)与突出端序列互补的序列和(ii)荧光标记；e)在固相支持物上的多个位置处检测(例如，使用仪器或系统的光学模块)与第二多个探针对的荧光标记相关联的第二信号(或其缺失)，其中在特定位置处检测到的第二信号或其缺失对应于向特定位置处的RCP中的标识符序列分配的信号码序列中的第二信号码，从而在多个位置中的每个位置处生成至少包含第一信号码和第二信号码的信号码序列；f)比较(例如，使用仪器或系统的系统控制器)在多个位置处为RCP生成的信号码序列与来自码本的信号码序列，从而解码RCP中的标识符序列。
在一些实施方案中，在第一循环中，将中间探针的第一池和荧光标记的探针的通用池递送到固相支持物，其中中间探针的第一池中的每个中间探针包含(i)与RCP中的不同标识符序列之一互补的识别序列，和(ii)与通用池的荧光标记的探针互补的杂交序列。在一些实施方案中，在第二循环中，将中间探针的第二池和荧光标记的探针的通用池递送到固相支持物，其中中间探针的第二池中的每个中间探针包含(i)与RCP中的不同标识符序列之一互补的识别序列，和(ii)与通用池的荧光标记的探针互补的杂交序列。在一些实施方案中，RCP中的不同标识符序列的数量至少为9，并且通用池中的不同序列的荧光标记的探针的数量为4。
在本文的任何实施方案中，通用池中的不同序列的每个荧光标记的探针可以用不同颜色的荧光团标记。在本文的任何实施方案中，信号码序列包含第一信号码、第二信号码、对应于第三循环的第三信号码和对应于第四循环的第四信号码。在本文的任何实施方案中，信号码序列可以包含对应于在对应循环中没有信号的暗信号码。
VII.试剂盒
本文还提供了试剂盒，该试剂盒例如包含一种或多种多核苷酸，例如第III节中描述的任何环状探针或可环化探针或探针组，以及用于进行本文提供的方法的试剂，例如包括本文描述的杂交、连接、扩增、检测、测序和/或样品制备在内的一个或多个步骤所需的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含靶核酸，例如第II节中描述的任何靶核酸。在一些实施方案中，任何或所有多核苷酸为DNA分子。在一些实施方案中，靶核酸为信使RNA分子。在一些实施方案中，试剂盒还包含连接酶，例如用于从可环化探针或探针组形成环化探针。在一些实施方案中，连接酶具有DNA夹板化DNA连接酶活性。在一些实施方案中，连接酶具有RNA夹板化连接酶活性。在一些实施方案中，试剂盒还包含聚合酶，例如用于例如使用第IV节中描述的任何方法对环状或环化探针进行滚环扩增的聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增的引物(例如，RCA引物)。
在一些实施方案中，本文公开了一种使用滚环扩增分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含：(a)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组，其中环状探针或可环化探针或探针组包含与靶核酸的靶序列互补的靶杂交区；以及(b)聚合酶；其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基降低了聚合酶使用环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针作为模板在滚环扩增反应中的聚合速率。在一些实施方案中，试剂盒还可以包含用于由可环化探针或探针组生成环化探针的连接酶。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以包含修饰了糖的核苷酸残基和/或骨架修饰的核苷酸残基。在一些实施方案中，一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基可以选自由以下项组成的组：2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-氟核糖核酸(2′-F RNA)、硫逐磷酸酯骨架核苷酸、硫代磷酸酯骨架核苷酸、三唑修饰的核苷酸以及它们的组合。在任何前述实施方案中，试剂盒还可以包含：一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物，该一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物被配置为与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入；和/或一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物，该一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。
在一些方面，本文提供了一种用于进行滚环扩增(RCA)的试剂盒，该试剂盒包含：(a)聚合酶；(b)一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物，该一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物被配置为与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入；和/或一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物，该一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入；以及(c)用作RCA模板的一个或多个环状探针、用于生成用作RCA模板的环化探针的一个或多个可环化探针或探针组、和/或用于生成RCA环化模板的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物和/或一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物可以包含α-硫醇核苷酸、炔烃修饰的核苷酸、叠氮化物修饰的核苷酸、二磷酸核苷酸和/或一磷酸核苷酸。在任何前述实施方案中，该试剂盒还可以包含未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。
在试剂盒的任何前述实施方案中，一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物、一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物和/或未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的组合可以被用于RCA的反应混合物所包含，诸如第IV节中描述的任何反应混合物。
在一些方面，本文提供了一种用于进行滚环扩增(RCA)的试剂盒；该试剂盒包含：(a)聚合酶；(b)包含一个或多个疏水性修饰并被配置为被聚合酶掺入的一个或多个核苷酸类似物；以及(c)用于生成作为RCA模板的环化探针的一个或多个环状探针或可环化探针或探针组，或用于生成RCA环化模板的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸类似物包含选自乙炔基-dUTP和/或乙烯基dUTP的经修饰的dUTP。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸类似物作为包含一个或多个核苷酸类似物和未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的反应混合物提供。在一些实施方案中，反应混合物中经修饰的dUTP与未经修饰的dTTP的比率为至少约80:20。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可以预先组合到单个容器中。在一些实施方案中，试剂盒还含有使用试剂盒组分实施所提供的方法的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以含有用于进行所提供的方法的一个或多个步骤所需的试剂和/或消耗品。在一些实施方案中，试剂盒含有用于固定、包埋和/或透化生物样品的试剂。在一些实施方案中，试剂盒含有试剂，诸如用于连接和/或扩增的酶和缓冲液，诸如连接酶和/或聚合酶。在一些方面，试剂盒还可以包含本文所述的任何试剂，例如洗涤缓冲液和连接缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测和/或测序的试剂，如条形码检测探针或可检测标记。在一些实施方案中，试剂盒任选地含有其他组分，例如核酸引物、酶和试剂、缓冲液、核苷酸、经修饰的核苷酸、用于另外的测定的试剂。
VIII.应用
在一些方面，所提供的实施方案可以应用于分析核酸序列的原位方法中，如原位转录组分析或原位测序，例如来自其中空间信息已被保留的完整组织或样品的核酸序列。在一些方面，实施方案可以应用于用于多重核酸分析的成像或检测方法中。在一些方面，所提供的实施方案可以用于鉴定或检测靶核酸中感兴趣的区域。
在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，感兴趣的区域为单核苷酸变体(SNV)。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸置换。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含点突变。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸插入。
在一些方面，实施方案可以应用于研究和/或诊断应用中，例如，用于表征或评估来自受试者的特定细胞或组织。所提供的方法的应用可以包括生物医学研究和临床诊断。例如，在生物医学研究中，应用包括但不限于用于生物研究或药物筛选的空间分辨基因表达分析。在临床诊断中，应用包括但不限于检测患者样品的基因标志物如疾病、免疫反应、细菌或病毒DNA/RNA。
在一些方面，实施方案可以应用于以亚细胞分辨率可视化整个组织中遗传编码标志物的分布，例如染色体异常(倒位、重复、易位等)、遗传杂合性的丧失、指示疾病倾向或良好健康的等位基因的存在、对治疗有反应的可能性，或个性化医疗或世系中。
IX.术语
在整个本公开中使用特定术语来解释所描述的装置、系统、方法和组合物的各个方面。
已经描述了本公开的一些示意性实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，前述内容仅是示意性的而非限制性的，已仅以举例的方式呈现。许多修改和其他示意性实施方案在本领域普通技术人员的范围内并且被视为落在本公开的范围内。具体地，尽管本文中呈现的许多实例涉及方法动作或系统要素的特定组合，但应理解，这些动作和这些要素可以以其他方式组合以实现相同的目标。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
在整个本公开中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对要求保护的主题的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个居间值以及该陈述的范围中的任何其他陈述的或居间的值均涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在要求保护的主题内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在要求保护的主题中。不管范围的广度如何，这都适用。
在权利要求中使用序数术语(诸如“第一”、“第二”、“第三”等)修饰权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素相较于执行方法的动作的另一个顺序或时间顺序的任何优先、领先或顺序，而是仅仅用作标记以将具有特定名称的一个权利要求元素与具有相同名称(但使用了序数词)的另一元素区分开，从而区分这些权利要求元素。类似地，在权利要求中使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味着任何优先级、先后次序或步骤顺序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
(i)条形码
“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品和/或珠中的分析物的信息)的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是独特的。
条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。可以将条形码以可逆或不可逆方式连接至分析物或另一个部分或结构。可以在样品测序之前或期间将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独测序读段(例如，条形码可以是或可以包括独特的分子标识符或“UMI”)。
条形码可以例如以单细胞分辨率在空间上解析存在于生物样品中的分子组分(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方案中，条形码包括UMI和空间条形码两者。在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。
(ii)核酸和核苷酸
术语“核酸”和“核苷酸”旨在符合其在本领域中的用途并且包括未经修饰的天然存在的物类或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交(例如，能够与两种核酸杂交，使得可以在两种杂交的核酸之间发生连接)或能够用作特定核苷酸序列的复制模板。未经修饰的核酸一般具有含磷酸二酯键的骨架。类似物结构可以具有替代的骨架连接。未经修饰的核酸一般具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。
核酸可以包含具有糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可以包含天然或非天然核苷酸。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自由尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或多个碱基。
(iii)探针和靶
“探针”或“靶”，当用于指核酸或核酸序列时，在方法或组合物的上下文中旨在作为核酸或序列的语义标识符，并且不将核酸或序列的结构或功能限制在明确指出的范围之外。
(iv)寡核苷酸和多核苷酸
术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指长度为约2个至约500个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的、酶促(例如，通过聚合)或使用“分割池(split-pool)”方法制备的。寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(例如，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(例如，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些实例中，寡核苷酸可以包括寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的组合(例如，脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。例如，寡核苷酸可以为4至10、10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、或400-500个核苷酸的长度。寡核苷酸可以包括一个或多个与多聚体结构(例如，共价或非共价)连接的功能部分。例如，寡核苷酸可以包括一个或多个可检测标记(例如，放射性同位素或荧光团)。
(v)杂交(Hybridizing、Hybridize)、退火(Annealing、Anneal)
术语“杂交(hybridizing、hybridize)”、“退火(annealing、anneal)”在本公开中可互换使用，并且是指两个不同分子内基本上互补或互补的核酸序列的配对。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。出于杂交的目的，如果两个核酸序列各自单独的碱基的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则这两个核酸序列是“基本上互补的”。
(vi)引物
“引物”为具有3‘末端的单链核酸序列，所述3‘末端可以用作核酸延伸反应中的核酸聚合酶的底物。RNA引物由RNA核苷酸形成并且用于RNA合成，而DNA引物由DNA核苷酸形成并且用于DNA合成。引物也可以包含RNA核苷酸和DNA核苷酸(例如，以随机或设计的模式)两者。引物还可以包含本文所述的可以具有另外的功能的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，DNA引物可以用于引发RNA合成，反之亦然(例如，RNA引物可以用于引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包含多达约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。
(vii)引物延伸
“引物延伸”是指两个核酸序列通过其相应末端互补核酸序列(例如，3‘末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。这样的连接之后可以是用另一个核酸序列作为延伸模板进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。
(viii)核酸延伸
“核酸延伸”通常涉及以模板依赖性方式向分子(如但不限于核酸序列)中并入一种或多种核酸(例如，A、G、C、T、U、核苷酸类似物或其衍生物)，使得连续的核酸被酶(如聚合酶或逆转录酶)并入，从而生成新合成的核酸分子。例如，可以通过使用互补核酸序列作为核酸合成的模板将与互补核酸序列杂交的引物用于合成新的核酸分子。类似地，与聚(dT)序列杂交的mRNA转录物的3‘聚腺苷酸化尾可以用作对应cDNA分子的单链合成的模板。
(ix)PCR扩增
“PCR扩增”是指使用聚合酶链反应(PCR)来生成遗传物质的拷贝，包括DNA和RNA序列。用于实施PCR的合适试剂和条件描述于例如美国专利4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,512,462中，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。在典型的PCR扩增中，反应混合物包括待扩增的遗传物质、酶、一种或多种用于引物延伸反应的引物和用于反应的试剂。寡核苷酸引物具有足够的长度以在退火条件下提供与互补遗传物质的杂交。引物的长度通常取决于扩增结构域的长度，但通常将为至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基对(bp)、至少11bp、至少12bp、至少13bp、至少14bp、至少15bp、至少16bp、至少17bp、至少18bp、至少19bp、至少20bp、至少25bp、至少30bp、至少35bp，并且可以长达40bp或更长，其中引物的长度通常将在18至50bp的范围内。遗传物质可以与单个引物或一组两个引物(正向引物和反向引物)接触，这取决于是否需要引物延伸、遗传物质的线性或指数扩增。
在一些实施方案中，PCR扩增过程使用DNA聚合酶。DNA聚合酶活性可以由一种或多种不同的DNA聚合酶提供。在某些实施方案中，DNA聚合酶来自细菌，例如，DNA聚合酶是细菌DNA聚合酶。例如，DNA聚合酶可以来自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、嗜热菌属或火球菌属的细菌。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTMDNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Hot Start Taq DNA聚合酶、CrimsonTaq DNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶、Quick-DNA聚合酶、HemoDNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
术语“DNA聚合酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有经修饰的衍生物，还包括天然存在的DNA聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶可能已经被修饰以去除5'-3'核酸外切酶活性。可以使用的DNA聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括但不限于保留了野生型序列的至少一些功能(例如DNA聚合酶活性)的突变体。突变可以影响在不同的反应条件下(例如温度、模板浓度、引物浓度等)酶的活性分布，例如提高或降低聚合速率。突变或序列修饰也可能影响核酸外切酶活性和/或酶的热稳定性。
在一些实施方案中，PCR扩增可以包括反应，诸如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链反应、转录介导的扩增反应、等温扩增反应和/或环介导的扩增反应。
在一些实施方案中，PCR扩增使用与靶DNA片段的3'标签互补的单一引物。在一些实施方案中，PCR扩增使用第一引物和第二引物，其中所述第一引物的至少3'末端部分与靶核酸片段的3'标签的至少一部分互补，并且其中所述第二引物的至少3'末端部分展示靶核酸片段的5'标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物的5'末端部分与靶核酸片段的3'标签不互补，并且第二引物的5'末端部分不展示靶核酸片段的5'标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物包含第一通用序列和/或第二引物包含第二通用序列。
在一些实施方案中(例如，当PCR扩增扩增捕获的DNA时)，可以使用DNA连接酶将PCR扩增产物与另外的序列连接。DNA连接酶活性可以由一种或多种不同的DNA连接酶提供。在一些实施方案中，DNA连接酶来自细菌，例如，DNA连接酶是细菌DNA连接酶。在一些实施方案中，DNA连接酶来自病毒(例如，噬菌体)。例如，DNA连接酶可以是T4 DNA连接酶。适合于连接步骤的其他酶包括但不限于Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、嗜热球菌(菌株9oN)DNA连接酶(9oNTM DNA连接酶，可得自New England Biolabs,Ipswich,MA)和AmpligaseTM(可得自Epicentre Biotechnologies,Madison,WI)。也可以使用它们的衍生物(例如序列修饰的衍生物)和/或突变体。
在一些实施方案中，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增遗传物质。所需逆转录酶活性可以由一种或多种不同的逆转录酶提供，其合适的实例包括但不限于：M-MLV、MuLV、AMV、HIV、ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM及I、II、III和IV酶。“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有此类修饰的衍生物，还包括天然存在的逆转录酶的衍生物。
此外，逆转录可以使用M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶的序列修饰的衍生物或突变体(包括保留野生型序列的至少一些功能活性(例如逆转录酶活性)的突变体)来进行。逆转录酶可以作为组合物的一部分提供，所述组合物包括其他组分，例如增强或改善逆转录酶活性的稳定组分，诸如RNA酶抑制剂、DNA依赖性DNA合成抑制剂，例如放线菌素D。逆转录酶的许多序列修饰的衍生物或突变体(例如M-MLV)、以及包括未经修饰和经修饰的酶的组合物是可商购获得的，例如ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM、以及I、II、III和IV酶。
某些逆转录酶(例如禽成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV、MMLV)逆转录酶)可以使用RNA(cDNA合成)和单链DNA(ssDNA)两者作为模板合成互补DNA链。因此，在一些实施方案中，逆转录反应可以使用能够使用RNA和ssDNA两者作为延伸反应模板的酶(逆转录酶)，例如AMV或MMLV逆转录酶。
在一些实施方案中，使用本领域中熟知的技术，诸如但不限于“TAQMANTM”或或在毛细管(“毛细管”)上，通过实时PCR(也称为定量PCR或qPCR)进行RNA和/或DNA的定量。在一些实施方案中，通过光学吸光度和用实时PCR来确定遗传物质的定量。在一些实施方案中，通过数字PCR来确定遗传物质的定量。在一些实施方案中，可以将分析的基因与对应于表达(mRNA)和数量(DNA)的参考核酸提取物(DNA和RNA)进行比较，以便比较靶核酸的表达水平。
(x)抗体
“抗体”为识别并结合互补靶抗原的多肽分子。抗体通常具有类似于Y形状的分子结构形状。天然存在的抗体，称为免疫球蛋白，属于免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE中之一。抗体也可以以合成方式产生。例如，为单克隆抗体的重组抗体可以使用合成基因来合成，做法是从源细胞回收抗体基因、扩增到适当的载体中并将该载体引入到宿主中以使得宿主表达重组抗体。一般而言，重组抗体可以使用合适的寡核苷酸引物和/或杂交探针从任何物种的产生抗体的动物克隆。可以使用重组技术来生成抗体和抗体片段，包括非内源物种。
合成抗体可以来源于非免疫球蛋白来源。例如，抗体可以从核酸(例如，适体)和从非免疫球蛋白蛋白支架(如肽适体)生成，高变环被插入其中以形成抗原结合位点。基于核酸或肽结构的合成抗体可以比免疫球蛋白衍生的抗体小，从而导致更大的组织穿透。
抗体还可以包括affimer蛋白，其是分子量通常为约12-14kDa的亲和试剂。Affimer蛋白通常以高亲和力和高特异性两者与靶(例如，靶蛋白)结合。此类靶的实例包括但不限于泛素链、免疫球蛋白和C反应蛋白。在一些实施方案中，affimer蛋白衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并包括肽环和提供结合位点的可变N-末端序列。
抗体还可以指“表位结合片段”或“抗体片段”，如本文所用，其通常是指能够结合与完整抗体相同的表位的完整抗体的一部分，虽然其程度不一定相同。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但是表位结合片段通常包含至少一对结合在一起(例如，通过二硫键)以保留抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，并且不包含Fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可以通过任何合适的技术(例如，重组DNA技术，或者完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得，并且通常能够以与筛选完整抗体相同的方式来筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包括F(ab‘)2片段、Fab‘片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体衍生的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、双体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或者包含抗体的足够部分(例如，一个或多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。
(xi)标记、可检测标记和光学标记
术语“可检测标记”、“光学标记”和“标记”在本文中可互换使用，是指与待检测的分子(例如，用于原位测定的探针)相关联(例如，缀合)的直接或间接可检测的部分。可检测标记可以是本身可直接检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶促标记的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化底物化合物或组合物的化学改变，所述底物化合物或组合物是可直接检测的。可检测标记可以适用于小规模检测和/或适用于高通量筛选。因此，合适的可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。
可检测标记可以被定性地检测(例如，光学地或光谱地)，或者可以被定量。定性检测通常包括其中确认可检测标记的存在或出现的检测方法，而可量化检测通常包括具有可量化(例如，数值可报告)值如强度、持续时间、极化和/或其他性质的检测方法。在一些实施方案中，可检测标记与特征或和特征相关联的探针结合。例如，可检测地标记的特征可以包括附接到珠的荧光、比色或化学发光标记(参见例如Rajeswari等人,J.Microbiol Methods139:22-28,2017和Forcucci等人,J.Biomed Opt.10:105010,2015，这些文献中的每一者的全部内容以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，可以将多个可检测标记与待检测的特征、探针或组合物结合。例如，可以在核酸聚合或扩增期间掺入可检测标记(例如，标记的核苷酸，诸如-dCTP)。可以使用任何合适的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。例如，荧光团可以来自包括以下的组：7-AAD(7-氨基放线菌素D)、吖啶橙(+DNA)、吖啶橙(+RNA)、Alexa350、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、别藻蓝蛋白(APC)、AMCA/AMCA-X、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-氨基-4-甲基香豆素、6-氨基喹啉、苯胺蓝、ANS、APC-Cy7、ATTO-TAGTMCBQCA、ATTO-TAGTMFQ、金胺O-福尔根、BCECF(高pH)、BFP(蓝色荧光蛋白)、BFP/GFP FRET、BOBOTM-1/BO-PROTM-1、BOBOTM-3/BO-PROTM-3、FL、TMR、TR-X、530/550、558/568、564/570、581/591、630/650-X、650-665-X、BTC、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、Calcium CrimsonTM、CalciumGreen-1TM、Calcium OrangeTM、白、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、6-羧基罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、羧基-X-罗丹明(5-ROX)、CascadeCascade YellowTM、CCF2(GeneBLAzerTM)、CFP(青色荧光蛋白)、CFP/YFP FRET、色霉素A3、Cl-NERF(低pH)、CPM、6-CR 6G、CTC甲 Cychrome(PE-Cy5)、丹酰胺、丹酰尸胺、丹酰氯、DAPI、Dapoxyl、DCFH、DHR、DiA(4-Di-16-ASP)、DiD(DilC18(5))、DIDS、Dil(DilC18(3))、DiO(DiOC18(3))、DiR(DilC18(7))、Di-4 ANEPPS、Di-8 ANEPPS、DM-NERF(4.5-6.5pH)、DsRed(红色荧光蛋白)、EBFP、ECFP、EGFP、-97醇、曙红、赤藓红、溴化乙锭、乙锭均二聚体-1(EthD-1)、氯化铕(III)、5-FAM(5-羧基荧光素)、坚牢蓝、荧光素-dT亚磷酰胺、FITC、Fluo-3、Fluo-4、Fluoro-GoldTM(高pH)、Fluoro-GoldTM(低pH)、Fluoro-Jade、1-43、Fura-2(高钙)、Fura-2/BCECF、Fura RedTM(高钙)、Fura RedTM/Fluo-3、GeneBLAzerTM(CCF2)、GFP Red Shifted(rsGFP)、GFP野生型、GFP/BFP FRET、GFP/DsRed FRET、Hoechst 33342&33258、7-羟基-4-甲基香豆素(pH 9)、1,5IAEDANS、Indo-1(高钙)、Indo-1(低钙)、吲哚二羰花青、吲哚三羰花青、JC-1、6-JOE、JOJOTM-1/JO-PROTM-1、LDS751(+DNA)、LDS 751(+RNA)、LOLOTM-1/LO-PROTM-1、荧光黄、LysoSensorTM蓝(pH5)、LysoSensorTM绿(pH 5)、LysoSensorTM黄/蓝(pH 4.2)、绿、红、黄、Mag-Fura-2、Mag-Indo-1、Magnesium GreenTM、Marina4-甲基伞形酮、光辉霉素、绿、橙、红、NBD(胺)、尼罗红、Oregon488、Oregon500、Oregon514、太平洋蓝、PBF1、PE(R-藻红蛋白)、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)、PerCP-Cy5.5(TruRed)、PharRed(APC-Cy7)、C-藻青蛋白、R-藻青蛋白、R-藻红蛋白(PE)、PI(碘化丙啶)、PKH26、PKH67、POPOTM-1/PO-PROTM-1、POPOTM-3/PO-PROTM-3、碘化丙啶(PI)、PyMPO、芘、派若宁Y、Quantam Red(PE-Cy5)、喹吖因氮芥、R670(PE-Cy5)、Red 613(PE-德克萨斯红)、红色荧光蛋白(DsRed)、试卤灵、RH 414、Rhod-2、罗丹明B、Rhodamine GreenTM、RhodamineRedTM、罗丹明鬼笔环肽、罗丹明110、罗丹明123、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、S65A、S65C、S65L、S65T、SBFI、SITS、-1(高pH)、-2、-1(高pH)、-1(低pH)、Sodium GreenTM、#1、#2、11、13、17、45、蓝、绿、橙、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、-X、-X(NHS酯)、硫杂二羰花青、噻唑橙、-1/TO--1、-3/TO--3、TO--5、Tri-color(PE-Cy5)、TRITC(四甲基罗丹明)、TruRed(PerCP-Cy5.5)、WW 781、X-罗丹明(XRITC)、Y66F、Y66H、Y66W、YFP(黄色荧光蛋白)、-1/YO--1、-3/YO--3、6-FAM(荧光素)、6-FAM(NHS酯)、6-FAM(叠氮化物)、HEX、TAMRA(NHS酯)、Yakima Yellow、MAX、TET、TEX615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTORho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665、TYE 705、5‘700、5‘800、5‘800CW(NHS酯)、WellRED D4染料、WellRED D3染料、WellRED D2染料、640(NHS酯)和Dy 750(NHS酯)。
如上文所提及的，在一些实施方案中，可检测标记为发光或化学发光部分或者包括发光或化学发光部分。常见的发光/化学发光部分包括但不限于过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SP)、碱性磷酸酶和荧光素酶。给定适当的底物(例如，氧化试剂加上化学发光化合物)，这些蛋白质部分可以催化化学发光反应。已知许多化合物家族在各种条件下提供化学发光。化学发光化合物族的非限制性实例包括5-氨基-6,7,8-三甲氧基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮鲁米诺和二甲基氨基[ca]苯并类似物。这些化合物可以在碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱的存在下发光。化学发光化合物家族的其他实例包括例如，2,4,5-三苯基咪唑、对二甲基氨基和-甲氧基取代基、草酸酯诸如草酰活性酯、对硝基苯基、N-烷基吖啶酯、萤光素、光泽精或吖啶酯。在一些实施方案中，可检测标记是或包括基于金属或基于质量的标记。例如，小簇金属离子、金属或半导体可以充当质量代码。在一些实例中，金属可以选自周期表的第3-15族，例如Y、La、Ag、Au、Pt、Ni、Pd、Rh、Ir、Co、Cu、Bi或其组合。
本公开的示例性实施方案包括：
1A.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的反应混合物接触，所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含具有疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，
(b)使用聚合酶对所述生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的RCA产物，其中所述RCA产物未经由掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物进行交联，以及
(c)检测所述生物样品中一定位置处未经由所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物交联的所述RCA产物。
2A.根据实施方案1A所述的方法，其中所述疏水性修饰是碱基修饰。
3A.根据实施方案1A或2A所述的方法，其中所述疏水性修饰包括碳链和/或烃环。
4A.根据实施方案1A至3A中任一项所述的方法，其中所述疏水性修饰包括三键。
5A.根据实施方案1A至4A中任一项所述的方法，其中所述疏水性修饰包括乙烯基或乙炔基基团。
6A.根据实施方案1A至5A中任一项所述的方法，其中包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP。
7A.根据实施方案6A所述的方法，其中包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。
8A.根据实施方案1A至7A中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的所述RCA产物的直径小于在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物。
9A.根据实施方案1A至8A中任一项所述的方法，其中将包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以至少1μM、至少1.25μM、至少2.5μM、至少5μM、至少10μM、至少40μM、至少80μM或至少100μM的浓度添加到所述生物样品中。
10A.根据实施方案1A至9A中任一项所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是经修饰的dUTP，并且所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约1:99之间，任选地其中所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与所述未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约40:60之间。
11A.根据实施方案1A至10A中任一项所述的方法，其中将包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以约50μM至约100μM的浓度添加到所述生物样品中，任选地其中将包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以约80μM至约100μM的浓度添加到所述生物样品中。
12A.根据实施方案1A至11A中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径。
13A.根据实施方案1A至12A中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于500nm。
14A.根据实施方案1A至13A中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径是在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径的不超过90％或不超过80％。
15A.根据实施方案1A至14A中任一项所述的方法，其中掺入了所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度与在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异。
16A.根据实施方案1A至15A中任一项所述的方法，其中所述将所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物掺入到所述RCA产物中增加了所述RCA产物的整体疏水性。
17A.根据实施方案1A至16A中任一项所述的方法，其中所述将所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物掺入到所述RCA产物中促进了所述RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用。
18A.根据实施方案1A至17A中任一项所述的方法，其中：掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物不包含胺；和/或掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物不包含可检测标记，任选地其中所述可检测标记是荧光团。
19A.根据实施方案1A至18A中任一项所述的方法，包括在(c)中，使所述生物样品与能与所述RCA产物杂交的核酸探针接触，任选地其中所述核酸探针包含可检测标记，并且任选地其中所述可检测标记是荧光团。
20A.根据实施方案19A所述的方法，其中所述核酸探针是中间探针，并且所述方法包括使所述生物样品与能与所述中间探针杂交的可检测地标记的探针接触。
21A.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物的反应混合物接触，
(b)使用聚合酶对所述生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，
其中所述一个或多个核苷酸或核苷酸类似物包含：
(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，所述不可掺入的核苷酸或其类似物未被所述聚合酶掺入，和/或
(ii)可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，所述可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入，以及
(c)检测所述生物样品中一定位置处未经由核苷酸或核苷酸类似物交联的所述RCA产物。
22A.根据实施方案21A所述的方法，其中在(c)中，所述RCA产物未经由掺入到所述RCA产物中的核苷酸或核苷酸类似物来与所述RCA产物自身、所述生物样品中的另一分子或包埋所述生物样品的基质交联。
23A.根据实施方案21A或22A所述的方法，其中：掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个核苷酸或核苷酸类似物不包含胺；和/或掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个核苷酸或核苷酸类似物不包含可检测标记，任选地其中所述可检测标记是荧光团。
24A.根据实施方案21A至23A中任一项所述的方法，包括在(c)中，使所述生物样品与能与所述RCA产物杂交的核酸探针接触，任选地其中所述核酸探针包含可检测标记，并且任选地其中所述可检测标记是荧光团，任选地其中所述核酸探针是中间探针，并且所述方法包括使所述生物样品与能与所述中间探针杂交的可检测地标记的探针接触。
25A.根据实施方案21A至24A中任一项所述的方法，其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的参考反应混合物相比，所述反应混合物中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的存在降低了所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小，任选地其中所述参考反应混合物仅包含未经修饰的dATP、dTTP和/或dUTP、dCTP和dGTP。
26A.根据实施方案1A至25A中任一项所述的方法，包括在除以下之外的一个或多个核苷酸残基处使所述RCA产物与其自身或另一分子交联：(i)具有所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，和/或(ii)掺入到所述RCA产物中的所述可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述交联在检测所述RCA产物之前和/或之后进行。
27A.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组接触，其中所述环状探针或可环化探针或探针组包含与所述生物样品中的靶核酸杂交的杂交区，并且其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基在所述杂交区之外，
(b)使用聚合酶对所述环状探针或由所述可环化探针或探针组生成的环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了所述聚合酶在所述环状或环化探针上的聚合速率和/或所述RCA产物的大小，以及
(c)检测所述生物样品中一定位置处的所述RCA产物。
28A.根据实施方案27A所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含经修饰的脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA类似物残基和/或经修饰的核糖核苷酸(RNA)或RNA类似物残基。
29A.根据实施方案27A或28A所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基不包含胺和/或可检测标记，任选地其中所述可检测标记是荧光团。
30A.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与以下物质接触：(i)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的第一环状探针或可环化探针或探针组，其中所述第一环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第一靶核酸杂交，和(ii)第二环状探针或可环化探针或探针组，其中所述第二环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第二靶核酸杂交，
(b)使用聚合酶对所述第一环状探针或由所述第一可环化探针或探针组生成的第一环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第一RCA产物，以及
(c)使用聚合酶对所述第二环状探针或由所述第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第二RCA产物，
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述第一环状或环化探针中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小；和/或其中使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小小于使用所述第二环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小
1.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与能与所述生物样品中的靶核酸杂交的环状探针或可环化探针或探针组接触，其中所述环状探针或由所述可环化探针或探针组生成的环化探针包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，并且所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基位于与所述靶核酸杂交的区域之外，
(b)使用聚合酶对所述环状探针或所述环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述环状探针或环化探针中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了使用所述环状探针或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含糖修饰的核苷酸。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含C2‘修饰的核苷酸。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基具有C3‘内折叠构象。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含一个或多个经修饰的核糖核苷酸残基。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针不包含未经修饰的核糖核苷酸残基。
7.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针包含一个或多个未经修饰的核糖核苷酸残基。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基选自由以下项组成的组：2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)、锁定核酸(LNA)、2′-氟核糖核酸(2′-F RNA)以及它们的组合。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含2′-OMeRNA。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含经修饰的脱氧核糖核苷酸残基。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针主要由未经修饰的脱氧核糖核苷酸残基构成。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针包含不超过20％、不超过10％、不超过5％或不超过1％的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或未经修饰的核糖核苷酸残基。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针包含不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个连续的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基和/或未经修饰的核糖核苷酸残基。
14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含一个或多个三唑或硫醇基键，而不是磷酸二酯键。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述环状探针或环化探针在残基之间包含一个或多个硫逐磷酸酯键。
16.根据实施方案14或15所述的方法，其中所述环状探针或环化探针在残基之间包含一个或多个硫代磷酸酯键。
17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述生物样品与包含一个或多个硫醇键的可环化探针或探针组接触，并且所述一个或多个硫醇键不位于所述可环化探针或探针组的5‘或3‘末端。
18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针包含两个或更多个三唑键。
19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中所述环状探针或环化探针包含两个或更多个硫醇键。
20.根据实施方案18或19所述的方法，其中所述两个或更多个三唑键或所述两个或更多个硫醇键中的至少两者被少于100个核苷酸分开。
21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中所述环状探针或可环化探针或探针组是第一环状探针或可环化探针或探针组，所述环化探针是第一环化探针，并且所述靶核酸是第一靶核酸，并且所述方法还包括使所述生物样品与第二环状或可环化探针或探针组接触，其中所述第二环状或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第二靶核酸杂交，以及
使用聚合酶对所述第二环状探针或由所述第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第二RCA产物。
22.根据实施方案21所述的方法，其中所述第二环状探针或环化探针不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，或者其中所述第二环状探针或环化探针包含比所述第一环状探针或环化探针更少的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
23.根据实施方案21或22所述的方法，其中所述第二环状探针或环化探针包含与所述第一环状探针或环化探针不同的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
24.根据实施方案21至23中任一项所述的方法，其中使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率慢于使用所述第二环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述生物样品与包含一个或多个核苷酸或其类似物的反应混合物接触，其中所述一个或多个核苷酸或其类似物包含：
(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，所述不可掺入的核苷酸或其类似物被配置为与所述聚合酶短暂结合，但未被所述聚合酶掺入，和/或
(ii)可掺入的核苷酸或其类似物，所述可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入。
26.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个核苷酸或其类似物的反应混合物接触，以及
(b)使用聚合酶对所述生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，
其中所述一个或多个核苷酸或其类似物包含：
(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，所述不可掺入的核苷酸或其类似物与所述聚合酶短暂结合，但未被所述聚合酶掺入，和/或
(ii)可掺入的核苷酸或其类似物，所述可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入。
27.根据实施方案25或26所述的方法，其中所述一个或多个核苷酸或其类似物包含：不可掺入的核苷酸或其类似物，所述不可掺入的核苷酸或其类似物与所述聚合酶短暂结合，但未被所述聚合酶掺入；以及可掺入的核苷酸或其类似物，所述可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入。
28.根据实施方案25至27中任一项所述的方法，其中聚合期间所述聚合酶掺入所述可掺入的核苷酸或其类似物的平均开放时间比掺入对应天然存在的核苷三磷酸的平均开放时间更长。
29.根据实施方案28所述的方法，其中聚合期间所述聚合酶掺入所述可掺入的核苷酸的平均开放时间为掺入对应核苷三磷酸的平均开放时间的至少125％、150％、200％、225％或250％。
30.根据实施方案25至29中任一项所述的方法，其中所述可掺入的核苷酸或其类似物包含α-硫醇核苷酸、炔烃修饰的核苷酸或叠氮化物修饰的核苷酸。
31.根据实施方案25至30中任一项所述的方法，其中所述可掺入的核苷酸或其类似物包含二磷酸核苷酸。
32.根据实施方案30所述的方法，其中所述方法不包括使所述生物样品与脱氧核糖核苷三磷酸接触。
33.根据实施方案25至32中任一项所述的方法，其中所述反应混合物中不超过50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的所述核苷酸或其类似物是所述不可掺入的核苷酸或其类似物和/或所述可掺入的核苷酸或其类似物。
34.根据实施方案25至33中任一项所述的方法，其中所述不可掺入的核苷酸或其类似物包含一磷酸核苷酸。
35.根据实施方案25至34中任一项所述的方法，其中所述不可掺入的核苷酸或其类似物可从所述聚合酶解离。
36.根据实施方案25至35中任一项所述的方法，其中所述聚合酶在所述滚环扩增中的平均聚合速率与所述反应混合物中所述一个或多个可掺入或不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物的浓度成反比。
37.根据实施方案1至36中任一项所述的方法，其中所述聚合酶在所述滚环扩增中的平均聚合速率小于2280nt/min、小于2000nt/min、小于1500nt/min、小于1250nt/min、小于1000nt/min、小于750nt/min、小于500nt/min或小于250nt/min。
38.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与反应混合物接触，所述反应混合物包含具有疏水性修饰的一个或多个核苷酸类似物，以及
(b)使用聚合酶对所述生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了所述一个或多个核苷酸类似物的RCA产物，
其中包含所述一个或多个核苷酸类似物的所述RCA产物小于不包含所述一个或多个核苷酸类似物的参考RCA产物。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述疏水性修饰是碱基修饰。
40.根据实施方案38或39所述的方法，其中所述疏水性修饰包括碳链和/或烃环。
41.根据实施方案38至40中任一项所述的方法，其中所述疏水性修饰包括三键。
42.根据实施方案38至41中任一项所述的方法，其中所述疏水性修饰包括乙烯基或乙炔基基团。
43.根据实施方案38至42中任一项所述的方法，其中包含所述疏水性修饰的所述核苷酸类似物是乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP。
44.根据实施方案38至43中任一项所述的方法，其中包含所述疏水性修饰的所述核苷酸类似物是5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。
45.根据实施方案38至44中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个核苷酸类似物生成的所述RCA产物的直径小于在所述反应混合物中不包含所述一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同环状核酸模板产生的参考RCA产物。
46.根据实施方案38至45中任一项所述的方法，其中将包含所述疏水性修饰的所述核苷酸类似物以至少1μM、至少1.25μM、至少2.5μM、至少5μM、至少10μM、至少40μM、至少80μM或至少100μM的浓度添加到所述样品中。
47.根据实施方案38至46中任一项所述的方法，其中所述核苷酸类似物是经修饰的dUTP，并且所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约1:99之间，任选地其中所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与所述未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约40:60之间。
48.根据实施方案38至47中任一项所述的方法，其中将包含所述疏水性修饰的所述核苷酸类似物以约50μM至约100μM的浓度添加到所述样品中，任选地其中将包含所述疏水性修饰的所述核苷酸类似物以约80μM至约100μM的浓度添加到所述样品中。
49.根据实施方案38至48中任一项所述的方法，其中已掺入了所述一个或多个核苷酸类似物的所述RCA产物的中值直径小于在所述反应混合物中不包含所述一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同环状核酸模板生成的参考RCA产物的中值直径。
50.根据实施方案38至49中任一项所述的方法，其中掺入了所述一个或多个核苷酸类似物的所述RCA产物的中值直径小于500nm。
51.根据实施方案38至50中任一项所述的方法，其中掺入了所述一个或多个核苷酸类似物的所述RCA产物的中值直径是在所述反应混合物中不包含所述一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同环状核酸模板生成的参考RCA产物的中值直径的不超过90％或不超过80％。
52.根据实施方案38至51中任一项所述的方法，其中掺入了所述一个或多个核苷酸类似物的所述RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度与在所述反应混合物中不包含所述一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同环状核酸模板生成的参考RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异，任选地其中在所述反应混合物中不包含所述一个或多个核苷酸类似物的情况下使用相同环状核酸模板生成所述参考RCA产物，并且任选地其中所述RCA产物中的核苷酸和核苷酸类似物的总数不小于所述参考RCA产物中的核苷酸的总数。
53.根据实施方案38至52中任一项所述的方法，其中所述将所述一个或多个核苷酸类似物掺入到所述RCA产物中增加了所述RCA产物的整体疏水性。
54.根据实施方案38至52中任一项所述的方法，其中所述将所述一个或多个核苷酸类似物掺入到所述RCA产物中促进了所述RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用。
55.根据实施方案1A至54中任一项所述的方法，其中所述滚环扩增在18℃和30℃之间的温度下进行。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述滚环扩增在30℃下进行。
57.根据实施方案1A至56中任一项所述的方法，其中使用线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合生成所述RCA产物。
58.根据实施方案1A至57中任一项所述的方法，其中所述RCA产物使用选自以下的聚合酶生成：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(外切-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶以及任何前述的变体或衍生物。
59.根据实施方案1A至58中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶。
60.根据实施方案1A至59中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
61.根据实施方案1A至60中任一项所述的方法，其中所述RCA产物在所述生物样品中或在包埋所述生物样品或其分子的基质中原位生成。
62.根据实施方案1A至61中任一项所述的方法，其中所述RCA产物与在所述生物样品中和/或在包埋所述生物样品或其分子的基质中的一个或多个其他分子交联。
63.根据实施方案1A至62中任一项所述的方法，包括在所述生物样品中或在包埋所述生物样品或其分子的基质中原位检测所述RCA产物。
64.根据实施方案63所述的方法，其中检测所述RCA产物包括使所述生物样品与一个或多个可检测地标记的探针接触，所述一个或多个可检测地标记的探针直接或间接与所述RCA产物所包含的一个或多个条形码序列杂交。
65.根据实施方案1A至64中任一项所述的方法，其中与所述RCA产物相关联的信号在所述生物样品中或在包埋所述生物样品或其分子的基质中原位放大。
66.根据实施方案65所述的方法，其中所述信号放大包括直接或间接与所述滚环扩增(RCA)产物结合的探针的RCA；直接或间接在所述RCA产物上的杂交链反应(HCR)；直接或间接在所述RCA产物上的线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)；直接或间接在所述RCA产物上的引物交换反应(PER)；直接或间接在所述RCA产物上组装分支结构；直接或间接在所述RCA产物上杂交多个可检测探针，或它们的任何组合。
67.根据实施方案1A至66中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过热变性和/或通过使所述生物样品与聚合酶抑制剂接触来终止所述滚环扩增。
68.根据实施方案67所述的方法，其中终止所述滚环扩增包括使所述生物样品与聚合酶抑制剂接触，所述聚合酶抑制剂选自由焦磷酸类似物、所述聚合酶的变构抑制剂、与所述聚合酶结合的非催化离子和链终止核苷酸组成的组。
69.根据实施方案26至68中任一项所述的方法，其中所述环状核酸模板是环状探针或由可环化探针或探针组生成的环化探针，其中所述环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的靶核酸杂交。
70.根据实施方案1A至69中任一项所述的方法，其中使用所述靶核酸作为连接模板由所述可环化探针或探针组生成所述环化探针。
71.根据实施方案1A至70中任一项所述的方法，其中所述可环化探针组包含两个、三个或更多个探针。
72.根据实施方案1A至71中任一项所述的方法，其中使用酶促连接和/或化学连接来生成所述环化探针。
73.根据实施方案1A至72中任一项所述的方法，其中使用模板依赖性连接和/或非模板依赖性连接来生成所述环化探针。
74.根据实施方案1A至73中任一项所述的方法，其中使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶来生成所述环化探针。
75.根据实施方案1A至74中任一项所述的方法，其中使用选自由小球藻病毒DNA连接酶(也称为PBCV-1DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶组成的组的连接酶来生成所述环化探针。
76.根据实施方案1A至75中任一项所述的方法，其中使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(也称为T4Rnl2)或其变体或衍生物来生成所述环化探针。
77.根据实施方案1A至76中任一项所述的方法，其中所述RCA产物包含一个或多个条形码序列或其互补序列。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述一个或多个条形码序列或其互补序列对应于所述靶核酸或其一部分。
79.根据实施方案1A至78中任一项所述的方法，其中所述RCA产物包含约10个与约100个之间、约100个与约1,000个之间、约1,000个与约5,000个之间、约5,000个与约10,000个之间或超过10,000个拷贝的所述环状核酸模板或所述环状或环化探针。
80.根据实施方案1A至79中任一项所述的方法，其中所述RCA产物是纳米球的形式，所述纳米球的直径在约0.1μm与约3μm之间，任选地其中所述直径在约0.1μm与约0.5μm之间、在约0.5μm与约1μm之间、在约0.8μm与约1.3μm之间或在约1μm与约1.5μm之间。
81.根据实施方案1A至80中任一项所述的方法，其中所述RCA产物的长度在约1千碱基与约15千碱基之间、在约15千碱基与约25千碱基之间、在约25千碱基与约35千碱基之间、在约35千碱基与约45千碱基之间、在约45千碱基与约55千碱基之间、在约55千碱基与约65千碱基之间、在约65千碱基与约75千碱基之间或超过75千碱基。
82.根据实施方案1A至81中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包含DNA和/或RNA，任选地其中所述靶核酸是基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA或直接或间接与所述生物样品中的分析物结合的标记剂的报告寡核苷酸。
83.根据实施方案1A至82中任一项所述的方法，还包括使所述RCA产物与其自身交联、与所述生物样品中的一个或多个其他分子交联和/或与包埋所述生物样品或其分子的基质交联，任选地其中所述交联降低了所述RCA产物在所述生物样品中和/或所述基质中的迁移率。
84.根据实施方案1A至83中任一项所述的方法，其中所述生物样品是固定的和/或透化的生物样品。
85.根据实施方案1A至84中任一项所述的方法，其中所述生物样品是非均质化的组织样品或组织切片。
86.根据实施方案1A至85中任一项所述的方法，其中所述生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品、冷冻组织样品或新鲜组织样品。
87.根据实施方案1A至86中任一项所述的方法，其中所述生物样品是厚度在约1μm与约50μm之间的组织切片，任选地其中所述组织切片的厚度在约5μm与约35μm之间。
88.根据实施方案1A至87中任一项所述的方法，其中所述生物样品是交联的。
89.根据实施方案1A至88中任一项所述的方法，其中所述生物样品包埋在基质中，任选地其中所述基质是水凝胶。
90.根据实施方案1A至89中任一项所述的方法，其中所述生物样品是透明化的。
91.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与以下物质接触：(i)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的第一环状探针或可环化探针或探针组，其中所述第一环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第一靶核酸杂交，和(ii)第二环状探针或可环化探针或探针组，其中所述第二环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第二靶核酸杂交，以及
(b)使用聚合酶对所述第一环状探针或由所述第一可环化探针或探针组生成的第一环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第一RCA产物，以及
使用聚合酶对所述第二环状探针或由所述第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第二RCA产物，
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述第一环状或环化探针中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率，和/或
其中使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率慢于使用所述第二环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率。
92.根据实施方案91所述的方法，其中所述第二环状或环化探针不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
93.根据实施方案91所述的方法，其中所述第二环状或环化探针包含比所述第一环状或环化探针更少的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
94.根据实施方案91至93中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸在所述生物样品中比所述第二靶核酸更丰富。
95.一种用于进行滚环扩增的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组，其中所述环状探针或可环化探针或探针组包含与靶核酸的靶序列互补的靶杂交区；以及
(b)聚合酶；
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基降低了所述聚合酶使用所述环状探针或由所述可环化探针或探针组生成的环化探针作为模板在滚环扩增反应中的聚合速率。
96.根据实施方案95所述的试剂盒，还包含用于由所述可环化探针或探针组生成所述环化探针的连接酶。
97.根据实施方案95或96所述的试剂盒，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含修饰了糖的核苷酸残基和/或骨架修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。
98.根据实施方案95至97中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基选自由以下项组成的组：2′-O-甲基核糖核酸(2′-OMeRNA)、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-氟核糖核酸(2′-FRNA)、硫逐磷酸酯骨架核苷酸、硫代磷酸酯骨架核苷酸、三唑修饰的核苷酸以及它们的组合。
99.根据实施方案95至98中任一项所述的试剂盒，还包含：
一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物，所述一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物被配置为与所述聚合酶短暂结合，但未被所述聚合酶掺入，和/或
一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物，所述一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入。
100.一种用于进行滚环扩增(RCA)的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)聚合酶；
(b)一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物，所述一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物被配置为与所述聚合酶短暂结合，但未被所述聚合酶掺入，和/或
一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物，所述一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入；以及
(c)用作RCA模板的一个或多个环状探针、用于生成用作RCA模板的环化探针的一个或多个可环化探针或探针组、和/或用于生成RCA环化模板的一种或多种试剂。
101.根据实施方案99或100所述的试剂盒，其中所述一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物和/或一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物包含α-硫醇核苷酸、炔烃修饰的核苷酸、叠氮化物修饰的核苷酸、二磷酸核苷酸和/或一磷酸核苷酸。
102.根据实施方案95至101中任一项所述的试剂盒，还包含未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。
103.根据实施方案100至102中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个不可掺入的核苷酸或其类似物、所述一个或多个可掺入的核苷酸或其类似物和/或所述未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的任何组合被反应混合物所包含。
104.一种用于进行滚环扩增的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)聚合酶；
(b)包含一个或多个疏水性修饰并被配置为被所述聚合酶掺入的一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物；以及
(c)用作滚环扩增(RCA)模板的一个或多个环状探针、用于生成用作RCA模板的环化探针的一个或多个可环化探针或探针组、和/或用于生成滚环扩增环化模板的一种或多种试剂。
105.根据实施方案104所述的试剂盒，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含经修饰的dUTP，其中每个经修饰的dUTP独立地选自乙炔基-dUTP和乙烯基dUTP。
106.根据实施方案104或105所述的试剂盒，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物在包含所述一个或多个核苷酸类似物和未经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的反应混合物中提供。
107.根据实施方案105或106所述的试剂盒，其中所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与未经修饰的dTTP的比率为至少约80:20。
应当理解，所描述的方法和系统的所有组合都被视为本文公开的发明主题的一部分。具体地，出现在本公开中的要求保护的主题的所有组合都被视为本文公开的发明主题的一部分。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例1：使用包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的探针进行原位分析，以降低滚环扩增的速率
该实施例公开了使用滚环扩增(RCA)进行原位靶核酸检测的示例性方法。在一些方面，可以通过降低原位RCA的聚合速率来实现改进的靶检测和/或图像分析。在一些实例中，本文公开的方法促进了提供具有较小强度和/或较小大小的RCA产物。
在一些实例中，可以通过使用包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组来实现降低RCA(例如，在细胞或组织样品中原位进行的RCA)的聚合速率。
使生物样品(例如，经处理或透明化的生物样品、组织样品、包埋在水凝胶中的样品等)与环状探针或可环化探针或探针组(例如，挂锁探针、SNAIL探针、RollFISH探针、PLAYR探针等)接触。在单独的实验条件下，可环化探针或探针组(a)不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基(例如，如图1B所示)，(b)包含一个或多个2‘-OMeRNA核苷酸残基(例如，如图1A和图1C所示，将2‘-OMeRNA的结构与未经修饰的核苷酸残基进行比较)，或(c)包含一个或多个三唑基键(例如，如图1D所示)。在一些实例中，可环化探针或探针组包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的任何组合。经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基能够作为RCA的模板，但导致聚合速率降低。在单独展示RCA探针的不同聚合速率的实例中，除了经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基之外，(a)、(b)和(c)中的可环化探针或探针组的核苷酸序列可以是相同的。
在相同的扩增条件下对每个探针设计进行RCA反应。使可环化探针与生物样品中的靶核酸序列(诸如mRNA或cDNA)杂交，并连接以生成环化探针。使RCA引物与连接的(环化的)探针杂交，并将RCA反应混合物(含有Phi29反应缓冲液、dNTP和Phi29聚合酶)添加到样品中。将样品在温育温度(例如，30℃或37℃)下温育一段限定的时间(例如，3小时)，使闭环用作RCA的模板，并通过DNA聚合酶扩增以生成RCA产物。通过用TE缓冲液洗涤样品来终止RCA反应。
使每种条件下的RCA产物与荧光团标记的(例如Cy5标记的)可检测探针在室温下杂交，并成像以评估RCA产物的大小。成像前，用Gold Antifade Mounting介质处理组织样品，以优化光路并延长样品完整性。使用Orca Fusion相机以40x放大倍率进行成像。
与探针不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的条件相比，在探针包含2‘-OMeRNA核苷酸残基或三唑基键的条件下RCA产物预计大小会减小(例如，具有较小的平均直径)。
在另一个实例中，可以使生物样品与多个可环化探针接触，其中每个可环化探针与样品中的靶核酸杂交。在一个实例中，第一靶核酸(mRNA 1)在样品中高度丰富(例如，以高密度存在)，而第二靶核酸(mRNA 2)在样品中不太丰富(例如，以低密度存在)。可以使样品与以下探针接触：包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基(例如，包含一个或多个2‘-OMeRNA和/或三唑键)并与mRNA 1所包含的靶序列杂交的第一可环化探针，以及不包含经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基并与mRNA 2所包含的靶序列杂交的第二可环化探针。可以连接可环化探针，并且可以如上所述的那样进行RCA以在样品中生成第一RCA产物和第二RCA产物。第一环化探针上的聚合速率小于第二环化探针上的聚合速率，从而产生相对于第二RCA产物更小的第一RCA产物(例如，如图1A和图1B示意性地描绘)。
实施例2：反应混合物中的核苷酸或其类似物用于降低滚环扩增速率的用途
该实施例公开了使用滚环扩增(RCA)改进原位靶检测和图像分析的示例性方法。可以通过降低原位RCA的聚合速率来实现改进的靶检测和图像分析，从而提供具有更小强度和大小的RCA产物。可以通过在反应中包含一个或多个核苷酸或其类似物来实现降低原位RCA的聚合速率，该一个或多个核苷酸或其类似物包含(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，该不可掺入的核苷酸或其类似物与聚合酶短暂结合，但未被聚合酶掺入，和/或(ii)可掺入的核苷酸或其类似物，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。
该实施例提供了使用RCA分析生物样品的示例性方法。具体地，该实施例提供了一种用于在RCA反应混合物中包含核苷酸或其类似物以降低聚合速率并因此减小所得RCA产物的大小的示例性方法。
在一些实例中，使生物样品(例如，经处理或透明化的生物样品、组织样品、包埋在水凝胶中的样品等)与环状探针或可环化探针或探针组(例如，挂锁探针)接触。例如，使可环化探针与生物样品中的靶核酸序列(诸如mRNA或cDNA)杂交，并连接以由可环化探针生成环化探针。使RCA引物与环化探针杂交。在一些实例中，环状探针或可环化探针或探针组不包含任何经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基。在其他实例中，可以使用环状或可环化探针或探针组，其包含降低聚合酶在模板上的聚合速率的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基(例如，如实施例1中所述)。
在其他实例中，RCA的环状模板可以是环化cDNA分子(例如，使用CircLigaseTM生成，CircLigaseTM是一种热稳定的ATP依赖性连接酶，其催化具有5′-磷酸和3′-羟基基团的ssDNA模板的分子内连接(例如，环化))。可以类似地使RCA引物与环化cDNA分子杂交。
将含有Phi29反应缓冲液、Phi29聚合酶和未经修饰的dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的RCA反应混合物添加到样品中。在单独的实验条件下，反应混合物还包含(a)没有额外的核苷酸或其类似物，(b)α-硫醇核苷酸，(c)二磷酸核苷酸，或(d)一磷酸核苷酸。在其他实例中，反应混合物可以包含α-硫醇核苷酸、二磷酸核苷酸和/或一磷酸核苷酸的任何组合。
将样品在温育温度(例如，30℃或37℃)下温育一段限定的时间(例如，3小时)，使环化探针用作RCA的模板，并通过DNA聚合酶扩增以生成RCA产物。通过用TE缓冲液洗涤样品来终止RCA反应。
使每种条件下的RCA产物与荧光团标记的(例如Cy5标记的)可检测探针在室温下杂交，并成像以评估RCA产物的大小。成像前，可以用Gold Antifade Mounting介质处理组织样品，以优化光路并延长样品完整性。可以使用Orca Fusion相机以40x放大倍率进行成像，每个截面具有4×4视野(FOV)。
与仅包含未经修饰的dNTP的条件相比，在反应混合物中包含α-硫醇核苷酸、二磷酸核苷酸或一磷酸核苷酸的条件下，RCA产物的大小预计会减小。
实施例3：反应混合物中经修饰的核苷酸用于降低原位滚环扩增的速率的用途
上面的实施例2描述了使用各种可掺入的核苷酸或其类似物降低滚环扩增(RCA)速率的示例性方法，这些可掺入的核苷酸或其类似物以比对应的未经修饰的核苷三磷酸更慢的速率被聚合酶掺入。该实施例展示了使用滚环扩增(RCA)分析生物样品的方法，其中在RCA反应混合物中包含示例性可掺入的核苷酸5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP以降低聚合速率。聚合速率的降低导致RCA产物的大小和强度更小。
通过福尔马林固定和透化，制备新鲜/冷冻小鼠脑的切片用于原位分析。
将靶向基因Prox1和Satb2的挂锁探针添加到样品中，并使其在37℃下杂交过夜。探针杂交后，在甲酰胺和SSC中洗涤样品以去除未结合的探针。对于挂锁探针连接，将样品与1.25U/μL SplintR连接酶在SplintR连接酶缓冲液中于37℃下一起温育2小时。将滚环扩增(RCA)的引物添加样品中，并使其与环化挂锁探针在30℃下杂交30分钟。
向每个样品中添加含有Phi29聚合酶、Phi29反应缓冲液和dNTP的RCA反应混合物。在单独的条件下，允许RCA进行2小时或4小时。对照条件仅包括未经修饰的dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，并且实验条件包括经修饰的dNTP 5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP。对于实验条件，每个经修饰的核苷酸取代了75％未经修饰的对应核苷酸(100％的dATP核苷酸未被修饰，100％的dGTP核苷酸未被修饰，25％的dCTP核苷酸是未经修饰的dCTP且75％为5-叠氮基-PEG4-dCTP，并且25％的dTTP核苷酸未被修饰且75％为5-乙炔基-dUTP)。
如下表1所示的那样设置实验条件。
表1
条件 RCA时间 存在经修饰的dNTP
1 2小时 否
2 2小时 是(75％)
3 4小时 否
4 4小时 是(75％)
终止RCA反应，并且使对应于Prox1或Satb2的中间探针(例如，L形探针)与对应RCA产物(RCP)杂交。每个中间探针包含与对应RCA产物的靶序列杂交的区域以及用于结合荧光标记的探针(例如，检测寡核苷酸，DO)的突出端。然后使荧光标记的探针与中间探针杂交。通过荧光显微术对样品进行成像，以评估与齿状回和皮质中RCP相关联的可检测信号的密度、大小和强度。
如图3所示，RCP的密度没有因存在经修饰的dNTP而受到显著影响。然而，如图4所示，在RCA反应中存在经修饰的核苷酸的条件下，无论是2小时还是4小时条件，RCP大小都减小了。如图5所示，在RCA反应中存在经修饰的核苷酸的条件下，无论是2小时还是4小时条件，RCP强度都减小了。
结果表明，包含经修饰的dNTP可以降低RCA速率，导致RCP的大小和/或与RCP相关联的可检测信号的大小和强度减小。
实施例4：定量RCA表明使用经修饰的核苷酸降低了聚合速率
上面的实施例3表明，使用经修饰的可掺入的核苷酸进行原位RCA可以降低所得RCA产物的大小和/或强度。该实施例提供了定量RCA结果，表明在RCA反应混合物中包含经修饰的dNTP 5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP的反应混合物中聚合速率降低，从而降低了聚合速率。
进行定量RCA(qRCA)以确定特定经修饰的dNTP对RCA速率的影响。反应包括Phi29聚合酶、Phi29反应缓冲液、环状RCA模板寡核苷酸、RCA引物以及包含0％、50％或100％经修饰的核苷酸的dNTP，如表2所示。作为一个实例，50％5-叠氮基-PEG4-dCTP指示：50％的dCTP核苷酸是未经修饰的dCTP，并且50％是5-叠氮基-PEG4-dCTP。阴性对照包括没有环状寡核苷酸、没有dNTP或没有Phi29聚合酶的条件。反应还包括SYBR Gold，以促进聚合速率的定量。将反应在37℃下温育，并且每30秒成像一次，持续1小时。
表2.
如图6B所示，包含单独或组合的5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP，以浓度依赖性方式降低了RCA速率。对RCA速率的作用是累加的，其中对于掺入5-叠氮基-PEG4-dCTP和5-乙炔基-dUTP两者的反应，观察到RCA速率的最大降低(图6B，左图)。与5-乙炔基-dUTP(图6B，右图)相比，5-叠氮基-PEG4-dCTP(图6B，中图)对单独经修饰的核苷酸具有更强的作用。由于5-叠氮基-PEG4-dCTP是两种修饰中体积较大的一种(图6A)，这些结果表明聚合速率的降低可能与碱基修饰的大小有关。
上述结果表明，经修饰的dNTP或其类似物可以以浓度和修饰依赖性方式降低RCA反应的速率。因此，结果支持使用可掺入的核苷酸或其类似物来控制RCA反应的速率，该可掺入的核苷酸或其类似物被配置为以比dNTP(例如，dATP、dTTP/dUTP、dCTP或dGTP)更慢的速率被聚合酶掺入。
实施例5：反应混合物中经修饰的核苷酸用于原位减小RCA产物大小的用途
该实施例公开了使用滚环扩增(RCA)改进原位靶检测和图像分析的示例性方法。可以通过减小RCA产物的大小来实现改进的靶检测和图像分析。可以通过在反应中包含一个或多个核苷酸或其类似物(例如包含疏水性修饰的核苷酸或其类似物，诸如5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)和/或5-乙烯基-dUTP)来实现减小RCA产物的大小。
上面的实施例描述了用于降低RCA速率的示例性方法。该实施例提供了一种使用RCA分析生物样品的示例性方法，其中在RCA反应混合物中包含添加了疏水基团的示例性核苷酸(5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)或5-乙烯基-dUTP)，以促进RCA产物的压缩。包含经修饰的核苷酸导致RCA产物的大小更小。
通过福尔马林固定和透化，制备新鲜/冷冻小鼠脑的切片用于原位分析。将靶向基因Prox1和Satb2的挂锁探针添加到样品中，并使其在37℃下杂交过夜。探针杂交后，在甲酰胺和SSC中洗涤样品以去除未结合的探针。对于挂锁探针连接，将样品与SplintR连接酶和RNA酶抑制剂在连接酶缓冲液中于37℃下一起温育2小时。将滚环扩增(RCA)的引物添加样品中，并使其与环化挂锁探针在37℃下杂交30分钟。
将含有Phi29聚合酶和100μM dNTP的RCA反应混合物添加到每个样品中(100μMdATP、100μM dCTP、100μM dGTP以及100μM组合的dTTP和经修饰的dUTP)。将经修饰的dUTP5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)或5-乙烯基-dUTP以下列浓度添加到反应混合物中：0μM(对照)、1μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM或100μM，其中经修饰的dUTP替换了反应混合物中未经修饰的dTTP，使经修饰的dUTP和dTTP的组合总浓度达到100μM。图7中显示了5-EdUTP和5-乙烯基-dUTP的结构式(其中疏水性修饰用虚线圆圈显示)。
允许RCA在37℃下进行2小时。终止RCA反应，并且使对应于Prox1或Satb2的中间探针与对应RCA产物(RCP)杂交。每个中间探针包含与对应RCA产物的靶序列杂交的区域以及用于结合荧光标记的探针的突出端。然后使荧光标记的(Cy3)探针与中间探针杂交。通过荧光显微术对样品进行成像，以评估与RCP相关联的可检测信号的密度、大小和强度。
如图8A所示，RCP的密度没有因存在经修饰的dNTP而受到显著影响。高于局部背景的信号强度(图8B)、局部信噪比(图8C)和信号背景比(图8D)也没有因存在经修饰的dNTP而受到影响。
如图9A至图9B所示，在包含5-EdUTP或5-乙烯基-dUTP时，RCP大小的分布(例如，通过直径测量)减小，其中在包含80μM 5-EdUTP时，RCP大小显著减小。如图10A至图10B所示，对于不同组的浓度，在包含5-EdUTP或5-乙烯基-dUTP时，RCP大小的分布减小，其中在包含100μM 5-EdUTP时，RCP大小分布显著减小。
结果表明，包含具有疏水性修饰的核苷酸类似物可以减小RCP大小和/或与RCP相关联的可检测信号的大小。
本公开的范围并非旨在限于所公开的特定实施方案，这些实施方案是例如为了举例说明本公开的各方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的这些组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和实质的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

Claims (30)

1.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的反应混合物接触，所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含具有疏水性修饰的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，
(b)使用聚合酶对所述生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成掺入了所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的RCA产物，其中所述RCA产物未经由掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物来与另一分子交联，以及
(c)检测所述生物样品中一定位置处未经由所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物交联的所述RCA产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水性修饰是碱基修饰。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述疏水性修饰包括碳链和/或烃环。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述疏水性修饰包括三键。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述疏水性修饰包括乙烯基或乙炔基基团。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是乙炔基-dUTP或乙烯基-dUTP。
7.根据权利要求6所述的方法，其中包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是5-乙炔基-dUTP或5-乙烯基-dUTP。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的所述RCA产物的直径小于在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以至少1μM、至少1.25μM、至少2.5μM、至少5μM、至少10μM、至少40μM、至少80μM或至少100μM的浓度添加到所述生物样品中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是经修饰的dUTP，并且所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约1:99之间，任选地其中所述反应混合物中所述经修饰的dUTP与所述未经修饰的dUTP或dTTP的比率在约80:20与约40:60之间。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以约50μM至约100μM的浓度添加到所述生物样品中，任选地其中将包含所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物以约80μM至约100μM的浓度添加到所述生物样品中。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径小于500nm。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物生成的RCA产物的中值直径是在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的中值直径的不超过90％或不超过80％。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中掺入了所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度与在所述反应混合物中不包含所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的情况下使用相同模板产生的参考RCA产物的平均强度、平均信噪比和/或密度没有显著差异。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述将所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物掺入到所述RCA产物中增加了所述RCA产物的整体疏水性。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述将所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物掺入到所述RCA产物中促进了所述RCA产物中的核苷酸之间的碱基堆积相互作用。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中：
掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物不包含胺；和/或
掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物不包含可检测标记，任选地其中所述可检测标记是荧光团。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，包括在(c)中，使所述生物样品与能与所述RCA产物杂交的核酸探针接触，任选地其中所述核酸探针包含可检测标记，并且任选地其中所述可检测标记是荧光团。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述核酸探针是中间探针，并且所述方法包括使所述生物样品与能与所述中间探针杂交的可检测地标记的探针接触。
21.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物的反应混合物接触，
(b)使用聚合酶对所述生物样品中的环状核酸模板进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，
其中所述一个或多个核苷酸或核苷酸类似物包含：
(i)不可掺入的核苷酸或其类似物，所述不可掺入的核苷酸或其类似物未被所述聚合酶掺入，和/或
(ii)可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，所述可掺入的核苷酸或核苷酸类似物被配置为以比对应核苷三磷酸更慢的速率被所述聚合酶掺入，以及
(c)检测所述生物样品中一定位置处未经由核苷酸或核苷酸类似物交联的所述RCA产物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在(c)中，所述RCA产物未经由掺入到所述RCA产物中的核苷酸或核苷酸类似物来与所述RCA产物自身、所述生物样品中的另一分子或包埋所述生物样品的基质交联。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中：
掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个核苷酸或核苷酸类似物不包含胺；和/或
掺入到所述RCA产物中的所述一个或多个核苷酸或核苷酸类似物不包含可检测标记，任选地其中所述可检测标记是荧光团。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，包括在(c)中，使所述生物样品与能与所述RCA产物杂交的核酸探针接触，任选地其中所述核酸探针包含可检测标记，并且任选地其中所述可检测标记是荧光团，
任选地其中所述核酸探针是中间探针，并且所述方法包括使所述生物样品与能与所述中间探针杂交的可检测地标记的探针接触。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中与没有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的参考反应混合物相比，所述反应混合物中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物的存在降低了所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小，任选地其中所述参考反应混合物仅包含未经修饰的dATP、dTTP和/或dUTP、dCTP和dGTP。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，包括在除以下之外的一个或多个核苷酸残基处使所述RCA产物与其自身或另一分子交联：(i)具有所述疏水性修饰的所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基，和/或(ii)掺入到所述RCA产物中的所述可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述交联在检测所述RCA产物之前和/或之后进行。
27.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的环状探针或可环化探针或探针组接触，其中所述环状探针或可环化探针或探针组包含与所述生物样品中的靶核酸杂交的杂交区，并且其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基在所述杂交区之外，
(b)使用聚合酶对所述环状探针或由所述可环化探针或探针组生成的环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成RCA产物，
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了所述聚合酶在所述环状或环化探针上的聚合速率和/或所述RCA产物的大小，以及
(c)检测所述生物样品中一定位置处的所述RCA产物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基包含经修饰的脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA类似物残基和/或经修饰的核糖核苷酸(RNA)或RNA类似物残基。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基不包含胺和/或可检测标记，任选地其中所述可检测标记是荧光团。
30.一种用于分析生物样品的方法，包括：
(a)使所述生物样品与以下物质接触：(i)包含一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的第一环状探针或可环化探针或探针组，其中所述第一环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第一靶核酸杂交，和(ii)第二环状探针或可环化探针或探针组，其中所述第二环状探针或可环化探针或探针组与所述生物样品中的第二靶核酸杂交，
(b)使用聚合酶对所述第一环状探针或由所述第一可环化探针或探针组生成的第一环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第一RCA产物，以及
(c)使用聚合酶对所述第二环状探针或由所述第二可环化探针或探针组生成的第二环化探针进行滚环扩增(RCA)，从而生成第二RCA产物，
其中与没有所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的参考环状模板相比，所述第一环状或环化探针中所述一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物残基的存在降低了使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小；和/或其中使用所述第一环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小小于使用所述第二环状或环化探针作为模板的所述聚合酶的聚合速率和/或所述RCA产物的大小。
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