CN118304316A - 克拉屈滨在制备抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于非抗生素类化合物作为抑菌剂的技术领域，公开了一种已知的非抗生素类化合物克拉屈滨在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用。本申请发现克拉屈滨能够抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的生长，最小抑菌浓度达到64mg/L。进一步探究抑菌机制发现暴露于克拉屈滨后，细菌细胞膜通透性增强，而且细胞内的大分子物质(核酸和蛋白质)发生外泻，造成细菌细胞膜的完整性被破坏，进而引起肺炎克雷伯菌的死亡。本发明提出了克拉屈滨可以破坏细菌的细胞膜，改变细胞膜的通透性，对多重耐药肺炎克雷伯菌具有良好的抑制作用，可以进一步应用于相关药物制备。

Description

克拉屈滨在制备抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长药物中的 应用

技术领域

本发明属于抑菌剂技术领域，具体涉及已知药物克拉屈滨在制备抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长药物中的应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是一种重要的机会性革兰氏阴性菌，也是医院中最常见的致病菌之一，是导致严重的医院和社区获得性感染(包括尿路感染、肺部感染和血流感染)频繁发生的原因。研究表明，肺炎克雷伯菌的临床检出率仅次于大肠杆菌，呈逐年上升趋势。近年来，随着临床上抗生素的过度使用和滥用，肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药性不断增强，多重耐药肺炎克雷伯菌引起的感染已成为日益严重的全球性问题，给临床治疗带来相当大的挑战。因此，寻求对多重耐药肺炎克雷伯菌有效的抑菌剂迫在眉睫，这对临床上多重耐药肺炎克雷伯菌感染的治疗方面具有重要意义。

克拉屈滨(Cladobine)是脱氧腺苷的氯化类似物，在临床上多用于治疗多发性硬化症(MS)，暂时未发现克拉屈滨可以抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长，更加缺少克拉屈滨抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长的相关研究。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述问题，本发明提供了克拉屈滨在制备抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长药物中的应用。针对目前临床上多重耐药肺炎克雷伯菌存在的广泛传播问题，目的在于提供克拉屈滨(CAS号:4291-63-8；英文名:Cladribine)在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用，为开发新型抗生素替代物提供了广阔的前景，并为防控耐药肺炎克雷伯菌的传播提供科学依据。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

克拉屈滨在制备抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长药物中的应用。进一步地，多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药种类为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢噻肟、庆大霉素、磷霉素、环丙沙星、四环素、替加环素或黏菌素中的一种或多种。

进一步地，耐药肺炎克雷伯菌为候鸟源肺炎克雷伯菌。本申请所述药物的类型为非抗生素类抑菌剂。

本申请利用微量肉汤稀释法测定克拉屈滨对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)。测得克拉屈滨对所述候鸟源肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度为64μg/mL，显示出极强的抑制活性。

此外，本申请通过紫外分光光度计法测定结果表明暴露于克拉屈滨后细胞内的大分子物质(核酸和蛋白质)发生外泻，造成细菌细胞膜的完整性被破坏。NPN和PI染色结果表明克拉屈滨处理后的肺炎克雷伯菌细胞膜细胞膜通透性增强，细菌细胞膜完整性损伤进而引起细菌死亡。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果是：

本发明从现存的天然小分子化合物库筛选出非抗生素耐药菌抑制剂，基于克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌的作用的研究，发现非抗生素类化合物克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌具有良好的抑菌效果，能够较好的抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的生长，为研发新型多重肺炎克雷伯菌抑菌剂提供了新思路。同时明确了克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑制作用，为有效遏制多重耐药肺炎克雷伯菌的流行和传播提供了理论基础。

附图说明

图1为不同浓度的克拉屈滨处理后细菌胞内蛋白质和核酸的泄漏量。A图为700603胞内蛋白质泄漏量；B图为21QH43K胞内蛋白质泄漏量；C图为21QH35K胞内蛋白质泄漏量；D图为700603胞内核酸泄漏量；E图为21QH43K胞内核酸泄漏量；F图为21QH35K胞内核酸泄漏量。(注：280nm处吸光值表示胞内蛋白质泄漏量，260nm处吸光值表示胞内核酸泄漏量)；

图2为不同浓度的克拉屈滨处理后细菌内膜和外膜通透性的变化。A图为700603内膜通透性变化；B图为21QH43K内膜通透性变化；C图为21QH35K内膜通透性变化；D图为700603外膜通透性变化；E图为21QH43K外膜通透性变化；F图为21QH35K外膜通透性变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：多重耐药肺炎克雷伯菌的药敏实验

本发明以肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603和候鸟源肺炎克雷伯菌(保藏于华南农业大学兽医学院国家兽医微生物耐药性风险评估实验室)为测试菌株，选择美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢噻肟、庆大霉素、磷霉素、环丙沙星、四环素、替加环素和黏菌素10种常用的抗生素通过微量肉汤倍比稀释法进行药敏试验。

将质控菌株ATCC25922和测试菌株分别划线于相应的琼脂培养基上，37℃恒温培养16～18h，挑取单菌落接种于500μL MH肉汤中，37℃，180rpm恒温振荡培养至对数生长期备用。在96孔板的第一列孔中加入180μL MH肉汤，其余孔加入100μL MH肉汤，接着在第一列的孔加入20μL相应浓度的药液，然后使用排枪吹打混匀后吸出100μL至下一孔，重复此操作至最后一孔吸取100μL弃去。用MH肉汤将对数生长期的菌液按1：100的比例进行稀释，然后每孔加入100μL菌液。此外，每个96孔板应加阴性和阳性对照。37℃恒温培养16～18h，进行三个生物学重复。参照美国临床试验室国家标准化管理委员会药敏标准(CLSI)对结果进行判读，判定标准见表1。

药敏实验结果如表2所示，21QH43K和21QH35K两株菌对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢噻肟、庆大霉素、磷霉素、环丙沙星和四环素这8种临床常用的抗生素表现为耐药，这8种药物分别属于碳青霉烯类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、磷霉素类、氟喹诺酮类和四环素类抗生素，因此这两株菌为多重耐药肺炎克雷伯菌。

表1CLSI标准判定结果

表2肺炎克雷伯菌的药敏试验结果

注：表中MIC值的单位为mg/L，结果为三个生物学重复的平均值。

实施例2：克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑制作用

采用微量肉汤二倍稀释法测定克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC，步骤同上，抑制结果如表3所示。

表3克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑制结果

由表3可知，克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC为64mg/L，且抑制活性强。

实施例3：克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌细胞膜完整性的破坏

将肺炎克雷伯菌接种于含4mL LB肉汤的15mL离心管中，置于37℃、180rpm摇床震荡培养4h左右，细菌培养液OD₆₀₀调整至0.5左右，随后离心用PBS重悬以后加入不同浓度的克拉屈滨过夜培养。第二天进行离心吸取上清液并转移至比色皿中，最后使用紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。由图1可知，随处理浓度升高核酸及蛋白质的泄漏量增加，这说明克拉屈滨能够破坏肺炎克雷伯菌细胞膜的完整性。

实施例4：克拉屈滨增强多重耐药肺炎克雷伯菌的细胞膜通透性

将肺炎克雷伯菌接种于含4mL LB肉汤的15mL离心管中，置于37℃、180rpm摇床震荡培养过夜；第二天离心弃去上清，用PBS重悬菌体沉淀，调至菌液OD₆₀₀为0.5。在2mL EP管中加入800μL PBS，对照组中加入100μLPBS，实验组中分别然后加入不同浓度克拉屈滨，使药物终浓度为1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC，然后向对照组和实验组中各加入100μL上述制备好的菌液，放入37℃培养箱避光培养2h，随后加入PI和NPN探针进行染色，使其终浓度分别为0.5μm和10μm，再放入37℃培养箱避光静置培养30min，然后在5000rpm/min离心5min，弃去上清液，用PBS洗涤两次，后吸取200μL溶液至黑色96孔板中，放入酶标仪进行荧光检测，测定PI探针的激发光为535nm，发射光为615nm，测定NPN探针的激发光为350nm，发射光为420nm，操作过程全程避光。

由图2可知，与对照组相比，多重耐药肺炎克雷伯菌的荧光强度随着克拉屈滨浓度的升高而增强，这表明暴露于克拉屈滨后肺炎克雷伯菌细菌细胞膜的通透性增加，这可能引起多重耐药肺炎克雷伯菌的死亡。

综上结果可知克拉屈滨对多重耐药肺炎克雷伯菌具有良好的抑菌效果，而且有通过增加细胞膜的完整性和破坏细胞膜的完整性发挥抑菌作用。

显然，以上所述的具体实施方案，只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.克拉屈滨在制备抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药种类为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢噻肟、庆大霉素、磷霉素、环丙沙星、四环素、替加环素或黏菌素中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，耐药肺炎克雷伯菌为候鸟源肺炎克雷伯菌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为非抗生素类抑菌剂。