CN118326035A - 一种血浆外泌体pir-56497的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种血浆外泌体pir‑56497的检测方法及其应用，提供了检测外周血血浆外泌体中的piRNA的方法及其应用。所述检测方法包括血浆外泌体分离和鉴定、外泌体RNA提取、外泌体piRNA的qPCR定量检测。其中，所述外泌体piRNA为pir‑56497。通过对血浆外泌体pir‑56497的检测，可有效判断某些疾病的患病风险。该方法准确可靠，应用前景广阔。

Description

一种血浆外泌体pir-56497的检测方法及其应用

技术领域

本申请属于生物医学技术领域，尤其涉及一种检测血浆外泌体piR-56497的方法及其应用。

背景技术

外泌体(Exosomes)来源于晚期核内体，是哺乳动物细胞释放的细胞外囊泡(EV)的三个主要亚组(外泌体，微囊泡和凋亡小泡)之一，直径在50～150nm之间。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，且广泛分布于血清、血浆、尿液、腹水和细胞上清等样品中。外泌体内包含蛋白质、RNA和脂类，可参与调控重要的细胞生理活动，在免疫应答、凋亡、血管生成和炎症反应等过程中均有报道，被认为将可能成为多种疾病的潜在治疗靶点、早期诊断标记物和靶向药物载体。

外泌体内包含多种非编码小RNA，主要包含miRNA、piRNA、tsRNA和snoRNA等小RNA分子。它们参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等重要生物学过程，是生命活动中不可少的调控因子。

piRNA(Piwi-interacting RNA)是与Piwi(P-element Induced Wimpy Testis)蛋白家族成员相互作用的一类非编码小RNA，长度为24–31nt，通过PIWI–piRNA复合物起作用，主要功能是调节表观遗传和转录后水平的基因表达。piRNA通过DNA甲基化使表观遗传上的转座因子沉默，从而保护基因组的完整性。研究表明，piRNA和PIWI蛋白在多种癌症中异常表达，是肿瘤诊断和治疗的潜在新型生物标志物和治疗靶标之一。

piRNA被认为通过在转录或转录后水平上调节关键的信号通路而参与肿瘤的发病机制。研究表明，PIWI蛋白在乳腺癌中异常表达，比如PIWIL4在TNBC肿瘤和细胞系中高表达，并与远处转移相关。有研究发现，乳腺癌中piRNA-36712的水平显著低于正常乳腺组织，并且低水平的piRNA-36712与患者不良的临床预后相关。piRNA-36712与SEPW1P(一种SEPW1的反加工假基因)结合，随后通过SEPW1 mRNA与SEPW1P RNA竞争microRNA-7和microRNA-324抑制SEPW1表达，进而抑制细胞增殖，侵袭和迁移。另有研究研究发现，piR-021285通过DNA甲基化调节细胞增殖和侵袭，进而参与乳腺癌的发生。在另一项研究中，有大于100种piRNA在正常乳腺组织和肿瘤中差异表达，其中最关键的8个piRNA的靶mRNA编码的蛋白质参与了乳腺癌的关键细胞过程，包括细胞间信号传导和相互作用，细胞死亡和存活，细胞周期，DNA复制和修复等。

我们利用乳腺癌筛查人群样品测序发现，piR-56497的表达水平在组间有显著差异。提示piR-56497在乳腺癌的风险评估或早诊早治中有潜在的应用价值。piR-56497的检测技术在国内外均没有公开的借鉴。本发明提供了一种检测piR-56497的方法，可以很好地解决piR-56497在疾病中的应用问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测外泌体piR-56497的方法及其应用，旨在解决现有技术中尚未有检测外泌体piR-56497的方法及其应用的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面：外泌体pir-56497在乳腺癌人群的风险评估中的应用，所述外泌体pir-56497的基因序列(5’-3’)为：TGGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGATGGT(如SEQ ID NO.1所示)。

通过对外泌体piR-56497定量PCR检测在乳腺癌阳性人群和阴性人群筛查或风险评估中的应用。

第二方面：一种外泌体pir-56497的检测方法：

提取生物样本中的外泌体，采用qRT-PCR方法检测piR-56497的相对定量，参考基因为cel-miR-39-3p；

所述外泌体pir-56497的基因序列(5’-3’)为：

TGGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGATGGT(如SEQ ID NO.1所示)；

piR-56497的逆转录引物序列(5’-3’)为：

GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACCATC(如SEQ ID NO.2所示)；

piR-56497的qPCR扩增引物序列(5’-3’)为：CGTGGGGTTTCATCATGTTGGC(如SEQ IDNO.3所示)；

参考基因cel-miR-39-3p的基因序列(5’-3’)为：UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG；

参考基因cel-miR-39-3p的逆转录引物序列(5’-3’)为：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCAAGCT；

参考基因cel-miR-39-3p的qPCR扩增引物序列(5’-3’)为：CCGGGTCACCGGGTGTAAATC；

qPCR反应反向引物(miR-Universal-R)序列(5’-3’)为：CAGTGCAGGGTCCGAGGT，如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，piR-56497相对定量检测的计算如下：

根据piR-56497的PCR反应CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)和参考基因cel-miR-39-3p的CT值按照以下公式计算-△CT值：

-△CT＝-[Mean(检测基因CT值)-Mean(内参基因CT值)]

即：检测基因CT值的平均数-内参基因CT值的平均数；

两个样本间同一个检测基因表达量差异的计算公式为：

-△△CT＝-(△CT样本1-△CT样本2)＝-[样本1(检测基因CT-内参基因CT)]-[样本2(检测基因CT-内参基因CT)]，

2-△△CT即为检测样品的相对表达量。

进一步地，如果设置对照组，则对照组的相对表达量为1，各样本相对表达量RQ计算公式如下：

RQ＝2^{-[(待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值)-(对照组目的基因平均CT值-对照组管家基因平均CT值)]}；

如果不设置对照组，把“对照样品的目的基因的CT值的平均—对照样本的看家基因的CT的平均值”)作为零来计算，待测组相对表达量RQ则为：

RQ＝2^{-[(待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值)]}。

优选地，所述生物样本为血液或血浆。

第三发明：一种外泌体pir-56497的检测试剂盒，包括权利要求3所述的pir-56497和参考基因cel-miR-39-3p的逆转录引物序列(5’-3’)引物、qPCR扩增引物序列(5’-3’)引物和qPCR反应反向引物(miR-Universal-R)序列(5’-3’)。

第四发明：所述的外泌体pir-56497的检测试剂盒，在乳腺癌阳性人群和阴性人群或风险评估中的应用。

本发明的技术效果：利用本技术进行血浆外泌体pir-56497的定量检测，可以有效区别乳腺癌筛查阳性人群和阴性人群，根据血浆外泌体pir-56497定量检测结果进行乳腺癌风险评估有较好的风险预测效能，表明piR-56497的定量检测可应用于乳腺癌的早期筛查。

本发明开发了血浆外泌体piR-56497定量PCR检测方法及其在乳腺癌人群的风险评估中的应用，研究结果证明了可用于区别乳腺癌筛查阳性人群和阴性人群。

附图说明

图1为外泌体电镜照片：a为100nm比例尺下外泌体图片，b为1μm比例尺下外泌体图片。

图2为外泌体表面标志蛋白流式细胞术检测结果图。

图3为为外泌体的粒径和浓度分析图。

图4为qPCR定量检测的扩增曲线和溶解峰图：a为piR-56497扩增引物测试实验PCR反应扩增曲线；b为piR-56497扩增引物测试实验PCR反应溶解峰；c为大批量样品进行piR-56497定量PCR反应的扩增曲线；d为大批量样品进行piR-56497定量PCR反应的溶解峰。

图5为血浆外泌体piR-56497定量PCR检测组间差异比较[阴性组(1.049±0.1423N＝100)与阳性组(0.3580±0.03089N＝100)之间有显著统计学差异(P<0.0001，t＝4.767)]。

图6为血浆外泌体piR-56497定量PCR检测结果风险预测ROC曲线分析(AUC＝0.6644，95％CI：0.5890to 0.7397，P<0.0001。最佳约登指数为0.31，对应特异性最高为55％，敏感度最高为76％)。

具体实施方式

本申请的目的在于提供一种检测血浆外泌体piR-56497的方法及其应用，旨在解决现有技术中尚未有检测外泌体piR-56497的相关应用的问题。

实施例一：一种检测血浆外泌体piR-56497的方法

一、外泌体的提取

采用试剂盒法提取外泌体。样品包括细胞培养液、血浆和其它组织样品等。本研究以血浆为例：使用5ml EDTA抗凝采血管采集人静脉血。离心分离血细胞和血浆后直接使用或在-80℃保存待用。参考RiboTM Exosome Isolation Reagent(广州锐博生物技术有限公司)试剂盒方法提取血浆外泌体。

操作方法：

将血浆样本从低温环境中取出，并置于冰上；室温，2000×g离心20min，以去除残留细胞及碎片；转移上清至新管；室温，10000×g离心20min；转移上清至新管。加入1/3体积的外泌体分离试剂；颠倒混合或移液器混合，直至完全混匀样本；放入4℃冰箱静置30min；4℃，15000×g离心2min；用移液器小心地吸去上清；离心获得的外泌体用于后续实验。

二、外泌体的鉴定

分离提取的外泌体采用包括NTA外泌体浓度和粒径检测、外泌体透射电镜检测和外泌体表面蛋白流式细胞术检测三种方法进行鉴定。NTA外泌体浓度和粒径检测使用Nanosight ns30(Malvern公司)仪器；外泌体透射电镜检测HT-7700透射电镜(Hitachi公司)仪器；外泌体表面蛋白流式细胞术检测采用Accuri C6 flow cytomenter(BD公司)仪器按照设备标准操作程序操作，简述如下：

透射电镜观察步骤：取10μL外泌体滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；磷钨酸10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；常温干燥数分钟；5 100kv进行电镜检测成像。(见图1)

流式细胞仪检测步骤：经抽提分离得到外泌体沉淀使用经过滤PBS复溶，按100ul每管分装，密封冰上保存；使用不染色外泌体的作为阴性对照，标记为NC；样品进行CD63和CD81两组抗体染色，标记为CD63和CD81；按照流式细胞仪仪器操作规程上机检测。(见图2)

粒径分析步骤：经抽提分离得到外泌体沉淀使用1ml经过滤PBS复匀外泌体，密封冰上保存；选择一次性干净的样品池，对光使用无尘纸擦拭确保光路上无颗粒附着外管壁；缓慢注入外泌体溶液避免气泡，可适度倾斜样品池，使用盖子将样品池封住；将样品池放入仪器，按照标准操作规程操作仪器检测；按照仪器操作规程上机检测。(见图3)

三、外泌体总RNA提取

分离的外泌体按照以下步骤提取总RNA：

外泌体样品在涡旋震荡器震荡15s，加入1mL Trizol溶液，37℃金属浴1400rpm，5min，直至外泌体溶解；再加入200μL Trizol溶液，涡旋震荡15s；吸取样本到新的1.5mL离心管中；加入0.2体积(0.2mL/1mL Trizol)的氯仿，涡旋震荡15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心15min，出现分层，小心吸取上层水相到新的1.5mL离心管中；加入10μLcel-miR-39-3p(0.1μM)至离心管中；再加入与上清液1.5倍体积的无水乙醇(约0.9mL)，上下颠倒混匀，涡旋震荡15s，4℃静置5min；把Hipure RNA Micro Column(HiPure Serum/PlasmamiRNA Kit，美基生物)装在2ml收集管中，转移700μl混合液至柱子中，8000×g离心30S；倒弃滤液把柱子装回收集管，重复步骤(k)直至剩余的混合液全部转移完；倒弃滤液把柱子装回收集管，加入300μl Buffer RWC至柱子中，8000×g离心30S；倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500μl Buffer RW2至柱子中，8000×g离心30S；重复步骤：倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500μl Buffer RW2至柱子中，8000×g离心30S；倒弃滤液把柱子装回收集管，13000×g离心空柱3min甩干柱子的基质；将柱子转移至1.5ml的离心管中，加入50μlRNase-free H2O至柱子的膜中央，静置1min 13000×g，1min r)丢弃柱子，把RNA样品保存在-80℃待用。

四、qRT-PCR

把从外泌体中提取的总RNA作为模板进行cDNA逆转录和定量PCR检测。cDNA反转录：以提取的总RNA作为模板建立反应体系(2μL RTase Mix、1μL 10μM的RT primer、3μLRNAtemplate、2μL 5x RTase Buffer)，42℃ 60min，72℃ 10min。产物即为cDNA模板。DNA稀释3倍后进型qPCR反应：建立反应体系：2.6μL RNase-Free H2O、0.2μL Forward primer(10μM)、0.2μL Reverse primer(10μM)、5μL SYBR Green Mix、2μL cDNA template。在95℃下初始化10分钟，然后进行40次扩增循环，其中95℃变性15秒，60℃退火30秒，70℃延伸30秒。

五、基因和扩增引物

piR-56497的基因序列(5’-3’)为：

TGGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGATGGT，如SEQ ID NO.1所示。

根据piR-56497的基因序列设计并优化后的piR-56497的逆转录引物序列(5’-3’)为：

GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACCATC，如SEQ ID NO.2所示。

根据piR-56497的基因序列设计并优化后的piR-56497的qPCR扩增引物序列(5’-3’)为：

CGTGGGGTTTCATCATGTTGGC，如SEQ ID NO.3所示。

参考基因cel-miR-39-3p的基因序列(5’-3’)为：

UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG。

根据参考基因cel-miR-39-3p的基因序列设计的逆转录引物序列(5’-3’)为：

GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCAAGCT。

根据参考基因cel-miR-39-3p的基因序列设计的qPCR扩增引物序列(5’-3’)为：

CCGGGTCACCGGGTGTAAATC。

qPCR反应反向引物(miR-Universal-R)序列(5’-3’)为：

CAGTGCAGGGTCCGAGGT，如SEQ ID NO.4所示。

基因扩增曲线和溶解峰见图4。

六、piR-56497相对定量检测的计算

根据piR-56497的PCR反应CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)和参考基因cel-miR-39-3p的CT值按照以下公式计算-△CT值：

-△CT＝-[Mean(检测基因CT值)-Mean(内参基因CT值)]

即：检测基因CT值的平均数-内参基因CT值的平均数。

对于两个样本间同一个检测基因表达量差异的计算公式为：

-△△CT＝-(△CT样本1-△CT样本2)＝-[样本1(检测基因CT-内参基因CT)]-[样本2(检测基因CT-内参基因CT)]。

2-△△CT即为检测样品的相对表达量。

如果设置对照组，则对照组相对表达量为1。各样本相对表达量RQ计算公式如下：

RQ＝2^{-[(待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值)-(对照组目的基因平均CT值-对照组管家基因平均CT值)]}

注：如果不设置对照组，则把“对照样品的目的基因的CT值的平均—对照样本的看家基因的CT的平均值”)作为零来计算。此时待测组相对表达量RQ则为：

RQ＝2^{-[(待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值)]}

实施例二：血浆外泌体piR-56497定量PCR检测在人群中的应用

乳腺癌初诊人群：选择到院体检女性为检测对象。45岁以上(含45岁)者采用超声检查结合X线摄片检查；45岁以下者采用超声检查，如出现可疑或阳结果加X线摄片检查。采用美国放射学会(ACR)制定并为国际广泛采用的乳腺影像报告及数据系统(BI-RADS，Breast Imaging Reporting and Data System)对影像诊断结果进行记录、分析。采用双阅片诊断，诊断医师要求至少5年工作经验，其中一人为工作满3年的主治医师以上的医师。结果包括BI-RADS分类、乳腺厚度、占位、肿块、肿大淋巴结等信息。BI-RADS结果阳性者进行病理组织检查确诊。选择乳腺癌筛查阳性人群作为应用研究人群。采集外周血样品，按上述方法分离血浆外泌体，提取外泌体中的RNA，qPCR方法检测piR-56497的相对表达量。

根据piR-56497的相对表达量进行统计学分析，获得piR-56497在人群的组间表达差异。piR-56497的相对表达量在组间有显著差异(P<0.05)。表示乳腺癌筛查阳性人群的piR-56497的相对表达量显著低于阴性人群。piRNA主要功能是调节表观遗传和转录后水平的基因表达。被发现通过抑制导致肿瘤发生的信号通路上的基因参与肿瘤的发生机制。本研究中piR-56497在阳性人群中的表达显著下调，分类结果与体检结果一致。表明piR-56497的定量检测可应用于乳腺癌的早期筛查。(见图5)

实施例三：qPCR方法检测血浆外泌体piR-56497相对表达量的风险预测应用

以乳腺癌筛查人群为测试对象。45岁以上(含45岁)者采用超声检查结合X线摄片检查；45岁以下者采用超声检查，如出现可疑或阳结果加X线摄片检查。采用美国放射学会(ACR)制定并为国际广泛采用的乳腺影像报告及数据系统(BI-RADS，Breast ImagingReporting and Data System)对影像诊断结果进行记录、分析。采用双阅片诊断，诊断医师要求至少5年工作经验，其中一人为工作满3年的主治医师以上的医师。结果包括BI-RADS分类、乳腺厚度、占位、肿块、肿大淋巴结等信息。BI-RADS结果阳性者进行病理组织检查确诊。根据临床检查结果随机选择200人作为测试对象，其中100人为阳性人群，另外100人为阴性人群。按上述qPCR方法检测血浆外泌体piR-56497相对表达量。根据相对表达量结果绘制ROC曲线，计算AUC值，计算灵敏度和特异性。

如图6所示，结果显示：本例ROC曲线的AUC值为0.6644，表明piR-56497对于乳腺癌风险预测有较高的分类效能，piR-56497相对表达量的检测对于乳腺癌筛查人群的风险评估有较好的灵敏度和特异性，qPCR方法检测血浆外泌体piR-56497相对表达量可应用于乳腺癌人群风险预测筛查。

备注：以上研究中虽然是对血浆外泌体中的piR-56497的相对表达量进行检测，同理对其他生物样本也能检测外泌体中的piR-56497，只是根据不同生物样本所采用的外泌体提取略有不同而已。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽描述所有的细节内容，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作其他相关的修改。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (9)

1.外泌体pir-56497在乳腺癌人群的风险评估中的应用，所述外泌体pir-56497的基因序列(5’-3’)为：TGGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGATGGT(如SEQ ID NO.1所示)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过对外泌体piR-56497定量PCR检测在乳腺癌阳性人群和阴性人群筛查或风险评估中的应用。

3.一种外泌体pir-56497的检测方法,其特征在于：提取生物样本中的外泌体，采用qRT-PCR方法检测piR-56497的相对定量，参考基因为cel-miR-39-3p；

所述外泌体pir-56497的基因序列(5’-3’)为：

TGGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGATGGT(如SEQ ID NO.1所示)；

piR-56497的逆转录引物序列(5’-3’)为：

GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACCATC(如SEQ ID NO.2所示)；

piR-56497的qPCR扩增引物序列(5’-3’)为：

CGTGGGGTTTCATCATGTTGGC(如SEQ ID NO.3所示)；

qPCR反应反向引物(miR-Universal-R)序列(5’-3’)为：CAGTGCAGGGTCCGAGGT，如SEQID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，piR-56497相对定量检测的计算如下：

根据piR-56497的PCR反应CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)和参考基因cel-miR-39-3p的CT值按照以下公式计算-△CT值：-△CT＝-[Mean(检测基因CT值)-Mean(内参基因CT值)]

即：检测基因CT值的平均数-内参基因CT值的平均数；

两个样本间同一个检测基因表达量差异的计算公式为：

-△△CT＝-(△CT样本1-△CT样本2)＝-[样本1(检测基因CT-内参基因CT)]-[样本2(检测基因CT-内参基因CT)]，2-△△CT即为检测样品的相对表达量。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：

设置对照组，对照组的相对表达量为1，各样本相对表达量RQ计算公式如下：

RQ＝2^{-[(待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值)-(对照组目的基因平均CT值-对照组管家基因平均CT值)]}。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：

不设置对照组，把“对照样品的目的基因的CT值的平均—对照样本的看家基因的CT的平均值”)作为零来计算，待测组相对表达量RQ则为：

RQ＝2^{-[(待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值)]}。

7.根据权利要求3-6任一项所述的检测方法，其特征在于：所述生物样本为血液或血浆。

8.一种外泌体pir-56497的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求3所述的pir-56497和参考基因cel-miR-39-3p的逆转录引物序列(5’-3’)引物、qPCR扩增引物序列(5’-3’)引物和qPCR反应反向引物(miR-Universal-R)序列(5’-3’)。

9.权利要求8所述的外泌体pir-56497的检测试剂盒，在乳腺癌阳性人群和阴性人群筛查或风险评估中的应用。