CN118284687A - 培养间充质干细胞的方法、组合物及其实施方式 - Google Patents

Abstract

本文提供了产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体群的方法。根据本公开的方法可以包括扩增培养中的间充质干细胞(MSC)群；在培养中施用一种或多种引发剂以引发MSC群并获得引发的MSC群；使培养中引发的MCS群生长以产生引发的MSC衍生的条件培养基；收集引发的MSC条件培养基；并从引发的MSC条件培养基中纯化外泌体群。一种或多种引发剂可包含源自不同于MSC群的干细胞群的条件培养基、Nrf2激活剂或其组合。本文还提供了使用来自引发的MSC条件培养基的外泌体群治疗组织如角膜和肝脏的方法。

Description

培养间充质干细胞的方法、组合物及其实施方式

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月11日提交的印度申请号202141036331的优先权。所有申请均通过引用整体并入本文。

背景技术

有几项引人注目的临床前和临床研究证明了间充质干细胞(MSC)和使用细胞衍生的外泌体的无细胞疗法在治疗纤维化、炎症以及促进伤口愈合和组织再生方面的功效。MSC的治疗作用很大程度上归因于细胞分泌的旁分泌因子，包括外泌体。

例如在但不限于肿瘤中，分泌外泌体的MSC充当细胞与细胞通讯的介质，并且在肿瘤生成、血管生成、转移和细胞内通讯中发挥多种作用。外泌体是纳米级细胞外囊泡(EV)，充当细胞间串扰的介质。MSC衍生的外泌体(MSC-Exo)含有作为货物蛋白的如生长因子、细胞因子、脂质部分和核酸(包括miRNA、mRNA和转移RNA(tRNA))以及其他非编码RNA(ncRNA))，可为人类提供外泌体的抗纤维化、抗炎和促再生治疗作用。还发现MSC-Exo可以激活在组织再生和炎症中重要的几种信号转导通路(Akt、ERK和STAT3)，并诱导多种生长因子的表达。虽然MSC本身可用作治疗剂，但使用MSC-Exo相对于使用MSC的优势包括低免疫原性、低排斥风险和低致瘤性。MSC-Exo也不太可能出现肺部首过效应，这对于安全性和进行全系统递送都很重要。因此，来源于MSC的外泌体已被尝试用于治疗某些疾病和缺陷。

然而，外泌体货物的补充会受到培养物中引发剂的影响，这些引发剂会引发MSC并影响其活性和转录谱。因此，无论好坏，引发都会以意想不到的方式显著影响给定MSC群产生的外泌体的治疗效果。

此外，MSC-Exo是从分泌MSC-Exo的MSC中获得的。大量扩增MSC是基于MSC-Exo的疗法的必要条件之一。然而，本领域可用的常规方法不允许充分扩大用于商业规模的治疗应用的MSC及其分泌产物的生产。

因此，需要鉴定用于产生引发的MSC和由此产生的MSC-Exo的引发剂和相关的MSC培养方法，其可以提供具有高且改善的治疗功效的外泌体的充足供应。

发明内容

本文提供了产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体群的方法的实施方案，该方法包括：(a)扩增培养中的间充质干细胞(MSC)群；(b)用源自不同于MSC群的细胞群的细胞衍生的条件培养基和至少一种限定引发剂引发MSC群，以获得引发的MSC群；(c)使培养中的引发的MCS群生长以产生引发的MSC衍生的条件培养基；以及(d)收集引发的MSC条件培养基。在一些变型中，方法包括(e)从引发的MSC条件培养基中纯化外泌体。

在一些变型中，引发MSC群包括：(1)使MSC群与细胞衍生的条件培养基接触；(2)使MSC群与至少一种限定引发剂接触。任选地，MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时与细胞衍生的条件培养基接触，并且MSC群从约60％至约90％汇合时开始与至少一种限定引发剂接触。任选地，MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时述细胞衍生的条件培养基接触，并且此后与至少一种限定引发剂接触。任选地，MSC群与至少一种限定引发剂接触约12小时至约72小时。

在一些变型中，来自不同细胞群的细胞衍生的条件培养基是角膜基质干细胞衍生的条件培养基。

在一些变型中，至少一种限定引发剂是核因子红系2相关因子2(Nrf2)激活剂、沉默信息调节因子1(SIRT1)激活剂、或全反式视黄酸(ATRA)。任选地，至少一种引发剂是Nrf2激活剂。任选地，Nrf2激活剂是富马酸二甲酯(DMF)或衣康酸4辛酯(4-OI)。

在一些变型中，MSC群是骨髓衍生的MSC(BM-MSC)群、脐带衍生的MSC(UM-MSC)群、诱导多能干细胞(iPSC)衍生的MSC(iPSC-MSC)群或华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)群。任选地，BM-MSC群是人BM-MSC群。

在一些变型中，细胞衍生的条件培养基是角膜干细胞衍生的条件培养基，并且限定引发剂是DMF或衣康酸4辛酯(4-OI)。任选地，角膜干细胞衍生的条件培养基以约10％至约30％的浓度存在。任选地，DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。

本文还提供了用上述方法的实施方案产生的引发的MSC衍生的外泌体群的实施方案。

本文还提供了引发的MSC衍生的外泌体群的实施方案，其特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：(a)更低的血管内皮生长因子(VEGF)表达水平；和(b)更高的神经生长因子(NGF)表达水平。任选地，引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的间充质干细胞衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：(c)更高的肝细胞生长因子(HGF)表达水平；和(d)更高的sFLT1表达水平。任选地，引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的间充质干细胞衍生的外泌体相比，具有以下两项或更多项、三项或更多项或全部项的之一或组合：(a)至少高2倍的sFLT1的表达水平；(b)VEGF的表达水平是未引发的MSC衍生的外泌体中表达水平的四分之一或更少；(c)至少高2倍的HGF表达水平；和(d)至少高3倍的NGF表达。在一些变型中，通过以下方式制备引发的MSC：(1)使MSC群与角膜干细胞衍生的条件培养基接触；和(2)使MSC群与Nrf2激活剂接触。任选地，Nrf2激活剂是DMF或衣康酸4辛酯(4-OI)。任选地，MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时与角膜干细胞衍生的条件培养基接触，并且MSC群从约60％至约90％汇合时开始与Nrf2激活剂接触。任选地，MSC群与Nrf2激活剂接触约12小时至约72小时。

本文还提供了治疗角膜缺损的方法的实施方案，该方法包括向具有角膜缺损的角膜表面施用治疗剂量的本文公开的外泌体群。任选地，角膜缺损选自：角膜瘢痕、角膜炎、角膜溃疡、角膜擦伤、角膜上皮损伤、角膜基质损伤、感染性角膜损伤、沙眼、圆锥角膜、角膜穿孔、角膜缘损伤、角膜营养不良、新血管形成、春季角结膜炎和干眼。在一些变型中，外泌体群包含在配制用于施用于角膜表面的眼科组合物中。任选地，组合物是滴眼液。任选地，滴眼液包含生物相容性聚合物。任选地，生物相容性聚合物是可交联的，并且该方法包括将滴眼液施用于角膜表面，并使足够部分的可交联的聚合物交联，使得滴眼液转化为水凝胶。

本文还提供了眼科组合物的实施方案，眼科组合物被配制用于施加在角膜表面并且包含本文所公开的外泌体群。任选地，眼科组合物处于滴眼液形式。任选地，滴眼液包含生物相容性聚合物。任选地，眼科组合物是水凝胶并且至少一部分生物相容性聚合物是交联的。

本文还提供了产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体群的方法的实施方案，该方法包括：(a)在培养基中培养间充质干细胞(MSC)群；(b)用Nrf2激活剂引发MSC群以获得引发的MSC群；(c)使引发的MCS群在收集培养基中生长，其中收集培养基变得富含由引发的MSC产生的外泌体，从而产生引发的MSC衍生的条件培养基；和(d)收集引发的MSC条件培养基。任选地，该方法还包括(e)从引发的MSC条件培养基中纯化外泌体。任选地，MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时在第一培养基中生长，然后与Nrf2激活剂接触。任选地，MSC群与Nrf2激活剂接触约12小时至72小时。任选地，Nrf2激活剂是富马酸二甲酯(DMF)或衣康酸4辛酯(4-OI)。任选地，DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。任选地，MSC群是骨髓衍生的MSC(BM-MSC)群、脐带衍生的MSC(UM-MSC)群、诱导多能干细胞(iPSC)衍生的MSC(iPSC-MSC)群或华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)群。

本文还提供了用上文提供的方法产生的引发的MSC衍生的外泌体群的实施方案。

还提供了引发的MSC衍生的外泌体群，其特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：(a)更高的肝细胞生长因子(HGF)表达水平；和(b)更高的神经生长因子(NGF)表达水平。任选地，引发的MSC衍生的外泌体的特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下项：(a)更高的HGF表达水平；和(b)更高的NGF表达水平。任选地，引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一项或两项：(a)至少高1.2倍的HGF表达水平；和(b)至少高2倍NGF表达水平。

在一些变型中，引发的MSC通过以下方式制备：(1)使MSC群在第一培养基中生长；和(2)使MSC群与Nrf2激活剂接触。任选地，Nrf2激活剂是DMF或衣康酸4辛酯(4-OI)。任选地，DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。任选地，MSC从接种直至约60％至约90％汇合时在第一培养基中生长，然后与Nrf2激活剂接触。任选地，MSC群与Nrf2激活剂接触约12小时至约72小时，然后与收集培养基交换。

本文还提供了治疗肝脏病况的方法的实施方案，该方法包括向患有肝脏病况的受试者施用治疗量的本文上文提供的外泌体群。任选地，肝脏病况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。任选地，NAFLD是非酒精性脂肪肝(NAFL)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。任选地，外泌体群通过静脉内途径施用至肝脏。任选地，静脉内途径是通过肝门静脉。

本文还提供了包含如上本文所公开的外泌体群的组合物的实施方案。任选地，组合物用于治疗肝脏病况。任选地，肝脏病况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。任选地，NAFLD是非酒精性脂肪肝(NAFL)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

本文还提供了增加间充质干细胞(MSC)群分泌外泌体的方法的实施方案，该方法包括：(a)在培养基中培养MSC群；(b)用Nrf2激活剂引发MSC群以获得引发的MSC群；和(c)使引发的MCS群在收集培养基中生长，其中收集培养基变得富含由引发的MSC产生的外泌体。任选地，MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时在第一培养基中生长，然后与Nrf2激活剂接触。任选地，MSC群与Nrf2激活剂接触约12小时至72小时。任选地，Nrf2激活剂是富马酸二甲酯(DMF)或衣康酸4辛酯(4-OI)。任选地，DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。任选地，MSC群是骨髓衍生的MSC(BM-MSC)群、脐带衍生的MSC(UM-MSC)群、诱导多能干细胞(iPSC)衍生的MSC(iPSC-MSC)群或华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)群。

参考以下描述和所附权利要求将更好地理解本主题的这些和其他特征、方面和优点。提供此发明内容是为了以简化的形式介绍概念的选择。本发明内容不旨在识别所要求保护主题的关键特征或基本特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

下列附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本公开的各方面。通过参考附图并结合本文所呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本公开。

图1A-1E描绘了用角膜基质干细胞衍生的条件培养基(CSSC-CM)引发的人骨髓衍生的MSC(hBM-MSC)的分泌组的定量柱状图。定量基于hBM-MSC在其中生长的培养基或其部分的酶联免疫测定(ELISA)。根据本公开的实施方案，用CSSC-CM引发hBM-MSC细胞(20％的培养基中的10％被CSSC-CM替换)，并且表征了引发的hBM-MSC细胞的分泌组概况，特别是HGF(图1)、VEGF(图1B)、sFLT1(图1C)、IL-6(图1D)、NGF(图1E)的分泌水平。

图2A-2E描绘了在指定的引发的外泌体存在下，引发的hBM-MSC衍生的外泌体对用脂多糖(LPS)结合蛋白刺激的RAW 264.7巨噬细胞的抗炎作用的定量柱状图。根据本公开的实施方案，通过ELISA测量IL-6(图2A)、IL-1β(图2B)、IL-10(图2C)、TNF-α(图2D)和IFNγ(图2E)的细胞因子表达。

图3A-3E描绘了在指定的引发的外泌体(5亿个外泌体)存在下，用LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞的细胞因子表达的定量柱状图。通过定量PCT(qPCR)分别测量IL-6(图3A)、IL-1β(图3B)、TNF-α(图3C)、IL-10(图3D)和IFNγ(图3E)的细胞因子表达。

图4A-4F描绘了不同外泌体变体对用TGF-β处理的人真皮成纤维细胞的抗纤维化特性的表征的代表性免疫荧光图像。将人真皮成纤维细胞(HDF)与TGF-β(图4B)和指定的外泌体(图4C-4F)共处理24小时。固定细胞并通过免疫染色评估α-SMA表达。根据本公开的实施方案，TGF-β在仅用TGF-β处理的细胞中诱导α-SMA表达，其在CSSC引发的BM-MSC外泌体(图4D-4E)和CSSC-外泌体(图4F)的存在下被阻断，并且在较小程度上被初始hBM MSC外泌体阻断(图4C)。

图5描绘了显示由Nrf2激活剂(DMF或4-OI)介导的BM-MSC引发的效果的柱状图，并且表征了不同引发条件下的分泌组和外泌体概况。数据代表3个技术重复±SEM。根据本公开内容的实施方案，NRF2激活剂DMF显示出更高的外泌体产量。

图6A-6F描绘了在不同引发条件下引发的细胞的分泌组标志物概况的定量柱状图。HGF(图6A)、IL-6(图6B)、VEGF(图6C)、sFLT1(图6D)、NGF(图6E)和SDF-1(图6F)的分泌通过ELISA在蛋白水平上定量。HGF的表达(图6A)在所有引发的变体中更高，而VEGF和sFLT1水平未改变(图6C-6D)。姜黄素和Nrf2激活剂减弱IL-6的表达(图6B)，而Nrf2激活剂4-OI和DMF增强NGF分泌水平(图6E)。根据本公开的实施方案，姜黄素条件培养基+DMF的组合显示对任何读数均没有显著影响。

图7A-7E描绘了在用不同引发剂如姜黄素(CUR)和Nrf2激活剂DM和4-OI引发下由MSC分泌的外泌体的货物(如外泌体蛋白)的定量概况的柱状图。定量的货物包括外泌体HGF(图7A)、外泌体VEGF(图7B)、外泌体sFLT1(图7C)、外泌体NGF(图7D)、外泌体TGF-β(图7E)和外泌体SDF-1(图7F)。与初始MSC相比，所有引发的变体中外泌体HGF均更高。通过Nrf2激活剂引发(尤其是通过DMF引发)诱导外泌体NGF的表达。sFLT1、TGF-β和SDF-1水平保持不变。

图8A-8E描绘了引发的hBM-MSC衍生的外泌体(hBM-MSC-Exo)对RAW 264.7巨噬细胞的抗炎作用的定量柱状图。在指定的引发外泌体(4亿个外泌体)存在的情况下，用LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞。根据本公开的实施方案，通过ELISA测量IL-6(图8A)、IL-1β(图8B)、IL-10(图8C)、TNF-α(图8D)和IFNγ(图8E)的细胞因子表达。

图9A-9D描绘了源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂组合引发的hBM-MSC的外泌体的外泌体货物蛋白的定量柱状图。根据本公开的实施方案，定量基于应用于纯化的产生的外泌体的ELISA。通过ELISA在蛋白质水平上定量外泌体HGF(图9A)、外泌体VEGF(图9B)、外泌体sFLT1(图9C)和外泌体NGF(图9D)。

图10A-10E描绘了用具有Nrf2激活剂(DMF)的CSSC-CM引发的不同外泌体变体的抗炎活性表征的定量柱状图。在指定的引发外泌体(约5亿个外泌体)存在的情况下，用LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞。根据本公开的实施方案，通过ELISA分别测量IL-6(图10A)、IL-1β(图10B)、TNF-α(图10C)、IL-10(图10D)和IFNγ(图10E)的细胞因子表达。

图11A-11F描绘了来自用CSSC-CM和/或Nrf2激活剂(DMF)引发的BM-MSC的不同外泌体变体对用TGF-β处理的人真皮成纤维细胞的抗纤维化活性的表征的代表性免疫荧光图像。用TGF-β和指定的外泌体变体处理人真皮成纤维细胞24小时，并检测α-SMA表达。如上所示，TGF-β在仅TGF-β处理的细胞中诱导α-SMA(图11B)，而外泌体在不同程度上抑制α-SMA的诱导。

图12描绘了在多个时间点观察到的不同外泌体变体、用CSSC-CM和/或Nrf2激活剂(DMF)引发的hBM-MSC的伤口愈合活性的表征的代表性图像。根据本公开的实施方案，在0小时、24小时、48小时和72小时的多个时间点观察到描绘单层上皮细胞上伤口闭合的时间过程(2D划痕测定)的代表性图像。BM-MSC；CSSC-CM(20％)；Nrf2激活剂：DMF。

图13描绘了跟踪用不同外泌体变体处理的细胞汇合的细胞迁移/细胞增殖测定的图，所述不同外泌体变体包括初始外泌体、源自用CSSC-CM、Nrf2激活剂或其组合引发的hBM-MSC的外泌体。

图14描绘了使用具有开放性上皮伤口的兔角膜进行的伤口愈合测定的代表性图像，所述开放性上皮伤口包括未处理的对照、液体角膜生物聚合物、和液体角膜生物聚合物和源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂(DMF)引发的hBM-MSC的外泌体的组合。

图15A描绘了健康肝球体、NASH诱导的肝球体或外泌体处理的NASH诱导的肝球体中CYP34A染色的代表性免疫荧光图像。

图15B示出了24小时、48小时和72小时后，人肝球体中分泌的白蛋白水平的定量柱状图，所述人肝球体包括NASH诱导的肝球体和外泌体处理的NASH诱导的肝球体。

图15C描绘了NASH诱导的肝球体和外泌体处理的肝球体中胶原蛋白(纤维化标志物)染色的代表性免疫荧光图像。

图15D示出了人肝球体中胶原蛋白沉积的覆盖百分比的定量柱状图，所述人肝球体包括NASH诱导的肝球体和外泌体处理的NASH诱导的肝球体。

图15E描绘了在健康肝球体、NASH诱导的肝球体和外泌体处理的NASH诱导的肝球体中针对α-SMA(纤维化标志物)染色的代表性免疫荧光图像。

图15F示出了人肝球体中α-SMA强度的定量柱状图，所述人肝球体包括NASH诱导的肝球体或外泌体处理的NASH诱导的肝球体。

图16A描绘了用源自BM-MSC的引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的全部基因表达谱的基因表达热图。

图16B描绘了比较用引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的差异表达基因的主成分分析图。

图17A描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的肝脏特异性基因图谱的基因表达热图。

图17B描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)/纤维化相关基因图谱的基因表达热图。

图17C描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的星状细胞特异性基因图谱的基因表达热图。

图17D描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的与异生物质代谢过程相关的基因图谱的基因表达热图。

图17E描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的脂肪酸代谢基因图谱的基因表达热图。

图17F描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的与环氧合酶p450途径相关的基因图谱的基因表达热图。

图17G描绘了用初始外泌体或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体的脂肪纤维化相关基因图谱的基因表达热图。

图18A描绘了基于肝脏球体中NASH/纤维化相关基因、全部基因和肝脏特异性基因的Jaccard相似性指数的图。

图18B描绘了基于与肝球体中的神经生成、血管生成和炎症反应基因相关的Jaccard相似性指数的图。

图18C描绘了基于与肝球体中的细胞外基质、伤口愈合和组织重塑相关的基因的Jaccard相似性指数的图。

图19描绘了与未处理的、NASH诱导的或引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体中富集的生物过程相关的基因的基因表达热图。

图20描绘了根据本公开的实施方案的用于产生引发的外泌体的方法的流程图。

具体实施方式

本领域技术人员将意识到，除了具体描述的那些之外，本公开还可以进行变化和修改。应理解，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指示的所有此类步骤、特征、组合物和化合物，以及任何或多个此类步骤或特征的任何或所有组合。

定义

为了方便起见，在进一步描述本公开之前，本文对说明书中使用的某些术语和实例进行描述。这些定义应根据本公开的其余部分来阅读并由本领域技术人员理解。本文使用的术语具有本领域技术人员认可和已知的含义，然而，为了方便和完整，下面列出了特定术语及其含义。

冠词“一种”、“一个”和“该”用于指一个或多个(即至少一个)冠词的语法宾语。

术语“包含”和“包括”以包容性、开放的含义使用，意味着可以包括附加元素。它不应被解释为“仅由组成”。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及变体将被理解为暗示包括所陈述的元素或步骤或元素或步骤组，但不排除任何其他元素或步骤或元素或步骤组。

使用术语“包括”意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可以互换使用。

出于本文件的目的，术语“扩增的引发的间充质干细胞群”是指与最初获得用于培养的间充质干细胞群相比具有增加的细胞数量的间充质干细胞群。培养过程不会分化细胞，它只是增加细胞流形(cells manifolds)数量。另外，引发是指使用小分子引发剂。

术语“三维培养”或“3D培养”是指体外培养细胞的系统，其中允许生物细胞在所有三个维度上生长并与其周围环境相互作用。

术语“二维培养”或“2D培养”是指将细胞作为单层在表面培养的方法，其中在该表面上生物细胞能够在二维上与其周围环境相互作用。

术语“基于球体的系统”是指根据本公开中描述的方法通过形成球体以三维方式培养间充质干细胞(MSC)的过程。

术语“基于微载体的系统”是指根据本公开中描述的方法通过形成藻酸盐-明胶(Alg/Gel)微载体或微珠以三维方式培养间充质干细胞(MSC)的过程。

术语“微载体”和“微珠”可互换使用；它是指本公开中所描述的藻酸盐-明胶(Alg/Gel)微载体或微珠。

术语“间充质干细胞衍生的条件培养基或“MSC-CM”是指MSC生长后获得的培养基。由此获得的条件培养基包含分泌的细胞调节剂和对组织再生至关重要的多种因子。由此获得的条件培养基还包含分泌组和外泌体，在能够应用于治疗目的之前需要从条件培养基中纯化它们。如本文所述的获得扩增的MSC的过程也导致MSC-CM的形成，因此，可以说单个过程导致获得扩增的引发的MSC群以及MSC-CM群。

术语“外泌体”是指细胞分泌的纳米级范围(例如20-200nm范围)的细胞外囊泡，其含有作为货物的生物分子，如蛋白质、DNA和RNA(包括各种类型如mRNA和miRNA)，通常来自分泌它们的生物细胞。一些生物分子可具有抗炎、抗纤维化和再生特性，并且可具有临床意义。

术语“微分子”或“小分子”被定义为细胞行为的合成或天然存在的化学调节剂并诱导治疗特性。小分子的分子量小于800Da。

术语“大分子”是分子量大于800Da的的生物制剂。在本公开中，大分子包括蛋白质、脂质、核酸、生长因子、细胞因子和条件培养基的组分。

出于本文件的目的，术语“角膜缘干细胞”是指存在于角膜缘干细胞生态位中的干细胞群。角膜缘干细胞是指主要以角膜基质干细胞(CSSC)和角膜缘上皮干细胞(LESC)为代表的干细胞群。

术语“角膜基质干细胞衍生的条件培养基”或“CSSC-CM”是指角膜基质干细胞(CSSC)在其中生长的培养基。本文所述的CSSC-CM通过以本领域已知的方式培养CSSC或通过按照本文公开的方法培养CSSC获得。

本公开中所描述的术语“无异源”是指不含任何源自非人类动物的产物的培养基。由于其临床应用的合理性，无异源方法是一个重要的优势。

术语“受试者”是指可以施用治疗剂例如包含外泌体的组合物的动物受试者。动物受试者可以是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是患有或被诊断患有本公开中提及的病况的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是人类受试者。

术语“治疗有效量”是指治疗受试者的病况所需的组合物的量。

这里的术语“初始细胞”是指未用任何条件培养基引发的未引发的间充质干细胞。因此，术语未引发的和初始在本公开中可互换使用。

尽管由于不同的体外细胞培养方法导致MSC存在很大的可变性，但传统方法存在各种局限性，限制了MSC治疗在临床试验中的成功。MSC对免疫介导的、炎症和退行性疾病的恶劣微环境的高度敏感性仍然是基于MSC的治疗成功的巨大障碍。恶劣的组织环境会限制移植的MSC的功能和存活。此外，同质MSC群的使用限制了它们在治疗应用中的使用。许多其他限制也危害基于MSC的治疗，如由于体外过度扩增导致的细胞衰老、冷冻保存后的功能丧失以及临床前和临床试验中体内治疗效果的不一致。

为了解决本领域面临的问题，本公开一方面提供了产生间充质干细胞(MSC)和产生从MSC纯化的外泌体的方法。在一些变型中，本公开提供的方法包括从表达标志物标记组的各种来源分离间充质干细胞亚群。在一些变型中，间充质干细胞亚群可以使用hTERT(人端粒酶逆转录酶)来进一步修饰，hTERT可以扩展工程化MSC(eMSC)的倍增潜力，以促进源自所述MSC的细胞和治疗性外泌体的规模化且均质的生产。

本公开的方法的另一个方面是用一种或多种引发剂(如小分子和大分子)和/或源自其他干细胞群的条件培养基来引发MSC。源自本公开的方法的细胞和外泌体可以本身或彼此组合用于临床应用。在一些变型中，来自初始MSC群的条件培养基可用于引发来自不同组织来源的不同初始MSC群。在一些变型中，使用两种或更多种引发剂(即组合引发策略)，可以增强MSC和/或MSC分泌的外泌体的再生、抗炎和抗纤维化特性中的一种或多种。为了表述方便，由初始MSC分泌的外泌体在本文中可称为“初始外泌体”，由例如用一种或多种引发剂和/或来自其他细胞的条件培养基引发的MSC分泌的外泌体在本文中可称为“引发的外泌体”或“引发的外泌体变体”。除了初始/引发的MSC之外，初始或引发的外泌体可以本身或其组合用于治疗应用，不同的基于细胞的疗法来解决多种未满足的临床需求。

本公开涉及脐带血衍生的间充质干细胞(UC-MSC)/华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)/骨髓衍生的MCS(BM-MSC)的体外培养，随后选择独特的具有与抗纤维化、抗炎/免疫调节和促血管生成活性中的一种或多种相关的富集因子的亚群。为了进行所述方法，可以从确定的MSC群中分离外泌体并进行全面表征。本公开描述了用不同的引发剂(单独或其组合)(在一些情况下是临床批准的引发剂)引发各种MSC群(如UC-MSC、WJ-MSC和BM-MSC)的方案/方法，以增强细胞的再生、干性和抗炎特性，所述引发剂包括但不限于Nrf2激活剂、SRT1激活剂、ATRA、条件培养基。单一引发或组合引发可用于产生具有特定/富集货物载荷因子的不同外泌体变体。在一些变型中，外泌体变体可以在物理和分子水平上表征其功效。在一些变型中，外泌体变体可以根据其针对不同炎症和纤维化相关疾病的功能进行分类，所述炎症和纤维化相关疾病例如为肺功能障碍、急性呼吸窘迫、炎症相关疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、骨关节炎、NASH、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡、心肌梗死等。

在一些变型中，引发剂可以是以下之一：(a)用Nrf2激活剂引发：不受理论的束缚，在一些变型中，用Nrf2激活剂引发增强了引发的MSC和由MSC分泌的外泌体的抗炎特性。由引发的MSC分泌的外泌体(“引发的外泌体)可以富含有利于治疗炎症相关病症的货物。炎症相关病症的实例包括类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、骨关节炎、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)(可以是非酒精性脂肪肝(NAFL)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡、心肌梗死；(b)用SIRT 1激活剂引发；(c)用Nrf2激活剂+SIRT 1激活剂的组合引发：不受理论的束缚，在一些变型中，通过用SRT1激活剂以及Nrf2激活剂引发MSC来增强再生治疗功效。富集的治疗级外泌体可用于血管组织再生。在一些变型中，用SRT1激活剂和Nrf2激活剂组合引发可以诱导MSC产生具有增强的治疗性货物载荷因子的外泌体，所述货物载荷因子具有抗炎、抗纤维化和促血管生成作用中的一种或多种；(d)用Nrf2激活剂+CSSC衍生的条件培养基(CCSC-CM)组合引发：在一些变型中，不受理论的束缚，用Nrf2激活剂(如DMF)和CSSC-CM组合引发诱导MSC产生外泌体，所述外泌体富含抗炎因子，但血管生成因子减少。因此，来自用Nrf2激活剂和CSSC-CM组合引发的MSC的外泌体，可用于无血管组织(如角膜)的再生；(e)NRF2激活剂+SIRT 1激活剂+全反式视黄酸+CSSC-CM。此外，在引发过程中通过物理(创建缺氧微环境)或化学(HIF-1α)诱导剂诱导缺氧将增加引发的MSC的存活率和耐受性。本公开还公开了在缺氧存在和不存在的情况下在特定的BM-MSC/UC-MSC/WJ-MSC中用SRT1激活剂和Nrf2激活剂组合引发的方案，以产生更显著的治疗性富集的外泌体，用于肺、肝脏的再生疗法、血管组织的生物工程和3D生物打印。本公开的目的是显著提高细胞产量并解决更多的患者群，保持相同数量的产品生产运行和下游加工。

在一些变型中，MSC群可以使用hTERT(人端粒酶逆转录酶)进行修饰，从而扩展工程化MSC(eMSC)的倍增潜力，以促进细胞和治疗性外泌体的规模化和均质生产。调节MSC、eMSC或诱导多能干细胞(iPSC)中的特定途径和/或应用各种组合引发方案可用于生成为下游应用定制的外泌体。

本公开提供源自各种来源的MSC作为源材料，所述来源包括人骨髓、脂肪组织、脐带、非限制性成体干细胞、华顿氏胶、牙髓衍生的MSC、iPSC、工程化细胞、角膜缘干细胞。MSC可以生长，并且任选地被引发，以产生独特的亚群或变体，其表达标志物标记组并产生对于给定病况或病况组在治疗上有效的外泌体。

本公开的一方面在于用诱导剂的特定组合来引发源自不同组织来源(例如骨髓、脂肪、脐带等)的MSC以激活某些途径用于产生具有富集因子作为货物的治疗性外泌体，用于无血管或血管组织的再生，所述富集因子包括抗炎、抗纤维化、促进伤口愈合、血管生成(促/抗)和神经再支配因子(re-innervation factor)中的一种或两种或更多种的组合。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。

本公开的范围不受本文描述的具体实施方案的限制，这些具体实施方案仅旨在用于示例的目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。

产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体的方法

在本公开的一些实施方案中，提供了产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体群的方法100。图20描绘了方法100的实施方案的流程图。该方法可以包括以下步骤：步骤101-扩增培养中的间充质干细胞(MSC)群；步骤103-在培养物中施用一种或多种引发剂以引发MSC群并获得引发的MSC群；步骤105-使培养中的引发的MCS群生长以产生引发的MSC衍生的条件培养基；和步骤107-收集引发的MSC衍生的条件培养基。在一些变型中，该方法还包括步骤109-从引发的MSC衍生的条件培养基中纯化外泌体群。

MSC群的类型

在一些变型中，MSC群可以选自骨髓衍生的间充质干细胞、脂肪衍生的间充质干细胞、脐带衍生的间充质干细胞、华顿氏胶衍生的间充质干细胞、牙髓衍生的间充质干细胞、诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞、角膜缘干细胞和角膜基质干细胞。在一些变型中，MSC可以是原代细胞或工程化细胞。在一些变型中，MSC可以是从初始来源新鲜获得的或冷冻保存然后解冻。

在一些变型中，MSC可以是表达选自以下的干细胞标志物的干细胞亚群：CD34^-、α-SMA^-CD46⁺、CD47⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105^+/-、CD54⁺、CD58⁺、CD106⁺、CD142^+/-、CD146⁺、CD166⁺、CD200⁺、CD273⁺、CD274⁺、CD276⁺或其组合。在一些变型中，可以如下分离干细胞亚群：(a)从干细胞亚群中选择间充质干细胞的第一亚群，其中间充质干细胞的第一亚群表达选自CD34^-、α-SMA^-、CD73⁺、CD90⁺和CD166⁺的阳性标志物；和(b)从干细胞亚群中选择间充质干细胞的第二亚群，其中间充质干细胞的第二亚群表达选自CD146⁺、CD54⁺、CD58⁺和CD142^+/-的标志物。

在一些变型中，MSC可包含非病毒人端粒酶逆转录酶(hTERT)。

培养基

在一些变型中，MSC可以在无异源培养基中扩增。在一些变型中，MSC可以在低氧条件下生长，任选地培养基中的氧在0.2-10％的范围内。在一些变型中，MSC可以在最低必需培养基和5-20IU/μl范围内的至少一种类型的胶原酶中培养以获得扩增的干细胞，其中所述至少一种类型的胶原酶是胶原酶-I和胶原酶-II的组合。

引发剂

在一些实施方案中，可将引发剂应用于MSC以改变细胞的活性或基因表达模式。引发剂在MSC中诱导的变化可以引起或诱导由受影响的MSC产生和分泌的外泌体的一种或多种特征的变化，如某些生物分子的存在或某些生物分子在货物中的相对表达。引发剂可以是限定试剂，如大分子或小分子。大分子可以是生物分子，如蛋白质、DNA或RNA(如mRNA、miRNA或siRNA)。蛋白质可以是小分子。在一些变型中，引发剂可以是选自Nrf2激活剂、SIRT1(沉默信息调节因子1)激活剂、全反式视黄酸(ATRA)、ML228、MDL 800、异槲皮素、岩藻依聚糖、木犀草素、槲皮素、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷(AICAR)、5-苯基烷氧基补骨脂素(Psora-4)、噻吩并吡啶酮(Thienopyridone(A-769662))(A-769662)、二甲双胍、雷帕霉素、5-氮杂胞苷(5-Aza)、UM171、SB203580、非瑟酮、阿托伐他汀、丙戊酸、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、虾青素(ATX)、琥珀酸盐及其组合。

在一些变型中，Nrf2激活剂可以选自：任选地浓度为10-250μM的富马酸二甲酯(DMF)、任选地浓度为10-500μM的衣康酸4辛酯(4-OI)，以及任选地浓度为0.1-10μM的2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-酸的咪唑衍生物(CDDO-Im)，任选地浓度为1-20μM的姜黄素，和任选地浓度为0.1-100μM的黄连素。

在一些变型中，SIRT1激活剂可以选自：任选地浓度为0.01nM至10nM的SRT-2104、任选地浓度为0.1μM-10μM的反式白藜芦醇、任选地浓度为10-200μM的反式白藜芦醇、任选地浓度为0.1-10μM的SRT-1720、任选地浓度为50-200μM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、任选地浓度为0.08-2.25μM的烟酰胺单核苷酸(NMN)，或浓度为1-10000μM、1-100μM、100-10000μM、10-100μM或100-1000μM的烟酰胺核糖(NR)。

在一些变型中，至少一种限定引发剂可包含任选地浓度为0.1-500μM的全反式视黄酸(ATRA)、任选地浓度为1-10μM的ML228、任选地浓度为5-500μM的MDL 800、任选地浓度为0.01-5000μM的异槲皮素、任选地浓度为0.00001-0.001μM的岩藻依聚糖、任选地浓度为10-100μM的木犀草素、任选地浓度为0.1-10μM的槲皮素、任选地浓度为1000-10000μM的5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷(AICAR)、任选地浓度为0.01-200μM的5-苯基烷氧基补骨脂素(Psora-4)、任选地浓度为10-200μM的噻吩并吡啶酮(A-769662)、任选地浓度为1-10000μM的二甲双胍、任选地浓度为0.001-0.1μM的雷帕霉素、任选地浓度为0.1-1μM的5-氮杂胞苷(5-Aza)、任选地浓度为0.01-0.1μM的UM171、任选地浓度为1-10μM的SB203580、任选地浓度为1-50μM的非瑟酮、任选地浓度为0.1-20μM的阿托伐他汀、任选地浓度为500-5000μM的丙戊酸、任选地浓度为0.01-0.1μM的1-磷酸鞘氨醇(S1P)、任选地浓度为0.01-100μM的虾青素(ATX)、任选地浓度为10-500μM的琥珀酸盐，或其组合。

在一些变型中，至少一种引发剂可包含条件培养基，其源自不同于用至少一种引发剂引发的MSC群的细胞(任选地干细胞)群。在一些变型中，条件培养基选自角膜基质干细胞衍生的条件培养基和角膜缘上皮干细胞衍生的条件培养基。在一些变型中，添加到培养基中用作引发剂的条件培养基相对于MSC在其中生长的培养基的体积百分比(浓度)为5-50％、10-50％、15-40％、约10％、15％、约20％、约25％或约30％。

在一些变型中，MSC暴露于至少一种引发剂的时间段可以为12-72小时、24-72小时、或24-48小时、或约24小时或约48小时。在一些变型中，MSC暴露于至少一种引发剂的时间段可以是从接种直至约60％至约90％汇合、约70％至90％汇合、约70％至80％汇合、约60％汇合、约70％汇合、或约80％汇合。

组合引发

在一些变型中，MSC可以部分重叠或无重叠地同时或连续暴露于两种或更多种引发剂。在一些变型中，每种或两种引发剂的引发时间段为12-72小时。在一些变型中，MSC从接种直至约60％至约90％汇合、约70％至90％汇合、约60％汇合、约70％汇合或约80％汇合时可暴露于第一培养基中包含的第一引发剂，然后与包含第二引发剂的第二培养基交换并任选地暴露于第二引发剂12-72小时、24-72小时或24-48小时。

在一些变型中，MSC群可以用至少一种Nrf2激活剂和至少一种SIRT1激活剂引发。在一些变型中，MSC可以用至少一种Nrf2激活剂和CSSC-CM引发。在一些变型中，MSC可以用至少一种Nrf2激活剂、至少一种SIRT1激活剂和ATRA引发。

在一些变型中，MSC群可以用至少一种Nrf2激活剂和至少一种SIRT1激活剂的组合来引发。Nrf2激活剂可以选自：任选地浓度为10-250μM的富马酸二甲酯(DMF)、任选地浓度为10-500μM的衣康酸4辛酯(4-OI)、或任选地浓度为0.1-10μM的2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-酸的咪唑衍生物(CDDO-Im)。所述至少一种SIRT1激活剂可以选自：任选地浓度为0.01-10nM的SRT-2104、任选地浓度为0.1-10μM的反式白藜芦醇，或任选地浓度为0.1-10μM的SRT-1720。在一些变型中，Nrf2激活剂和SIRT1激活剂可以部分重叠或无重叠地同时或连续施用于MSC，其中每种或两种限定引发剂的引发时间段为12-72小时。

在一些变型中，MSC群可以用至少一种Nrf2激活剂和CSSC-CM的组合来引发。不受理论的束缚，与来自相当的初始MSC群的外泌体相比，由用Nrf2激活剂和CSSC-CM引发的MSC分泌的外泌体可以有利地相对富集抗炎因子，同时血管生成因子相对减少。因此，来自用Nrf2激活剂和CSSC-CM组合引发的MSC的外泌体可用于治疗或诱导非血管组织(如角膜)的再生。Nrf2激活剂可以选自浓度为10-250μM的富马酸二甲酯(DMF)、浓度为10-500μM的衣康酸4辛酯(4-OI)或浓度为0.1-10μM的2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-酸的咪唑衍生物(CDDO-Im)。在一些变型中，添加到培养基中用作引发剂的CSCC-CM相对于MSC在其中生长的培养基的体积百分比可以为5-50％、10-50％、15-40％、约10％、15％、约20％、约25％或约30％。在一些变型中，MSC的引发可以在任选地具有0.2-10％氧气的低氧条件下进行。在一些变型中，MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时可以在包含浓度为约20％的CSSC-CM的第一培养基中生长，然后与包含浓度为约50μM和约100μM的DMF的第二培养基交换并在第二培养基中生长24-28小时。

培养方法

在一些变型中，可以用选自基于中空纤维的方法、基于微载体的方法和基于球体的方法的方法在3D生物反应器系统中培养MSC。

在一些变型中，基于中空纤维的方法可以包括(i)提供或获得中空纤维生物反应器系统；(ii)在无异源培养基中培养步骤(a)中获得的干细胞以获得细胞悬浮液；(iii)将细胞悬浮液注入中空纤维生物反应器系统的筒中；(iv)将干细胞悬浮液孵育21-35天以获得扩增的干细胞群；(v)将蛋白酶、任选的胰蛋白酶EDTA添加到包含扩增的干细胞群的中空纤维生物反应器系统的额外毛细管空间中，以获得扩增的干细胞；和(vi)用缓冲液处理扩增的干细胞以获得扩增的干细胞。

在一些变型中，基于微载体的方法可以包括(i)将微载体悬浮在培养基中，以获得悬浮液；(ii)用步骤(a)中获得的干细胞接种悬浮液；(iii)在培养基中培养步骤(ii)的干细胞以获得粘附至微载体的扩增干细胞群；和(iv)通过使微载体与包含氯化钠和柠檬酸三钠的溶解缓冲液接触来溶解步骤(iii)的微载体，以获得扩增的干细胞。

在一些变型中，基于球体的方法可以包括：(i)将步骤(a)中获得的干细胞沉淀，以获得干细胞沉淀；(ii)将干细胞沉淀重悬于包含基础培养基的培养基中，以获得干细胞悬浮液；(iii)从步骤(ii)中获得的干细胞悬浮液提供或获得干细胞球体，其中干细胞球体具有每个球体600-10,000个细胞的干细胞密度；和(iv)在包含MSC基础培养基的培养基中培养步骤(iii)的干细胞球体以获得扩增的干细胞。

外泌体纯化方法

包含在引发的MSC衍生的条件培养基中的外泌体可以用外泌体纯化方法来纯化。

在一些变型中，外泌体纯化方法可包括：(i)在2-6℃的温度下以90,000-120,000xg的速度离心70-110分钟以得到沉淀；(ii)将沉淀溶解在低血清无异源培养基中以获得粗外泌体；和(iii)对粗外泌体进行密度梯度超速离心以获得外泌体的级分；(c)通过尺寸排阻色谱法纯化外泌体级分，以获得富集的外泌体群。

在一些变型中，外泌体纯化方法可以包括：(i)使引发的条件培养基或条件培养基以200-400xg的速度进行第一次离心5-20分钟，然后以2000-4000xg的速度进行第二次离心10-40分钟以获得上清液；(ii)将上清液以200-400xg的速度离心5-20分钟，然后过滤上清液以获得分泌组；(c)离心分泌组，以获得沉淀；(d)将沉淀溶解在低血清无异源培养基中，得到粗溶液；(e)对粗溶液进行密度梯度超速离心，以获得包含外泌体的级分；和(f)通过尺寸排阻色谱法纯化包含外泌体的级分，以获得富集的外泌体群。

引发的外泌体的分子表征

MSC的引发会诱导某些外泌体蛋白表达水平的特征性变化，例如通过富集外泌体的ELISA所测量的。

在一些变型中，BM-MSC与CSSC-CM和Nrf2激活剂的组合引发可以引起产生外泌体，其特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一种或两种或更多种的组合：更低的血管内皮生长因子(VEGF)外泌体表达水平、更高的神经生长因子(NGF)表达水平、更高的肝细胞生长因子(HGF)表达水平和更高的sFLT1表达水平。在一些变型中，更高的HGF的表达水平可以是至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍或约2.2倍的更高表达。在一些变型中，更高的NGF表达水平可以是至少2倍、至少2.2倍、至少2.5倍、至少3倍或约3.2倍的更高表达。在一些变型中，更高的sFLT1表达水平可以是至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍或约2.2倍的更高表达。在一些变型中，更低的VEGF表达水平可以是一半或更少、三分之一或更少、或者四分之一或更少的表达。

在一些变型中，用Nrf2激活剂(例如DMF或4-OI)引发BM-MSC可引起产生外泌体，其特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比具有更高的HGF表达水平和/或更高的NGF表达水平。在一些变型中，更高的HGF表达水平可以是至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍或约2.2倍的更高表达。在一些变型中，更高的HGF表达水平可以是至少1.1倍、至少1.2倍、至少约1.3倍或约1.4倍更高表达。

基于上述方法的组合物

在本公开的一个方面，提供了通过本文所述的方法获得的引发的MSC群。

在本公开的一个方面，提供了通过本文所述的方法获得的引发的条件培养基。

在本公开的一个方面，提供了从通过本文所述的方法获得的条件培养基纯化的引发的外泌体群。在本公开的一个方面，提供了包含本文所述的纯化的引发的外泌体的组合物。在一些变型中，组合物可以形成用于肠胃外施用。在一些变型中，组合物可以是配制用于施用于角膜表面的眼科组合物或滴眼液。在一些变型中，滴眼液或眼科组合物可包含生物相容性聚合物。在一些变型中，眼科组合物可以是水凝胶，其中至少一部分生物相容性聚合物是交联的。在一些变型中，生物相容性聚合物可包含选自胶原蛋白、透明质酸、纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、丝、明胶和藻酸盐的一种聚合物或两种或更多种聚合物的组合。在一些变型中，一种或多种生物相容性聚合物可通过例如硫醇化或甲基丙烯酸化而被改性为可交联的。

在本公开的一个方面，提供了包含本文所述的引发的MSC的组合物。

在本公开的一个方面，提供了包含至少两种选自以下的组分的组合物：(a)如本文所述的引发的干细胞；(b)如本文所述的引发的条件培养基；和(c)如本文所述的富集的外泌体。

用于治疗病况的治疗方法或组合物

在本公开的某些实施方案中，提供了用于治疗受试者的病况的方法，所述方法包括：(a)提供或获得如本文所述的富集的外泌体；和(b)将外泌体施用于受试者以治疗病况。在一些变型中，可以在角膜表面施用。在一些变型中，角膜表面施用可以使用滴眼剂制剂，其可以包含生物相容性聚合物。生物相容性聚合物可以是可交联聚合物，使得液体在交联后变成水凝胶。在一些变型中，施用可以是肠胃外或静脉内施用。静脉内施用可以通过肝门静脉。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于治疗受试者的病况的方法，所述方法包括，(a)提供或获得如本文所述的引发的条件培养基；和(b)向受试者施用治疗有效量的条件培养基以治疗病况。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于治疗受试者的病况的方法，所述方法包括：(a)提供或获得本文所述的引发的干细胞，和(b)向受试者施用治疗有效量的扩增的引发的间充质干细胞群以治疗病况。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于治疗受试者的病况的方法，所述方法包括：(a)提供或获得如本文所述的组合物，例如，富集的外泌体、条件细胞培养基、引发的间充质干细胞群；和(b)向受试者施用治疗有效量的组合物以治疗病况。

在某些变型中，上述病况可以选自：类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、心肌梗死、骨关节炎、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡、角膜炎(CK)、干眼症溃疡、单纯疱疹性角膜炎、LASIK术后扩张、术后角膜融化、人工角膜后融化、角膜穿孔、神经营养性角膜炎(NK)、圆锥角膜干燥综合征、粘膜类天疱疮、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、化学烧伤和热烧伤。

在本公开的某些实施方案中，提供了包含如本文所述的富集的外泌体、条件细胞培养基或引发的间充质干细胞群)的组合物，其用于治疗选自以下的病况：类风湿性关节炎、全身性幼年性关节炎的病症、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、心肌梗死、骨关节炎、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡和角膜炎(CK)、干眼症溃疡、单纯疱疹性角膜炎、LASIK术后扩张、术后角膜融化、人工角膜后融化、角膜穿孔、神经营养性角膜炎(NK)、圆锥角膜干燥综合征、粘膜类天疱疮、史蒂文斯-约翰逊综合征、化学烧伤和热烧伤。

在本公开的某些实施方案中，提供了本文所述的引发的干细胞或本文所述的引发的条件培养基、或本文所述的富集的外泌体，用于治疗选自以下的病症：类风湿性关节炎、全身性幼年性关节炎的病症、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、心肌梗死、骨关节炎、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡和角膜炎(CK)、干眼症溃疡、单纯疱疹性角膜炎、LASIK术后扩张、术后角膜融化、人工角膜后融化、角膜穿孔、神经营养性角膜炎(NK)、圆锥角膜干燥综合征、粘膜类天疱疮、史蒂文斯-约翰逊综合征、化学烧伤和热烧伤。

尽管已经参考某些实例及其实现方式相当详细地描述了本主题，但是其他实现方式也是可能的。

实施例

现在将通过工作实施例来说明本公开，其旨在说明本公开的工作而不旨在限制性地暗示对本公开的范围的任何限制。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于所公开的方法和组合物的实践中，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。应当理解，本公开不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以应用。

材料和方法

干细胞的来源

出于本公开的目的，源自诸如人骨髓(BM)、角膜缘干细胞、脐带(UC)、非限制性成体干细胞、华顿氏胶(WJ)、牙髓(DP)和脂肪组织(AD)、诱导多能干细胞(iPSC)、工程化细胞、角膜基质干细胞衍生(CSSC衍生)的条件培养基引发的MSC的间充质干细胞(MSC)可用于本文所述方法和细胞衍生产品。本文中提到的工程化细胞是用hTERT永生化的细胞。干细胞类型的选择是靶向的和组织特异性的。

永生化成体干细胞系(非病毒永生化MSC细胞系)的来源：

(1)hTERT永生化人骨髓间充质干细胞(hBM-MSC)：具有临床批准的CD105⁺、CD90⁺、CD73⁺标志物的原代BM-MSC(初始)用于初始外泌体生产，CSSC条件培养基引发的初始BM-MSC用于初始变体外泌体生产，用于无血管组织再生。临床批准的非病毒人类端粒酶逆转录酶(hTERT)诱导的永生化BM-MSCs用于持续生产外泌体。

(2)hTERT永生化人华顿氏胶衍生的MSC(WJMSO/脐带衍生的MSC(UC-MSC)细胞系：选择具有临床批准的CD166⁺、CD90⁺、CD73⁺标志物和CD34^-、α-SMA^-标志物的UC-MSC并在无异源培养基中生长，并从表达上述标志物的上述细胞群中产生初始外泌体。临床批准的非病毒hTERT诱导的永生化UCMSC用于持续生产外泌体。

实施例1

角膜基质干细胞(CSSC)和初始细胞(hBM-MSC、UC-MSC和WJ-MSC)的获取和培养

本实施例描述了获得或培养干细胞(如角膜基质干细胞(CSSC)、hBM-MSC、脐带UC-MSC和WJ-MSC)，以及富集干细胞以在无异源培养条件下获得扩增的干细胞群的过程。本实施例还描述了从如上所述的干细胞获得条件培养基的过程。

1.1在无异源条件下培养CSSC，并从CSSC收集条件培养基

1.1.1.在无异源条件下分离和培养CSSC

获取保存在角膜储存培养基中有效期为4-5天的角膜组织。“组织规格表”上具有以下详细信息的组织用于细胞提取和培养：(1)具有移植/细胞采集有效期的组织；(2)主要死因，无HIV(人类免疫缺陷病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)、HbsAg(乙型肝炎表面抗原)和梅毒；(3)每平方毫米的细胞数；(4)没有脓毒症和疤痕、没有任何系统感染、没有任何使组织不适合细胞采集的眼部病史。

经过彻底筛选后，使用人类供体衍生的角膜在无异源条件下使用方案衍生CSSC。在无异源条件下培养CSSC的过程描述如下：

在提取含有CSSC的角膜缘之前，用抗生素强化缓冲盐水(PBS)清洗人类供体衍生的角膜。在无菌条件下，使用手术器械切除360°角膜缘环，并用缓冲盐水清洗并切成更小的碎片。将切碎的组织碎片收集到不完全培养基(MEM培养基)中，并通过向组织悬浮液中添加20μL浓度为0.5U的重构释放酶(Roche)进行释放酶消化。

孵育16小时后，通过添加2mL用2％人血小板裂解物(HΜL)强化的完全培养基来终止酶消化。

将消化的组织在补充有青霉素和链霉素的盐水中在室温下以200 x g离心3分钟，然后进行不同水平的传代。

第0代(P0)：在第0代期间，将消化的外植体重悬于5mL无异源完全培养基(MEM+2％HΜL、IX ITS、10ng/mL EGF)中，并在T25 Corning CellBIND烧瓶中培养14天。培养基每3天更换一次。

第1代(P1)：在第1代期间，用TrypLe(IX，Gibco)对从外植体分离的细胞进行胰蛋白酶化，并在14天结束时重悬于新鲜的完全培养基中。将细胞以8000个细胞/cm²接种到第1代的T75 CellBIND烧瓶中。如果在P1将0.7x10⁶细胞接种到三个T-75烧瓶中，则对于下一次传代(第2代；P2)，将细胞分到两个T-75烧瓶，随后按照细胞倍增将进一步传代(第3代；P3)分到四个T-75烧瓶。

在以下时间点进行P1、P2和P3的完全培养基更换：

P1-第3天：补充50％培养基，即2.5mL培养基。

第5天：用5mL新鲜培养基替换5mL培养基。

P2-第3天：补充50％培养基，即5mL。

第5天：用10mL新鲜培养基替换10mL培养基。

第7天：用10mL新鲜培养基替换10mL培养基。

P3-第3天：补充50％培养基，即5mL。

第5天：用10mL新鲜培养基替换10mL培养基。

第7天：用10mL新鲜培养基替换10mL培养基。

对于P2和P3，约1.2X10⁶个CSSC被复苏，并且细胞接种密度约为8000个细胞/cm²。

表1显示了在第1代(P1)、第2代(P2)和第3代(P3)收集的CSSC用过的培养基的体积。

表1

为了质量控制，使用标志物如干细胞标志物(如CD90、CD73和CD105)、角膜细胞特异性标志物(如PAX6)和阴性标志物(如SMA、CD34)来表征P1、P2和P3的细胞(免疫荧光成像)。

1.1.2.从CSSC培养中收集条件培养基(CSSC-CM)

从如上所述的第1-2-3代开始，每次培养基更换都伴随着从烧瓶中收集用过的/条件培养基。通过将培养基以300 x g离心10分钟对用过的培养基进行进一步预处理以收集上清液。将上清液在4℃下以3000 x g进一步离心20分钟，然后将上清液在4℃下以13000 xg再次离心30分钟，以收集进一步处理的上清液。通过0.45微米过滤器对培养基进行双重过滤，并进一步使用0.22微米过滤器收集上清液。

收集的上清液(条件培养基)短期储存在4℃(1-2天)，长期储存在-80℃。

1.2.培养初始hBM-MSC并从初始hBM-MSC收集条件培养基

1.2.1.在无异源条件下培养初始hBM-MSC

为了培养初始hBM-MSC，从制造商处采购了IM人BM-MSC(hBM-MSC)细胞(传代2)及其推荐培养基(hBM-MSC高性能培养基试剂盒XF)，并根据制造商的方案培养hBM-MSC细胞。简而言之，将10mL无异源加强型MSC和基础型MSC在室温下解冻，并在无菌条件下转移到生物安全柜中，重新配制为500mL培养基。

为了培养的目的，将vial-hBM-1M-XF从液氮(LN)盒中取出并在37℃水浴中解冻2-3分钟。将细胞瓶无菌转移至50/15mL离心管中，其中将4mL培养基逐滴添加至细胞中。将200x g离心10分钟后获得的细胞沉淀溶解于5mL的完整培养基并作为质量控制，记录细胞计数。将试管中的培养基体积增至30mL(根据制造商的方案推荐)，并将细胞以2000-3000个细胞/cm²的密度接种到CELLBIND T225 cm²烧瓶中，并将培养基体积增至40-45mL。将每个烧瓶中的培养基体积增加到40-45mL，并在37℃和5％CO₂下孵育。

为了确定汇合细胞的百分比，从第3天开始每天观察细胞。直到细胞达到高达80％汇合时，即(43000-50000)个细胞/cm²才更换培养基，之后准备采集细胞。在采集过程中，将细胞转移到生物安全柜中并除去用过的培养基，将10mL用过的培养基保留在无菌管(15-50mL)中用于淬灭胰蛋白酶。除去培养基并用1X PBS洗涤细胞，随后添加10mL TrypLE并在37℃培养箱中孵育。每5分钟检查一次细胞是否从表面脱离。为了停止TrypLE活性，将等体积的淬灭(新鲜培养基)或用过的培养基添加到细胞中。

将细胞悬浮液转移至无菌50mL离心管中，200g离心10分钟。弃去上清液，用4-5mL新鲜培养基重悬细胞，并测量细胞悬浮液的总体积。获得悬浮液后，将0.1mL细胞悬浮液转移至微量离心管中进行细胞计数，并使用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)进行稀释，以获得(0.1-1)X 106个细胞/mL的计数范围，并且细胞被冷冻保存直至需要。

1.2.2从初始hBM-MSC收集条件培养基。

如上所述，从第3天开始对IM hBM-MSC细胞瓶进行复苏和观察。在第3天、第4/5天和第6/7天用相差显微镜拍摄图像；细胞密度如表2所示。根据细胞密度(43000-50000个细胞/cm²)，在第4/5天用20mL PBS洗涤细胞1-2次，并将培养基更换为Rooster EV收集培养基。孵育48小时后，收集条件培养基，并按照上文实施例1.2.1中所述的方案采集细胞。随后，使用细胞计数器对细胞进行计数。立即按照上述实施例1.1.2中所述的预处理步骤对收集的条件培养基进行处理，然后将预处理的条件培养基储存在4℃(短期储存长达24小时)或-80℃(长期储存长达1个月)。

表2显示了第3天、第4天和第6/7天的细胞密度(细胞/cm²)。

表2

1.3.培养初始UCMSC并从初始UCMSC收集条件培养基

1.3.1.培养初始UCMSC

UC-MSC细胞从制造商处采购，并按照制造商的方案在推荐的无异源培养基中培养。简而言之，将MSC-XF和basal-MSC在室温下黑暗中解冻，以重构一瓶500mL培养基。此外，将传代后获得的小瓶-人脐带-1X-XF(无异源)(hUC-1M-XF)在37℃水浴中解冻，并将细胞无菌转移到生物安全柜中。将细胞转移至10mL培养基体积的15/50mL离心管中，并以280 x g离心6分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀溶解在20mL培养基中。将细胞悬浮液进一步分到四个T75烧瓶和两个T225烧瓶，其中T75烧瓶的接种密度保持在2000-3000个细胞/cm²的范围内，而对于T225，接种密度保持在2000-3000个细胞/cm²的范围内。

对于T225烧瓶和T75烧瓶，分别使用45mL和15mL的培养基体积，并且将培养基维持在37℃。为了确定汇合百分比，从第3天开始用显微镜观察细胞，捕获图像，然后使用ImageJ软件进行细胞计数。

在第4天和第5天，当培养物汇合至80％(例如，对于T225烧瓶，细胞的细胞密度为60k-100k个细胞/cm²)时进一步观察细胞。通过将烧瓶转移到生物安全柜中并将用过的培养基收集在无菌容器(～10mL)中以淬灭胰蛋白酶来采集细胞。除去培养基后，分别向每个T225或T75烧瓶中添加10mL或3mL的TrypLE，并将烧瓶在37℃培养箱中孵育。每5分钟检查一次细胞培养物，直到细胞从表面脱离或通过轻轻敲击细胞脱落。为了终止TrypLE活性，将等体积的淬灭或用过的培养基添加到细胞悬浮液中，并转移到15/50mL离心管中，以280 x g离心6分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于4-5mL新鲜培养基中，并测量细胞悬浮液的总体积。用DPBS/培养基稀释后，使用0.1mL细胞悬浮液进行细胞计数，以获得(0.1-1)X 10⁶个细胞/mL的计数范围，并将细胞冷冻保存直至进一步使用。

1.3.2.从初始UCMSC收集条件培养基

为了从初始UC-MSC中产生细胞外囊泡(EV)，如上所述对1M细胞小瓶进行复苏，并从第3天开始观察细胞，以在第3天、第4/5天和第6/7天使用相差显微镜捕获图像，细胞密度如表3所示。在第4/5天，根据细胞密度(60-100k)个细胞/cm²(T225烧瓶)，即接近80％汇合，用20mLPBS洗涤细胞两次，并将培养基更换为细胞外囊泡(EV)收集培养基。孵育48小时后，收集条件培养基，采集细胞并用细胞计数器计数。立即按照上面实施例1.1.2中所述的预处理步骤对收集的条件培养基进行处理。

表3：第3天、第4天和第6/7天的细胞密度(细胞/cm²)(传代4扩增)

1.4.用于选择干细胞群及其亚型的细胞分选

本公开的关键方面之一是从表达标志物标记组的干细胞如UC-MSC/WJ-MSC中分离间充质干细胞(MSC)的独特亚群以产生具有所需治疗效果的外泌体，所述治疗效果如为抗炎、抗纤维化、促进伤口愈合、(促/抗)血管生成和神经再支配特性。该特征很重要并且不同于文献中已知的常规方法，因为常规方法使用异源干细胞(如UC-MSC细胞)群，而本公开的方法采用提供优异治疗活性(抗炎、抗纤维化、促进伤口愈合、(促/抗)血管生成、神经再支配)的独特的MSC亚群。

表4列出了干细胞(如UCMSCS和WJMSC)表达的共同标志物标记组。

表4

进一步地，除了上表列出的标志物外，MSC中表达水平更高的其他细胞标志物包括但不限于CD44、CD73和CD90。

1.4.1UCMSC亚群的分离

在第一次传代结束时(P4)或如实施例1.3.1中所述扩增hUC-1M-XF细胞小瓶后，基于临床批准的MSC表面标志物CD90、CD73和CD166使用基于流式细胞术的分选方案对细胞进行分选以获得两个UC-MSC亚群。UC-MSC的两个亚群是：

第一亚群：选择表达临床批准的MSC表面标志物如CD90⁺、CD73⁺和CD166⁺的干细胞的第一亚群。

第二亚群：对具有CD166⁺、CD90⁺、CD73⁺阳性的MSC群进行重新分选，以提供第一亚群的两个亚型(富集的治疗性独特的UC-MSC群)：

(i)CD146+、CD54+、CD58+和CD142+阳性群；

(ii)CD146+、CD54+、CD58+和CD142-(低/阴性)群。

将上述UC-MSC亚型维持在无异源培养基中进行两次以上传代(P5和P6)，然后如本公开实施例1.1.2中所述收集条件培养基。

1.5.hTERT永生化WJ-MSC的培养

1.5.1WJ-MSC的细胞复苏和扩增

在复苏之前，将培养瓶预先涂有不含动物成分的细胞附着底物。简而言之，将底物(1:300，在1X PBS中稀释)添加到培养瓶中并在室温下孵育至少2h。除去过量的底物溶液，并用PBS(IX)冲洗烧瓶两次。冲洗后，将6ml生长培养基添加至25cm²培养瓶中，并置于培养箱中至少30分钟，使培养基达到其正常pH。将冷冻细胞小瓶从液氮中取出，用70％乙醇冲洗外面，并在手中预热，直到看到最后一片冷冻细胞。将解冻的小瓶转移至预先装有9mL培养基并预冷至4℃的15mL离心管中。

将细胞在室温下以400 x g进一步离心5分钟，弃去上清液，然后将细胞重悬于1mL预热的培养基中。将细胞转移至准备好的培养瓶(T25cm²)中并在37℃下孵育。作为质量控制(QC)，对细胞进行计数和记录，然后在24小时后更换培养基，并在约70-80％汇合时传代细胞。

1.5.2WJMSC/hTERT永生化WJMSC的传代培养

使用预先涂覆的培养瓶进行传代培养，汇合度为70-80％，细胞密度为28000个细胞/cm²。为了脱离细胞，添加TrypLE Select酶溶液(20μL/cm²)并用PBS(160μL/cm²)洗涤细胞两次。将烧瓶在37℃下孵育约2-3分钟，并在显微镜下观察细胞脱离。将生长培养基添加到细胞中，并以400 x g离心5分钟，然后重悬于1mL培养基中，并使用台盼蓝涂布。将细胞接种到补充有240μL/cm²生长培养基的涂布的培养皿中(7000个细胞/cm²)，在达到80％汇合后保持每周两次1:4的平分比数(例如，约28000个细胞/cm²)，然后使用TrypLE选择酶对细胞进行胰蛋白酶消化。

随后，将细胞重新悬浮在生长培养基中并以400 x g离心5分钟，并将细胞悬浮在1mL冷冻保存培养基CryoStor(CS10)中，其对应于5x10⁵个细胞/mL。将1mL细胞悬浮液转移至预冷的冷冻瓶中，并转移至-80℃过夜或转移至液氮中长期储存。为了进一步使用，细胞在补充有MesenCult-ACF+500X补充剂、200pg/mL G418的MesenCult-ACFΜLus培养基中生长。

实施例2

在3D培养中扩增干细胞的方法

将源自如实施例1中所述的各种来源的MSC(天然/hTERT永生化)在基于3D培养的系统中培养以获得扩增的干细胞。不同的基于3D培养的方法如下：

(i)在3D微载体中培养：MSC在3D微载体上的培养在未决申请PCT/IN2020/050622中详细描述，该申请的整体并入本公开中。

(ii)作为3D球体培养：MSC在3D微载体上的培养在未决申请PCT/IN2020/050622中详细描述，该申请的整体并入本公开中。

(iii)在中空纤维生物反应器中培养。

2.1CellSTACK烧瓶中hMSC的2D培养

购买第1-2代的人间充质干细胞(hMSC)，并按照制造商的方案进行扩增以生成工作细胞库。对于hMSC的大规模扩增(即在CellSTACK培养室(10层)中进行扩增)，将来自工作细胞库的2000万个hBM-MSC以3145个细胞/cm²的接种密度接种到培养室中(Corning，目录#3271)。按照制造商的方案制备完全培养基，并使细胞生长4天，直到细胞汇合度达到约80-90％。

对于从CellSTACK烧瓶中采集细胞，除去培养基，添加0.25％胰蛋白酶-EDTA后将细胞在37℃下孵育6-8分钟。此外，为了抑制胰蛋白酶活性，将在DPBS(不含Ca++、Mg++)中制备的200μL的2％MSC筛选的FBS添加到细胞中，然后将悬浮液收集在50mL离心管中并以200×g离心10分钟。将悬浮液进一步重悬于最终体积为20mL的完全培养基中，并注入中空纤维生物反应器系统中。

2.2.FiberCell中空纤维生物反应器中hMSC的3D培养

将细胞以90-220×10⁶个细胞/筒(20-kD MWCO，4000cm²，聚砜纤维筒)接种在单独的中空纤维生物反应器中，并维持在无异源的完全培养基中，其中根据制造商的说明制备和使用中空纤维生物反应器系统。所有预接种步骤均使用无菌D-PBS-/-进行。注射细胞悬浮液之前，从培养基储液器中抽取1mL培养基，使用葡萄糖仪验证总葡萄糖含量，并使用乳酸检测试剂盒(50μL稀释1000倍的培养基)验证L(+)-乳酸含量。为了将细胞接种到生物反应器系统中，按照制造商的程序将制备的细胞悬浮液(20mL)注入筒中。在28天细胞接种期的前2-3天，脉动灌注泵的流速设置为每分钟22次。

细胞外毛细管空间中的培养基体积维持在250mL，并从28天细胞接种期的第3-17天以每分钟25次的系统流速循环到生物反应器中。第17天后，培养基体积加倍至500mL，流速相同。每2-3天从培养基储液器中收集1mL等份培养基，以监测葡萄糖含量和pH。25天培养期结束时，使用40mL胰蛋白酶-EDTA 0回收hMSC后回收条件培养基，将25％细胞注射到毛细血管外空间并在37℃下孵育10分钟。使用PBS将胰蛋白酶消化的细胞推过，直至获得60mL的细胞悬浮液。将采集的细胞悬浮液进一步用等体积的在DPBS(不含Ca++、Mg++)中制备的2％MSC筛选的FBS淬灭，并在200×g下离心10分钟，并使用台盼蓝排除试剂盒进行细胞活力计数，然后进行下游分析。。

实施例3

干细胞的引发

本实施例展示了本公开的重要方面之一，其为如实施例1中所述的源自各种来源的干细胞的引发。干细胞的引发是在不同引发剂(如分子量小于800Da的小分子和分子量大于800Da的大分子)的存在下进行的。用一种或多种引发剂(分别为单一引发或组合引发)对干细胞进行引发以增强MSC的再生、干性、抗炎和抗纤维化特性。初始MSC或引发的MSC可以本身使用或者与初始外泌体或引发的外泌体(通过如随后实施例中描述的方法获得)一起用于治疗应用。

3.1本公开中使用的引发剂

3.1.1.用小分子引发干细胞

在不存在或存在物理诱导剂(缺氧)的情况下，使用各种小分子(疏水剂)(包括但不限于SIRT 1激活剂、Nrf2激活剂)通过引发进行再生增强(许可增强体外和体内的干性、活力和植入能力)。由于这些化合物(小分子)的大多数本质上是疏水性的，因此不溶于水，首先将它们以高浓度溶解在无毒的有机溶剂(如二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、丙酮等)中，随后在水性培养基(PBS、盐水或细胞培养基)中稀释以产生工作浓度或配制在基于脂质的载体(例如脂质体)中，用于治疗MSC。

表5列出了引发剂(小分子)以及工作浓度和处理持续时间。

表5

沉默信息调节因子1 (SIRT 1)激活剂：在一个实例中，小分子是沉默信息调节因子1(SIRT1)激活剂。SIRT1是一种NAD依赖性组蛋白脱乙酰酶，在细胞代谢、细胞存活细胞衰老、DNA修复、炎症、细胞增殖和神经退行性疾病中发挥重要作用(Zhu,Y.g.,et al.,Humanmesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichia coliendotoxin-induced acute lung injury in mice.Stem cells,2014.32(1):p.116-125)。SIRT1激活剂包括但不限于SRT-2104、SRT-1720、反式白藜芦醇。

核因子红系2相关因子2(Nrf2)激活剂：核因子红系2相关因子2(Nrf2)在大多数真核细胞中普遍表达，并起到诱导细胞广泛防御外源性和内源性应激(包括氧化剂、外源性物质和过量营养/代谢产物供应)的作用。Nrf2激活剂是干细胞静止、存活、自我更新、增殖、衰老和分化的关键调节因子。

Nrf2激活剂包括但不限于富马酸二甲酯(DMF)、2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-酸的咪唑衍生物(CDDO-Im)和4-衣康酸辛酯(4-OI)。其他激活剂包括家族：芳基环己基吡唑类、磺酰基香豆素类、含有1,4-二氨基萘核的化合物、苯磺酰基嘧啶酮、含有1,2,3,4-四氢异喹啉核的化合物。

可在本公开内容中用作引发剂的Nrf2诱导肽(Nrf2/Keap相互作用的阻断剂)：LDEETGEFL-NH2、(NH2-RKKRRQRRR-PLFAERLDEETGEFLPNH2)、Ac-DPETGEL-OH、Ac-DEETGEF-OH、LQLDEETGEFLPIQGK(MR121)-OH、Ac-LDEETGEFL-NH、AcDPETGEL-NH2、Ac-NPETGEL-OH。

3.1.2.缺氧介导的引发

缺氧引发是一种体内MSC生态位微环境的模拟特性，它有提高MSC的再生、存活和血管生成潜力。缺氧在MSC扩增过程中调节细胞代谢，提供对氧化应激的抵抗力，并提高缺血微环境中的植入和生存能力。在缺氧引发中检测到HIF-1α诱导，并且HIF-1α过表达显示与MSC的血管生成能力相关的miR-15、miR-16、mIR-17、miR-31、miR-126、miR-145、miR-221、miR-222、miR-320、miR-424的诱导。

在本公开中，缺氧介导的引发是在0.2-10％范围内的氧气存在下完成的。

3.1.3.光介导的引发

光介导的引发或光生物调节是另一种诱导平台，涉及使用可见光和近红外光谱中的非电离形式光源。这种非热过程在内源生色团的影响下导致生物尺度的光物理和光化学过程。所涉及的光源的波长为以下范围(300-650nm和800-1400nm)，而光能量为0.5-4J/cm²。研究表明，低密度和高密度的MSC增殖也受到辐照度(5-20mW/cm²)的影响，辐照度可以是单剂量辐照度或多剂量辐照度。

3.1.4.用大分子引发干细胞

在本公开中，大分子用于引发干细胞，其中大分子是指生物制剂，如蛋白质、脂质、核酸、生长因子、细胞因子、条件培养基的成分等。为了本公开的目的，使用如实施例1中所述的初始MSC衍生的条件培养基来引发源自不同来源的初始MSC。

在本公开中，初始MSC被称为A，源自初始MSC的外泌体(A)被称为B。使用小分子如核因子红系相关因子2(Nrf2)激活剂、沉默信息调节因子(SIRT1)激活剂和大分子引发A，称为A’，源自引发的MSC(A’)的外泌体称为B’。使用单一诱导剂分子的单一引发和使用小分子或大分子的组合引发的过程在下面的实施例中描述。

3.2.用CSSC条件培养基的hBM-MSC的单一引发方案

根据实施例1.2中描述的过程进行维持作为第4代细胞的hBM-MSC。使用补充有体积百分比在10-20％范围内的角膜基质干细胞(CSSC)衍生的条件培养基(大分子)的培养基进行hBM-MSC的引发。在CSSC维持期间，进行CSSC的无异源培养并收集用于引发的条件培养基，最终浓度为20％。进一步扩增hBM-MSC直至80-85％汇合(即43000-50000个细胞/cm²)并用于外泌体生产。如上面实施例1.2和1.1.2中所述进行条件培养基收集和处理。

表6：用CSSC条件培养基的hBM-MSC的单一引发方案。

表6

3.3.用Nrf2激活剂的hBM-MSC的单一引发方案

根据上述实施例1.2中描述的过程维持作为第4代细胞的hBM-MSC，并用Nrf2激活剂或诱导剂(DMF，4-OI)处理细胞。一旦细胞达到70-80％汇合，用PBS清洗，并补充具有100μM DMF或100μM 4-OI的新鲜培养基培养24小时，然后切换到EV收集，然后如上面实施例1.2和1.1.2中所述进行条件培养基收集和处理程序。

表7：用Nrf2激活剂的hBM-MSC的单一引发方案。

表7

3.4用SIRT1激活剂(SRT2104或反式白藜芦醇)的UCMSC的单一引发方案(EXO变体 B’)

在浓度低于SRT-2104的IC50值的SIRT1激活剂(SRT-2104或Zrans-白藜芦醇)存在下，分别培养两种UC-MSC细胞类型。对于两个亚群，使用0.04-3.78nM或24-1962ng/mL的浓度范围测定SRT-2104在UC-MSC细胞中的IC50值。用于UCMSC引发的RSV工作浓度范围为0.1-2.5μM或22.85-571.25μg/mL。UC-MSC在SRT-2104或RSV存在下培养至80％汇合。随后，进行EV收集处理、条件培养基收集以生产引发的外泌体。引发后，使用ELISA测定筛选UC-MSC引发的条件培养基/分泌组以检测两种情况下TNF-α、IFN-γ、IL-10和HGF的表达。

通过ELISA检测外泌体货物分子如SIRT1、HGF、IDO、IL-10、NRF2、VEGF和NGF的表达水平来表征引发的外泌体变体，并根据这些结果，最终确定用于UC-MSC引发的SRT2104或RSV治疗的浓度。

3.5用Nrf2激活剂(DMF或4-OI或CDDO-IM)的UC-MSC的单一引发方案-(EXO变体B’)

按照实施例1.3中描述的过程培养UC-MSC。传代至5-6传代阶段的细胞用于引发的外泌体(B’)生产。用Nrf2激活剂(DMF、4-OI或CDDO-Im)处理UC-MSC，其工作浓度范围为如DMF((1.44-36mg/mL)或(10-250μM))、4OI((0.0024-0.060)mg/mL或(10-250))μM、CDDO-Im((2.56-128μg/mL)或(0.2-1))μM。

引发后，用ELISA测定试剂盒筛选UC-MSC引发的条件培养基/分泌组以检测TNF-α、IFN-γ、IL-10和HGF的表达水平。通过ELISA测定对引发的外泌体变体进行表征，以检测外泌体货物分子如Nrf2、IL-10、HGF和VEGF的表达水平，其中最终确定DMF或4-OI或CDDO-Im的浓度用于UC-MSC引发。

3.6用CSSC衍生条件培养基和Nrf2激活剂组合引发hBM-MSC-(EXO变体B’)

hBM-MSC的引发是用补充有CSSC衍生的条件培养基(体积百分比在10-20％范围内)的培养基进行的。在CSSC维持期间，进行角膜基质干细胞(CSSC)的无异源培养，并收集最终浓度为20％的用于引发的条件培养基。将hBM-MSC细胞解冻并以2000-3000个细胞/cm²接种在T225 cm²烧瓶和补充有10-20％CSSC衍生的条件培养基的培养基中。一旦hBM-MSC达到约70-80％汇合，将细胞在PBS中洗涤，然后在切换到细胞外囊泡(EV)收集培养基之前用Nrf2激活剂(例如100μM DMF或100μM 4-OI)补充细胞24-72小时。

表8显示了用CSSC条件培养基和Nrf2激活剂的hBM-MSC的组合引发方案-(Exo变体B’)。

表8

3.7在缺氧情况下用SIRT1激活剂和Nrf2激活剂组合引发UC-MSC-(EXO变体B’)

按照实施例1.3中描述的方案培养UC-MSC和选定的UC-MSC亚群，然后引发扩增的UC-MSC干细胞群，并且它是在存在SIRT1激活剂如SRT-2104(0.00001-0.01M)或反式白藜芦醇(RSV)(0.1-10μM))的情况下的亚群以达到80％汇合(例如，细胞密度为60-100K个细胞/cm²)，然后用Nrf2激活剂(如10-250μM的DMF或10-250μM的4-OI)处理细胞24-72小时。使用ELISA进一步筛选条件培养基以检测抗炎分子表达。此外，从组合引发组(缺氧情况下，SIRT1激活剂和Nrf2激活剂)中分离UC-MSC引发的外泌体变体(B’)。然后通过ELISA检测货物分子来表征外泌体的引发的变体。

3.8在缺氧情况下用SIRT1激活剂和Nrf2激活剂组合引发US-MSC-(EXO变体B’)

按照实施例1.3中描述的方案培养UC-MSC，随后用0.00001-0.01μM的SRT-2104或0.1-10μM的反式白藜芦醇(RSV)引发。缺氧是在缺氧/常氧循环(8-20个循环，间隔30-90分钟)中产生的。对于缺氧，氧气浓度为0.5-10％，而在常氧情况下，氧气浓度为14-22％。然后在细胞达到80％汇合后，用10-250μM的Nrf2激活剂DMF或10-250μM的4-OI处理细胞24-72小时。如上面实施例1.2和1.1.2中所述进行EV收集暴露、条件培养基收集。使用ELISA进一步筛选条件培养基以检测抗炎分子表达。从组合引发组(缺氧情况下的SRT1激活剂和Nrf2激活剂)中分离UC-MSC引发的外泌体变体，并且通过ELISA检测各种货物分子来表征外泌体的引发的变体。

3.9.在缺氧情况下用SIRT1激活剂(SRT-2104或反式白藜芦醇)的UC-MSC的组合引 发方案-(EXO变体B’)

按照实施例1.3中描述的方案将UC-MSC培养至第5-6代，并在缺氧/常氧循环中产生缺氧(8-20个循环，间隔30-90分钟)。对于缺氧，氧气浓度为0.5-10％，在常氧情况下，使用三气室-培养箱装置，氧气浓度为14-22％。一旦UC-MSC在低氧处理中达到80％汇合，就在分泌组和衍生的外泌体变体中检查细胞存活率、HIF-1α、HGF、VEGF和TNF-α表达。将分泌组和外泌体谱与细胞维持在常氧条件下的UC-MSC衍生的外泌体进行比较。此外，使用0.00001-0.01μM的SRT-2104或0.1-10μM的反式白藜芦醇(RSV)在交替缺氧/常氧循环存在下诱导UC-MSC引发。如上面实施例1.2和1.1.2中所述进行EV收集暴露、条件培养基收集。

3.10用Nrf2激活剂(缺氧情况下DMF或4-OI)的UC-MSC的组合引发方案(EXO变体 B’)

如上面实施例3.8所述，将UC-MSC培养至传代并产生缺氧。在转变为EV收集之前，用Nrf2激活剂：10-250μm的DMF或10-250μm的4-OI处理UC-MSC 24-72小时。根据上面实施例1.2和1.1.2中描述的方案进行EV收集暴露、条件培养基收集。分泌组通过ELISA检测Nrf2、HIF-1α、HGF、VEGF、sFLTl的水平来表征，而引发的外泌体变体(B’)通过ELISA检测外泌体货物分子如Nrf2、HIF-1α、VEGF、sFLT1、IL-10、SIRT1的表达的水平来表征。

3.11全反式视黄酸(ATRA)干细胞单一引发方案

按照上述方案培养UC-MSC/hBM-MSC。第5-6代用于引发的外泌体生产，并且在转变为EV收集之前，用工作浓度为(0.1-500)μM的ATRA诱导剂处理UC-MSC/hBM-MSC，处理24-72小时。如上所述进行强力EV收集孵育、条件培养基收集。引发后，用ELISA测定试剂盒对UC-MSC/hBM-MSC引发的条件培养基/分泌组进行筛选，以检测COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2和Ang-4的表达水平。然后通过ELISA测定对引发的外泌体变体进行表征，以检测外泌体货物分子如COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2和Ang-4的表达水平。根据获得的结果，最终确定用于UC-MSC/hBM-MSC引发的ATRA浓度。

ATRA被发现可以增加MSC的活力。这是通过用不同浓度的ATRA(0.1μM至500μM)处理MSC 24和48小时，并通过MTT测定检查它们的活力来确定的。除0.1μmol/L ATRA外，所有处理的MSC中的MSC活力均显著更高。ATRA提高了PGE2水平。用不同浓度的ATRA(1、10、100μmol/L)在MSC中以剂量依赖性方式预处理MSC可显著增加MSC中PGE2的水平。ATRA增加了涉及MSC存活、迁移和血管生成的基因表达。通过实时定量PCR评估COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2和Ang-4的mRNA水平，并且当用ATRA(1、10、100μmol/L)处理MSC时，该水平以剂量依赖性方式升高。

3.12.在缺氧情况下用Nrf2激活剂、SIRT1激活剂、ATRA的干细胞的组合引发方案 (EXO变体B’)

如上所述培养UC-MSC/hBM-MSC直至第(5-6)代，并如本文所述产生缺氧。在转变为EV收集之前，用Nrf2激活剂(DMF、4-OI)处理UC-MSC/hBM-MSC，处理24-72小时。如上所述进行EV收集暴露、条件培养基收集。

通过ELISA检测Nrf2、HIF-1α、HGF、VEGF、sFLT1的水平来表征分泌组。

通过ELISA检测外泌体货物分子如Nrf2、HIF-1α、VEGF、sFLT1、IL-10、SIRT1的表达水平来表征引发的外泌体变体。

3.13.缺氧情况下用ATRA诱导剂的UC-MSC/hBM-MSC的组合引发方案(EXO变体B’)

如上所述培养UC-MSC/hBM-MSC直至第(5-6)代，并如上所述产生缺氧。在转变为EV收集之前，用ATRA诱导剂(0.1-500)μM处理UC-MSC/hBM-MSC，处理24-72小时。如上所述进行强力EV收集暴露、条件培养基收集。通过ELISA检测COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2和Ang-4的水平进一步表征分泌组。

通过ELISA检测外泌体货物分子如COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2和Ang-4的表达水平来表征引发的外泌体变体。

3.14.在缺氧情况下用SIRT1诱导剂和ATRA组合引发UC-MSC/hBM-MSC(EXO变体B’)

在SRT2104激活剂或RSV诱导引发后，如上所述培养UC-MSC/hBM-MSC。缺氧是在缺氧/常氧循环(8-20个循环，间隔30-90分钟)中产生的。缺氧时，氧气浓度保持在0.5-10％，常氧时氧气浓度为14-22％。细胞达到80％汇合后，用(0.1-500)μM的ATRA诱导处理24-72小时。如上所述进行强力EV暴露、条件培养基收集。

使用ELISA检测COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2和Ang-4的表达来筛选条件培养基。

按照优化的外泌体分离方案，从组合引发组(缺氧情况下，SRT1激活剂和ATRA诱导剂)中分离UC-MSC/hBM-MSC引发的外泌体变体。引发的外泌体变体通过ELISA检测各种货物分子来表征。

通过质谱分析彻底表征不同的UC-MSC/hBM-MSC引发的外泌体变体，以通过纳米串分析等技术检测蛋白质图谱和miRNA图谱。使用体外测定如2D划痕测定、抗炎测定、抗纤维化、促/抗血管生成和神经再支配测定测试每种外泌体变体的功效。根据不同变体的功效，选择评分最高的外泌体变体并继续进行抗炎疾病模型的体内临床前试验。LPS诱导的ARDS诱导和博来霉素治疗的肺损伤模型将用于评分最高的外泌体的体内功效测试。

实施例4

外泌体的分离和纯化

分别根据实施例1.2.2和1.3.2中描述的过程从hBM-MSC和UC-MSC收集条件培养基。

获得的条件培养基直接用作分泌组或进行超速离心以分离外泌体。使用三种方法从条件培养基/分泌组中分离外泌体：(i)单步超速离心；(ii)基于蔗糖的缓冲密度超速离心和(iii)碘克沙醇密度梯度超速离心。

通过下述三种方法从条件培养基/分泌组中分离外泌体。

4.1基于蔗糖的缓冲密度超速离心：

按照以下步骤使用基于蔗糖的缓冲密度离心纯化外泌体：

(i)细胞达到80％汇合后，除去培养基，并在1X PBS(20mL)中洗涤细胞，然后将260mL EV收集培养基添加到烧瓶中，然后将烧瓶在37℃和5％CO₂下孵育72小时。

(ii)收集上清液并进行如下预处理步骤：

a.将培养基在4℃下以300 x g离心10分钟，收集上清液。

b.将上清液在4℃下以3000×g离心20分钟，收集上清液。

c.将上清液在4℃下以13000 x g离心30分钟，收集上清液。

d.通过0.45微米过滤器过滤培养基

e.接下来，通过0.22微米过滤器过滤培养基。

(iii)条件培养基在4℃下短期储存(24小时)，或在-80℃下长期储存(1个月)。然而，如果立即处理培养基或冷冻，则将条件培养基置于4℃，然后进行如下所述的方案：

a.将条件培养基在4℃下以100,000 x g离心90分钟；

b.小心地除去上清液。在管底部观察到透明沉淀。

c.将富集的外泌体转移到含有30％蔗糖(1M)的超速离心管中。

d.将速度设置为100000g，在4℃下保持2小时，并将加速度和减速度设置为零。

e.小心地除去上清液，并将外泌体重悬于无菌1X PBS中。

F.将外泌体等分，并储存在-80℃。

4.2单步超速离心：

按照以下步骤使用单步离心纯化外泌体：

(i)细胞80％汇合后，除去培养基，并在1X PBS(20mL)中洗涤细胞。弃去PBS，并将40-45mL/烧瓶的EV收集培养基添加到烧瓶中，然后在37℃和5％CO₂下孵育72小时。收集上清液并进行如下预处理步骤：

a.将培养基在4℃下以300×g离心10分钟，收集上清液。

b.将上清液在4℃下以3000×g离心20分钟，收集上清液。

c.将上清液在4℃下以13000×g离心30分钟，收集上清液。

d.通过0.45微米过滤器过滤培养基

e.接下来，通过0.22微米过滤器过滤培养基。

条件培养基在4℃下短期储存(24小时)，或在-80℃下长期储存(1个月)，而如果立即处理或使用解冻的样品进行处理，则使用以下方案：

a.将条件培养基在4℃下以100,000 x g离心90分钟。

b.小心地除去上清液。在管底部观察到透明沉淀。

c.将沉淀溶解在PBS/盐水中。0.5mL的粗外泌体储存在-80℃下用于QC。

4.3.碘克沙醇密度梯度超速离心：

细胞达到80％汇合(例如，43000-50000个细胞/cm²)后，除去培养基，并在1X PBS(20mL)中洗涤细胞。弃去PBS，并将40-45mL/瓶的EV收集培养基添加到烧瓶中，然后在37℃和5％ CO₂下孵育72小时。收集上清液并立即进行如下所述的预处理步骤：

a.将培养基在4℃下以300×g离心10分钟，收集上清液。

b.将上清液在4℃下以3000×g离心20分钟，收集上清液。

c.将上清液在4℃下以13000×g离心30分钟，收集上清液。

d.通过0.45微米过滤器过滤培养基

e.接下来，通过0.22微米过滤器过滤培养基。

条件培养基在4℃下短期储存(24小时)，或在-80℃下长期储存(1个月)，而如果立即处理或使用解冻的样品进行处理，则使用以下方案：

1.将条件培养基在4℃下以100,000 x g离心90分钟。

2.小心地除去上清液。在管底部观察到透明沉淀。

3.将沉淀溶解在36mL EV收集培养基中(每300mL起始条件培养基36mL)。将0.5ml粗外泌体储存在-80℃用于QC。

密度梯度超速离心(DGUC)：

通过将3mL含有NaCl(150mM)和25mM Tris:HCl(pH 7.4)的10％w/v IDX溶液(Sigma#D1556)漂浮在3mL 55％w/v IDX溶液上来制备碘克沙醇(IDX)梯度IDX。将浓缩的条件培养基(6mL)漂浮在IDX垫的顶部，并使用Beckman Coulter SW 40Ti转子在100,000 x g(4℃)下超速离心4.5小时。从冰上梯度的顶部收集十二个级分(每个级分1mL)，并将每个级分收集到预冷的1.5mL管中。将级分-9转移到新鲜的超速离心管中，并将11mL PBS添加到1mL级分中。使用Beckman Coulter SW 40Ti转子在4℃下，在Optima XPN-100超速离心机中以100,000 x g重复超速离心4小时。弃去上清液，将外泌体重悬于1mL PBS中。制备50-100μL的不同等分试样，并在4℃下短期(2-3天)储存，在-80℃下长期储存。

上述所有三种方法之后均使用尺寸排阻色谱法(使用Captocore 700柱)进行第二轮纯化。外泌体纯化的方法详细描述于未决申请PCT/IN2020/050622、PCT/IN2020/050623、PCT/IN2020/050653中，这些申请整体并入本公开中。尽管本实施例展示了从hBM-MSC和UC-MSC收集的条件培养基中分离和纯化外泌体，然而，可以预期本领域技术人员可以从收集自干细胞(包括但不限于CSSC、WJMSC)的条件培养基中获得外泌体。本文所述的干细胞可以是初始干细胞或如实施例3中所述的用不同引发剂引发的干细胞，其中初始干细胞(A)/引发的干细胞(A’)用于进一步收集条件培养基，其通过遵循本实施例中描述的方案，可以分别用于获得初始外泌体(B)/引发的外泌体(B’)。

实施例5

外泌体的表征

如实施例4中所述采集或纯化的外泌体通过诸如纳米粒子追踪分析(NTA)、透射电子显微镜(TEM)、蛋白质印迹、质谱分析以及通过实时PCR和RNAseq分析RNA含量等方法进行表征。所表征的外泌体变体是初始外泌体(B)或引发的外泌体(B’)。

5.1NTA分析

将纯化的外泌体溶解在无菌PBS中，并将外泌体级分的单独等分试样(20-50μl)储存在-80℃。使用0.22μM注射器过滤器/无核酸酶水过滤的高压灭菌的milli Q用于样品稀释。1:500稀释的外泌体样品用于NTA数据采集。通过移液混合后，从等分试样中取出2μl外泌体样品。将其添加到1.5ml微量离心管中的998μl milli Q中，并用1ml移液器混合多次。仪器信息和数据采集设置是通过使用Malvern的Nanosight LM 10进行数据采集完成的，其中设置如下：相机级别16、增益3和三次运行，每次运行30秒和阈值。

5.2外泌体的透射电子显微镜成像

将外泌体沉淀用在0.1M二甲胂酸钠溶液(pH 7.0)中的1mL 2.5％戊二醛在4℃下固定1小时。除去固定剂并在室温下用1mL 0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗沉淀。重复三次，每个循环持续10分钟。样品用1mL 2％四氧化锇在4℃下固定1小时。除去固定剂并用0.1M二甲胂酸钠缓冲液每10分钟冲洗三次。使用分级丙酮系列(分别为50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％)将样品在摇床上孵育10分钟。除去丙酮，将3:1丙酮:低粘度包埋混合物的溶液孵育30分钟以获得外泌体沉淀。此外，再加入1:1丙酮:低粘度包埋混合物培养基，孵育30分钟。除去培养基，加入1:3丙酮:低粘度包埋混合物培养基，然后孵育30分钟。此外，除去培养基并加入100％低粘度包埋混合物并在室温下孵育过夜。

使用包埋模具将样品包埋在纯低粘度包埋混合物中，并在65℃下烘烤24h。使用超薄切片机获得60nm厚的切片并用2％乙酸铀酰20分钟和柠檬酸铅10分钟进行双染，以在80kV的透射电子显微镜下观察网格。

5.3:蛋白质印迹

通过如下所述的两个过程进行蛋白质印迹。

5.3.1:方案1

将相当于2亿个颗粒的20微升外泌体裂解物与20μl 2X Laemmli样品缓冲液(对于CD63、CD9和CD81，不含β巯基乙醇)混合。将其在95℃下加热10分钟，涡旋后，将其加载到凝胶中(12％ SDS-PAGE)。对于Alix和TSG101，根据抗体数据表样品制备，使用具有β巯基乙醇的2X Laemmli样品缓冲液(例如，在还原条件下)。

5.3.2方案2

将约0.4 2n的外泌体冻干，然后将20μl无核酸酶的水添加到冻干的外泌体中。随后添加20μl 2X Laemmli样品缓冲液，并在95℃下加热10分钟。涡旋后，将其加载到凝胶中(12％ SDS-PAGE)。

将PVDF膜与其所嵌入的两层纸一起切割成适当的尺寸。用镊子分离白色膜并浸入50mL甲醇中以活化膜。保持1分钟，并用蒸馏水冲洗。然后将活化的膜转移至50mL 1X转移缓冲液中。清洁转移装置盒，并将吸水纸在约30ml 1X转移缓冲液中润湿。将一张转印吸水滤纸放入盒中，然后放入膜、凝胶和滤纸。使用印迹滚筒确保印迹和凝胶之间的气泡被去除。转移设置为25V和2.5A、60分钟。

转移完成后，用镊子小心地取出PVDF膜，并在室温下在封闭液(50mL 1X TBST中的5％脱脂牛奶溶液)中在摇床上孵育1小时。然后使用镊子将PVDF膜从封闭溶液中取出，并在室温下在摇床上进行1X TBST洗涤10分钟。使用干净的镊子根据蛋白质大小将膜小心地切成条带。

将PVDF条带在各自的相对于目标蛋白质的一抗(在1X TBS中的0.1％BSA中稀释)中在摇床上于40℃下孵育过夜。第二天将PVDF膜从一抗上取下，并在1X TBST缓冲液中冲洗6次(每次冲洗5分钟)。将一抗储存在-20℃下以重复使用。将膜与HRP缀合的二抗(在1X TBS中的0.1％ BSA中稀释)在室温下在摇床上孵育2小时。用1X TBST缓冲液洗涤膜6次(每次冲洗5分钟)，最后一次洗涤后，在显影前将膜保留在转移缓冲液中。在黑暗中使用ECL化学发光试剂进行印迹显影(活性试剂按照制造商的指南制备)。

5.4质谱

5.4.1样品制备：

将样品在2-8℃解冻，并将25μL样品与25μL裂解缓冲液(0.1％ Triton-X100、100mM DTT、150mM Tris-HCl pH 8.0)混合，然后在室温下孵育1小时和短暂的超声处理。将获得的样品加载到预制SDS-PAGE凝胶(Invitrogen NuPage 4-12％ Bis-Tris梯度凝胶)上的三个不同泳道中。在恒定电压下进行短暂的电泳(<10分钟)以去除蛋白质样品中的去污剂。使用Gel-Code蓝色染色试剂使蛋白质条带可视化。采用包括半胱氨酸残基还原和烷基化的凝胶内胰蛋白酶蛋白质消化方法来消化蛋白质。合并获得的胰蛋白酶肽并使用C18zip-tip进行澄清。将Zip-tip洗脱液浓缩至接近干燥，并溶解在8μL 0.1％ FA中。进行三次重复注射，每次2μL，以鉴定蛋白质。

5.4.2基于质谱的蛋白质鉴定

使用纳流装置，在反相液相色谱柱上通过0.1％甲酸(FA)和乙腈的线性梯度分离胰蛋白酶肽，历时110分钟(总运行时间140分钟)。数据是在充分优化的条件下以数据相关模式下收集的。在优化条件标准中，在2μg负载下He-La细胞胰蛋白酶消化可鉴定6000种蛋白质。使用Maxquant软件在人类蛋白质组数据库中搜索获得的测试样品的MS和MS/MS数据。蛋白质鉴定按照以下标准进行：(a)胰蛋白酶消化的肽允许有4个漏切，(b)肽耐受性<10ppm，(c)>1个独特肽，(d)FDR<1％，和(e)固定的修饰-半胱氨酸的脲甲基化和可变修饰-蛋氨酸的氧化。

表9显示了蛋白质生物标志物的列表，这些生物标志物可以作为引发的外泌体变体中的货物存在，并且可以使用一种或多种标准的蛋白质检测方法(如蛋白质印迹、ELISA或质谱)进行检测。

表9

5.5外泌体RNA分离

5.5.1外泌体RNA分离方案

根据制造商的方案，使用Qiagen的RNeasy Mini试剂盒从初始BM-MSC衍生的外泌体中提取RNA。考虑使用50亿个外泌体来分离外泌体RNA。RNA定量在Nanodrop和Qubit中进行，Qubit microRNA测定用于检查miRNA/小RNA分子的存在。

5.5.2从100亿个冻干外泌体中分离外泌体RNA

使用miRVana miRNA分离试剂盒(目录号：AM1560)进行RNA提取，并进行4次洗脱，体积分别为25μl、25μl、50μl和50μl。在Nanodrop和Qubit中进行RNA定量，Qubit microRNA测定用于检查miRNA/小RNA分子的存在。

5.5.3外泌体miRNA分析

提取的外泌体RNA的不同洗脱液在生物分析仪中运行，以检查小RNA和miRNA的存在。洗脱液汇集在一起，并被制备用于使用NanoString平台进行miRNA图谱分析。所有过程均根据制造商的说明进行。

表10显示了在引发的外泌体变体中分析的miRNA列表。

表10

表11显示了在引发的外泌体变体中分析的mRNA列表

表11

5.6实时PCR

使用RNAeasy和mirVanaTM(n＝3)分离的总RNA，使用Turbo DNase Free试剂盒(Ambion)进行DNase处理。根据制造商的方案，使用miRCURYTM LNATM micro-PCR系统进行第一链cDNA合成和实时PCR。简而言之，每个cDNA合成均使用固定体积的总RNA、miR-451特异性反向引物(基因ID：574411)和第一链cDNA合成试剂盒试剂一式两份进行，并在50℃下孵育30分钟，然后85℃孵育10分钟。然后将每个cDNA样品按1:10稀释，并与miRCURYTMLNATM Green反应混合物、通用引物和LNATM PCR miR-451特异性引物一起一式两份使用。PCR在95℃下进行10分钟；95℃进行10s+60℃进行5s，共40个循环，并通过每0.5℃5s的熔解曲线最终确定。平行运行对照样品。CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)用于cDNA和实时PCR反应。

实施例6

外泌体的功能表征

通过评估以下测定来对外泌体进行功能表征：a)划痕测定(伤口愈合能力)；b)抗炎测定；c)抗纤维化测定；d)神经再支配测定；e)血管生成(抗/促)测定

6.1划痕测定

永生化人角膜上皮细胞(hTCEPI)用于2D划痕测定。hTECPI细胞以5000个细胞/cm²的密度在无血清培养基中接种在组织培养处理的培养皿中，并允许细胞生长直至其汇合，然后穿过孔的中心产生划痕。移去培养基并用lx PBS洗涤细胞以去除漂浮细胞，然后将含有(1-20)x10⁸个外泌体/mL的培养基添加到每个孔中。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育，并且每6小时评估一次划痕闭合直至完全闭合。在不同时间点(每6小时)捕获细胞图像，并使用ImageJ定量伤口宽度。所采取的对照是仅培养基(无外泌体)或外泌体耗尽的对照/培养基。

6.2抗炎测定

将RAW264.7巨噬细胞以5000个细胞/cm²的密度接种到组织培养皿中的完全培养基(RPMI+10％ FBS)，并使细胞生长直至80％汇合。将细胞在无血清培养基中饥饿16小时并用LPS(10ng/mL)在存在或不存在培养基中补充(1-20)X10⁸个外泌体/mL的情况下刺激4小时。处理后收集培养基并通过ELISA测量分泌的细胞因子水平。此外，裂解细胞，并通过qPCR测量细胞因子的转录水平，以补充分泌的蛋白质水平。所采取的对照是仅培养基(无外泌体)或外泌体耗尽的对照/培养基。

6.3抗纤维化测定

将人角膜上皮细胞以5000个细胞/cm²的密度接种到组织培养处理的培养皿中的无血清培养基，并使细胞生长直至80％汇合。在存在或不存在培养基中补充(1-20)X10⁸个外泌体/mL的情况下，用TGF-β(10ng/mL)处理细胞24小时。通过免疫荧光表征I型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白的表达来评估纤维化诱导的程度。所采取的对照是仅培养基(无外泌体)或外泌体耗尽的对照/培养基。

6.4神经再生测定

将PC12细胞以5000个细胞/cm²的接种密度接种在胶原蛋白涂布的板上，并在细胞接种24小时后用无血清培养基替换培养基，并用(1-20)X10⁸个外泌体/mL处理。每隔24小时捕获一次图像，最长可达3-5天。所采取的对照是仅培养基(无外泌体)或外泌体耗尽的对照/培养基作为阴性对照，而NGF(20ng/mL)作为阳性对照。

6.5血管生成(抗/促)测定

使用人血管内皮细胞(HUVEC)或冠状动脉内皮细胞(CAEC)进行测定。HUVEC在补充有10％ FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中生长24小时。测定前一天，如下对HUVEC细胞进行血清饥饿：从细胞中吸出培养基，添加补充有0.2％ FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM的还原血清培养基，并使细胞再生长24小时。随后，将300μL基质胶(生长因子减少)添加到24孔板中，并在37℃下固化30分钟。在存在或不存在(1-20)x10⁸个外泌体的情况下，将无血清培养基中的HUVEC(2x10⁴个/孔)悬浮于VEGF补充培养基(浓度)中24小时。按照制造商的说明使用Cell Tracker^TMGreen CMFDA对细胞进行染色，并使用免疫荧光染色检测管的形成。

6.6.细胞转化测定

使用含有3g/1D-葡萄糖、5％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM/HAM的F-12中的小鼠3T3细胞进行细胞转化测定。将3T3细胞(5000个细胞/孔)接种到Primaria^TM6孔板中，并在标准条件(37℃、5％ CO₂、95％湿度)下培养42天。接种后24小时用样品处理细胞，处理后3天更换培养基。此外，在第8、11、15、18天直至第21天添加肿瘤促进因子TPA(12-O-十四烷酰基-佛波醇-13-乙酸酯，0.3μg/ml，Sigma#79346)。42天后，用PBS洗涤细胞两次，用PBS/甲醇(50:50)固定3分钟，用100％冰冷的甲醇固定10分钟，最后用甲醇洗涤两次。

出于本公开的目的而采取的对照：(i)仅培养基(无外泌体)；(ii)外泌体耗尽的对照/培养基作为阴性对照；(iii)VEGF作为阳性对照。

实施例7

研究外泌体在临床前试验中的功效

基于不同变体的功效，如实施例8所述，选择评分最高的外泌体变体并继续用于抗炎疾病模型的体内临床前试验，其中应用所选择的外泌体变体用于特定组织(即无血管组织和血管组织)的再生。

7.1体内功效研究

在如下所述的多个体内急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型中进行临床前疗效研究。MSC衍生的外泌体用于一种或多种COVID-19相关ARDS体内小鼠模型：

·LPS诱导的肺损伤模型或

·博莱霉素诱导的肺纤维化模型

7.2动物模型

小鼠模型(8-10周龄)用于体内研究。所用小鼠品系为C57BL/6品系。

7.3施用方式

外泌体通过静脉内模式(i.v)组施用：第1组：盐水对照；第2组：UC-MSC-Exo(初始/引发的)。

7.4剂量计算

外泌体的剂量是根据对UC-MSC和外泌体用于治疗应用的可获得的临床和临床前数据的评估来确定的。

7.5临床前研究剂量(小鼠模型)

根据体重和表面积的差异计算人与动物剂量当量公式。

(i)小鼠剂量(每千克体重)＝人剂量(每千克体重)x12.3

(ii)人类剂量：外泌体以80-1600亿个的剂量施用(对于70kg的平均体重，13-26亿个/kg体重)。

外泌体以16-32亿个外泌体/kg体重的高剂量施用。

7.6LPS剂量(LPS诱导的肺损伤模型)

鉴于可获得的工作量，10mg至100-125mg之间的剂量被认为是合适的，以确保研究涵盖亚致死和致死浓度的剂量。预计100mg的剂量会在LPS施用后48-72小时诱导死亡。

7.7博来霉素剂量(博来霉素诱导的肺纤维化模型)

确定了博来霉素的单次气管内剂量(50μL，3U/kg(2mg/kg))。

7.8体内读数：

终端读数：

·存活率

·组织学：HandE、Masson三色或天狼星红

·总血细胞计数和差异血细胞计数的评估：自动分析仪

·纤维化和炎症标志物表征

·血清和BAL样本中的炎症细胞因子分析

·炎症细胞类型和亚群分析

时间读数：

·总血细胞计数和差异血细胞计数的评估：自动分析仪

·血清样本中的炎症细胞因子分析。

实施例8

从引发的BM-MSC生成治疗性富集的外泌体，用于无血管组织(角膜)再生。

根据蛋白质表达以及与相对于货物蛋白或生物标志物的更高再生潜力的相关性，评分最高的外泌体用于无血管组织再生。本实施例展示了通过经使用大分子(CSSC衍生的条件培养基(CSSC-CM))介导的骨髓衍生的间充质干细胞(hBM-MSC)的引发的富集的外泌体来进行无血管组织(即角膜)再生。

8.1源自用CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体

8.1.1CSSC条件培养基诱导hBM-MSC的引发

hBM-MSC在无异源培养基中培养，并替换10％和20％CSSC衍生的条件培养基(CSSC-CM)，以达到80-90％的汇合。然后将培养基转移至EV收集24-72小时，并收集引发的条件培养基(如实施例1.1和1.2中所述)，并通过碘克沙醇密度梯度法(如实施例4.4中所述)进行外泌体分离并获得富集的外泌体。均质级分F9被考虑用于进一步的功能分析。使用ELISA进行分泌组分析，检测HGF、VEGF、sFLT1、IL-6、NGF的水平。

图1A-1E显示源自用CSSC衍生的条件培养基引发的hBM-MSC的富集的外泌体的分泌组谱(参见实施例3.2)。图1A描绘了柱状图，其示出了与对照外泌体相比，源自用CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体分泌的肝细胞生长因子(HGF)的水平增加。同样，图1C-1E表明分别与对照外泌体相比，源自用CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体分泌的sFLT1、IL-6和神经生长因子(NGF)的水平增加。图IB表明与对照外泌体相比，源自用CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体的血管内皮生长因子(VEGF)的水平显著降低。这些结果表明，hBM-MSC可以用CSSC条件培养基引发，以产生治疗性富集的外泌体。

8.1.2不同CSSC条件培养基引发的外泌体变体的抗炎活性表征

使用RAW 264.7细胞测试了源自用CSSC条件培养基(CSSC-CM)引发的hBM-MSC的不同外泌体变体，以检测其抗炎活性。用脂多糖(LPS)结合蛋白处理RAW 264.7细胞，在外泌体存在的情况下诱导炎症，以检查外泌体在炎症中的预防/预防作用。如图2A-2B和2D-2E所示，源自用CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体变体降低了用LPS处理的RAW 264.7细胞中关键炎症细胞因子(例如IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ)的炎症细胞因子蛋白表达。此外，在用LPS刺激和用源自用CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体变体处理的RAW 264.7细胞中，总体炎症细胞因子基因表达也有所降低。图2A-3E表明源自hBM-MSC并用CSSC培养基条件化的外泌体变体通过减少关键炎症细胞因子(例如IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ)的炎症细胞因子表达和炎症细胞因子基因表达而具有抗炎活性。进一步地，从图3A-3E可以推断出，在LPS处理的RAW 264.7细胞中，源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂DMF两者引发的hBM-MSC的外泌体(参见实施例3.6)表现出抗炎细胞因子IL-10表达水平增加，以及IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低。

8.1.3CSSC条件培养基引发的不同外泌体变体的抗纤维化特性的表征

测试源自用CSSC条件培养基(CSSC-CM)引发的hBM-MSC(参见实施例3.2)的不同外泌体变体，以检测引发的外泌体的抗纤维化活性。为了测试外泌体变体的抗纤维化活性，用TGF-β处理人真皮成纤维细胞24小时(图4B)或用TGF-β和指定的外泌体(图4C-4F)共同处理以诱导纤维化(类似于实施例6.3)。将α-SMA表达作为纤维化标志物进行监测，以检查外泌体变体的功效。参考图4D-4E，可以观察到源自用20％和10％CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体能够抑制成纤维细胞中TGF-β诱导的α-SMA表达。与引发的外泌体(图4D-4E)相比，用源自hBM-MSC的初始外泌体处理的细胞表达α-SMA的程度更小(图4C)。与对照和初始外泌体处理相比，源自用20％和10％CSSC-CM引发的hBM-MSC的外泌体能够有效抑制成纤维细胞的纤维化。

8.2源自用Nrf2激活剂(DMF或4-OI)引发的hBM-MSC的外泌体

8.2.1Nrf2激活剂(DMF或4-OI)介导的hBM-MSC细胞引发以及分泌组和外泌体谱的表征

hBM-MSC在制造商推荐的无异源培养基中培养。hBM-MSC细胞生长至(80-90)％汇合，并用Nrf2激活剂(DMF-100μM)处理24小时，然后将细胞转移并维持在EV收集培养基中24-72小时(参见实施例3.3)。72小时后，收集条件培养基，并使用碘克沙醇密度梯度方案进行外泌体分离(如实施例4.4中所述)。

图5示出了定量初始外泌体、源自用各种Nrf2激活剂(例如DMF或4-OI)引发的hBM-MSC的外泌体和源自用其他引发剂如姜黄素引发的hBM-MSCS的外泌体的产量的柱状图。从图5可以看出，与未处理的(初始)外泌体和用其他引发剂(如姜黄素或姜黄素和DMF的组合)引发的外泌体相比，源自用Nrf2激活剂DMF或4-OI引发的hBM-MSC的外泌体各自产生更高的外泌体产量。或者，图5还表明Nrf2激活剂对细胞的外泌体分泌没有抑制作用，使其成为良好的引发剂。

8.2.2使用引发剂引发的细胞的分泌组标志物分析

hBM-MSC用各种引发剂(小分子)引发并收集分泌组(参见实施例3.2-3.6)。采用ELISA进行分泌组分析，检测HGF、VEGF、NGF、IL-6、sFLT1、SDF1的水平。图6A-6F描绘了来自用姜黄素、4-OI、DMF或姜黄素条件培养基和DMF的组合引发的hBM-MSC的HGF、VEGF、NGF、IL-6、sFLT1和SDF-1的分泌蛋白水平的定量柱状图。

与其他引发的变体和未处理的对照相比，Nrf2激活剂、4-OI和DMF各自产生显著增加的HGF分泌(图6A)。无论使用何种引发剂，VEGF分泌水平均未改变(图6C)。用DMF引发确实导致sFLT1的分泌增加(图6D)、NGF的分泌增加(图6E)和SDF的分泌增加(图6F)。进一步地，参照图6B可以观察到姜黄素和Nrf2激活剂(4-OI和DMF)各自减弱IL-6的分泌。值得注意的是，每种Nrf2激活剂(4-OI和DMF)增强NGF的分泌水平(图6E)。从图6A-6F也观察到，姜黄素条件培养基+DMF的组合显示对HGF、VEGF、NGF、IL-6、sFLT1、SDF1的水平没有显著影响。

8.2.3.源自用各种引发剂引发的细胞的外泌体的外泌体货物的分析。

参考图7A-7F。用指定的引发剂引发hBM-MSC，收集分泌组，并使用Pandorum优化的碘克沙醇密度梯度方法(参见实施例4.3)进行外泌体分离，使用ELISA在纯化级分9中检测以下项的水平：HGF(图7A)、VEGF(图7B)、sFLT1(图7C)、NGF(图7D)、TGF-β(图7E)和SDF1(图7F)。如图7D所示，与初始外泌体或源自用其他引发剂(如4-OI、姜黄素(CUR)或组合的姜黄素和DMF(CUR/DMF))引发的hBM-MSC的外泌体相比，源自DMF引发的hBM-MSC的外泌体含有显著更高水平的外泌体NGF。同样，与初始外泌体、姜黄素引发或4-OI引发的外泌体相比，用DMF引发hBM-MSC导致外泌体TGF-β增加。

8.2.4.源自引发的BM-MSC的外泌体的抗炎活性

使用RAW 264.7细胞测试源自用Nrf2激活剂DMF引发的hBM-MSC的外泌体变体(参见实施例6.2)，以检测其抗炎活性。用LPS处理RAW 264.7细胞，以在存在和不存在源自引发的hBM-MSC的外泌体的情况下诱导炎症，并通过ELISA测量关键炎症细胞因子，以确定外泌体在炎症中的预防作用。如图8A-8E所示，源自用DMF或姜黄素引发的hBM-MSC的外泌体显示IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ表达在蛋白质水平上降低。此外，在源自用DMF或姜黄素引发的hBM-MSC的外泌体中，抗炎细胞因子IL-10显著增加，表明DMF和姜黄素引发的外泌体不仅减少常见的炎症细胞因子，而且还具有抗炎作用。

8.3源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂引发的hBM-MSC的外泌体

8.3.1源自用CSSC条件培养基、Nrf2激活剂或两者引发的hBM-MSC的外泌体的外泌体货物分析。

hBM-MSC在制造商推荐的无异源培养基中培养。hBM-MSC在浓度为总培养基体积20％的CSSC-CM存在下生长，直至细胞达到80-90％汇合。然后改变培养基，用Nrf2激活剂(DMF-100μM)处理hBM-MSC 24小时，然后将细胞转移到EV收集培养基中并在EV收集培养基中维持72小时。72小时后，收集条件培养基，并使用碘克沙醇密度梯度方案(如实施例4.4中所述)进行外泌体分离(纯化)。使用ELISA检测不同组合引发的外泌体变体中的HGF、VEGF、sFLT1和NGF的水平(图9A-9D)。尽管单独引发的(Nrf2激活剂或CSSC条件培养基)外泌体表现出外泌体HGF、sFLT1和NGF的增加，但组合引发的(CSSC-CM和DMF)外泌体具有最高水平的外泌体HGF、sFLT1和NGF。

CSSC-CM引发的外泌体和DMF引发的外泌体均显示外泌体HGF增加。DMF引发的外泌体中的外泌体HGF的表达水平是初始外泌体的外泌体HGF的表达水平的约1.2倍(1.2x)，CSSC-CM引发的外泌体中的外泌体HGF的表达水平是初始外泌体的外泌体HGF的表达水平的约2倍(2x)。也就是说，组合引发的(CSSC-CM+DMF)外泌体显示外泌体HGF的增加最高，与初始外泌体相比，外泌体HGF表达水平超过两倍(2x)或约三倍(3x)，与仅DMF引发相比，约是外泌体HGF表达水平的两倍(图9A)。此外，CSSC-CM引发的外泌体和组合引发的(CSSC-CM+DMF)外泌体证明与初始外泌体或DMF引发的外泌体相比，两者都具有显著降低的外泌体VEGF表达，小于VEGF表达的四分之一(1/4或25％)(图9B)。

单一引发的(CSSC-CM或DMF)外泌体显示外泌体sFLT1和NGF增加(图9C-9D)。DMF引发的外泌体中外泌体NGF的表达水平与初始外泌体中外泌体NGF的表达水平相比超过2倍(2x)或约3倍(3x)，并且CSSC-CM引发的外泌体中外泌体NGF的表达水平是初始外泌体中外泌体NGF的表达水平的约2倍(2x)。然而，组合引发的(CSSC-CM和DMF)外泌体具有最高的外泌体sFLT1和NGF，表明与外泌体或初始外泌体的单一引发相比，CSSC-CM和DMF的组合引发可产生更理想的外泌体货物。组合引发的(CSSC-CM和DMF)外泌体的外泌体sFLT表达水平是初始外泌体的外泌体sFLT表达水平的两倍以上，约是DMF引发的外泌体的外泌体sFLT表达水平的两倍。组合引发的(CSSC-CM和DMF)外泌体的外泌体NGF表达水平是初始外泌体的外泌体NGF表达水平的三倍(3x)以上，是DMF引发的外泌体的外泌体NGF表达水平的约1.5倍(1.5x)。

8.3.2用CSSC条件培养基和Nrf2激活剂(DMF)引发的不同外泌体变体的抗炎活性表征

使用用LPS处理的RAW 264.7细胞测试源自用CSSC条件培养基、Nrf2激活剂DMF或其组合引发的hBM-MSC的外泌体，以检测引发的外泌体的抗炎活性。通过ELISA测定炎症和抗炎细胞因子。如图10A-10E所示，源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂(DMF)组合引发的hBM-MSC的外泌体能够通过减少IL-6(图10A)、IL-1β(图10B)、TNF-α(图10C)和IFN-γ(图10E)在蛋白质水平上的表达来减少炎症。此外，抗炎细胞因子IL-10的表达随着单一引发的外泌体(CSSC-CM或DMF)的处理而增加。此外，使用源自用CSSC-CM和DMF组合引发hBM-MSC的外泌体，实现了IL-10表达的最高增加。

这些数据表明，源自用CSSC-CM和DMF二者引发的hBM-MSC的外泌体有效降低了炎症细胞因子的表达，同时增加了抗炎细胞因子的表达。

8.3.3源自用CSSC条件培养基+Nrf2激活剂(DMF)组合引发的细胞的外泌体的抗纤维化活性表征

测试源自用CSSC-CM和DMF引发的hBM-MSC的外泌体，以检测其抗纤维化活性。用TGF-β处理人真皮成纤维细胞以诱导纤维化(参见实施例6.3)。用引发的外泌体处理成纤维细胞，以测试外泌体的抗纤维化活性。使用免疫荧光监测纤维化标志物α-SMA的表达，以检查治疗后外泌体抗纤维化活性的功效。图11A-11F所示的代表性的免疫荧光图像显示，甚至单一引发的外泌体(CSSC-CM或DMF)也减少纤维化(图1ID和1IE)。然而，源自用CSSC-CM和DMF的组合引发的hBM-MSC的外泌体表现出最大程度的纤维化减少(图11F)。

8.3.4源自用CSSC条件培养基、Nrf2激活剂(DMF)或其组合引发的hBM-MSC的外泌体的伤口愈合活性的表征。

参考图12。测试源自用CSSC-CM、Nrf2激活剂(DMF)或其组合引发的hBM-MSC的外泌体，以检测它们在2D划痕测定中的效果(参见实施例6.2)。用绿色荧光染料(CMFDA)标记永生化人角膜上皮细胞(hTCEPi)，并通过hTCEPi细胞产生划痕。用初始外泌体(初始BM-MSC)、单独引发的外泌体(CSSC-CM或DMF)或其组合处理hTCEPi细胞，并使用荧光显微镜在以下时间点0、24小时、48小时和72小时观察伤口闭合。单一引发的外泌体处理及其组合导致伤口在72小时内闭合，表明引发的外泌体处理导致显著的定向细胞迁移。类似地，进行外泌体处理后角膜细胞迁移和增殖的定量测定，如图13所示。用源自用CSSC-CM和DMF引发的hBM-MSC的外泌体处理的角膜细胞在几乎所有时间点都具有最高的细胞增殖，而与用CSSC-CM引发的外泌体或单独用初始外泌体处理的角膜细胞相比，用DMF引发的外泌体处理的角膜细胞在随后的时间点细胞增殖增加。

8.3.5源自用CSSC-CM和DMF引发的hBM-MSC的外泌体的兔角膜伤口愈合活性的表征。

图14描绘了手术后第1天、第7天和第14天，具有开放性上皮伤口的兔角膜的代表性显微图像。为了测试源自hBM-MSC的外泌体在3D模型中有效诱导伤口愈合的能力，用液体角膜生物聚合物结合源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂DMF引发的hBM-MSC的外泌体、单独的液体角膜生物聚合物或未经处理的对照处理受伤的兔角膜。在手术后第7天，与单独的液体角膜生物聚合物或未处理的对照相比，液体角膜生物聚合物和来自用CSSC-CM和Nrf2激活剂DMF引发的hBM-MSC的外泌体的组合显示出显著的伤口愈合。第14天，液体角膜生物聚合物与源自用CSSC-CM和Nrf2激活剂DMF引发的hBM-MSC的外泌体的组合显示了兔角膜的完整且稳定的上皮化。单独用液体角膜生物聚合物的处理在第14天表现出几乎完全的上皮化，但有一些斑块破裂，而未处理的对照则表现出有缺陷的上皮化。结合图12、13和14来看，基于2D划痕测定和角膜细胞迁移和增殖分析，源自用CSSC-CM和DMF二者组合引发的hBM-MSC的外泌体表现出优异的伤口愈合活性，并且在兔角膜中表现出强劲的体内伤口愈合。

实施例9

从引发的UC-MSC/WJ-MSC中生成治疗性富集的外泌体，用于血管多组织(肝、肺)再 生

本实施例展示了脐带血衍生的间充质干细胞(UC-MSC)和华顿氏衍生的MSC(WJ-MSC)的体外培养。培养UC-MSC和WJ-MSC的方案在实施例1.5中描述。此外，基于实施例1.4中描述的方法选择独特的干细胞亚群(UC-MSC和WJ-MSC)。然后获得扩增的干细胞群，并用以下不同的引发剂单独或其组合进行引发：(a)Nrf2激活剂，如DMF或4-OI，或CDDO-Im；和(b)，SRT1激活剂：SRT-2104或白藜芦醇。干细胞的引发可以在存在或不存在缺氧的情况下进行。用本文提到的引发剂引发干细胞允许提供或获得具有增强的再生性、干性和抗炎特性的引发的干细胞和引发的条件培养基。将使用单一引发剂(如Nrf 2激活剂或SIRT1激活剂)或引发剂的组合(例如Nrf2激活剂+SIRT1激活剂)引发的MSC用作具有特定/富集的货物负载因子的不同外泌体变体生产的来源。然后在物理和分子水平上表征外泌体变体的功效。表征的外泌体变体根据其针对不同炎症和纤维化相关疾病的功能进行分类，所述疾病例如为肺功能障碍、急性呼吸窘迫、炎症相关疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、骨关节炎、NASH、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡、心肌梗死等。

总体而言，本公开提供了提供或获得引发的干细胞和引发的条件培养基的方法。该方法涉及分离表达标志物标记组的间充质干细胞如UC-MSC和WJ-MSC群的步骤。然后使用hTERT(人端粒酶逆转录酶)对选择的MSC群进行修饰，其中hTERT延长了MSC的倍增潜力，这有助于促进规模化和均质的细胞群。将干细胞进一步在3D培养系统(基于微载体的系统，或基于球体的系统，或中空纤维生物反应器)中培养，以获得扩增的干细胞群。扩增的干细胞群进一步用不同的引发剂(小分子和大分子)进行引发。引发剂(小分子和大分子)的存在以及所公开的浓度范围，以及引发剂对细胞的处理持续时间对于提供或获得引发的干细胞和引发的条件培养基是关键的。使用单独使用或组合使用的不同引发剂来引发初始干细胞有助于增强细胞的再生、干性和抗炎特性。引发的干细胞进一步用作不同外泌体变体的来源，这些变体富含抗炎因子、抗纤维化因子、促血管生成因子。然后，富集的治疗级外泌体进一步应用于血管组织(肺或肝)再生或无血管组织(角膜)再生。利用本公开所公开的方法，高产率地富集的引发的干细胞或引发的外泌体可以治疗大量患有疾病的患者，所述疾病包括但不限于类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类别、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核、系统性狼疮、心肌梗死、骨关节炎、非酒精性脂肪性肝病(NASH)、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡、角膜炎(CK)、干眼症溃疡、单纯疱疹性角膜炎、LASIK术后扩张、术后角膜融化、人工角膜后融化、角膜穿孔、神经营养性角膜炎(NK)、圆锥角膜干燥综合征、粘膜类天疱疮、史蒂文斯-约翰逊综合征、化学烧伤和热烧伤。

实施例10

用引发的外泌体治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)诱导的肝球体

本实施例展示了使用源自在标准条件下生长的初始hBM-MSC的外泌体(初始外泌体)或源自用DMF引发的hBM-MSC的外泌体(引发的外泌体)体外治疗人类肝球体中诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)表型。用于培养和引发hBM-MSC以及从引发的hBM-MSC获取外泌体的方案在实施例3和4以及实施例8中描述。特别是，本实施例中产生用于治疗NASH诱导的肝球体的DMF引发的MSC衍生的外泌体的方案描述于实施例8的8.2.1节中。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种脂肪在受试者肝脏中堆积的病况，与受试者的饮酒无关。这种疾病有几个阶段。如果肝脏有多余的脂肪，但尚未发生炎症或纤维化，则该疾病可称为肝脏脂肪变性或非酒精性脂肪肝(NAFL)。一旦病情进一步进展，肝组织出现炎症和纤维化，这种疾病就被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

本研究中生成人类肝球体并在人类肝球体中诱导NASH表型的方案如下：将来自人类供体的原代肝细胞和肝星状细胞混合物以70:30的比例(70个肝细胞对30个肝星状细胞)共培养。将细胞混合物接种在超低附着板上并培养以形成活的肝球体。一旦获得活的肝球体，通过连续处理游离脂肪酸以诱导脂肪变性，然后用TGF-β处理以诱导纤维化，在肝球体中诱导NASH表型，从而使肝球体将显示脂肪纤维化肝的各方面。NASH诱导方案如下：在接种后第7天，用600μM游离脂肪酸(FFA)混合物处理球体6天，该混合物由重量比为2:1的油酸和棕榈酸组成，培养基每隔一天更换一次。FFA处理6天后(接种后13天)，将20ng/mL的TGFβ1添加到含有FFA的培养基中，进行另外两天的FFA和TGFβ1组合处理。在接种后第15天(FFA处理8天和FFA与TGFβ1组合处理2天后)，将培养基改为仅TGFβ1处理，具有20ng/mL TGFβ1并且没有FFA混合物。两天后，即接种后第17天，球体被指定为NASH诱导的(即表现出脂肪纤维化的方面)并接受治疗性治疗(例如使用初始或引发的外泌体、HGF或媒介物对照)，无需FFA或TGFβ1。两天后，即接种后第19天，采集球体和条件培养基进行表征。上述NASH诱导方案可总结如下：

第0天：接种原代肝细胞

第7天：用600μM FFA混合物(油酸和棕榈酸的2:1混合物)处理

第13天：添加TGFβ1以进行FFA和TGFβ1联合处理

第15天：仅TGFβ1处理

第17天：治疗性治疗(初始或引发的外泌体、HGF或媒介物对照)

第19天：采集用于分析。

在用游离脂肪酸混合物和TGF-β顺序处理诱导NASH后，肝球体表现出NASH样表型，包括球体尺寸减小、胶原蛋白沉积增加和白蛋白分泌减少。然后对NASH诱导的肝球体施用来自初始或引发的hBM-MSC的外泌体，并用于如下文解释的进一步测定。

图15A描绘了四种条件下肝球体中CYP3A4和DAPI染色的代表性免疫荧光图像：(1)健康(无NASH诱导)；(2)NASH诱导(“疾病/逆转控制”)；(3)NASH诱导，随后用初始外泌体(“初始Exo”)处理；(4)NASH诱导，随后用引发的外泌体(“引发的Exo”)处理。DAPI是细胞核标志物，CYP3A4是用于指示健康肝组织的标志物，因此CYP3A4染色的减少表明肝组织健康状况下降，CYP3A4染色的增加表明肝组织健康状况改善。类似于如实施例6.3中所述进行肝球体的成像。

结果发现，与未进行NASH诱导的健康肝球体相比，NASH诱导的肝球体表现出CYP3A4染色减少，用来自DMF引发的hBM-MSC的引发的外泌体(“引发的Exo”)处理的NASH诱导的肝球体的处理显示出CYP3A4染色的部分恢复，表明外泌体处理至少能部分恢复NASH诱导的球体的健康。相比之下，与初始外泌体处理相比，初始外泌体(“初始exo”)处理没有表现出恢复的CYp3A4染色。

分泌的白蛋白水平是肝脏健康的另一个标志物。图15B示出了显示不同条件下肝球体分泌到培养基中的白蛋白水平的柱状图，不同条件包括：(1)在D19时健康(没有NASH诱导)；(2)在D19时NASH诱导(“疾病/逆转对照”)；(3)NASH诱导，随后在D17-D19(HGF”)时用40ng/ml肝生长激素处理；(4)NASH导，随后在D17-D19时用初始外泌体(“初始Exo”)处理；和(5)NASH诱导，随后在D17-D19时用DMF引发的外泌体处理(“引发的Exo”)。根据ELISA测量对培养基中分泌的白蛋白进行定量。在处理后24小时、48小时和72小时(或健康和NASH诱导条件的等同时间范围)对各自的培养基样品进行测量。发现用DMF引发的外泌体处理的NASH诱导的肝球体显示白蛋白分泌上调，表明肝球体的健康得到改善。相比之下，用HGF或初始外泌体处理的NASH诱导的肝球体不会导致球体白蛋白分泌增加。

胶原蛋白可以作为肝组织(包括肝球体)纤维化的标志物。图15C描绘了在以下三种条件下肝球体中胶原蛋白1染色的代表性免疫荧光图像：(1)NASH诱导并在D17-D19时用媒介物对照(“媒介物对照”)处理；(2)NASH诱导，随后在D17-D19时用初始外泌体处理；(3)NASH诱导，随后在D17-D19时处用DMF引发的外泌体处理(“引发的Exo”)。肝球体成像类似于实施例6.3中所述。与用媒介物对照或初始外泌体处理相比，用引发的外泌体处理NASH诱导的肝球体减少了细胞表面胶原蛋白表达。

图15D示出了在以下条件下肝球体中胶原蛋白沉积的覆盖百分比的定量柱状图：

健康D19作为逆转组媒介物处理(患病-D19)的健康对照，而右侧的健康对照对应D17疾病诱导组，作为FFA和FFA+TGFbl处理的对照。

(1)在D19诱导NASH之前(“健康的”)；

(2)在D17-D19时NASH诱导并用媒介物对照处理，在D19时采集(“媒介物处理的”)；

(3)在D17-D19时进行HGF处理，在D19时采集“用Tl逆转”；

(4)在用TGFβ1进行纤维化诱导期间，D13-D17时用初始外泌体联合处理(“联合初始外泌体处理的”)；

(5)在用TGFβ1进行纤维化诱导期间，D13-D17时用引发的外泌体联合处理(“联合引发的外泌体处理的”)；

(6)NASH诱导后D17-D19时用初始外泌体处理(“初始外泌体处理的”)；

(7)NASH诱导后D17-D19时用引发的外泌体处理(“引发的外泌体处理的”)；

(8)未进行NASH诱导，在D17采集(“健康对照”)；

(9)脂肪变性诱导-仅用不含TGFβ1的FFA混合物处理并在D15采集；

(10)通过用FFA和TGFβ1顺序处理诱导脂肪纤维化，在D19采集(参见图15G；“脂肪纤维化”)。

“健康对照”与“脂肪纤维化”的比较表明，用FFA和TGFβ1诱导NASH，而不是仅用FFA处理诱导脂肪变性，会诱导肝球体纤维化。仅基于胶原蛋白1染色，添加初始或引发的外泌体显示可以防止TGFβ1诱导的纤维化。还基于胶原蛋白1染色，显示停止TGFβ1处理并随后用媒介物处理两天足以逆转TGFβ1诱导的纤维化。然而，发现与仅用媒介物处理相比，用初始外泌体和引发的外泌体处理NASH诱导的肝球体在减少纤维化方面均比媒介物更有效。

图15E描绘了NASH诱导的肝球体的代表性免疫荧光图像，所述肝球体包括使用与图15C中关于胶原蛋白染色所示的肝球体相同的一组条件，针对另一种纤维化标志物α-SMA染色的外泌体处理的NASH诱导的肝球体。图15F显示，使用与图15D中胶原蛋白染色所示的肝球体相同的一组条件，α-SMA阳性细胞与健康细胞相比的相对强度的柱状图。仅基于α-SMA染色，显示用FFA混合物和TGFβ1诱导NASH，以及仅用FFA混合物诱导脂肪变性，均诱导纤维化。同样仅基于α-SMA染色，初始外泌体和引发的外泌体在减少NASH诱导的纤维化方面显示比媒介物更有效。同样仅基于α-SMA染色，显示与引发的外泌体(而非初始外泌体)联合处理可以阻止基于NASH诱导的α-SMA增加。

如本文上面所描述的以及如图15A-15F所示，用疾病状态诱导剂如FFA混合物或TGFβ1和/或用治疗剂如外泌体处理对肝球体的影响可以用技术如免疫染色和ELISA一次测定一种标志物(或一种新标志物)来分析。然而，可以使用高通量技术(例如微阵列或下一代测序(NGS))同时测定更多(数十、数百、数千)的标志物。图16A描绘了基于微阵列杂交数据的肝球体基因表达变化的热图。如下获得微阵列杂交数据：如上所述，在肝球体样品生长并用NASH诱导剂和/或治疗剂处理后，分离肝球体、裂解并分离mRNA，然后将其转化为互补DNA序列(cDNA)。然后将cDNA样品应用于微阵列并用微阵列读取器读取。使用标准方法对预先确定的22,473个基因(包含在微阵列中)的转录组进行微阵列分析，以获得标准化表达值。在以下条件(“肝球体状态”)下对肝球体样品进行微阵列分析：

(1)NASH诱导后在D17-D19用40ng/ml HGF处理(“HGF”)；

(2)NASH诱导后在D17-D19用初始外泌体处理(“初始外泌体处理”)；

(3)在D19时，NASH诱导(“患病”)；

(4)在D19时未接受NASH诱导(“健康”)；

(5)NASH诱导后在D17-D19用引发的外泌体处理(“引发的外泌体处理”)；

(6)在用TGFβ1进行纤维化诱导期间，D13-D17时用初始外泌体联合处理(“初始外泌体联合”)；和

(7)在用TGFβ1进行纤维化诱导期间，D13-D17时用引发的外泌体联合处理(“引发的外泌体联合”)。

每个条件都基于30个球体池，并且热图是基于合并的样本的表达谱数据生成的。

在热图中，每行代表基因，每列代表肝球体状态。这些列是基于每个肝球体状态中基因表达模式的层次聚类分析来排列的。将在相对于各自的基因表达模式方面彼此邻近的而聚类的成对的肝球体状态排列为相邻的列，连接列的括号反映了不同肝球体状态的各自的基因表达模式之间的相似程度。如图16A所示，肝球体状态的基因表达谱的聚类分析显示，在NASH诱导的肝球体受到潜在处理性处理的肝球体状态1、2和5-7中，引发的外泌体处理的肝球体状态的基因表达谱与健康肝球体状态的基因表达谱最相似。相反，初始外泌体处理的肝球体状态的基因表达谱与患病肝球体状态的基因表达谱最相似，这表明引发的外泌体在至少部分逆转NASH诱导和改善NASH诱导的肝球体的健康方面是有效的，初始外泌体无法有效实现这样的结果。

每种不同肝球体状态下的肝球体的基因表达水平也被分别表示和存储为特征向量(“球体状态特征向量”)，其中给定球体状态特征向量的每个元素是微阵列中测定的基因之一的表达水平。不同状态之间基因表达谱的相似性(或缺乏相似性)是基于n维空间中特征向量对之间的距离测量来确定的，n是每个特征向量中表示的基因数量。还基于该距离分析，发现与其他处理条件(即，初始外泌体联合条件、引发的外泌体联合条件和初始外泌体处理条件)相比，表示引发的外泌体处理条件的球体状态特征向量(其中NASH诱导的肝球体在诱导后用DMF引发的外泌体进行处理)被发现与表示健康肝球体(未进行NASH诱导)的球体特征向量具有最短的欧几里德距离。换句话说，用来自DMF引发的hBM-MSC的外泌体进行处理被显示是测试的处理中使NASH诱导的肝球体的基因表达谱恢复到健康肝球体的表达谱的最有效的处理。

图16B描绘了基于健康对照肝球体、NASH诱导的肝球体和外泌体处理的NASH诱导的肝球体中差异表达基因的主成分分析的图。该图示出了n维空间的二维投影，该n维空间包括表示关于图16A描述的相同七个肝球体状态的各种球体状态特征向量：HGF、初始外泌体处理、患病、健康、引发的外泌体、初始外泌体联合和引发的外泌体联合。二维投影基于主成分分析。肝球体中NASH表型的诱导产生了差异表达的基因，与健康对照基因图谱相比，这些差异表达的基因向下和向左移动。基于二维投影中可视化的基于微阵列的转录组分析，很明显，用初始外泌体或用40ng/ml HGF处理对处理NASH诱导的肝脏无效：如图所示，用初始外泌体或HGF处理的NASH诱导的肝球体的基因表达谱与未处理的NASH诱导的肝球体相比基本没有变化。相反，用源自用Nrf2激活剂DMF引发的hBM-MSC的外泌体处理NASH诱导的肝球体，导致处理的NASH诱导的肝球体的基因表达谱向上和向右移动，更接近健康对照肝球体，证明在逆转肝球体中NASH诱导的遗传变化方面，引发的外泌体处理比其他评估的处理方法(初始外泌体和HGF)显著更有效，并且将NASH诱导的肝球体的基因表达谱改变为更接近于健康的肝球体的基因表达谱。

在研究外泌体处理对NASH诱导的肝球体的预防作用时，使用联合外泌体(引发的和初始)来处理NASH诱导的肝球体。与患病对照相比，联合外泌体的处理(无论是初始的还是引发的)，都会使差异表达基因的基因谱显著向右移动，表明在用联合外泌体的NASH诱导的肝球体中存在一些与抑制纤维化进展有关的预防作用。对NASH诱导的肝球体进行初始联合外泌体处理和对NASH诱导的肝球体进行引发的联合外泌体处理之间，差异表达基因存在一些显著差异。也就是说，在改变NASH诱导的肝球体的基因表达谱以使其更接近健康的肝球体的基因表达谱方面，使用初始外泌体或引发的外泌体进行的联合外泌体处理的效果显著低于使用引发的外泌体进行的连续非联合处理。

图17A描绘了287个肝脏特异性基因的热图，所述基因是在上文关于图16A描述的微阵列研究中测定的基因的子集。如图17A所示，对如图16A所示的同一组肝球体状态的基因表达谱的聚类分析显示，在NASH诱导的肝球体受到潜在治疗处理的肝球体状态中，引发的外泌体处理的肝球状体状态的基因表现谱与健康肝球状体状态的基因表达图谱最接近。相反，HGF处理的肝球体的基因表达谱与患病肝球体状态的基因表达图谱最为相似，其次是初始外泌体处理的肝球形状态。

参考图17B，对不同基因子集的重复分析表明，DMF引发的外泌体处理始终在逆转NASH病理学方面最有效。图17B-17G显示了具有以下基因子集的聚类分析的热图：

图17B：184个NASH/纤维化相关基因(基于以下文献选择：Hoang et al.,GeneExpression Predicts Histological Severity and Reveals Distinct MolecularProfiles of Nonalcoholic Fatty Liver Disease,Scientific Reports 9(12541)2019,Govaere et al.Transcriptomic profiling across the nonalcoholic fatty liverdisease spectrum reveals gene signatures for steatohepatitis and fibrosis,Science Translational Medicine 12(572),Dec 2020and Gu C et al.,Identificationof Common Genes and Pathways in Eight Fibrosis Diseases,Frontiers inGenetics,January 2021))。

图17C：294个肝星状细胞特异性基因(基于Payen et al.,Single-cell RNAsequencing ofhuman liver reveals hepatic stellate cell heterogeneity,JHEPReports 3(3)June 2021选择基因)。

图17D：75个与外源代谢过程相关的基因(基于Gene Ontology reference GO:0006805选择)。

图17E：50个与脂肪酸代谢相关的基因(基于Gene Ontology reference GO:0006631选择)。

图17F：15个与环氧化酶P450途径相关的基因(基于Gene Ontology referenceGO:0019373选择)。

图17G：24个与脂肪纤维化相关的基因，其在患病组织中的表达与两个独立患者队列中组织学定义的NAFLD严重程度恶化为脂肪性肝炎和纤维化相关(基于Govaere etal.Transcriptomic profiling across the nonalcoholic fatty liver diseasespectrum reveals gene signatures for steatohepatitis and fibrosis,ScienceTranslational Medicine 12(572),Dec 2020选择基因)

图18A-C描绘了外泌体处理之前和之后肝球体的状态的图，该状态分别包括X、Y和Z轴上的全部基因、肝特异性基因和NASH/纤维化相关基因。图18A-18C中的每个描绘了相应n维空间的3维投影，该n维空间包括表示以下肝球体状态的球体状态特征向量：健康的、患病的(NASH诱导的)、HGF处理的、初始外泌体处理的和引发的外泌体处理的。图18A-18C中的每个描绘了每个图18A-18C中的描绘的三维空间，是三个2维投影的组合，其中X、Y和Z轴中的每一个都基于以上所述的微阵列研究中基因测定的子集的Jaccard相似性指数得分矩阵的主成分分析(PCA)(其中一些受试者显示在图17A-17G中)。在图18A中，X轴基于具有18,936个基因的全部基因的集合，Y轴基于287个肝脏特异性基因的集合(在图17A中描绘为热图)，并且Z轴基于184个NASH/纤维化基因的集合(如图17B中的热图所示)。在图18B中，X轴根据基于G0:0006954的476个炎症反应基因的集合，Y轴根据基于G0:0001525的386个血管生成基因的集合，并且Z轴根据基于GO:0022008的937个神经生成基因的集合。在图18C中，X轴根据基于GG:0042060的315个伤口愈合基因的集合，Y轴根据基于G0:0048771的127个组织重塑基因的集合，并且Z轴根据基于GG:0031012的405个细胞外基质基因的集合。每个2维投影(其是图18A-18C中所示的3维空间的一侧)使用相应3维空间中提供的三个轴中的两个。

在每个投影中，健康肝球体状态被分配一个坐标[1,1]，其余状态的坐标根据杰卡德相似度指数确定。如图18A-18C中每个所示，对NASH诱导的肝球体进行DMF引发的外泌体处理，基于基因表达模式，诱导NASH诱导的肝球体部分恢复至健康状态：DMF引发的外泌体处理状态的坐标值在Z轴上向前移动，在X轴上向右移动，在Y轴上向上移动，远离患病球体的坐标值并朝向健康状态的坐标值。相反，初始外泌体处理的NASH诱导的肝球体以及HGF处理的NASH诱导的肝球体在所有三个轴上的坐标值与DMF引发的外泌体处理的状态或健康状态相比，与疾病状态显著更相似。

基于上述结果，预期向患有NASH的人类受试者施用处理有效剂量的DMF引发的外泌体将治疗受试者的NASH。也预期DMF引发的外泌体将有效治疗NAFED和NAFL。也预期DMF引发的外泌体将有效治疗肝纤维化。

图19描绘了87个基因的入围选择的热图，这些基因的表达水平在用DMF引发的外泌体处理后最稳健地从与患病状态相似的表达水平逆转至与健康状态相似的表达水平。这些基因可以用作标志物，用于确定不仅在肝球体中而且在体内肝组织中的健康或NASH诱导状态。这87个基因包括表示与肝功能以及NAFLD和NASH疾病进展相关的各种信号转导通路的基因，如分泌(GE:0046903)；细胞稳态(G0:0019725)、伤口愈合(G0:0042050)、脂质生物合成(G0:0008610)。因此，如本文所述的NASH诱导及其用DMF引发的外泌体处理期间，肝球体的基因表达模式显示与体内NAFLD和NASH的临床表达以及从这些病况的恢复在机制上相关。

在87个基因中，以下基因被确定为特别稳健且有用的基因，可作为肝球体中肝脏健康的标志物，以及通过DMF引发的外泌体处理恢复所述健康的标志物：FOXA1、FOXA3、MMP10、FGFR2、FGFR3、ANGPT2、ANG、ATP1B和ICAM2。

表12显示了这9个基因的Log 2中基因表达的标准化值。

表12

本公开的优点

本公开公开了用诱导剂的特定组合来引发源自各种组织来源(例如骨髓、脂肪、脐带等)的MSC的方法，以激活某些途径来产生具有富集因子的(包括抗炎、抗纤维化、促进伤口愈合、血管生成(促/抗)和神经再支配因子)治疗性外泌体，用于组织的无血管和血管再生。MSC的引发是通过各种引发剂(小分子和大分子)完成的。

本发明的优点如下：

1.本公开提供了基于标志物标记集的表达来选择独特的干细胞(如UC-MSC/WJ-MSC)群，以产生具有所需治疗效果如抗炎、抗纤维化、促进伤口愈合、血管生成(促/抗)和神经再支配特性的外泌体。

2.本公开还提供了永生化/工程化的人MSC，使用hTERT(人端粒酶逆转录酶)来扩展MSC(eMSC)的倍增潜力，以促进细胞和治疗性外泌体的规模化且均质的生产。

3.本公开提供了涉及引发剂的方法，所述引发剂例如为Nrf2激活剂、SIRT1激活剂、全反式视黄酸(ATRA)、CSSC衍生的条件培养基等，其可以单独使用或组合使用。使用引发剂的方法有助于获得富集的治疗级外泌体，其再生治疗功效显著增强。

4.本公开还提供了诱导和激活的外泌体，用于治疗炎性相关病症，包括类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核病、系统性狼疮、心肌梗死、骨关节炎、非酒精性脂肪性肝病(NASH)、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡和角膜炎(CK)、干眼症溃疡、单纯疱疹性角膜炎、LASIK术后扩张、术后角膜融化、人工角膜后融化、角膜穿孔、神经营养性角膜炎(NK)、圆锥角膜干燥综合征、粘膜类天疱疮、史蒂文斯-约翰逊综合征、化学燃烧和热燃烧。

5.本公开还提供了一种成本有效的方法，因为在动物模型中具有治疗效果所需的MSC的细胞衍生产物的量为～50ug蛋白或接近100亿个颗粒。为了进行物理、分子和转录组分析，扩大规模的策略是前进的方向，这反过来又显著降低了所涉及的成本。

6.总体而言，本公开公开了培养、扩增和用不同引发剂引发MSC以获得引发的MSC和引发的条件培养基的方法。因此，本文描述的过程的可扩展性以及该过程是无异源过程的事实，提供了满足商业需求的规模化性的可行选择，并且还提供了以引发的MSC、引发的条件培养基为基础的临床级最终产品。进一步处理条件培养基(CSSC-CM)或引发的条件培养基以获得临床级外泌体、分泌组和其他细胞衍生产物，其可用于治疗选自以下的疾病：类风湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、COVID-19、冠状病毒感染类、囊性纤维化、汉坦病毒、流感、结核、系统性狼疮、心肌梗死、骨关节炎、非酒精性脂肪肝(NASH)、肝纤维化、蚕蚀性角膜溃疡、神经营养性溃疡、角膜炎(CK)、干眼症溃疡、单纯疱疹性角膜炎、LASIK术后扩张、术后角膜融化、人工角膜后融化、角膜穿孔、神经营养性角膜炎(NK)、圆锥角膜干燥综合征、粘膜类天疱疮、史蒂文斯-约翰逊综合征、化学烧伤和热烧伤。根据本公开的外泌体产量是可扩展的而不影响生产成本。

Claims (70)

1.一种产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体群的方法，所述方法包括：

(a)扩增培养中的间充质干细胞(MSC)群；

(b)用源自不同于所述MSC群的细胞群的细胞衍生的条件培养基和至少一种限定引发剂引发所述MSC群，以获得引发的MSC群；

(c)使培养中的所述引发的MCS群生长以产生引发的MSC衍生的条件培养基；和

(d)收集所述引发的MSC条件培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：

(e)从所述引发的MSC条件培养基中纯化所述外泌体。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中引发所述MSC群包括：

(1)使所述MSC群与所述细胞衍生的条件培养基接触；和

(2)使所述MSC群与所述至少一种限定引发剂接触。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时与所述细胞衍生的条件培养基接触，并且所述MSC群从约60％至约90％汇合时开始与所述至少一种限定引发剂接触。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时与所述细胞衍生的条件培养基接触，并且此后与所述至少一种限定引发剂接触。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述MSC群与至少一种限定引发剂接触约12小时至约72小时。

7.根据权利要求1-5、6中任一项所述的方法，其中：

来自不同细胞群的所述细胞衍生的条件培养基是角膜基质干细胞衍生的条件培养基。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中：

所述至少一种限定引发剂是核因子红系2相关因子2(Nrf2)激活剂、沉默信息调节因子1(SIRT1)激活剂、或全反式视黄酸(ATRA)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种引发剂是Nrf2激活剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Nrf2激活剂是富马酸二甲酯(DMF)或衣康酸-4-辛酯(4-OI)。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述MSC群是骨髓衍生的MSC(BM-MSC)群、脐带衍生的MSC(UM-MSC)群、诱导多能干细胞(iPSC)衍生的MSC(iPSC-MSC)群或华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)群。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述BM-MSC群是人BM-MSC群。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞衍生的条件培养基是角膜干细胞衍生的条件培养基，并且所述限定引发剂是DMF或衣康酸4辛酯(4-OI)。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述角膜干细胞衍生的条件培养基以约10％至约30％的浓度存在。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。

16.一种引发的MSC衍生的外泌体群，其通过权利要求1-15中任一项所述的方法产生。

17.一种引发的MSC衍生的外泌体群，其特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：

(a)更低的血管内皮生长因子(VEGF)表达水平；和

(b)更高的神经生长因子(NGF)的表达水平。

18.根据权利要求17所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的间充质干细胞衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：

(c)更高的肝细胞生长因子(HGF)表达水平；和

(d)更高的sFLT1表达水平。

19.权利要求17或权利要求18所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的间充质干细胞衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：

(a)至少高2倍的sFLT1的表达水平；

(b)VEGF的表达水平是未引发的MSC衍生的外泌体中表达水平的四分之一或更少；

(c)至少高2倍的HGF表达水平；和

(d)至少高3倍的NGF表达。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下两项或更多项：

(a)至少高2倍的sFLT1表达水平；

(b)VEGF的表达水平是未引发的MSC衍生的外泌体中表达水平的四分之一或更少；

(c)至少高2倍的HGF表达水平；和

(d)至少高3倍的NGF表达。

21.根据权利要求20所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC衍生的外泌体的特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下项：

(a)至少高2倍的sFLT1的表达水平；

(b)VEGF的表达水平是未引发的MSC衍生的外泌体中表达水平的四分之一或更少；

(c)至少高2倍的HGF表达水平；和

(d)至少高3倍的NGF表达。

22.根据权利要求17-21中任一项所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC通过以下方式制备：

(1)使MSC群与角膜干细胞衍生的条件培养基接触；和

(2)使所述MSC群与Nrf2激活剂接触。

23.根据权利要求22所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述Nrf2激活剂是DMF或衣康酸4辛酯(4-OI)。

24.根据权利要求22-23所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时与所述角膜干细胞衍生的条件培养基接触，并且所述MSC群从约60％至约90％汇合时开始与所述Nrf2激活剂接触。

25.根据权利要求25所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述MSC群与所述Nrf2激活剂接触约12小时至约72小时。

26.一种治疗角膜缺损的方法，所述方法包括向具有角膜缺损的角膜表面施用治疗剂量的权利要求16-25中任一项所述的外泌体群。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述角膜缺损选自：角膜瘢痕、角膜炎、角膜溃疡、角膜擦伤、角膜上皮损伤、角膜基质损伤、感染性角膜损伤、沙眼、圆锥角膜、角膜穿孔、角膜缘损伤、角膜营养不良、新血管形成、春季角结膜炎和干眼。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述角膜缺损是角膜炎。

29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述外泌体群包含在配制用于施用于角膜表面的眼科组合物中。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述组合物是滴眼液。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述滴眼液包含生物相容性聚合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物相容性聚合物是可交联的，并且所述方法包括将所述滴眼液施用于角膜表面，并使足够部分的可交联的聚合物交联，使得所述滴眼液转化为水凝胶。

33.一种眼科组合物，其被配制用于施加在角膜表面并且包含权利要求17-25中任一项所述的外泌体群。

34.根据权利要求29所述的眼科组合物，其中所述眼科组合物处于滴眼液形式。

35.根据权利要求33所述的眼科组合物，其中所述滴眼液包含生物相容性聚合物。

36.根据权利要求34所述的眼科组合物，其中所述眼科组合物是水凝胶并且至少一部分所述生物相容性聚合物是交联的。

37.一种产生引发的间充质干细胞衍生的外泌体群的方法，所述方法包括：

(a)在培养基中培养间充质干细胞(MSC)群；

(b)用Nrf2激活剂引发MSC群以获得引发的MSC群；

(c)使所述引发的MCS群在收集培养基中生长，其中所述收集培养基变得富含由引发的MSC产生的外泌体，从而产生引发的MSC衍生的条件培养基；和

(d)收集所述引发的MSC条件培养基。

38.根据权利要求36所述的方法，还包括：

(e)从所述引发的MSC条件培养基中纯化外泌体。

39.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时在第一培养基中生长，然后与所述Nrf2激活剂接触。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述MSC群与所述Nrf2激活剂接触约12小时至72小时。

41.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述Nrf2激活剂是富马酸二甲酯(DMF)或衣康酸4辛酯(4-OI)。

42.根据权利要求40所述的方法，其中所述DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。

43.根据权利要求36-41中任一项的方法，其中所述MSC群是骨髓衍生的MSC(BM-MSC)群、脐带衍生的MSC(UM-MSC)群、诱导多能干细胞(iPSC)衍生的MSC(iPSC-MSC)群或华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)群。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述MSC群是BM-MSC群。

45.一种引发的MSC衍生的外泌体群，其通过权利要求36-43中任一项所述的方法产生。

46.一种引发的MSC衍生的外泌体群，其特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一项或多项：

(a)更高的肝细胞生长因子(HGF)表达水平；和

(b)更高的神经生长因子(NGF)表达水平。

47.根据权利要求45所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC衍生的外泌体的特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下项：

(a)更高的HGF表达水平；和

(b)更高的NGF表达水平。

48.根据权利要求45或权利要求46所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC衍生的外泌体特征在于与未引发的MSC衍生的外泌体相比，具有以下一项或两项：

(a)至少高1.2倍的HGF表达水平；和

(b)至少高2倍的NGF表达水平。

49.根据权利要求45-47中任一项所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述引发的MSC通过以下方式制备：

(1)使MSC群在第一培养基中生长；和

(2)使所述MSC群与Nrf2激活剂接触。

50.根据权利要求48所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述Nrf2激活剂是DMF或衣康酸4辛酯(4-OI)。

51.根据权利要求49所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。

52.根据权利要求48-51中任一项所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述MSC从接种直至约60％至约90％汇合时在第一培养基中生长，然后与所述Nrf2激活剂接触。

53.根据权利要求51所述的引发的MSC衍生的外泌体群，其中所述MSC群与所述Nrf2激活剂接触约12小时至约72小时，然后与收集培养基交换。

54.一种治疗肝脏病况的方法，所述方法包括向患有肝脏病况的受试者施用治疗量的权利要求44-52中任一项所述的外泌体群。

55.根据权利要求53所述的方法，其中所述肝脏病况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。

56.根据权利要求54所述的方法，其中所述NAFLD是非酒精性脂肪肝(NAFL)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述NAFLD是NASH。

58.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，其中所述外泌体群通过静脉内途径施用至肝脏。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述静脉内途径是通过肝门静脉。

60.一种组合物，其包含权利要求44-52中任一项所述的外泌体群。

61.根据权利要求44-52中任一项所述的外泌体，其用于治疗肝脏病况。

62.根据权利要求59所述的外泌体，其中所述肝脏病况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。

63.根据权利要求60所述的外泌体，其中所述NAFLD是非酒精性脂肪肝(NAFL)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

64.根据权利要求61所述的外泌体，其中所述NAFLD是NASH。

65.一种增加间充质干细胞(MSC)群的外泌体分泌的方法，所述方法包括：

(a)在培养基中培养MSC群；

(b)用Nrf2激活剂引发所述MSC群以获得引发的MSC群；

(c)使所述引发的MCS群在收集培养基中生长，其中所述收集培养基变得富含由所述引发的MSC产生的外泌体。

66.根据权利要求63所述的方法，其中所述MSC群从接种直至约60％至约90％汇合时在第一培养基中生长，然后与所述Nrf2激活剂接触。

67.根据权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述MSC群与所述Nrf2激活剂接触约12小时至72小时。

68.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述Nrf2激活剂是富马酸二甲酯(DMF)或衣康酸4辛酯(4-OI)。

69.根据权利要求66所述的方法，其中所述DMF以约50μM至约100μM的浓度存在。

70.根据权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述MSC群是骨髓衍生的MSC(BM-MSC)群、脐带衍生的MSC(UM-MSC)群、诱导多能干细胞(iPSC)衍生的MSC(iPSC-MSC)群或华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)群。