CN118284581A - 氧化铪(iv)纳米颗粒及其水性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括或具有等于或小于(≤)15nm的直径的氧化铪(IV)(HfO₂)纳米颗粒纳米晶体，其通过附接至其表面的复数个分散剂分子来稳定。分散剂分子包含邻苯二酚或棓酚表面吸附部分和低聚(乙二醇)部分。本发明还涉及这样的纳米颗粒在生理pH下的稳定胶体悬浮体中的组合物，以及所述组合物在医学治疗和诊断应用中，特别地用于增强放射治疗和作为X射线造影剂的用途。在又一个方面中，本发明提供了用于制造根据本发明的组合物和纳米颗粒的方法。

Description

氧化铪(IV)纳米颗粒及其水性组合物

本申请要求2021年11月23日提交的欧洲专利申请EP21210057.2和2022年5月24日提交的欧洲专利申请EP22175125.8的优先权权利，二者均通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及与表面吸附的低聚(乙二醇)部分相结合的氧化铪(IV)纳米颗粒。本发明还涉及包含根据本发明的纳米颗粒的组合物，其用作药物或诊断。

背景技术

胶体纳米晶体(colloidal nanocrystal，NC)被认为用于多种生物医学应用，例如生物成像、药物递送、光热治疗和放射治疗增强。这些NC通常为混合物体，由经有机配体覆盖的无机核组成。配体决定了NC与溶剂之间的相互作用以及纳米胶体的稳定性。在生物医学应用的情况下，控制NC表面化学性质是关键，因为它将在颗粒团聚、细胞摄取、蛋白质排斥或吸附、细胞毒性、循环时间和靶向方法中发挥作用。虽然表面化学性质对所有类型的NC(硫属元素化物、磷属元素化物、卤化物和金属NC)均重要，但在此没有一种解决方案适合所有情况。例如，硫醇盐和硫醇对Au NC和CdSe NC具有强的结合亲和力，但与金属氧化物NC的相互作用不良。

金属氧化物NC在纳米医学中特别成功。三种类型的无机NC已经实现了临床转化，并且其中的两者为氧化物；铁氧化物和铪氧化物(Min,Y.Chemical Reviews 2015,115(19),11147-11190)。这些颗粒通常首先在非极性溶剂中合成，通过表面活性剂(通常具有羧酸根头部基团或膦酸根头部基团和脂族尾部)稳定。羧酸(例如，油酸)在金属氧化物表面上解离，其中羧酸根结合至表面金属位点，并且质子结合至表面氧原子。这种结合模体写为NC(XX’)，因为质子和羧酸根二者均为X型配体。在非极性溶剂中，羧酸在X对X配体交换过程中被膦酸定量交换。事实上，膦酸是对于氧化物表面非常强的配体。相反，发现邻苯二酚为相当弱的配体，仅能够交换一小部分油酸。因此，在非极性溶剂中结合强度有明确的顺序：邻苯二酚<羧酸<膦酸。

在水性(或其他极性)环境中，这种顺序不太清楚，并且由于可变因素例如pH和盐浓度而进一步复杂化。例如，羧酸经常用于稳定水中的金属氧化物NC。它们能够在没有竞争性配体的静态体系中提供胶体稳定性，但不能在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或细胞培养基中提供胶体稳定性。对多齿羧酸根配体例如聚合物的结合亲和力显著增加。通常，文献报道认为羧酸是水中最弱的配体，比膦酸或邻苯二酚更弱。然而，关于膦酸或邻苯二酚是否是最佳的配体，文献没有定论。尽管在金属氧化物NC官能化中普遍使用膦酸和邻苯二酚，但对相对结合亲和力没有明确的共识。此外，NC的配体结合平衡和最终胶体稳定性之间通常没有建立直接联系。

基于上述现有技术，本发明的目的是提供手段和方法以提供用于医学应用的更好的纳米颗粒组合物。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题，以及在本说明书的从属权利要求、实施例、附图和一般性描述中描述的另外的有利实施方案来实现。

发明内容

本发明的一个方面涉及包含纳米晶体的纳米颗粒，所述纳米晶体包含直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)或者基本上由直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)组成，所述纳米晶体通过附接至纳米晶体的表面的复数个分散剂分子来稳定。

分散剂分子包含以下或者基本上由以下组成：选自包括邻苯二酚或棓酚的组的表面吸附部分、和低聚(乙二醇)部分。

在另一个方面中，本发明涉及本文所述的纳米颗粒的组合物。组合物提供了在生理pH下稳定的胶体悬浮体中的纳米颗粒。

本发明的另一个方面涉及本文所述的纳米颗粒和组合物在治疗和诊断应用中，特别地用于增强放射治疗和作为X射线造影剂的用途。

本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的纳米颗粒或纳米颗粒悬浮体，以及至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

在又一个方面中，本发明提供了用于制造根据本发明的组合物和纳米颗粒的方法。

术语和定义

出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，没有数量词修饰的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果下文阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，应以阐述的定义为准。

如本文使用的术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”以及其他类似形式及其语法等同物旨在含义上是等同的并且是开放式的，因为这些词语中的任一者后面的一个或更多个项目并不意味着是这样的一个或更多个项目的详尽列表，也不意味着仅局限于所列出的一个或更多个项目。例如，“包含”组分A、B和C的制品可以由组分A、B和C组成(即，仅包含组分A、B和C)，或者不仅可以包含组分A、B和C，而且还可以包含一种或更多种其他组分。因此，旨在并理解，“包含”及其类似形式以及其语法等同物包括“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方案的公开。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确指出，否则在该范围的上限和下限之间的各中间值，直至下限单位的十分之一，以及在该指出的范围内的任何其他指出的值或中间值均涵盖在本公开内容中，但要受限于指出的范围内任何具体排除的限制。当所述范围包括极限中的一者或二者时，不包括那些所包括的极限中的一者或二者的范围也包括在本公开内容中。

本文提及“约”值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。

如本文(包括所附权利要求书中)所用，除非上下文另有明确指示，否则没有数量词修饰的术语包括复数指代物。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本领域中(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常理解的含义相同。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(通常参见Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第4版,(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.和Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(2002)第5版,JohnWiley&Sons,Inc.)以及化学方法。

术语硝基多巴胺是指在多巴胺部分的二羟基苯环上带有硝基官能团的多巴胺部分。硝基多巴胺的一个特定实例为下式：

术语硝基多巴(nitroDOPA)是指在多巴(二羟基苯丙氨酸部分)的二羟基苯环上带有硝基官能团的多巴部分。硝基多巴的一个特定实例为下式：

术语含羞草碱是指下式的(2S)-2-氨基-3-(3-羟基-4-氧代吡啶-1-基)丙酸：

如本文所用的低聚-乙二醇部分涉及由式(CH₂-CH₂-O)_nCH₃描述的链，其中n为1至15的整数，特别地其中n为2至12，更特别地其中n为2至5。

在本说明书所基于的工作中，本发明人着手明确建立结合亲和力顺序，并为纳米医学中的最佳应用提供合适的表面化学性质。本发明人出于两个原因选择HfO₂ NC作为其模型体系：(1)其为纳米医学中的相关材料，以及(2)其与溶液核磁共振(NMR)波谱兼容。后者被证明是研究纳米晶体表面化学性质的非常有力的工具。不幸的是，铁氧化物NC干扰磁场，并且无法在NMR中进行研究。因此，HfO₂ NC是理想的起点，还因为其表面化学性质已经在非极性溶剂中使用NMR波谱进行了广泛研究。首先，本发明人使用¹H和³¹P NMR波谱评估了天然羧酸配体与膦酸配体和邻苯二酚配体的配体交换。重要的是，他们对所有三个结合基团使用相同的聚(乙二醇)配体链，从而确保结果可以直接进行比较。接下来，他们评估了溶剂(甲醇相对于水)和pH对配体结合的影响。此外，本发明人使用NMR和动态光散射(DLS)来确定不同配体类型在水性环境和缓冲环境中提供的胶体稳定性，并将其与配体结合动力学直接相关联。最后，本发明人构建了胶体稳定性图，显示了哪个结合基团提供根据pH的胶体稳定性。该实用指南将帮助研究人员设计未来的表面化学性质。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及包含纳米晶体核和吸附至纳米晶体核的有机稳定剂的纳米颗粒，所述有机稳定剂有助于颗粒在生理pH下的水溶液中的稳定性。

纳米颗粒由纳米晶体和复数个附接至纳米晶体的表面的分散剂分子构成，所述纳米晶体包含直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)或者基本上由直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)组成。分散剂分子包含以下或者基本上由以下组成：

i.选自包括邻苯二酚或棓酚的组的表面吸附部分，特别地1,2-羟基-4-硝基苯部分；和

ii.低聚(乙二醇)部分。

这样的分散剂分子的一个非限制性实例为多巴胺-MEEAA加合物(MEEAA为2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸)：

在某些实施方案中，多巴胺-低聚(乙二醇)分散剂分子可以由以下通式更一般地描述：

其中n选自1、2、3、4、5、6。

在某些实施方案中，多巴胺-低聚(乙二醇)分散剂分子可以由以下通式更一般地描述：

其中n选自1、2、3、4、5、6。

在某些实施方案中，颗粒由纯的氧化铪(IV)(HfO₂)组成。这是化学上最容易获得的纳米晶体。然而，可以想到HfO₂仅为颗粒的一部分；例如，Hf金属可能构成核并且使颗粒的表面氧化。较高含量的Hf金属预期提供甚至较高的对比度。

在某些实施方案中，纳米晶体的直径≤6nm。在特定的实施方案中，直径≤4nm。在更特定的实施方案中，其中直径≤3.5nm。直径越小，颗粒容易在体内扩散并且将经受肾清除的可能性就越大。

在某些实施方案中，纳米晶体的直径≤15nm。本发明人估计直径最大约15nm的颗粒在用作CT造影剂时提供了本发明的优点；材料的稳定性取决于分散剂(低聚乙二醇)链的长度。如果链较长，则也可以使较大的颗粒稳定。

在某些实施方案中，纳米晶体的特征在于纵横比为0.5至0.9。本发明人获得的颗粒具有近似米粒的形状。预期均匀形状的颗粒在生理学上更容易被接受。

在某些实施方案中，分散剂分子的分子量为≤500g/mol。在某些特定的实施方案中，分散剂分子的分子量为≤400g/mol。

在某些特定的实施方案中，分散剂分子包含以下，特别地由以下组成：

i.选自硝基多巴胺、硝基多巴、多巴、多巴胺、含羞草碱的表面吸附部分，和

ii.(CH₂-CH₂-O)_nCH₃部分，其中n为选自2、3、4和5的整数。

在某些特定的实施方案中，分散剂分子由以下通式描述：

其中n选自1、2、3、4、5、6。

在某些特定的实施方案中，分散剂分子由以下通式描述：

其中n选自1、2、3、4、5、6。

在某些实施方案中，纳米颗粒包含另外的分散剂分子，其中另外的分散剂分子选自：

其中R^染料为荧光染料，任选地通过具有1至25个序数为12或更高的原子的连接基团经由共价键与硝基多巴胺部分连接。

在某些特定的实施方案中，另外的分散剂分子由以下通式描述：

其中n选自1、2、3、4、5、6，并且其中R^X选自染料分子(特别地荧光染料分子)和促进与染料分子反应的化学官能团(特别地选自N₃、NH₂、OH、CCH(乙炔基)的化学官能团)。

本说明书上下文中的术语荧光染料涉及能够在可见光谱或近红外光谱中发出荧光的小分子。呈现可见颜色的荧光染料分子或标记的实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶绿素(PerCP)、藻红素(PE)、alexa Fluors(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)、dylight fluors(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、ATTO染料(ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany)、BODIPY染料(基于4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省的染料)、800CW染料(基于吲哚的染料)等。

在某些实施方案中，分散剂为：

本文使用的低聚乙二醇部分的替代物包括但不限于低聚甘油链和低聚唑啉链。

在某些特定的实施方案中，纳米晶体上的分散剂分子的密度为0.5个/nm²至5个/nm²。

在某些特定的实施方案中，纳米颗粒包含用于光学定位的染料分子。

本发明的另一个方面涉及包含复数个根据以上讨论的方面和实施方案的纳米颗粒的组合物。在某些实施方案中，组合物为稳定的水性胶体悬浮体。

在某些实施方案中，组合物的pH为pH 6至pH 10。在某些特定的实施方案中，组合物的pH为pH 6.5至pH 8.0。据本发明人所知，这是第一次在生理pH下的稳定水溶液中提供这样的超小HfO₂颗粒。

在某些实施方案中，组合物在中性pH值或碱性pH值(特别地pH 6至pH 8)下是稳定的。

在某些实施方案中，80％的纳米颗粒的直径为2.0 nm至5.0 nm。在某些特定的实施方案中，85％的纳米颗粒的直径为2.5 nm至4.5 nm。

就组合物的尺寸不均匀性而言，可以通过尺寸分散或用于将分布拟合为高斯分布的σ来描述组合物。示例性参数包括但不限于：平均直径＝2.6nm；σ＝0.2 nm；尺寸分散＝7.7％。

组合物可以通过其ζ电势来描述。ζ电势为pH的函数；本发明人发现，对于相关的pH范围，其总是负的。

本发明的另一个方面涉及根据本发明的组合物，在本发明的方面或实施方案中的任一者中，其用于医学。描述了HfO₂颗粒的数种用途，主要是作为放射治疗增强剂(放射敏化剂)的用途(Maggiorella等人,FutureOncol.2012年9月；8(9):1167-81)以及作为计算机化断层显像(CT)造影剂的用途(McGinnity,Nanoscale,2016,8,13627-13637)。

在某些实施方案中，组合物内纳米颗粒的浓度(v/v)为15μmol/L至1000μmol/L。在某些实施方案中，组合物内纳米颗粒的浓度(v/v)为15μmol/L至500μmol/L。在某些实施方案中，组合物内纳米颗粒的浓度(v/v)为15μmol/L至250μmol/L。

本发明的又一个方面涉及制造根据本发明的组合物的方法。该方法包括以下步骤：

a.提供由羧酸配体稳定的氧化铪(IV)(HfO₂)纳米晶体在水性介质中的悬浮体；

b.向悬浮体中添加分散剂分子的碱性溶液，其中如本文所述的分散剂分子由以下构成：

i.在中性pH下具有两个芳族OH羟基官能团的表面吸附部分，所述表面吸附部分选自包括邻苯二酚或棓酚的组，特别地1,2-羟基-4-硝基苯部分；和

ii.低聚(乙二醇)部分。

选择分散剂分子的碱性溶液的pH，使得两个芳族羟基官能团在碱性溶液中去质子化。

c.随后，将悬浮体的pH调节至生理pH，以及

d.任选地，将组合物分离或离析。特别有用的用于分离的方案包括尺寸排阻/旋转过滤。

e.另外任选的步骤包括声处理以使团聚物重新悬浮。

在方法的第一步中用作稳定剂的一种羧酸为MEEAA。该配体结合不良，但足以将颗粒初步分散在水中。

在一个实例中，旋转过滤步骤如下进行：将包含溶解在2ml溶剂中的最多50mg材料的NC悬浮体经由0.2μm注射器过滤器转移至预冲洗的Sartorius Vivaspin(30000MWCO)旋转过滤管。将悬浮体用Milli-Q水稀释至20ml的体积，然后使溶液在离心机中以2100rcf旋转30分钟。使用Milli-Q水进行最少2次旋转过滤循环，直到滤液无色。将浓缩物收集、蒸发并悬浮在H₂O中，进行30分钟的声处理以确保所有团聚物重新悬浮并使不溶物最少。

医学治疗

类似地，在本发明的范围内的是在有此需要的患者中治疗对放射治疗敏感的病症，特别地癌症的方法，包括向患者施用根据以上描述的组合物。药物组合物、施用形式/剂型和盐

根据根据本发明的化合物的一个方面，根据本发明的纳米颗粒或纳米颗粒悬浮体作为药物组合物、药物施用形式、或药物剂型提供。

在本发明的某些实施方案中，本发明的纳米颗粒或纳米颗粒悬浮体通常被配制成提供易于控制的药物剂量并且为患者提供美观且易于操作的产品的药物剂型。

类似地，提供了用于预防或治疗癌症的剂型，其包含根据本发明以上方面或实施方案中的任一者的纳米颗粒或纳米颗粒悬浮体。

本发明还涵盖药物组合物，其包含本发明的纳米颗粒或纳米颗粒悬浮体以，以及可药用载体。在另一些实施方案中，组合物包含至少两种可药用载体，例如本文所述的那些。

本发明的某些实施方案涉及用于肠外施用(例如皮下、静脉内、肝内或肌内注射形式)的剂型。任选地，可以存在可药用载体和/或赋形剂。

本发明化合物的剂量方案将根据已知因素而变化，例如特定药剂的药效学特性及其施用方式和途径；受者的物种、年龄、性别、健康状况、医学状况和重量；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗的频率；施用途径、患者的肾功能和肝功能、以及期望的效果。在某些实施方案中，本发明的化合物可以以每日单次剂量施用，或者每日总剂量可以以每日两次、三次或四次的分剂量施用。

根据本发明的制造方法和治疗方法

作为另一个方面，本发明还涵盖如上文详细说明的本文所确定的纳米颗粒或纳米颗粒悬浮体用于药物制造方法的用途。在特定的实施方案中，提供药物用于放射治疗，特别地癌症中，或者作为造影剂。

无论单个可分离特征的替代方案在本文中作为“实施方案”出现在何处，应当理解的是，这样的替代方案可以自由组合以形成本文公开的本发明的离散实施方案。

本发明还涵盖以下项目。

项目

1.一种纳米颗粒，包括：

a.纳米晶体，所述纳米晶体包含直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)，或者基本上由直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)组成，和

b.附接至所述纳米晶体的表面的复数个分散剂分子，所述分散剂分子包含以下或者基本上由以下组成：

i.选自包括邻苯二酚或棓酚的组的表面吸附部分，特别地1,2-羟基-4-硝基苯部分；和

ii.低聚(乙二醇)部分。

2.根据项目1所述的纳米颗粒，其中所述纳米晶体的直径≤6nm，特别地其中所述直径≤4nm，更特别地其中所述直径≤3.5nm。

3.根据项目1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米晶体的特征在于纵横比为0.5至0.9。

4.根据项目1至3中任一项所述的纳米颗粒，其中所述分散剂分子的分子量≤500g/mol，特别地≤400g/mol。

5.根据项目1至4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述分散剂分子包含以下，特别地由以下组成：

i.选自硝基多巴胺、硝基多巴、多巴、多巴胺、含羞草碱的表面吸附部分，和

ii.(CH₂-CH₂-O)_nCH₃部分，其中n为选自2、3、4和5的整数；

特别地其中所述分散剂分子为：

6.根据项目1至5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米晶体上的分散剂分子的密度为0.5个/nm²至5个/nm²。

7.根据项目1至6中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含用于光学定位的染料分子。

8.一种组合物，包含复数个根据项目1至5中任一项所述的纳米颗粒。

9.根据项目8所述的组合物，其中所述组合物为稳定的水性悬浮体。

10.根据项目9所述的组合物，其中所述组合物的pH为pH 6至pH10，特别地pH为pH6.5至pH 8.0。

11.根据项目7或8所述的组合物，其中80％的所述纳米颗粒的直径为2.0nm至5.0nm，特别地其中85％的所述纳米颗粒的直径为2.5nm至4.5nm。

12.根据项目8至11中任一项所述的组合物，其用于医学。

13.根据项目8至11中任一项所述的组合物，其用作放射治疗增强剂(放射敏化剂)。

14.根据项目8至11中任一项所述的组合物，其用作计算机化断层显像(CT)造影剂。

15.一种制造根据项目8至11中任一项所述的组合物的方法，包括：

a.提供由羧酸配体，特别地由MEEAA稳定的氧化铪(IV)(HfO₂)纳米晶体在水性介质中的悬浮体；

b.向所述悬浮体中添加分散剂分子的碱性溶液，其中所述分散剂分子由以下构成：

i.包含两个芳族羟基官能团的表面吸附部分，所述表面吸附部分选自包括邻苯二酚或棓酚的组，特别地1,2-羟基-4-硝基苯部分；和

ii.低聚(乙二醇)部分；

其中两个芳族羟基官能团在所述碱性溶液中去质子化；

c.将所述悬浮体的pH调节至生理pH；

d.任选地，分离所述组合物，特别地通过尺寸排阻/旋转过滤分离所述组合物。

通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从中可以得出另外的实施方案和优点。这些实施例意在说明本发明，而不是限制其范围。

附图说明

图1示出了(A)从1当量Hf(O-tBu)₄和88当量苄醇开始的HfO₂纳米晶体的溶剂热合成。(B)MEEAA官能化的HfO₂ NC在不同溶剂中的(扩散滤波)1H NMR波谱。α共振和β共振分别属于甲醇的残留羟基和甲基。(C)合成的HfO₂ NC的透射电子显微镜(TEM)图像和数据。在测量至少150个NC的表面积之后计算准球形NC的NC直径，并且将其视为圆来计算。平均值：2.64±0.19nm。在左下方和右上角可以分别看到单个NC的尺寸分布直方图和放大图像。

图2示出了(A)在MEEAA官能化的NC与PA-PEG之间进行的配体交换。(B)游离配体在MeOD中的¹H NMR参照波谱作为参照以及用PA-PEG逐步滴定MEEAA官能化的NC，当量相对于存在的MEEAA的总量。共振*为不明杂质。(C)对于用PA-PEG逐步滴定MEEAA官能化的NC在MeOD中的³¹P NMR波谱(4096次扫描)，增宽的信号指示NC结合。(D)添加1.3当量的PA-PEG之后MEEAA官能化的NC在MeOD中的扩散滤波¹H NMR波谱。由结合的MEEAA产生的信号用红色表示，由PA-PEG产生的信号用蓝色条纹表示。C_NC＝1210μmol.L^-1，相当于0.5ml MeOD中34mg该尺寸的NC。

图3示出了在添加1.6当量PA-hex-PEG时在MeOD中的NC悬浮体的扩散滤波¹H NMR波谱。

图4示出了PA-PEG官能化的NC(A)和PA-hex-PEG官能化的NC(B)在不同D₂O体积％下的³¹P NMR波谱。(C)通过峰去卷积确定的PA-PEG和PA-hex-PEG在不同D₂O体积％下的游离配体分数。

图5示出了(A)在MEEAA官能化的NC与硝基多巴胺-mPEG之间进行的配体交换。(B)在D₂O中用硝基多巴胺-mPEG进行配体交换滴定之前和之后的¹H NMR波谱。添加1.5当量的硝基多巴胺-mPEG，并且在添加期间始终保持pH高于5，在pH＝7.4下测量纯化的硝基多巴胺官能化的NC波谱，C_NC＝128μmol.L^-1，相当于2ml D₂O中14.4mg该尺寸的NC。

图6示出了pH对纯化的用PA-PEG、PA-hex-PEG和硝基多巴胺-mPEG官能化的NC在水中的配体结合和稳定性的影响。(A)在不同pH值下基于NMR峰去卷积的在D₂O中的结合和未结合配体分数。(B)NC在不同pH值下在DLS中的Z-平均值。(C)NC在不同pH值下的ζ电势。所有测量均在恒定离子强度(0.01μmol.L^-1NaCl)下在25℃下进行。

图7示出了官能化的NC在pH 7.4和25℃下在不同浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定性。(A)在不同PBS浓度下使用DLS z-平均值测量的官能化的纳米晶体的胶体稳定性。(B)官能化的NC在2X PBS中在pH 7.4和25℃下随时间的稳定性。

图8用羧酸、膦酸和邻苯二酚官能化的金属氧化物纳米晶体的胶体稳定性图。在该具体实例中，本发明人使用HfO₂作为NC模型体系，具有其各自的等电点(IEP)，MEEAA作为羧酸，PA-PEG作为膦酸，以及硝基多巴胺-mPEG作为邻苯二酚。图上的绿色与良好的胶体稳定性相关，渐变过渡到红色的区域表示胶体稳定性降低，红色阴影区域指示胶体稳定性差。

图9示出了纯化的硝基多巴胺-mPEG官能化的NC在H₂O中在不同pH值下的UV-VIS光谱。

图10示出了与本发明人提出的工作流程相比，检测前哨淋巴结的当前临床工作流程。二者均用女性乳腺癌患者来例示。

图11示出了(A)HfO₂纳米晶体的溶剂热合成。(B)HfO₂ NC的TEM图像。通过测量至少400个颗粒来确定球形形状NC的大直径和小直径。在插入角处可以看到尺寸分布直方图。(C)硝基多巴胺-mPEG官能化的HfO₂ NC在D₂O中的1H NMR波谱。(D)在38℃下通过动态光散射确定的HfO₂ NC在PBS中的体积尺寸分布。(E)用CT测量的HfO₂ NC在PBS中的浓度系列，造影增强以亨氏单位(Hounsfield unit，HU)表示。

图12示出了(A)将染料与NC表面共价连接的官能化工作流程。(B)顶部：IRDye800CW-DBCO在PBS中的激发和发射光谱。在805nm追踪到发射的同时记录发射光谱。在730nm追踪到的同时记录发射光谱。底部：NC-染料缀合物在PBS中的激发和发射光谱。在813nm下追踪到发射的同时记录激发光谱。在764nm下激发的同时记录发射光谱。

图13示出了(A)在左后足垫中以0.38mg NC/克体重的NC剂量皮下注射的小鼠在不同时间点拍摄的CT扫描冠状切片和矢状切片(板厚度为0.2mm)。(B)注射后75分钟扫描的体绘制。SLN、骨骼和软组织被单独划分。

图14示出了在左后足垫中以8.5MBq的Nanocoll剂量皮下注射的小鼠在不同时间点进行的对齐的SPECT扫描和CT扫描的体绘制。

图15示出了800CW DBCO的完整结构。

实施例

实施例1：HfO₂-MEEAA模型体系。

本发明人经由已建立的溶剂热过程(Lauria等人,ACS Nano 2013,7(8),7041-7052)在220℃下由叔丁醇铪和苄醇合成了HfO₂纳米晶体(NC)(图1A)。HfO₂表面用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(MEEAA，参见图1B)官能化，以使纳米晶体在甲苯中稳定，并且如先前所述(De Roo等人,Chem Mater 2018,30(15),5485-5492)去除所有未结合配体。根据TEM，纳米晶体的直径为2.64±0.19nm(μ±σ)(图1C)，并且根据x射线散射分析，纳米晶体具有单斜晶体结构(数据未示出)。纳米晶体分散体在甲苯-d₈中的¹H NMR波谱仅示出了增宽的共振，归因于结合配体(图1B)。事实上，波谱增宽是结合配体由于均匀增宽(T₂弛豫)和非均匀增宽(配体壳的不完全溶剂化；参见de Roo，同上)二者的典型特征。

纳米晶体也可以分散在乙醇、甲醇和水中，并因此是本发明人研究在极性溶剂中的配体结合行为的理想起点。在甲醇-d₄(MeOD)中，¹H NMR波谱看起来明显不同，其中尖锐信号叠加在宽共振上(图1B)。本发明人将尖锐信号归因于自动解吸的配体，通过扩散序谱(DOSY)中两组共振的出现得到证实。DOSY允许根据其扩散系数将(重叠的)NMR共振分开，并因此将游离配体(迅速扩散)与结合至NC的配体(缓慢扩散)分开。本发明人可以在扩散滤波谱(图1B)中选择性地观察结合配体，并且在仔细检查后，观察到在甲醇-d₄中的结合的MEEAA共振比在甲苯-d₈中的共振稍微尖锐，表明配体壳在甲醇中更好地溶剂化。考虑到所有配体均在甲苯中结合，本发明人推断溶剂显然在吸附-解吸平衡中发挥作用，例如通过改变配体的溶解度。事实上，甚至更多的MEEAA配体在D₂O中脱附，但纳米晶体在2至6的pH范围内保持稳定。NC在pH>6下迅速沉淀，并因此MEEAA对于许多通常需要在生理条件(pH＝7.4)下的稳定性的生物医学应用来说不是合适的配体。

注意，除了主要的MEEAA信号之外，本发明人还在¹H谱的芳族区中观察到低强度的宽共振，归因于苯甲酸根配体。苯甲酸先前被确定为纳米晶体合成的副产物，并被发现吸附在纳米晶体表面上。合成之后用MEEAA将表面官能化显然没有从表面去除所有的苯甲酸根，并且一小部分仍然存在。

实施例2：HfO₂纳米晶体合成和官能化

本发明人通过采用已建立的溶剂热过程在220℃下由异丙醇铪(IV)异丙醇加合物和苄醇合成了HfO₂ NC(图11A)。合成之后，用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(MEEAA)将NC官能化以使其在甲苯中稳定，如前所述去除所有未结合配体。重要的是，为了获得与临床上使用的平均直径为约8nm的^99mTc标记的纳米颗粒(即，纳米胶体Nanocoll)相当的淋巴引流，本发明人选择合成在表面官能化之后具有相同尺寸等级同时保持低于肾清除极限的HfO₂ NC。根据透射电子显微镜(TEM)，NC的大直径和小直径分别为5.04±3.73nm和2.41±0.85nm(μ±3σ)(11B)，并且根据X射线衍射，NC具有单斜(P2₁/c)晶体结构。

如之前所报道的，合成硝基多巴胺-mPEG并纯化，然后在水中对MEEAA官能化的NC进行配体交换，并在经由旋转过滤(超滤的形式)纯化之后，获得纯的NC悬浮体。硝基多巴胺-mPEG官能化的NC的1H NMR波谱(图11C)仅显示宽峰。峰增宽是结合配体的典型特征，并且由非均匀线增宽(与配体壳溶剂化相关)和均匀线增宽(T2弛豫)二者引起。根据动态光散射(DLS)，NC溶液在PBS中的Z-平均值为12nm(图11D)。Z-平均值是描述溶液中平均颗粒尺寸的单一值，并且对团聚高度敏感，在DLS中观察到的峰值与该低Z-平均值之间的匹配证实了悬浮体没有任何团聚。由于由硝基多巴胺-mPEG提供的胶体稳定性，可以产生PBS中的高度浓缩的NC悬浮体。图11E示出了使用CT在50kV管电位下扫描的官能化的NC在PBS中的浓度系列。可以观察到X射线衰减随NC浓度而线性增加，达到超过6000HU单位，甚至比最致密的骨骼都高得多。

为了提供将载荷与NC表面共价连接的方法，在本发明人的情况下为染料分子；参见图10，本发明人合成了1-叠氮基-N-(4,5-二羟基-2-硝基苯乙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(硝基多巴胺-PEG(4)-N₃)。从盐酸多巴胺开始的一步硝化反应结果是形成硝基多巴胺半硫酸盐。使用N-甲基吗啉(NMM)充当非亲核性碱进行硝基多巴胺半硫酸盐与15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酸琥珀酰亚胺酯(NHS-PEG(4)-N₃)之间的偶联。最终的硝基多巴胺-PEG(4)-N₃配体使用制备型高效液相色谱(HPLC)进行纯化，并且用电喷雾电离/高分辨率质谱(ESI-HRMS)和NMR波谱进行全面表征。

方案1：(A)硝基多巴胺半硫酸盐的合成。(B)硝基多巴胺-PEG(4)-N₃的合成。试剂和条件：(i)NaNO₂，20％H₂SO₄，H₂O 0℃至室温，12小时，50％；(ii)NMM，无水DMF，室温，48小时，70％。

硝基多巴胺-PEG(4)-N₃的设计基于以下标准决定：连接基团需要能够与NC表面强力结合，在该情况下经由硝基邻苯二酚锚，同时还包含可以在NC官能化和纯化之后共价结合载荷的官能团。本发明人选择引入末端叠氮化物，因为该基团可以与任何包含环辛炔官能团的分子进行快速的生物正交无铜点击反应。选择PEG间隔基比硝基多巴胺-mPEG稍长，以允许叠氮化物官能团位于拥挤的配体壳外部，从而在不显著增加NC的溶剂动力学直径的同时减少载荷偶联期间可能发生的任何可能的空间位阻。

本发明人使用图12A中描述的工作流程以执行与NC的染料偶联。在用硝基多巴胺-mPEG的典型官能化中，本发明人从水中的经MEEAA稳定的NC开始，并添加1.2当量去质子化的硝基多巴胺-mPEG以执行交换，纯化之后基于TGA和NMR的NC上结合的有机质量为18.9质量％，得到配体密度为1.8nm-2和每个NC 60个配体，计算参见SI。在包含硝基多巴胺-mPEG和硝基多巴胺-PEG(4)-N₃二者的混合配体壳的情况下，本发明人的目的是每个NC具有约一个叠氮化物官能团。考虑到该目标，本发明人构建1.18当量硝基多巴胺-mPEG和0.02当量硝基多巴胺-PEG(4)-N₃的混合物，将其预活化，并在水中进行与MEEAA官能化的NC的配体交换。旋转过滤之后，经由¹H NMR仅可以观察到宽的结合峰，表明纯化成功。不幸的是，峰的宽性质以及硝基多巴胺-mPEG与硝基多巴胺-PEG(4)-N₃之间的波谱重叠使得无法经由ERETIC对与NC结合的叠氮化物进行定量。然而，本发明人可以通过工作流程中的下一步：染料偶联，以间接方式对此进行定量。本发明人选择市售的800CW DBCO作为本发明人选择的染料(参见图15)。该染料是常用的近红外(NIR)荧光示踪剂，目前在多项临床试验中用于靶向乳腺、胰腺、头颈部和神经胶质瘤的恶性肿瘤。染料既吸收又发射近红外光谱中的光，从而减少了与组织自发荧光的光谱重叠。此外，其与(预)临床级成像装置兼容。将1当量(与假设附接至NC的叠氮化物的量相比)的800CW DBCO溶解在pH 7的无内毒素的超纯水中，并添加至叠氮化物官能化的NC中，在30℃下搅拌2小时之后，使用无内毒素的水作为溶剂经由旋转过滤对悬浮体再次进行纯化。通过使用UV-VIS光谱分析样品浓缩物和滤液并应用比尔-朗伯定律，本发明人能够对结合染料和剩余的未结合染料进行定量，从而间接测量染料偶联效率。本发明人发现在偶联之后，每个NC共价结合约0.7个染料分子。图12B分别示出了自由扩散的染料分子(顶部)和NC-染料缀合物(底部)的归一化激发和发射光谱，二者均在PBS中测量。尽管NIR-染料通常在NIR区显示出强吸收，但这不一定与所述区域中的强激发效率相关。本发明人可以看到，尽管对游离染料而言在805nm处追踪到发射，但使分子激发的最有效区域实际上在可见区。有趣的是，NC-染料缀合物的激发光谱看起来显著不同，尽管在813nm处追踪到发射，但在此最有效的激发区在NIR中。虽然对该现象的确切机制的解释在本发明工作的范围之外，但本发明人可以假设，硝基多巴胺-mPEG在300nm至500nm区域中的吸收影响缀合染料的激发。使用DLS，本发明人观察到与混合壳官能化的相比，染料缀合不影响NC胶体稳定性，并且不会引起流体动力学直径的显著增加。

实施例3：NC-染料缀合物的荧光优化

接下来，本发明人确定NC-染料缀合物的荧光发射是否发生浓度猝灭。为了排除纳米晶体浓度对荧光强度的可能影响，本发明人构建了浓度系列，其中缀合荧光染料浓度降低，同时在各样品中保留相等量的NC。为了实现这一点，本发明人将染料缀合NC的悬浮体与硝基多巴胺-mPEG官能化的NC的悬浮体混合，并相应地用PBS稀释每个样品。使用体内成像系统使用带通激发滤波器分别在710(±15)nm和745(±15)nm下使样品荧光可视化，同时在ICG窗口(810nm至875nm)中观察发射。从浓度系列中可以观察到明显的趋势，其中荧光强度随着缀合染料浓度增加而增加，在约28μmol*L-1下达到最佳。高于该浓度时，来自猝灭的有害影响引起荧光信号再次减弱。更具体地，与460μmol*L-1的最高浓度相比，14.4μmol*L-1的最低缀合染料浓度表现出约两倍的平均辐射效率，所述平均辐射效率为用于补偿非均匀激发光图案的单位。发现对于两种激发波长均发现了这种趋势和染料浓度最佳水平，其中唯一的区别是在使用745(±15)nm激发滤波器的情况下各样品的平均辐射效率更高(表1)。因此，745(±15)nm滤波器将是用于进一步体内实验的最佳选择。为了证明各荧光样品包含相等量的NC，进行了CT扫描。

表1：从浓度猝灭实验中提取的平均辐射效率数据。对于各样品绘制一个圆形感兴趣区域，通过在ICG窗口(810nm至875nm)中进行检测从该区域中获得平均辐射效率。

实施例4：初步体内CT优化

对于小鼠，皮下足垫注射被认为是实现淋巴引流的标准注射途径，其中位于膝盖后面的腘淋巴结作为SLN，以及髂LN、腹股沟LN、坐骨LN和肾LN作为较高梯队。在不同的CT切片上标出LN的解剖区域，但是LN本身很难或不可能与周围组织区分开来。从浓度为291mgHfO₂/ml的PBS中的NC悬浮体开始，本发明人在小鼠的左后足中皮下缓慢注射50μL。50μL是在该位置对小鼠的最大允许且可行的注射体积，并且得到对该动物0.38mg NC/克体重的剂量。引人注目的是，在注射后立即可以观察到SLN内的强的造影增强(图13)，而在较高梯队中未见造影增强。还要注意，在这个时间点，大多数造影剂仍位于足垫中。注射后75分钟SLN内的造影增强仍然是强的，并且可以在髂LN中观察到造影增强的略微增加，在注射后150分钟变得更强。在24小时时期内的数个时间点对小鼠进行纵向扫描，在此时期内SLN中的造影增强似乎保持稳定，髂淋巴结中的造影增强增加并在注射后约4小时稳定。

对于各时间点，本发明人发现造影增强主要位于LN皮层中，这是淋巴进入LN中的进入点。本发明人从该观察结果中猜测，NC不会在LN的髓质中保留很长时间，而是经由输出淋巴管向下一个LN迅速排出，并最终进入血流中。此外，本发明人没有观察到NC从同侧向对侧的溢出，证明NC基于其注射位置遵循明确限定的同侧引流途径，并且不会过早地从淋巴系统泄漏。在本发明人随时间的观察期间，在NC注射后和从第一次镇静中初步恢复后，动物没有表现出疼痛或不适的迹象。然而，为了减少药物剂量和减少总引流时间，本发明人在不同的小鼠中测试了另外两种剂量：0.19mg NC/g体重和0.28mg NC/g体重。从两种剂量，本发明人观察到与最高0.38mg NC/g体重剂量相似的引流结果。0.19mg NC/g体重的造影增强低于最高剂量，虽然SLN中的造影增强在注射后可直接辨别，并且如果扫描时机正确则理论上可以用于SLN识别，但需要受过训练的眼睛将其与背景区分开来，用于另外的扫描点。另一方面，0.28mg NC/g体重的剂量确实在所有扫描点的SLN中产生了强的造影增强，同时在较高梯队的NC外观中保持了所需的时间间隔，因此该剂量被选择为在增加造影增强同时使NC剂量最小化之间的良好折衷以用于之后的实验。此外，为了未来临床应用，具有造影增强也是具有吸引力的，因此另外用于双模态探针的NIR荧光在较长的持续时间内在SLN中保持足够高，因为手术过程可能花费数小时来完成。此外，根据所治疗的恶性肿瘤的SLN位置，也可以采用放射照片代替CT以确定SLN位置。在该初始CT优化期间，本发明人可以注意到小鼠之间轻微解剖变化的影响，如使用远交动物品系的任何类型的体内实验所预期的那样。这方面的一个实例是特定淋巴结的引流行为，虽然对于0.28mg NC/g体重，肾LN在240分钟扫描点变得可见，但接受0.38mg NC/g体重剂量的小鼠在任何时间点都没有显示出在该LN中的造影增强。还应注意到，在动物之间可以发现特定LN的解剖位置的轻微变化，例如坐骨LN通常尺寸小并且位于骨盆附近，而来自该结中NC的造影增强可能容易地被误认为是由骨盆骨产生的信号。在这方面应注意，尤其是对于这种解剖学上的紧密性甚至更显著的小鼠而言。

实施例5：纳米晶体制剂途径

从浓度猝灭实验(表1)和初步的体内CT实验中，本发明人了解到，对于CT造影，理想的染料浓度和理想的NC浓度之间存在不匹配。由于软组织固有地在CT中具有约100至300的亨氏单位值，因此需要淋巴结中存在的最小量的NC来使其可视化。另一方面，软组织显示(除了少数例外)在NIR中不表现出自发荧光，并且结合荧光成像的高灵敏度，需要非常少量的染料。浓度猝灭实验表明，注射NC悬浮体(其中各NC包含一个缀合染料)对于最终的荧光强度是有害的，此外，使用NIR示踪剂的其他体内研究也表明，少至1μg的染料可以足以使淋巴结可视化。10为了满足两种成像模式的需要，本发明人决定其中大多数NC没有结合的染料的制剂途径，而不是注射其中每个NC都包含染料分子的NC悬浮体。因此，该制剂由仅用硝基多巴胺-mPEG官能化的NC(参见图11A)和具有缀合的约1个染料/NC(参见图12)的混合物组成，注射的NC剂量仍为0.28mg NC/g体重，但缀合染料浓度仅为约28μmol*L-1。为了确保不包含染料的NC和具有缀合染料的NC二者均表现出相同的淋巴引流，进行了对照实验。在该对照实验中，如下对小鼠进行同时注射：在右后足垫中注射0.28mg/ml剂量的不含染料的NC，以及在左后足垫中注射0.28mg/ml剂量的包含约1个染料/NC的NC。本发明人可以在注射后观察到左SLN和右SLN二者中同时的造影增强，随着时间变得更强。伴随着该过程，左SLN显示出清晰的可以通过皮肤检测到的NIR荧光信号，而右SLN和足部预期地没有。注射后180分钟及以后，在膀胱中出现次级NIR荧光信号，表明NC的肾清除开始。

实施例6：与^99mTc-Nanocoll的比较

最后，本发明人将本发明人的NC的结果与当前的临床标准进行比较，本发明人用50μL的99m-Tc-Nanocoll对3只小鼠在后足垫中的一者中皮下注射，各注射的活性为6MBq至9MBq。使用临床前SPECT扫描仪，在注射之后立即，以及在注射后40分钟、160分钟、280分钟和400分钟，对小鼠进行扫描。由于SPECT固有的较长采集时间，选择的时间点不如使用CT的NC的时间点灵活。为了获得可接受的信噪比，本发明人将视野缩小到包括腘LN、髂LN、坐骨LN、腹股沟LN和肾LN的区域，并扫描30分钟。本发明人不选择扫描超过400分钟，因为注射的放射性示踪剂的半衰期为6小时。可以在图14中发现各扫描点的体绘制，重要的是要注意各SPECT扫描与CT扫描对齐，因为难以或不可能从SPECT扫描中获得解剖信息。

与NC相似，SLN在99mTc-Nanocoll注射之后立即可见。40分钟之后活性增加，但仍仅可以分辨出腘LN。160分钟之后，不仅腘LN和髂LN，而且坐骨LN和肾LN均可见。此外，如从图5中可以看出，坐骨LN位于骨盆附近，这使得将LN造影增强与该区域的骨骼区分开来具有挑战性。与NC相似，LN中的99mTc-Nanocoll活性在整个接下来的4小时中保持稳定，并且活性主要位于LN皮层中。约24小时之后，大部分产品衰退。

实施例7：纳米晶体的临床整合

图10将当前的临床工作流程与本发明人的双模态NC可以如何使用可用的基础设施进行整合进行了比较。在单次术前注射NC后，进行术前CT扫描。NC的非放射性性质和与SPECT/CT相比CT的快速扫描时间将在手术前的注射时机方面产生更大的灵活性。接下来，在通过CT识别出SLN之后，术中NIR荧光用于确认SLN位置，并且用于指导其完全切除。尽管如此，仍有可能在初始注射之后数小时进行手术，这增加了较高梯队也可见的可能性，正如本发明人对双模态NC和99mTc-Nanocoll二者所显示的那样。然而，这应该不会造成问题，因为术前扫描是为识别哪个节是SLN而专门定时的，从而为外科医生提供了移除正确结所需的信息。此外，如果手术室中可获得，则C型臂可以用作在术中确认SLN存在的方式。

通过从等式中去除放射性，本发明人可以减少患者的总体辐射暴露，并消除对高成本SPECT扫描仪的需要，而是使用更广泛可得且更快速的技术，如CT或常规放射线照相术来识别SLN。第二成像模态NIR-荧光是同一成像探针的一部分，并因此不会像目前使用的小分子染料那样遭受不期望的组织外渗。

实施例8：膦酸的竞争性结合

为了评估膦酸在甲醇中的结合强度，本发明人选择(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸(PA-PEG)作为与MEEAA具有相当结构的配体(图2A)。在¹H NMR波谱中，PA-PEG的共振1具有2.05ppm的化学位移，与MEEAA共振明显分离，从而允许本发明人选择性地监测PA-PEG的结合(图2B)。由于MEEAA具有甲氧基而PA-PEG没有，共振f用于获得关于MEEAA结合的选择性信息。其他共振(2-6和b-e)重叠。

从甲醇-d₄中的MEEAA稳定的HfO₂纳米晶体开始，本发明人逐步添加PA-PEG，同时监测¹H NMR波谱，参见图1B。在滴定期间，本发明人观察到在约2.2ppm逐渐出现宽共振，归因于结合PA-PEG的共振1。伴随地，共振f变得较窄(图2B)，表明MEEAA从纳米晶体表面去除。在芳族区内，本发明人还观察到苯甲酸的解吸。本发明人得出结论，PA-PEG有效地取代了MEEAA和苯甲酸。鉴于没有游离膦酸，对于大多数滴定，交换是定量的。添加1.3当量的膦酸之后，在同一区域出现尖锐的信号，表明现在存在游离的PA-PEG。从³¹P谱中也得出了相同的结论(图2C)，其中首先宽信号的强度增加，以及在添加大于一当量之后出现尖锐的³¹P信号。有趣的是，结合的PA-PEG共振强度在1.3当量与1.6当量之间仍略有增加。本发明人推断交换的最后部分没有定量进行，并且剩余的羧酸根配体较难除去。该观察结果暗示，对于所有的MEEAA配体，结合亲和力(ΔG_吸附)不是单一的固定量，而是一种分布，正如先前CdSe纳米晶体所显示的。

不幸的是，NMR波谱的特征是大量的谱重叠，其中游离配体和结合配体的信号叠加。滴定结束时，游离配体的共振在波谱中占主导地位。为了更深入地了解那时配体壳的组成，本发明人转向扩散滤波谱(图2D)。虽然共振2-6与共振b-e重叠，但共振f的明显存在表明表面上存在残留的MEEAA。基于结合的MEEAA的扩散滤波谱，本发明人将属于MEEAA的谱部分指定为红色阴影区。蓝色图案区指定为PA-PEG。面积比向本发明人给出配体壳组成的粗略估计：10％MEEAA和90％PA-PEG，但是该估计忽略了不同共振的弛豫行为的差异。根据常规的¹H谱，在表面上还仍然存在苯甲酸根，但是由于其较快的T₂弛豫(由于刚性和接近表面)，这些共振的信噪比在扩散滤波谱中太低。因此，以上结果确定了羧酸根配体和PA-PEG之间的交换在甲醇中没有完成。该结论与脂肪酸和烷基膦酸在非极性溶剂中的相对结合亲和力(膦酸以1:1化学计量定量取代羧酸)形成对比。

MEEAA在甲醇中的自动解吸已表明配体溶解性可以改变结合亲和力。事实上，配体结合是由各物质的化学势控制的平衡过程：

因此，这种吸附-解吸平衡取决于游离配体的化学势(并因此也取决于溶解度)。为了在实践中探索该概念，本发明人设计了模拟胶束的配体壳结构；具有疏水性链段和亲水性链段二者。为此，本发明人选择配体(6-{2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己基)膦酸(PA-hex-PEG)，参见图3。本发明人假设该配体更容易在纳米晶体表面上自组装，因为疏水区降低了在极性溶剂中的溶解度。使用PA-hex-PEG，本发明人进行了与之前相同的滴定实验。结果通常非常相似，表明羧酸根配体交换为PA-hex-PEG(未示出)。然而，这一次，大多数苯甲酸根配体被PA-hex-PEG去除(尽管不是完全去除)，并且在扩散滤波谱中几乎检测不到任何MEEAA共振(图3)。至多3％的MEEAA仍存在于配体壳中。本发明人得出结论，事实上，竞争性结合可以通过改变配体溶解度来控制。有趣的是，苯甲酸似乎比MEEAA具有更高的结合亲和力，这可能归因于其更高的酸度和其在甲醇中更低的溶解度二者。

实施例9：膦酸酯封端的纳米晶体的纯化和向水中的转移。

考虑到本发明人的最终目标是为生物医学应用提供稳定的表面化学性质，本发明人试图纯化本发明人的分散体并将其分散在水性介质中。沉淀-再分散循环是纯化纳米晶体的最常见方式。然而，乙二醇链段的极大通用性提供了在各种溶剂和不能与甲醇很好地混合非溶剂如己烷中的胶体稳定性。因此，本发明人选择使用旋转过滤(超滤的形式)来纯化本发明人的分散体。该技术基于半透膜(如透析)，其中小分子可以通过孔，但大纳米晶体不能。通过在离心机中进行分离，加速纯化。首先将纳米晶体悬浮体置于旋转过滤器中，并用纯甲醇进一步稀释。稀释不会诱导配体解吸。过滤之后，回收纳米晶体的浓缩分散体。纯化是成功的，如3次纯化循环之后几乎所有未结合的物质均被除去所示。旋转过滤前后的扩散滤波谱的比较显示出完美的匹配，证明纯化没有改变配体壳组成。当逐渐将溶剂组成从纯甲醇-d₄改变为D₂O时，观察到PA-PEG和PA-hex-PEG之间的有趣差异(图4)。当水含量增加时，尽管PA-PEG逐渐从表面解吸，而PA-hex-PEG保持紧密结合。这进一步强调了本发明人的假设，PA-hex-PEG表现为胶束模拟物，避免了疏水性链段与水接触。通过结合纳米晶体表面，PA-hex-PEG配体产生了具有烷基-烷基相互作用的疏水性内壳和具有乙二醇部分作为水分子氢键受体的亲水性外壳。另一方面，PA-PEG是高度水溶性的，并因此对氧化铪表面的亲和力随着水含量增加而降低。

方案2.(A)硝基多巴胺半硫酸盐的合成。(B)MEEAA-NHS的合成。(C)硝基多巴胺-mPEG的合成。试剂和条件：(i)NaNO₂，20％H₂SO₄，H₂O，0℃至室温，12小时，50％；(ii)NHS，DCC，DMAP，无水THF，0℃至室温，12小时，83％；(iii)NMM，无水DMF，室温，48小时，75％。

实施例10：邻苯二酚的合成和结合。

本发明人合成了N-(4,5-二羟基-2-硝基苯乙基)-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰胺(硝基多巴胺-mPEG)，参见方案2。本发明人选择硝基邻苯二酚代替未经取代的邻苯二酚，因为硝基降低邻苯二酚pKa值，并且改善邻苯二酚的氧化稳定性。从盐酸多巴胺开始，一步硝化反应引起硝基多巴胺半硫酸盐的形成。单独地，使用N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)将MEEAA转化为活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(MEEAA-NHS)。使用N-甲基吗啉(NMM)充当非亲核性碱进行硝基多巴胺半硫酸盐和MEEAA-NHS之间的偶联。使用制备型HPCL纯化最终的硝基多巴胺-mPEG配体，并使用ESI-HRMS和NMR波谱进行全面表征。

当本发明人进行与之前相似的竞争性结合实验(向甲醇-d₄中的MEEAA封端的HfO₂纳米晶体中添加硝基多巴胺-mPEG)时，本发明人发现一当量的硝基多巴胺-mPEG不能有效地竞争纳米晶体表面，即使仅0.4当量的邻苯二酚，也可以观察到自由扩散的硝基多巴胺-mPEG信号。考虑到许多用邻苯二酚成功进行表面官能化的报道(Okada等人ChemistrySelect 2018,3(29),8458-8461；Dragoman等人,Chemistry of Materials2017,29(21),9416-9428；Amstad等人,The Journal of Physical Chemistry C 2011,115(3),683-691；Amstad等人,Nano Letters 2009,9(12),4042-4048；Gillich等人.Journalof the American Chemical Society 2011,133(28),10940-10950；Xie等人.Adv.Mater.2007,19(20),3163-3166.；Bae等人.Bioconjugate Chemistry 2010,21(3),505-512.)，这样的低结合亲和力是非常出乎意料的。然而，在这些报道中，使用水或生物缓冲剂作为溶剂。因此，本发明人设计了直接在水中的竞争性结合实验。幸运的是，即使很大一部分MEEAA被解吸，MEEAA稳定的HfO₂纳米晶体在D₂O中也是稳定的。在不调节pH的情况下添加一当量硝基多巴胺-mPEG产生在pH＝2下的混浊悬浮体。当将pH调节至pH＝5时，获得稳定的悬浮体。为了允许系统地逐步地添加硝基多巴胺-mPEG，本发明人用2当量NaOD制备了硝基多巴胺-mPEG的储备溶液以使邻苯二酚双重去质子化。添加碱使溶液的颜色从浅黄色变为深酒红色。本发明人向MEEAA稳定的HfO₂悬浮体中以0.5当量逐步地添加该储备溶液，并记录标准¹H NMR和扩散滤波NMR波谱二者。添加0.5当量之后，本发明人没有观察到任何属于硝基多巴胺-mPEG的尖锐信号，而本发明人确实观察到解吸的苯甲酸和解吸的MEEAA。在扩散滤波谱中，本发明人也看到明显的变化。在芳族区中，苯甲酸根的宽信号被硝基多巴胺-mPEG的宽信号所取代。区域3ppm至4ppm的峰形也发生改变。随着添加更多的硝基多巴胺-mPEG，交换继续，并且添加1.5当量之后，检测到尖锐的(未结合的)硝基多巴胺-mPEG信号。尽管滴定中此时pH为10.3，但悬浮体仍保持稳定，提供了配体交换成功的进一步证据，因为经MEEAA稳定的纳米晶体将在pH>6下沉淀。本发明人得出结论，如果pH>5，则硝基多巴胺-mPEG可以从纳米晶体表面定量取代MEEAA。

使用Milli-Q水作为溶剂，使用多个循环的旋转过滤再次纯化NC，直到滤液几乎无色。将浓缩物蒸发并重新分散在D₂O中，并将pH调节至7.4。图5B包括经纯化的悬浮体的常规¹H NMR波谱，样品的纯度是惊人的，并且仅观察到属于硝基多巴胺-mPEG的增宽共振。基于定量¹H NMR和25.79％的TGA质量损失，本发明人计算出纳米晶体表面的硝基多巴胺-mPEG配体密度为1.53nm^-2。本发明人得出结论，硝基多巴胺-mPEG在生理pH下在纳米晶体上形成紧密结合的配体壳，没有解吸的迹象。

实施例11：配体结合的pH依赖性。

由于很明显，pH在水性环境中的配体结合中发挥至关重要的作用，因此本发明人系统地将pH从3变化至10，并使用¹H NMR、³¹P NMR和动态光散射(DLS)来评估配体结合和胶体稳定性(图6)。从NMR中，本发明人通过³¹P共振的峰去卷积提取了膦酸配体的结合配体分数，并通过芳族¹H共振的峰去卷积提取了硝基多巴胺-mPEG的结合配体分数。从DLS测量中，本发明人获得了Z-平均值和ζ电势。Z-平均值是描述平均颗粒尺寸的单一值，并且对团聚最敏感。ζ电势表示纳米晶体之间的静电排斥程度(ζ电势值高于+25mV或低于-25mV表示稳定的悬浮体)。从图6中，本发明人清楚地观察到，对于PA-PEG和PA-hex-PEG二者，结合配体分数随着pH升高而降低。取乙基膦酸的pKa值(pKa₁＝2.43；pKa₂＝8.05)作为参照，令人惊讶的是，在pKa₂附近，结合配体分数下降最急剧。本发明人推断膦酸的第二次去质子化引起配体壳中配体-配体排斥，并且使得配体在水中的溶解度增加。两种效应均引起降低的结合配体分数。并不意外地，配体的损失对胶体稳定性具有有害影响，并且对于pH>pKa2，Z-平均值显著增加。总的来说，PA-hex-PEG比PA-PEG表现稍好，但差异小。最可能的是，双阴离子膦酸酯补偿了短的疏水性链段。

可以预期配体解吸后胶体稳定性完全丧失。然而，在样品中没有观察到看得见的混浊，并且Z-平均值保持低于100nm。注意，在pH>8下，ζ电势降至低于-25mV。虽然空间稳定化随着配体解吸进行而丧失，但静电稳定化接管，从而防止NC完全失稳。负电荷可能源自残留的结合双去质子化膦酸根，或者更可能源自纳米晶体表面上的氢氧化物吸附。事实上，在水中，同时存在多个吸附-解吸平衡。

再加上酸碱平衡，而开始理解体系复杂的pH依赖性。

根据图6，在静态体系中，膦酸使纳米晶体在pH 3至pH 8之间保持稳定。然而，在动态生物环境(例如血管)中，存在许多竞争性配体，并且解吸的配体迅速被去除。平衡将调整，并因此配体将不断从表面解吸，最终导致胶体稳定性丧失。尽管在生理pH下的Z-平均值可接受，但该动态行为可以解释为什么单膦酸根配体不一定成功地完全防止生理介质中的聚集。

有趣的是，硝基多巴胺-mPEG具有几乎完全相反的行为，不能在酸性条件下提供稳定的胶体分散体，在约pH＝5具有非常急剧的转变。Z-平均值的急剧增加证明了这一点(图6)。在pH 5至pH 10之间，所有硝基多巴胺-mPEG配体保持结合，并且仅在pH＝11下，结合分数从100％略微降低至97％。这意味着在5至11的pH范围内优异的胶体稳定性。本发明人得出结论，对于生理pH下的水性应用，硝基多巴胺-mPEG优于PA-PEG和PA-hex-PEG二者。另一方面，对于酸性pH下的水性应用，膦酸配体更适合。为了测试官能化NC体系的结合动力学是否还存在温度依赖性，本发明人在D₂O中在25℃至60℃下在pH 7.4下进行了变温NMR测量。¹HNMR波谱显示膦酸和硝基多巴胺-mPEG二者的配体吸附/解吸平衡没有变化，使本发明人初步得出结论：来自pH滴定的结果也将转化至生理温度。

为了说明膦酸和邻苯二酚的互补行为，本发明人在D₂O中对纯化的硝基多巴胺-mPEG NC进行了竞争性交换反应。与用硝基多巴胺-mPEG使NC官能化的原始添加量相比，添加1当量的PA-PEG，并在不同pH值下进行NMR测量。结果清楚地表明，在酸性pH值下，发生了与PA-PEG的部分交换，证据是在芳族区中出现了尖锐的硝基多巴胺-mPEG信号和3ppm附近的亚甲基三重峰。通常在pH低于5下完全失稳的硝基多巴胺-mPEG NC悬浮体由于现在混合的邻苯二酚-膦酸根配体壳而在pH 2.22下保持胶体稳定。随着pH向中性值和碱性值移动，交换平衡主要移回硝基多巴胺-mPEG。

实施例12：在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定性。

最后，本发明人评估了用PA-PEG、PA-hex-PEG和硝基多巴胺-mPEG官能化的NC在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定性。PBS中的稳定性是生物医学应用的重要先决条件，因为许多体内实验注射在盐水溶液中或在PBS中期望的药物或造影剂。1X PBS缓冲剂包含137mmolL^-1NaCl、2.7mmol.L^-1KCl、10mmol.L^-1Na₂HPO₄和1.8mmol.L^-1KH₂PO₄，并且为标准浓度。当浓度为一半或两倍时，这些缓冲剂分别被称为0.5X PBS和2X PBS。明显的是，PBS包含相对高的盐浓度和磷酸根离子(其将竞争表面)，并因此为本发明人的官能化纳米晶体的稳定性提供真实的测试。第一，本发明人改变PBS浓度，并立即通过DLS测量Z-平均值(图7A)。高至1.5XPBS，所有配体均使纳米晶体保持胶体稳定。如所预期的，在2X PBS溶液中，PA-PEG为最弱的配体并且不能防止纳米晶体开始聚集。第二，在2X PBS中监测所有官能化的NC随时间的稳定性(图7B)。显然，PA-PEG官能化的纳米晶体迅速团聚，并且数小时之后看得见地沉淀。在完全团聚之前，PA-hex-PEG官能化的纳米晶体的胶体稳定性在24小时内稳定下降。仅硝基多巴胺-mPEG官能化的纳米晶体保持完全稳定。在48小时的过程内没有聚集的迹象，并且悬浮体也保持视觉上的澄清至少1个月。

实施例13：讨论

以上结果清楚地表明，当从非极性溶剂转移至极性(例如，水性)溶剂时，表面化学性质变得更复杂。在非极性溶剂中，带电配体或纳米晶体是热力学不稳定的，引起有限的结合基序组和明确的配体交换规则。例如，油酸根(去质子化的油酸)的自动解吸在甲苯中不会发生。对于PbS(PbX₂)的结合基序，在氯仿或配位溶剂如THF中观察到整个路易斯酸PbX₂的去除。同样，对于HfO₂(H,OOCR)，通过羧酸根和质子的复合，油酸的解吸是可能的。然而，在电荷稳定的极性溶剂中，这些限制消失，并且质子和羧酸根具有独立的吸附/解吸平衡，也参见式2至式4。

根据以上数据，本发明人构建了胶体稳定性图，表明哪些配体在特定pH范围内提供胶体稳定性，参见图8。有趣的是将该稳定性图与配体的pKa相关联。本发明人采用乙基膦酸的pKa值(pKa₁＝2.43；pKa₂＝8.05)作为PA-PEG和PA-hex-PEG配体的参照。在pH＝3下(其中颗粒稳定)，本发明人计算出96％的膦酸是单去质子化的。可以假设膦酸根将以这种形式与纳米晶体表面结合。在pH>8下(高于pKa₂)，结合配体分数迅速减少，并且颗粒开始聚集(图6)。双去质子化有两个结果；(1)配体变得更易溶于水，和(2)出现静电配体-配体排斥，而不是使氢键合稳定。两种效应均促进配体解吸。此外，氧化铪的等电点在pH＝8下出现，使表面在pH>8下带负电荷，因此进一步降低带负电荷的膦酸根配体的结合亲和力。

相似的推理适用于硝基多巴胺-mPEG的情况(pKa₁＝6.6；pKa₂＝11；基于硝基多巴胺pKa值)。在pH＝5下(其中颗粒不稳定)，本发明人计算出约98％的配体完全质子化，并因此可以仅通过弱氢键与表面相互作用。pH高于5下，更多的硝基多巴胺-mPEG变成单去质子化，并且能够与表面金属位点配位并提供另外的氢键以进一步使结合状态稳定。参见图9，通过比较与HfO₂ NC结合的硝基多巴胺-mPEG的UV-VIS光谱和游离配体的参照光谱证实了这一点。对于5<pH<11，本发明人发现单去质子化的物质。在pH>11下，本发明人再次在NMR中看到游离配体的出现，并且在UV-Vis中看到双去质子化物质的出现。由于上述原因，双去质子化物质对表面的结合亲和力低。最后，羧酸可以仅单去质子化，并且本发明人观察到MEEAA(pKa＝3.4)使NC保持稳定直到pH＝6。本发明人假设由于缺乏配体-配体氢键合，它们不如膦酸根和邻苯二酚稳定。

在缓冲溶液中的稳定性实验指出了两个另外的变量：竞争性配体和盐。在磷酸盐缓冲盐水中，存在高浓度的磷酸根，其竞争表面但不提供空间稳定化。由于膦酸(PA-PEG和PA-hex-PEG)在pH＝7.4下解吸(25％解吸，参见图6)，它们处于平衡并因此可以随时间缓慢被取代。从本发明人的竞争实验判断，硝基多巴胺-mPEG紧密结合(0％解吸)并且没有被膦酸取代。因此，用硝基多巴胺-mPEG封端的颗粒的稳定性高。

以上讨论表明，在水性介质中，表面化学性质是多种因素之间的复杂相互作用。存在表面的pH依赖性电荷、配体的pH依赖性去质子化以及缓冲溶液中磷酸根的竞争。因此，在具有可用配体的pKa和纳米晶体的等电点的情况下，现在可以使用胶体稳定性图(图8)来开始预测哪些配体将在特定pH下提供胶体稳定性。

实施例14：合成细节

(6-{2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己基)膦酸和(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸购自N-羟基琥珀酰亚胺(≥98％)和盐酸多巴胺(≥99％)购自Acros Organics。2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(>95.0％)购自TCIChemicals。异丙醇铪(IV)异丙醇加合物(99.99％)购自Fisher Scientific。IRDye 800CW-DBCO购自LiCor。用于合成的叔丁醇铪(IV)(99.99％)、N,N’-二环己基碳二亚胺(99％)、4-(二甲基氨基)吡啶(≥99％)、4-甲基吗啉(99％)、亚硝酸钠(≥99.0％)和溶剂购自SigmaAldrich。在没有进一步纯化的情况下使用所有购买的化学品。所有氘代溶剂均购自SigmaAldrich或Eurisotop。

MEEAA-NHS的合成。

将4mmol(0.7128g)2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸和4.2mmol(0.4828g)N-羟基琥珀酰亚胺在预干燥小瓶中溶解在8ml无水THF中，并冷却至0℃。将4.2mmol(0.866g)N,N’-二环己基碳二亚胺在单独的预干燥小瓶中溶解在4ml THF中，并通过进行无空气转移滴加至第一混合物。将混合物在0℃下搅拌15分钟，之后添加0.2mmol(0.024g)催化性4-二甲基氨基吡啶。将混合物在室温下搅拌过夜，产生白色混浊混合物。将混浊溶液转移至50ml离心管，并以5000rcf离心5分钟，使用0.2μm PTFE注射器过滤器将上清液转移至烧瓶，并用10ml THF对白色固体进行洗涤一次，以收集剩余产物。在使用旋转蒸发器除去溶剂之后，将粘性液体溶解在12ml DCM中，用MQ水萃取有机相四次，并且用盐水再萃取两次。将有机相用MgSO₄干燥，并使用旋转蒸发器干燥。收集作为无色粘性液体的产物，产率为83％。

硝基多巴胺半硫酸盐的合成。

将8.753mmol(1.66g)盐酸多巴胺和35.219mmol(2.43g)NaNO₂溶解在100ml MQ水中，并在冰浴中冷却。在剧烈搅拌下向混合物中滴加8.33ml预冷的20％H₂SO₄，在添加期间，混合物随着棕色气体的形成变成浑浊的黄色。将混合物从冰浴中取出并使其在室温下搅拌12小时。将所得浑浊黄色溶液在冰浴中再次冷却，然后使用por 4烧结玻璃过滤器通过吸滤收集固体。接下来，将固体用50ml冰冷MQ水洗涤2次，用50ml冰冷无水乙醇洗涤1次，并且用50ml冰冷乙醚洗涤2次。收集黄色粉末并在真空下干燥过夜，最终产率为50％。

硝基多巴胺-mPEG的合成。

将1.784mmol(491mg)MEEAA-NHS和2.854mmol(846mg)硝基多巴胺半硫酸盐在预干燥的烧瓶中溶解在25ml无水DMF中，产生深橙色溶液。将烧瓶密封，用氩气冲洗并在冰浴中冷却。使用无空气技术向混合物中滴加785μLN-甲基吗啉，在搅拌约10分钟之后，溶液变浑浊。使混合物在室温下搅拌48小时，然后在40℃下在真空下蒸发过夜以除去DMF，产生深棕色液体。向粗物质中添加40ml 1M HCl，并用40ml CHCl₃萃取3次，在该过程期间在液体界面处形成深棕色固体，注意不要使其进入有机相。将有机相用50ml盐水再萃取两次，用Na₂SO₄干燥，并且使用旋转蒸发进行蒸发。使用从溶剂A(包含0.1％TFA的MQ水)到溶剂B(包含0.1％TFA的ACN)的梯度，用制备型HPLC对所得固体进行纯化，在冷冻干燥之后分离作为蓬松的白黄色固体的最终产物，产率为75％。

硝基多巴胺-PEG(4)-N₃的合成

将0.103mmol(40mg)NHS-PEG(4)-N₃(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酸琥珀酰亚胺酯)和0.1648mmol(48.8mg)硝基多巴胺半硫酸盐在预干燥的烧瓶中溶解在2mL无水DMF中，产生深橙色溶液。将烧瓶密封，用氩气冲洗，并在冰浴中冷却。接下来，使用无空气技术向混合物中滴加45.3μL N-甲基吗啉。使混合物在室温下搅拌48小时，产生包含黄褐色固体的混浊溶液。在30℃下在真空下过夜蒸发DMF。接下来，将粗物质溶解在3ml Milli-Q水中，并使用1mol*L-1HCl溶液稀释至5mL，旨在达到约1的pH。用5mL CHCl₃萃取含水粗物质三次；在该过程期间，在液体界面处形成深棕色固体，并且注意不要使其进入有机相。使用旋转蒸发蒸发有机相，并在30℃下在真空下再次干燥过夜，产生褐黄色粘性固体。将所得固体溶解在3mL 50/50ACN/Milli-Q水混合物中，在通过0.2μm注射器过滤器除去不溶物之后，用制备型HPLC使用从溶剂A(包含0.1％TFA的Milli-Q水)到溶剂B(包含0.1％TFA的ACN)的梯度对溶液进行纯化，并且在冷冻干燥之后，分离作为黄褐色固体的最终产物，产率为70％。

氧化铪纳米晶体的合成。

根据Lauria等(ACS Nano 2013,7(8),7041-7052)，由叔丁醇铪(IV)(4.8mmol，2.26g，1.94mL)和无水苄醇(40mL)合成NC。合成之后，通过向反应混合物中添加二乙醚(17mL)并在塑料离心管中离心(5000rcf，3分钟)来收集纳米晶体。沉淀物用二乙醚(17mL)洗涤三次。为了用2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酸官能化，首先将沉淀物分散在17mL甲苯中，产生乳白色混浊液体。添加335μL 2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酸(0.2885g；1.62mmol)，然后进行声处理30分钟，产生存在少量不溶物的透明悬浮体。通过离心(5000rcf，5分钟)除去不溶物，并将澄清的顶层转移至新的塑料离心管。通过添加1:2体积的己烷(异构体的混合物)使NC沉淀，离心(5000rcf，5分钟)之后，除去有机顶部相并使NC重新悬浮在甲苯中。该纯化步骤再重复3次，然后最终重新悬浮在甲苯中。纯化的NC在甲苯中的悬浮体保持稳定至少1年。可以将甲苯中的分散体干燥并分散在乙醇中，分散体可以从乙醇中再次干燥并重新悬浮在MeOH或水中。

TEM分析。

在带有Cs校正器的JEOL JEM-2200FS TEM上拍摄(在网格上的滴落涂布悬浮体的)透射电子显微镜(TEM)图像。

动态光散射分析。

在Malvern Zetasizer超动态光散射系统上以背散射模式(173°)进行动态光散射(DLS)和ζ电势测量。DLS和ζ电势测量分别在玻璃比色皿和一次性折叠毛细管池中进行。在系统内平衡240秒之后，在25℃下一式三份地进行所有测量，调整样品浓度以实现9至10的系统衰减器值。使用Malvern“ZS Explorer”软件使用“通用”分析模型进行DLS数据处理，在同一软件中使用“单峰”分析模型进行ζ电势数据处理。

UV-Vis分析。

在PerkinElmer Lambda 365上记录UV-VIS光谱。

XRD测量。

在具有电动防散射屏和自动交换机以及Bragg-Brentanoθ-θ几何(测角仪半径280mm)的Bruker D8 Advance上进行X射线衍射(XRD)。仪器使用无Kβ滤波器的Cu Kα辐射探测器为具有192个通道的LynxEye XE-T硅微条线探测器。通过在硅板上滴落涂布NC悬浮体来制备样品。测量在15°至60°的2θ范围内进行，步长为0.02°，以及扫描速率为0.5°/分钟。

X射线散射分析。

在德国汉堡的DESY使用Varex 2D探测器(2880×2880像素和150×150μm像素尺寸)以光束线P21.1以快速采集模式以800mm的样品到探测器的距离进行对分布函数(PairDistribution Function，PDF)测量。X射线的入射波长为使用镍标准对实验装置进行校准。变温NMR测量。

在以600.13MHz质子频率运行的Bruker Avance III NMR波谱仪上记录变温¹HNMR测量，该仪器配备有间接5mm BBI探针。探针设置有自屏蔽z-梯度。对于在低于318K下进行的实验，使用甲醇标准校准温度，显示+/-0.2K以内的精度。对于高于318K的变温NMR测量，使用甘油标准用于校准。

PA-PEG官能化的NC的NMR测量。

在以600.13MHz质子频率运行的Bruker Avance III NMR波谱仪(用PA-PEG滴定并转移至水)上记录用(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)膦酸(PA-PEG)进行的纳米晶体(NC)官能化的核磁共振(NMR)测量。该仪器配备有直接观察5mm BBFO智能探针(用于³¹PNMR)或者配备有间接5mm BBI探针。两个探针均配备有自屏蔽z-梯度。实验在298K下进行，并且使用甲醇标准校准温度，显示+/-0.2K以内的精度。

在以600.13MHz质子频率运行的Bruker Avance III HD NMR波谱仪上在298K的温度下记录所有其他用PA-PEG进行的官能化的¹H NMR测量，该仪器配备有低温QCI-F探针。在以500.13MHz质子频率运行的Bruker Avance Neo波谱仪上在298K的温度下记录用PA-PEG进行的官能化的所有其他³¹P NMR测量，该仪器配备有BBFO探头。两个波谱仪的探针均配备有自屏蔽z-梯度。使用甲醇标准校准温度，显示+/-0.2K以内的精度。

PA-hex-PEG官能化的NC和硝基多巴胺-mPEG官能化的NC的NMR测量。

在以600.13MHz质子频率运行的Bruker Advance III HD NMR波谱仪上记录用(6-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)己基膦酸(PA-hex-PEG)和N-(4.5-二羟基-2-硝基苯乙基)-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰胺(硝基多巴胺-mPEG)进行的纳米晶体(NC)官能化的核磁共振(NMR)测量，该仪器配备有低温QCI-F探针。在以500.13MHz质子频率运行的Bruker Avance Neo波谱仪上在298K的温度下记录用PA-hex-PEG进行的官能化的³¹P NMR测量，该仪器配备有BBFO探头。两个波谱仪的探针均设置有自屏蔽z-梯度。使用甲醇标准校准温度，显示+/-0.2K以内的精度。

合成配体的NMR测量。

在以500.13MHz质子频率运行的Bruker Avance Neo波谱仪上在298K的温度下记录合成配体的¹H、¹³C{¹H}、³¹P{¹H}和2D NMR测量，该仪器配备有BBFO探头。探针设置有自屏蔽z-梯度。使用甲醇标准校准温度，显示+/-0.2K以内的精度。

NMR实验参数。

对于定量1D ¹H测量，取样64k个数据点，其中谱宽设置为20ppm，以及弛豫延迟为30秒。使用数字ERETIC法获得浓度。用双刺激回波和双极梯度脉冲(dstebpgp2s)进行²DOSY测量。如果需要扩散滤波切片，则梯度强度从探针最大值的2％至95％以8步二次方地变化，或者如果需要产生伪2D波谱，则梯度强度以32步变化。对梯度脉冲持续时间和扩散延迟进行优化以确保信号在最终增量中的最终衰减相对于第一增量小于10％。通过将修正的斯捷斯卡尔-坦纳方程(Stejskal-Tanner equation)拟合到信号强度衰减来获得扩散系数：

I为信号强度，D为线性扩散系数，γ为所研究原子核的旋磁比，g为梯度强度，δ为脉冲场梯度持续时间，以及Δ为扩散延迟。由于用于梯度脉冲的平滑方形脉冲形状，因此对于δ应用0.6的校正因子。对于1D ³¹P{¹H}测量，在zgpg30脉冲序列中取样25000个数据点，其中谱宽设置为270.81ppm和4k次扫描，在波谱后处理期间将LB设置为40Hz。对于1D ¹³C{¹H}测量，在zgpg30脉冲序列中取样120480个数据点，其中谱宽设置为239.49ppm和4k次扫描。

MeOH和H₂O中的旋转过滤纯化。

将包含溶解在2ml溶剂中的最多50mg材料的NC悬浮体通过0.2μm注射器过滤器转移至预冲洗的Sartorius Vivaspin(30000MWCO)旋转过滤管。用MeOH或Milli-Q水将悬浮体稀释至20ml体积，然后使溶液在离心机中以2100rcf旋转30分钟。对于膦酸NC官能化，每个样品使用MeOH进行3次旋转过滤循环，对于硝基多巴胺-mPEG NC官能化，使用Milli-Q水进行最少2次旋转过滤循环，直到滤液无色。将浓缩物收集，蒸发并悬浮在(氘代)MeOH或(氘代)H₂O中，进行30分钟的声处理以确保所有团聚物重新悬浮并使不溶物最少化。

用PA-PEG和PA-hex-PEG进行滴定。

蒸发少量纯化的甲苯NC储备悬浮体，以产生约45mg官能化的材料。使NC悬浮在0.5ml无水EtOH中，并进行声处理30分钟，之后再次蒸发溶剂。然后使NC悬浮在0.5ml MeOD中，并进行声处理30分钟，使用数字ERETIC方法进行定量¹H NMR测量以确定MEEAA浓度。注意从计算中减去与MEEAA信号部分重叠的MeOH溶剂峰，以确保准确的浓度确定。接下来，在MeOD中构建包含至少3当量PA-PEG或PA-hex-PEG的储备溶液。通过以0.1当量逐步地添加PA-PEG或PA-hex-PEG来进行滴定，在各添加步骤翻转NMR管，然后使用涡旋旋转混合2分钟，然后进行声处理数秒。

用PA-PEG和PA-hex-PEG进行NC官能化。

在典型的官能化中，使用与用PA-PEG或PA-hex-PEG进行滴定期间相同的方法。只是在此将1.5当量的膦酸一次性添加至MEEAA官能化的NC中，搅拌并进行声处理10分钟，然后使用旋转过滤纯化，以产生纯的PA-PEG官能化的NC或PA-hex-PEG官能化的NC。

用D₂O滴定。

用PA-PEG或PA-hex-PEG官能化的NC使用如上所述的旋转过滤进行纯化，对浓缩物进行蒸发并重新悬浮在500μL MeOD中。以逐步的方式添加D₂O，以分别达到25％、50％、75％和100％的最终D₂O浓度。当需要时，在测量之间对悬浮体进行蒸发，以达到期望的D₂O浓度，而不使样品体积增加至高于0.8ml。

用硝基多巴胺-mPEG进行滴定

蒸发少量纯化的甲苯NC储备悬浮体，以产生约10mg官能化的材料。使NC悬浮在0.5ml无水EtOH中，并进行声处理30分钟，之后再次蒸发溶剂。然后使NC悬浮在0.5ml MeOH中，并进行声处理30分钟，之后再次蒸发溶剂。使NC悬浮在0.5ml D₂O中，并使用数字ERETIC方法进行定量¹H NMR测量以确定MEEAA浓度。通过添加2当量的NaOD(与所需的硝基多巴胺-mPEG的量相比)，在D₂O中预活化1.5当量的硝基多巴胺-mPEG(与NC上MEEAA的量相比)。以0.5当量逐步地添加预活化的硝基多巴胺-mPEG，同时确保pH在添加期间保持高于5，在各添加步骤之后翻转NMR管，然后使用涡旋旋转混合2分钟，然后进行声处理数秒。

用硝基多巴胺-mPEG进行NC官能化

在典型的官能化中，使用与用硝基多巴胺-mPEG进行滴定期间相同的方法。只是在此一次性添加1.5当量预活化的硝基多巴胺-mPEG，同时确保pH在整个添加期间保持高于5。将混合物搅拌并进行声处理10分钟，然后使用旋转过滤进行纯化，以产生纯的硝基多巴胺-mPEG官能化的NC。作者注意到，该方法可扩展到更高量的NC，只要不超过每个旋转过滤器允许的最大负载即可。

pH对配体结合的影响

对于所有测量，发现微型pH电极能够测量pH值所需的最小值为2ml溶剂。使用5MNaCl储备溶液以获得0.01M的样品盐浓度，使用D₂O中的DCl和NaOD的0.01M储备溶液来调节pH值。

膦酸：使用以上方法产生MeOH中的纯的PA-PEG官能化的NC和PA-hex-PEG官能化的NC，对NC悬浮体进行蒸发并重新悬浮在D₂O中。在数个pH值下进行³¹P NMR测量。³¹P谱中结合配体和未结合配体的量通过多峰拟合程序(峰去卷积)进行定量。

硝基多巴胺-mPEG：使用以上方法产生Milli-Q水中的纯的硝基多巴胺-mPEG官能化的NC，对NC悬浮体进行蒸发并重新悬浮在D₂O中。在数个pH值下进行定量¹H NMR测量。¹H谱中结合配体和未结合配体的量通过多峰拟合程序(峰去卷积)进行定量。

动态光散射稳定性评估

对于所有测量，使用以上方法产生MeOH(对于膦酸)或Milli-Q水(对于硝基多巴胺-mPEG)中的纯的官能化的NC，对NC悬浮体进行蒸发并重新悬浮在Milli-Q水中。对于Z-平均值和ζ电势测量，调节NC浓度以实现9至10的系统衰减器值。发现微型pH电极能够测量pH值并进行Z-平均值和ζ电势测量所需的最小值为2ml溶剂。在系统内平衡240秒之后，在25℃下一式三份地进行所有测量。

pH对Z-平均值和ζ电势的影响。使用过滤的5M NaCl储备溶液以获得0.01M的样品盐浓度，对悬浮体进行声处理15分钟，并在开始滴定之前通过0.2μM Supor注射器过滤器过滤以除尘。使用HCl和NaOH在Milli-Q水中的0.01M经过滤储备溶液调节pH值。

在2X PBS中的稳定性：通过0.2μM Supor注射器过滤器过滤悬浮体，然后使用HCl和NaOH在Milli-Q水中的0.01M经过滤储备溶液将pH调节至7.4。通过逐步添加经过滤的10XPBS储备溶液来增加PBS浓度，在每个添加步骤之后检查pH，并且如果需要的话重新调节至7.4。在密闭的石英比色皿中进行在2X PBS中稳定性随时间的测量，在稳定性测试的整个持续时间期间，比色皿保持在室温下和密闭条件下。

CT扫描

一般考虑

体外CT扫描和体内CT扫描在Molecubes X-cube台式CT扫描仪上使用内置的高分辨率扫描协议在50kV的管电位下采集。使用扫描仪内置的迭代重建算法以200μm、100μm或50μm的体素尺寸重建所采集的扫描，没有对数据应用另外的去噪步骤。使用Amide或Horos软件包对重建数据进行可视化，除非另有说明，否则各扫描的窗位通常设置为-1000HU至1000HU。

体内CT扫描

对于体内扫描，预先使用5％异氟烷麻醉小鼠用于诱导，并在扫描仪内使用2％异氟烷用于维持。诱导之后，将小鼠以俯卧姿势放置在加热的扫描床上。平均而言，对于全身扫描，小鼠每次扫描接受约340mGy的X射线剂量。对于体内实验，重建在每个扫描点总是以200微米的分辨率进行。

PBS中HfO₂ NC浓度系列的CT扫描

扫描和重建之后，X射线衰减(以亨氏单位值表示)在各样品管中使用测量1×1×1mm的球形目标区域进行定量。在定量期间取中值像素值以避免来自异常值的可能影响。当绘制X射线衰减与NC浓度的函数时，预先从NC重量中减去配体重量(18.9m％)，因为配体是纯有机的，并且将对X射线衰减不提供显著贡献。

近红外荧光成像

使用IVIS Lumina LT系列III体内成像系统使NC样品和体内淋巴结荧光可视化。使用710(±15nm)和745(±nm)下的带通激发滤波器和ICG窗口(810nm至875nm)中的带通发射滤波器进行成像。荧光图像通常被可见光照片覆盖。

邻苯二酚官能化的NC的制备

硝基多巴胺-mPEG官能化的NC

对甲苯中的少量纯化的MEEAA官能化的NC储备悬浮体进行蒸发，产生约20mg官能化的NC。使NC重新悬浮在氘代苯中，并且使用数字ERETIC方法通过定量¹H NMR来确定配体浓度，提供用mol MEEAA/mg官能化的NC表示的MEEAA浓度。接下来，对少量甲苯储备悬浮体进行蒸发，以产生约50mg官能化的NC。使NC重新悬浮在2ml无水乙醇中并进行声处理30分钟，之后再次蒸发溶剂。然后使NC悬浮在2ml MeOH中并进行声处理30分钟，之后再次蒸发溶剂。最后，使NC悬浮在2ml无内毒素的超纯水中并进行声处理30分钟。对于硝基多巴胺-mPEG官能化的NC，在单独的小瓶中称量1.2当量的硝基多巴胺-mPEG(基于通过定量NMR确定的MEEAA浓度)，并溶解在3ml无内毒素的超纯水中。与所需硝基多巴胺-mPEG的量相比，向硝基多巴胺-mPEG溶液中添加2当量的NaOH，产生深酒红色。然后在剧烈搅拌下向NC悬浮体中迅速添加配体溶液，在从酸性pH到碱性pH的转变期间可以观察到短暂的浑浊，并且这是正常的。在完全添加配体之后，获得透明的红橙色液体，随后将其进行声处理15分钟并剧烈搅拌。在声处理和搅拌之后，将悬浮体的pH调节至约9，然后开始纯化。在通过旋转过滤的纯化之后，获得纯的硝基多巴胺官能化的NC悬浮体。

硝基多巴胺-mPEG官能化的NC和硝基多巴胺-PEG(4)-N₃官能化的NC

对于用包含约98％硝基多巴胺-mPEG和2％硝基多巴胺-PEG(4)-N₃的混合邻苯二酚配体壳官能化的NC(每个NC约一个叠氮化物)，遵循与以上相同的过程，但用1.18当量硝基多巴胺-mPEG和0.02当量硝基多巴胺-PEG(4)-N3的混合物代替。

纳米晶体的数目和配体密度

为了计算给定量NC重量的NC数目的近似值，本发明人首先通过将材料密度(9.68g/cm³)除以分子量(210.49g/mol)来计算材料的摩尔体积(21.745cm³/mol)。

接下来，基于长球形状、2.52nm的平均长轴半径和1.205nm的平均短轴半径计算平均NC体积(15.33nm³)。

然后将转换成cm³的平均NC体积除以摩尔体积和阿伏伽德罗常数，以确定molHfO₂/NC(7.05*10^-22mol/NC)。

最后，通过用以克计的NC重量(减去配体重量)除以分子量(210.49g/mol)和molHfO₂/NC(7.05*10^-22mol/NC)来确定NC的数目(N_NC)。

为了计算NC表面上的配体密度，本发明人首先应用长球的面积公式计算NC的平均表面积(A_NC，32.42nm²)。

接下来，基于给定量的纯化的官能化的NC的TGA质量损失(m％)，获得以mol计的配体量(n_配体，mol)。

将配体量(n_配体)乘以阿伏加德罗常数，并且除以NC的数目(N_NC)得到配体/NC

最后，配体/NC除以NC表面(A_NC)得到以nm^-2计的配体密度。

旋转过滤纯化

用70％乙醇对20ml Sartorius Vivaspin(30000MWCO)旋转过滤管进行消毒，然后用中性pH下的20ml无内毒素的超纯水在进行预冲洗。将包含最多50mg的溶解材料的pH 8至9下的NC悬浮体通过0.2m注射器过滤器转移至旋转过滤管。用中性pH下的无内毒素的超纯水将悬浮体稀释至20ml的体积，然后使溶液在离心机中以2100rcf旋转20分钟。对于硝基多巴胺-mPEG和混合邻苯二酚配体壳官能化，使用无内毒素的超纯水进行最少5次旋转过滤循环，直到滤液无色。从旋转过滤器中收集浓缩物，并在35℃下在真空下蒸发。干燥的NC可以在室温下作为粉末储存，或者以约300mg HfO₂/ml的最大NC浓度重新悬浮在pH 7.4的水或PBS中。在后一种情况下，在浓度计算中从官能化的NC重量中减去有机配体重量(18.9m％)，通过无菌0.2m注射器过滤器过滤悬浮体并储存在无菌小瓶中。即使在高浓度下，在水或PBS中的NC悬浮体也保持稳定至少两个月。

官能化的NC的染料缀合

在用混合邻苯二酚配体进行的NC官能化中，假设最终纯化的产物中每个NC存在约1个叠氮化物。在典型的染料偶联反应中，首先在HPLC小瓶中称量10mg混合邻苯二酚官能化的NC，并溶解在100μL pH 7的无内毒素的超纯水中。基于18.9m％的配体质量贡献(通过TGA质量损失证实)，这对应于8.11mg裸露的纳米晶体，进而基于5.04nm的平均长直径、2.41nm的平均短直径和长球NC形状对应于5.4662*10¹⁶个NC。在分析天平上的HPLC小瓶中称量1.1当量的IRDye-800CW-DBCO(5.4662*10¹⁶个分子，0.091μmol，0.12mg)，并溶解在200μL pH 7的无内毒素的超纯水中。使用UV-VIS光谱，应用朗伯-比尔定律(Lambert-Beer Law)(参见等式10，其中路径长度为1cm，以及染料消光系数为240000L*(mol*cm)-¹，以及吸光度在774nm的波长下测量)确定染料分子浓度。

A＝c·∈·l

将染料溶液添加至NC中，并进一步稀释至300μL体积，产生透明的黄绿色悬浮体。将反应混合物避光并在30℃下搅拌2小时。然后通过3次连续的旋转过滤循环对NC进行纯化，之后在避光的同时将浓缩物分离并在30℃下在真空下蒸发。将所得深绿色NC粉末(包含约1个染料分子/NC)储存在氩气下-20℃的冰箱中。

制剂制备

为了获得NC和染料浓度分别为292mg NC/ml和28μmol/L的制剂，第一步是确定官能化的NC上的染料接枝密度，在这方面，使1mg干燥的染料官能化的NC悬浮在4ml 1X PBS中，并使用UV-VIS进行测量。使用朗伯-比尔定律(其中路径长度为1cm，染料消光系数为240000L*(mol*cm)^-1，以及吸光度在最大NIR吸收峰(±780nm)处测量)，以mol*L^-1确定染料浓度，然后将其转换为mol染料/mg官能化的NC。接下来，将硝基多巴胺-mPEG官能化的NC的储备溶液与染料官能化的NC粉末混合，并进行声处理15分钟，以获得292mg NC/ml的NC浓度和28μmol/L缀合染料的NC浓度。为了举例说明该过程：假设可获得包含5.796*10^-9mol染料/mg官能化的NC的一批染料缀合的NC。将0.199mg(18.9m％有机重量，0.161mg裸露的NC)该染料官能化的粉末与40μL浓度为288mg NC/ml的硝基多巴胺-mPEG NC储备液混合，产生期望的NC和染料浓度。

皮下足垫注射

在用PBS溶液或NC悬浮体进行皮下注射之前，使用5％异氟烷对小鼠进行麻醉用于诱导，在注射过程期间减少至2％异氟烷用于维持。麻醉之后，将小鼠以仰卧姿势放置在加热的床上，并且使用红外灯加热后足约30秒。拉紧足垫皮肤，将带有29G针头的0.5ml胰岛素注射器皮下插入足跟区域中，将其向足趾推进约3mm。在整个过程期间，针头透过足垫的薄皮肤层是可见的。接下来，缓慢注射最大体积50μL PBS溶液或NC悬浮体，同时缓慢地将针头向足跟缩回。注射完成之后，将针头在足垫中原位再保持30秒，然后从后足移出针头。针头缩回之后，立即向注射的后足施加一层厚厚的5％利多卡因作为止痛剂。

Claims (17)

1.一种纳米颗粒，包括：

a.纳米晶体，所述纳米晶体包含直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)或者基本上由直径等于或小于(≤)15nm的氧化铪(IV)(HfO₂)组成，以及

b.附接至所述纳米晶体的表面的复数个分散剂分子，其中所述分散剂分子中的每一者包含以下或者基本上由以下组成：

i.选自包括邻苯二酚或棓酚的组的表面吸附部分，特别地1,2-羟基-4-硝基苯部分；和

ii.低聚(乙二醇)部分。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米晶体的直径≤6nm，特别地其中所述直径≤4nm，更特别地其中所述直径≤3.5nm。

3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米晶体的特征在于纵横比为0.5至0.9。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒，其中所述分散剂分子的分子量≤500g/mol，特别地≤400g/mol。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述分散剂分子包含以下，特别地由以下组成：

i.选自硝基多巴胺、硝基多巴、多巴、多巴胺、含羞草碱的表面吸附部分，和

ii.(CH₂-CH₂-O)_nCH₃部分，其中n为选自2、3、4和5的整数。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述分散剂分子包含以下，特别地由以下组成：

7.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含另外的分散剂分子，其中所述另外的分散剂分子选自：

其中R^染料为荧光染料。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米晶体上的分散剂分子的密度为0.5个/nm²至5个/nm²。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含用于光学定位的染料分子。

10.一种组合物，包含复数个根据权利要求1至9中任一项所述的纳米颗粒。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物为稳定的水性悬浮体。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物的pH为pH 6至pH 10，特别地pH为pH 6.5至pH 8.0。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中80％的所述纳米颗粒的直径为2.0nm至5.0nm，特别地其中85％的所述纳米颗粒的直径为2.5nm至4.5nm。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其用于医学。

15.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其用作放射治疗增强剂(放射敏化剂)。

16.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其用作计算机化断层显像(CT)造影剂。

17.一种制造根据权利要求10至13中任一项所述的组合物的方法，包括：

a.提供由羧酸配体，特别地由MEEAA稳定的氧化铪(IV)(HfO₂)纳米晶体在水性介质中的悬浮体；

b.向所述悬浮体中添加分散剂分子的碱性溶液，其中所述分散剂分子由以下构成：

i.包含两个芳族羟基官能团的表面吸附部分，所述表面吸附部分选自包括邻苯二酚或棓酚的组，特别地1,2-羟基-4-硝基苯部分；和

ii.低聚(乙二醇)部分；

其中两个芳族羟基官能团在所述碱性溶液中被去质子化；

c.将所述悬浮体的pH调节至生理pH；

d.任选地，分离所述组合物，特别地通过尺寸排阻/旋转过滤分离所述组合物。