CN118243666A - 多表面生物样品成像系统和方法 - Google Patents
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Abstract
可以使用包括透镜、流通池和控制器的机器对支撑结构的多个表面上的生物样品进行成像。当该透镜分别位于距该流通池第一距离和第二距离处时，此类机器可以捕获从设置在该流通池的第一表面和第二表面上的核酸发射的光。在此类机器中，该透镜可以被浸没在第一流体中，并且该流通池的该第一表面和该第二表面可以由第二流体分开。另外，在此类机器中，当该透镜位于距该流通池该第一距离和该第二距离处时，该透镜的视场中的边缘光线和轴向光线之间的差可以基本上相等。
Description
背景技术
所公开的技术整体涉及对分析样品进行成像和评估的领域。更具体地讲，所公开的技术涉及用于匹配与对多表面支撑结构的不同表面进行成像相关联的像差的技术。
对支撑结构上的分析样品进行成像的应用越来越多。这些支撑结构可以包括其上存在生物样品的板。例如，这些板可以包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)探针，这些探针对存在于人和其他生物体中的基因中的核苷酸序列是特异性的。单个DNA或RNA探针可以附着在支撑结构上的小几何网格或阵列中的特定位置处。取决于所采用的技术，样品可以附着在支撑结构上的随机、半随机或预定位置处。可以将测试样品(诸如来自已知的人或生物体)暴露于阵列或网格，使得互补基因或片段与板表面上的各个位点处的探针杂交。在诸如测序的某些应用中，可以将遗传材料的模板或片段定位在位点处，并且可以使核苷酸或其他分子与模板杂交以确定模板的性质或序列。然后可以通过在位点上扫描特定频率的光来检查这些位点，以通过基因或片段杂交的位点的荧光来鉴定样品中存在哪些基因或片段。
这些板有时被称为微阵列、基因或基因组芯片、DNA芯片、基因阵列等，并且可以用于表达谱分析、监测表达水平、基因分型、测序等。例如，诊断用途可以包括评估特定患者的遗传组成，以确定是否存在疾病状态或是否存在针对特定病状的易感性。此类板的读取和评估是其效用的重要方面。尽管微阵列允许呈现单独的生物组分用于大量处理和单个检测，但是在单个实验中可以检测的组分的数量受到系统分辨率的限制。此外，在一些方法中使用的大量试剂可能是昂贵的，使得期望减少体积。虽然这些问题可以通过对单个流通池的多个表面进行成像以提高效率来解决，但是多表面成像可能与由与每个成像表面相关联的光学像差导致的进一步复杂化相关联。所公开的技术提供了可以允许基于高效多表面阵列的检测的方法和系统，该方法和系统具有比当前使用的方法和系统更低的成本和复杂性。还提供了其他优点，并且这些优点将从下面的描述中显而易见。
发明内容
所公开的技术提供了一种分析样品成像和评估的新颖方法，该方法降低了具有支撑样品的多个表面的成像和评估子系统的复杂性。支撑结构可以例如是流通池，试剂流体被允许流过该流通池并且与生物样品相互作用。来自至少一个辐射源的激发辐射可以用于激发多个表面上的生物样品。以这种方式，荧光辐射可以从该生物样品发射并且随后被检测光学器件和至少一个检测器捕获并检测。所返回的辐射然后可以用于生成图像数据。多个表面的这种成像可以顺序地或同时地完成。另外，本文中所述的技术可以与多种类型的成像系统中的任一类型一起使用。例如，落射荧光(epifluorescent)和全内反射(TIR)方法两者均可受益于所公开的技术。另外，成像的生物样品可以以随机位置或图案存在于支撑结构的表面上。
一种具体实施涉及包括透镜、流通池和控制器的机器。在此类具体实施中，该透镜可以具有视场并且被浸没在具有第一折射率的第一流体中。类似地，在此类具体实施中，该流通池可以包括由具有第二折射率的第二流体分开的第一表面和第二表面。另外，该控制器可以用于将该透镜从与该流通池具有第一距离的第一位置移动到与该流通池具有第二距离的第二位置。该控制器还可以用于，当该透镜与该流通池分开该第一距离时，使用该透镜捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸发射的光。该控制器还可以用于，当该透镜与该流通池分开该第二距离时，使用该透镜捕获从设置在该流通池的该第二表面上的核酸发射的光。该控制器还可以用于基于所发射的光来确定用于生物样品的核酸序列。在此类具体实施中，当该透镜与该流通池分开该第一距离时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差可以基本上等于当该透镜与该流通池分开该第二距离时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差。
在诸如前一段落中所述的机器的一些具体实施中，该第一折射率和该第二折射率可以基本上相等。
在诸如前一段落中所述的机器的一些具体实施中，该透镜可以包括光学器件，该光学器件适于捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许该生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像。在一些此类具体实施中，该第一折射率和该第二折射率基本上相等，意味着由该第一折射率和该第二折射率之间的任何差异引起的球面像差足够低而不阻止该生物样品的衍射受限成像，该衍射受限成像基于：从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光；以及从设置在该流通池的该第二表面上的核酸序列发射的光。
在诸如本发明内容的第三段落中所述的机器的一些具体实施中，该第一流体和该第二流体可以是相同的流体。
在诸如本发明内容的第三段落中所述的机器的一些具体实施中，该第一流体和该第二流体可以是不同的流体。
在诸如本发明内容的第二段落中所述的机器的一些具体实施中，该流通池的该第一表面是该流通池的顶部表面，并且该流通池的该第二表面是该流通池的底部表面。
在诸如本发明内容的第二段落中所述的机器的一些具体实施中，该透镜可以包括光学器件，该光学器件适于捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许该生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像。在一些此类具体实施中，当该透镜与该流通池分开该第一距离时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的该光程差基本上等于当该透镜与该流通池分开该第二距离时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的该光程差，意味着球面像差足够低而不阻止该生物样品的衍射受限成像，该衍射受限成像基于：从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光；以及从设置在该流通池的该第二表面上的核酸序列发射的光。
另一具体实施涉及一种方法，该方法包括使用透镜捕获从设置在流通池的第一表面上的核酸发射的光，该透镜与流通池相距第一距离并且被浸没在具有第一折射率的第一流体中。此类方法还可以包括将该透镜移动到距该流通池第二距离的位置。此类方法还可以包括当该透镜位于距该流通池该第二距离处时，使用浸没在具有该第一折射率的该第一流体中的该透镜捕获从设置在该流通池的第二表面上的核酸发射的光，其中该流通池的该第一表面由具有第二折射率的第二流体与该流通池的该第二表面分开。此类方法还可以包括基于从设置在该流通池的该第一表面上的核酸发射的该光和从设置在该流通池的该第二表面上的该核酸发射的该光确定生物样品的核酸序列。在此类方法中，当该透镜位于距该流通池该第一距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差基本上等于当该透镜位于距该流通池该第二距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差。
在诸如前一段落中所述的方法的一些具体实施中，该第一折射率和该第二折射率可以基本上相等。
在诸如前一段落中所述的方法的一些具体实施中，该透镜可以包括光学器件，该光学器件适于捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许该生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像。在一些此类具体实施中，该第一折射率和该第二折射率基本上相等，意味着由该第一折射率和该第二折射率之间的任何差异引起的球面像差足够低而不阻止该生物样品的衍射受限成像，该衍射受限成像基于：从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光；以及从设置在该流通池的该第二表面上的核酸序列发射的光。
在诸如本发明内容的第十段落中所述的方法的一些具体实施中，该第一流体和该第二流体可以是相同的流体。
在诸如本发明内容的第十段落中所述的方法的一些具体实施中，该第一流体和该第二流体可以是不同的流体。
在诸如本发明内容的第九段落中所述的方法的一些具体实施中，该流通池的该第一表面是该流通池的顶部表面，并且该流通池的该第二表面是该流通池的底部表面。
在诸如本发明内容的第九段落中所述的方法的一些具体实施中，该透镜包括光学器件，该光学器件适于捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许该生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像。在一些此类具体实施中，当该透镜位于距该流通池该第一距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的该光程差基本上等于当该透镜位于距该流通池该第二距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的该光程差，意味着球面像差足够低而不阻止该生物样品的衍射受限成像，该衍射受限成像基于：从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光；以及从设置在该流通池的该第二表面上的核酸序列发射的光。
另一具体实施涉及一种存储指令的非暂态计算机可读介质，该指令在由处理器执行时，使生物样品成像系统执行动作。在一些此类具体实施中，该动作可以包括使用位于距该流通池第一距离处的透镜捕获从设置在流通池的第一表面上的核酸发射的光，该透镜具有视场并且被浸没在具有第一折射率的第一流体中。在一些此类具体实施中，该动作可以包括将该透镜移动到距该流通池第二距离的位置。在一些此类具体实施中，该动作可以包括当该透镜位于距该流通池该第二距离处时，使用浸没在具有该第一折射率的该第一流体中的该透镜捕获从设置在该流通池的第二表面上的核酸发射的光，其中该流通池的该第一表面由具有第二折射率的第二流体与该流通池的该第二表面分开。在一些此类具体实施中，该动作可以包括基于从设置在该流通池的该第一表面上的核酸发射的该光和从设置在该流通池的该第二表面上的该核酸发射的该光确定生物样品的核酸序列。在一些此类具体实施中，当该透镜位于距该流通池该第一距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差可以基本上等于当该透镜位于距该流通池该第二距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差。
在诸如前一段落中所述的一些具体实施中，该第一折射率和该第二折射率可以基本上相等。
在诸如前一段落中所述的一些具体实施中，该透镜可以包括光学器件，该光学器件适于捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许该生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像。在一些此类具体实施中，该第一折射率和该第二折射率基本上相等，意味着由该第一折射率和该第二折射率之间的任何差异引起的球面像差足够低而不阻止该生物样品的衍射受限成像，该衍射受限成像基于：从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光；以及从设置在该流通池的该第二表面上的核酸序列发射的光。
在诸如本发明内容的第十六段落中所述的一些具体实施中，该流通池的该第一表面是该流通池的顶部表面，并且该流通池的该第二表面是该流通池的底部表面。在诸如本发明内容的第十六段落中所述的一些具体实施中，该透镜包括光学器件，该光学器件适于捕获从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许该生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像。在一些此类具体实施中，当该透镜位于距该流通池该第一距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的该光程差基本上等于当该透镜位于距该流通池该第二距离处时该透镜的该视场中的边缘光线与轴向光线之间的该光程差，意味着球面像差足够低而不阻止该样品的衍射受限成像，该衍射受限成像基于：从设置在该流通池的该第一表面上的核酸序列发射的光；以及从设置在该流通池的该第二表面上的核酸序列发射的光。
在诸如本发明内容的第十六段落中所述的一些具体实施中，该第一流体和该第二流体可以是相同的流体。
根据以下结合附图的详细描述，所公开技术的其他特征和方面将变得显而易见，附图以举例的方式示出了根据所公开的技术的示例的特征。本发明内容并非旨在限制本文档或任何相关文档提供的任何保护范围，该范围由相应文档的权利要求和等同物定义。
应当理解，前述概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。
附图说明
图1是生物样品成像系统的图解概述；
图2是被引导朝向支撑结构的表面以半共焦地辐照生物位点并且将辐射半共焦地返回到检测器的示例性辐射线的图解透视图；
图3是示例性支撑结构的剖视图，其中激发辐射指向该支撑结构的两个表面；
图4是具有呈空间有序图案的生物组分位点阵列的示例性支撑结构的图解透视图；
图5是具有呈随机空间分布的生物组分位点的示例性支撑结构的图解透视图；
图6是示例性支撑结构的剖面图，其中激发辐射指向支撑结构的多个表面；
图7示出了在一些具体实施中可能存在的物镜和支撑结构之间的示例性尺寸；
图8示出了用于多表面成像的从光源到物镜的第一透镜的示例性光线追踪；并且
图9图示了当成像系统针对顶部表面成像被优化时针对顶部表面和底部表面成像所预期的示例性图像。
具体实施方式
现在转到附图，并且首先参考图1，图解示出了生物样品成像系统10。生物样品成像系统10能够对支撑结构16内的多个生物组分12、14进行成像。例如，在所示实施方案中，第一生物组分12可以存在于支撑结构16的第一表面18上，而第二生物组分14可以存在于支撑结构的第二表面20上。支撑结构16可以例如是在内表面18、20上具有生物组分12、14的阵列的流通池，该内表面通常彼此相互面对，并且可以通过该流通池引入试剂、冲洗液和其他流体，诸如用于将核苷酸或其他分子结合到生物组分12、14的位点。结合到组分的分子上的荧光标签可以例如包括当被适当的激发辐射激发时发荧光的染料。包括使用荧光标签并且可以用于本文所述装置或方法的测定方法包括本文别处所述的那些，诸如基因分型测定、基因表达分析、甲基化分析或核酸测序分析。
本领域技术人员将认识到，流通池可以与本领域已知的多种阵列中的任一阵列一起使用，以实现类似结果。此类阵列可以通过使用各种技术将样品的生物组分随机地或以预限定图案设置在支撑件的表面上来形成。在特定实施方案中，核酸集落的成簇阵列可以如以下专利中所述制备：美国专利号7,115,400；美国专利申请公布号2005/0100900；PCT公布号WO 00/18957；或PCT公布号WO 98/44151，这些专利中的每一篇均在此以引用方式并入。此类方法被称为桥式扩增或固相扩增，并且对于测序应用特别有用。
可以使用的其他示例性随机阵列包括但不限于珠粒与固体支撑件缔合的随机阵列，其示例描述于美国专利号6,355,431；6,327,410；和US 6,770,441；美国专利申请公布号2004/0185483和US2002/0102578；以及PCT公布号WO 00/63437中，这些专利中的每一篇均在此以引用方式并入。珠粒可以定位在固相支撑件上的离散位置，诸如孔，其中每个位置容纳单个珠粒。
可以使用本领域已知的多种其他阵列或用于制造此类阵列的方法中的任一者。可以使用的市售微阵列包括例如微阵列或根据有时称为VLSIPSTM(极大规模固定化聚合物合成(Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis))技术的技术合成的其他微阵列，如例如美国专利号5,324,633；5,744,305；5,451,683；5,482,867；5,491,074；5,624,711；5,795,716；5,831,070；5,856,101；5,858,659；5,874,219；5,968,740；5,974,164；5,981,185；5,981,956；6,025,601；6,033,860；6,090,555；6,136,269；6,022,963；6,083,697；6,291,183；6,309,831；6,416,949；6,428,752；和6,482,591中所述，这些专利中的每一篇均在此以引用方式并入。还可以使用点状微阵列。示例性点状微阵列是得自Amersham Biosciences的CodeLinkTM阵列。可用的另一个微阵列是使用喷墨印刷方法(诸如得自Agilent Technologies的SurePrintTM技术)制造的微阵列。
阵列的位点或特征通常是离散的，彼此之间以空间分开。位点的大小和/或位点之间的间隔可以变化。例如，可与所公开的技术结合使用的阵列可以具有间隔小于100μm、50μm、10μm、5μm、1μm或0.5μm(例如，350nm或10nm)的位点。基于本公开实施的装置或方法可用于以足以区分上述密度或密度范围的位点的分辨率对阵列进行成像。
如本文所例示，在基于本公开实现的装置或方法中使用的表面通常是制造的表面。还可以使用天然表面或天然支撑结构的表面；然而，所公开的技术可以应用于表面既不是天然材料也不是天然支撑结构的表面的实施方案中。因此，生物样品的组分可以从它们的原生环境中除去并附着到制造的表面上。
多种生物组分中的任一种组分都可以存在于表面上。示例性组分包括但不限于核酸(诸如DNA或RNA)、蛋白质(诸如酶或受体)、多肽、核苷酸、氨基酸、糖、辅因子、这些天然组分的代谢物或衍生物。尽管本文所述的装置和方法是关于生物样品的组分来例示的，但应当理解，也可以使用其他样品或组分。例如，可以使用合成样品，诸如组合文库，或具有已知或怀疑具有期望结构或功能的种类的化合物文库。因此，该装置或方法可以用于合成一批化合物和/或针对期望结构或功能筛选一批化合物。
返回到图1的示例性系统，生物样品成像系统10可以包括至少第一辐射源22，但还可以包括第二辐射源24(或附加源)。辐射源22、24可以是在不同波长下操作的激光器。激光器的波长的选择通常取决于用于对组分位点进行成像的染料的荧光性质。所使用的激光器的多个不同波长可以允许区分支撑结构16内的各个位点处的染料，并且可以通过连续获取一系列图像来进行成像，以使得能够根据本领域中通常已知的图像处理和读取逻辑来识别组分位点处的分子。在其他具体实施中，发光二极管(LED)可以用作辐射源22、24。可以使用本领域已知的其他辐射源，包括例如弧光灯或石英卤素灯。特别有用的辐射源是产生在紫外(UV)范围(约200nm至390nm)、可见(VIS)范围(约390nm至770nm)、红外(IR)范围(约0.77微米至25微米)或电磁光谱的其他范围内的电磁辐射的那些辐射源。
为了便于描述，使用利用基于荧光的检测的实施方案作为示例。然而，应当理解，其他检测方法可以与本文所述的装置和方法结合使用。例如，可以检测多种不同的发射类型，诸如荧光、发光或化学发光。因此，可以用荧光、发光或化学发光的化合物或部分标记待检测的组分。还可以使用除了被修改以适应待检测的信号的特定物理性质之外，与本文所例示的那些装置和方法类似的装置和方法从多个表面检测除光学信号之外的信号。
来自辐射源22、24的输出可以被引导通过调节光学器件26、28，用于对光束进行滤波和成形。例如，在目前设想的实施方案中，调节光学器件26、28可以生成大体线性的辐射光束，并且组合来自多个激光器的光束，例如，如美国专利号7,329,860中所述。激光器模块还可包括用于记录每个激光器的功率的测量部件。功率测量可用作反馈机制，以控制记录图像的时长，以便获得均匀的曝光，并因此获得更容易比较的信号。在其他具体实施中，调节光学器件26、28可以形成直线辐射光束，诸如正方形或矩形形状。
在通过调节光学器件26、28之后，光束可以被引导朝向引导光学器件30，该引导光学器件将来自辐射源22、24的光束重新引导朝向聚焦光学器件32。引导光学器件30可以包括二向色镜，该二向色镜被配置为将光束重新引导朝向聚焦光学器件32，同时还允许反向光束(retrobeam)的某些波长通过。聚焦光学器件32可以将辐射共焦地引导到支撑结构16的一个或多个表面18、20，单个生物组分12、14定位在这些表面上。例如，聚焦光学器件32可以包括显微镜物镜，该显微镜物镜沿着线将辐射源22、24共焦地引导并聚集到支撑结构16的表面18、20。在一些具体实施中，聚焦光学器件32可以将辐射源22、24聚焦在表面18、20上方或下方，使得浓度低于待激发的组分的光饱和阈值和/或降低对样品的损害的阈值。在此类具体实施中，当激发辐射相对于表面18、20的平面散焦时，聚焦光学器件32还可以将检测器36的焦平面维持在表面18、20的平面处。在一些具体实施中，聚焦光学器件32可以相对于表面18、20可移动。例如，聚焦光学器件可以被安装到z平台，诸如音圈或压电部件，以使聚焦光学器件32移动通过垂直于表面18、20的平面的轴。在一些具体实施中，聚焦光学器件32可以相对于表面18、20沿着x轴和/或y轴可移动。
支撑结构16上的生物组分位点可以使用一种或多种试剂，该试剂响应于激发光束而以特定波长发荧光，并由此返回辐射用于成像。例如，荧光组分可以由荧光标记的核苷酸生成，该荧光标记的核苷酸使用聚合酶与样品的互补核苷酸杂交。在其他具体实施中，荧光标记的核苷酸可以暂时与样品的互补核苷酸缔合，然后被去除。在更进一步的具体实施中，可以使用荧光标记的寡核苷酸。如上所述，这些组分的荧光性质可以通过将试剂引入到支撑结构16中来改变(例如，通过从分子切割染料、阻断附加分子的附着、添加淬灭试剂、添加能量转移的受体等)。如本领域技术人员将理解的，激发样品的染料的波长和其发荧光的波长将取决于特定染料的吸收和发射光谱。此类返回的辐射可以通过引导光学器件30传播回来。该反向光束通常可以被引导朝向检测光学器件34，该检测光学器件可以对光束进行滤波以便分开反向光束内的不同波长，并且将反向光束引导朝向至少一个检测器36。
检测器36可以基于任何合适的技术，并且可以是例如带电耦合设备(CCD)传感器，该CCD传感器基于撞击设备中的位置的光子生成像素化图像数据。然而，应理解，也可以使用各种其他检测器中的任一种，包括但不限于被配置用于时间延迟积分(TDI)操作的检测器阵列、互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器、雪崩光电二极管(APD)检测器、Geiger模式光子计数器或任何其他合适的检测器。TDI模式检测可以与线扫描耦合，如美国专利号7,329,860中所述。
检测器36可以例如以0.1微米和50微米之间的分辨率生成图像数据，该图像数据然后被转发到控制/处理系统38。一般来讲，控制/处理系统38可执行各种操作，诸如模数转换、缩放、滤波和多帧数据关联，以适当地且准确地对样品上特定位置的多个位点进行成像。控制/处理系统38可以存储图像数据，并且可以最终将图像数据转发到分析数据的后处理系统(未显示)。取决于样品的类型、所使用的试剂和所执行的处理，可以对图像数据进行许多不同的使用。例如，核苷酸序列数据可以来源于图像数据，或者该数据可以用于确定特定基因的存在，表征组分位点处的一个或多个分子等。图1中所示的各种部件的操作也可以与控制/处理系统38协调。在实际应用中，控制/处理系统38可以包括硬件、固件和软件，该硬件、固件和软件被设计成控制辐射源22、24的操作，聚焦光学器件32、平移系统40和检测光学器件34的移动和聚焦，以及来自检测器36的信号的获取和处理。因此控制/处理系统38可以存储经处理的数据并且进一步处理该数据以用于生成在支撑结构16内发荧光的被辐照位点的重建图像。图像数据可以由系统本身进行分析，或者可以被存储以供其他系统并且在成像之后的不同时间进行分析。
支撑结构16可以被支撑在平移系统40上，该平移系统允许在成像之前和成像期间对支撑结构16进行聚焦和移动。平台可以被配置为移动支撑结构16，由此改变辐射源22、24和检测器36相对于表面结合的生物组分的相对位置，以用于逐行扫描(progressivescanning)。平移系统40的移动可以在一个或多个维度上，包括例如与激发辐射线的传播方向正交的维度中的一个或两个维度，通常表示为X和Y维度。在特定实施方案中，平移系统40可以被配置为在垂直于检测器器阵列的扫描轴的方向上移动。平移系统40可以进一步被配置为在激发辐射线传播所沿的维度(通常表示为Z维度)上移动。在Z维度上的移动也可以用于聚焦。
图2是对支撑结构16进行成像的示例性半共焦线扫描方法的图解表示。在所示实施方案中，支撑结构16包括上板42和下板44，在上板42与下板44之间具有内部体积46。上板42和下板44可以由多种材料中的任一种材料制成，但是可以优选地由在激发辐射和发荧光的反向光束的波长下基本上透明的衬底材料制成，从而允许激发辐射和返回的荧光发射通过而不会显著损失信号质量。此外，当在如所示的落射荧光成像布置中使用时，辐射所穿过的表面中的一个表面在相关波长下可以是基本上透明的，而另一个表面(该不被辐射穿过)可以是较不透明的、半透明的、或甚至不透明的或反射性的。上板42和下板44可以包括聚合物材料或其他中间组分，并且可以进一步在其相应的面向内的表面18、20上都包含生物组分12、14。如上文所讨论的，内部体积46可以例如包括流通池的一个或多个内部通道，试剂流体可流过该通道。
与支撑结构16相缔合的反应性元素(诸如氟化核苷酸)可以由激发辐射48沿着辐射线50进行辐照。辐射线50可以由来自辐射源22、24的激发辐射48形成，该激发辐射由引导光学器件30引导通过聚焦光学器件32。辐射源22、24可以生成光束，该光束被处理并成形以提供线性剖面或辐射线，该线性剖面或辐射线包括多个波长的辐射，该多个波长的辐射用于根据所使用的特定染料引起来自生物组分12、14的相应不同波长的荧光。然后，聚焦光学器件32可以将激发辐射48半共焦地引导朝向支撑结构16的第一表面18，以沿着辐射线50辐照与生物组分12相缔合的氟化核苷酸的位点。另外，支撑结构16、引导光学器件30、聚焦光学器件32或它们的某种组合可以被缓慢地平移，使得所得到的辐射线50如箭头52所指示的那样渐进地辐照该组分。该平移导致区域54的连续扫描，这允许逐渐辐照与支撑结构16的整个第一表面18的生物组分12相缔合的氟化核苷酸。如将在下文更详细讨论的，相同的过程也可以用于逐渐辐照支撑结构16的第二表面20。实际上，该方法可以用于支撑结构16内的多个表面。
在美国专利号7,329,860中描述了用于线扫描的示例性方法和装置，该专利以引用方式并入本文，并且该专利描述了具有检测器器阵列的线扫描装置，该检测器器阵列被配置为通过限制检测器器阵列的扫描轴尺寸来实现扫描轴上的共焦。更具体地讲，扫描设备可以被配置为使得检测器阵列具有矩形尺寸，使得检测器的较短尺寸处于扫描轴尺寸中，并且成像光学器件被放置成将样品区域的矩形图像引导到检测器阵列，使得图像的较短尺寸也处于扫描轴尺寸中。以这种方式，可以实现半共焦性，因为共焦性发生在单个轴(即，扫描轴)上。因此，检测对于衬底部表面上的特征是特定的，由此拒绝可能由特征周围的溶液产生的信号。美国专利号7,329,860中所述的装置和方法可以被修改，使得根据本文的描述来扫描支撑件的两个或更多个表面。
还可以使用除了线扫描之外的检测装置和方法。例如，可以如下文或美国专利号5,646,411(该专利以引用方式并入本文中)所述使用点扫描。广角区域检测可以在有或没有扫描运动的情况下使用。如本文别处进一步详细阐述的，还可以使用TIR方法。
大体如图2中所示，用于对生物组分12、14的位点进行成像的辐射线50可以是连续的或不连续的线。因此，一些实施方案可以包括由多个共焦或半共焦引导的辐射光束组成的不连续线，这些辐射光束仍然沿着辐射线50辐照多个点。这些不连续光束可以由被定位或扫描以提供激发辐射48的一个或多个源产生。如前所述，这些光束可以共焦或半共焦地被引导朝向支撑结构16的第一表面18或第二表面20，以辐照生物组分12、14的位点。与上述连续半共焦线扫描一样，支撑结构16、引导光学器件30、聚焦光学器件32或它们的一些组合可以如箭头52所示缓慢推进，以沿着支撑结构16的第一表面18或第二表面20辐照连续扫描区域54，并由此辐照生物组分12、14的位点的连续区域。
应当注意，该系统通常将同时形成和引导激发和返回的辐射以用于成像。在一些实施方案中，可以使用共焦点扫描，使得光学系统通过使激发光束扫描通过物镜透镜来引导激发点或光点穿过生物组分。检测系统对来自检测器上的激发点的发射进行成像，而不将反向光束“去扫描(descanning)”。发生这种情况的原因是反向光束被物镜透镜收集并且在通过扫描装置返回之前与激发光束光路分离。因此，取决于物镜透镜中原始激发光点的视场角，反向光束将在不同点处出现在检测器36上。当横跨样品扫描激发点时，检测器36处的激发点的图像将线的形状出现。例如，如果扫描装置由于某种原因不能接受来自样品的反向光束，则这种结构是有用的。示例是全息和声光扫描装置，该装置能够以非常高的速度扫描光束，但是利用衍射来产生扫描。因此，扫描性质是波长的函数。所发射的辐射的反向光束与激发光束的波长不同。可替代地或另外地，可以在不同波长的顺序激发之后被顺序地收集发射信号。
在特定实施方案中，装置或方法可以以至少约0.01mm2/sec的速率检测表面上的特征。取决于特定的应用，也可以使用更快的速率，包括例如在扫描或以其他方式检测的面积方面，至少约0.02mm2/sec、0.05mm2/sec、0.1mm2/sec、1mm2/sec、1.5mm2/sec、5mm2/sec、10mm2/sec、50mm2/sec、100mm2/sec或更快的速率。如果期望，例如为了减少噪声，检测速率可以具有约0.05mm2/sec、0.1mm2/sec、1mm2/sec、1.5mm2/sec、5mm2/sec、10mm2/sec、50mm2/sec或100mm2/sec的上限。
在一些情况下，支撑结构16可以以预期生物组分仅存在于一个表面上的方式使用。然而，在一些情况下，生物材料存在于支撑结构16内的多个表面上。例如，图3示出了典型的支撑结构16，其中生物材料已经附着到第一表面18以及第二表面20。在所示实施方案中，附着层56已经形成在支撑结构16的第一表面18和第二表面20两者上。第一激发辐射源58可以用于辐照支撑结构16的第一表面18上的生物组分12的许多位点中的一个位点，并且从与被辐照的生物组分12缔合的氟化核苷酸返回第一荧光发射60。同时或顺序地，第二激发辐射源62可以用于辐照支撑结构16的第二表面20上的生物组分14的多个位点中的一个位点，并从被辐照的生物组分14返回第二荧光发射64。
尽管图3中例示的实施方案显示了来自来源于支撑结构16的同一侧的源58和源62的激发，但是应当理解，光学系统可以被配置为撞击于来自支撑结构16的相对侧的表面上。以图3为例，可以从如所示的激发源58辐照上表面18，并且可以从下方辐照下表面20。类似地，可以从支撑结构的一侧或多侧检测发射。在特定实施方案中，支撑结构16的不同侧可以通过首先辐照一侧然后翻转支撑结构以使另一侧进入由辐射源激发的位置而从相同辐射源被激发。
生物组分12、14的分布可以遵循许多不同的图案。例如，图4示出了支撑结构16，其中第一表面18和第二表面20上的位点或特征处的生物组分12、14以生物组分位点68的空间有序图案66均匀分布。例如，可以使用某些类型的微阵列，其中单个生物组分位点68的位置可以呈规则的空间图案，诸如六边形图案。图案可以包括预定位置处的位点。相比之下，在其他类型的生物成像阵列中，生物组分在随机或统计变化位置出现的位点处附着于表面，使得对微阵列进行成像用于确定每个单个生物组分特征的位置。因此，尽管是合成或制造过程的产物，但特征的图案不需要预先确定。
例如，图5示出了支撑结构16，其中第一表面18和第二表面20上的位点定位在生物组分位点72的随机空间分布70中。然而，对于生物样品位点的固定阵列66和随机分布70两者，都可能可以进行支撑结构16的多个表面18、20的成像。另外，应当注意，在两种情况下，单个位点处的生物组分可以构成相同分子的群体或不同分子的随机混合物。此外，生物样品的密度可以变化，并且可以是每平方毫米至少1,000个位点。
本技术适应支撑结构16内的多个表面的此类变化的物理布置，以及表面上的组分内的位点的变化设置。如以上参考图2和图3所讨论的，在具有具第一表面18和第二表面20的支撑结构16的实施方案中，第一激发辐射源58可以辐照第一表面18上的生物组分12的位点，并返回第一荧光发射60，而第二激发辐射源62可以辐照第二表面20上的生物组分14的位点，并返回第二荧光发射64源，如图3中所示。因此，两个表面之间的样品体积的组分不需要被检测并且可以被拒绝。与邻近表面的支撑结构的体积相比以及与支撑结构的一个或多个其他表面相比，支撑结构的表面的选择性检测提供了对该表面的优先检测。
在更复杂的配置中，辐照多于两个表面可能有用。例如，图6示出了具有N数目个板的支撑结构16，包括第一板42、第二板44、……、N-2板74、N-1板76和N板78。这些板限定M数目个表面，包括第一表面18、第二表面20、……、M-3表面80、M-2表面82、M-1表面84和M表面86。在所示实施方案中，不仅可以辐照支撑结构16的第一表面18和第二表面20，而且可以辐照所有M数目个表面。例如，激发辐射源88可以用于辐照支撑结构16的第M表面86上的生物组分位点，并从被辐照的生物组分返回荧光发射90。对于具有多个表面的支撑结构，可能期望从顶部激发上层以及从底部激发下层以减少光漂白。因此，可以从第一侧辐照更靠近支撑结构的第一外侧的层上的组分，而可以使用来自相对外侧的辐照来激发更靠近相对外侧的层上存在的组分。
图7示出了物镜92，通过该物镜可以检测分别来自支撑结构16的第一表面18和第二表面20上的发射生物组分12、14的辐射。物镜92可以是上述聚焦光学器件32的部件中的一个部件。虽然未按比例绘制，但是图7示出了物镜92和支撑结构16之间的示例性尺寸。例如，物镜92可以与支撑结构16的上板42间隔大约500微米。生物样品成像系统10可以被配置为检测来自第一表面18上的生物组分12的穿过上板42的发射辐射，该上板可以例如由具有300μm至700μm的厚度的玻璃制成。另外，生物样品成像系统10还可以被配置为检测来自第二表面20上的生物组分14的穿过上板42(其可以是例如300μm-700μm)以及支撑结构46的内部体积46内的流体(例如，试剂溶液，诸如缓冲溶液、成像溶液或其他试剂)的发射辐射，该流体的厚度可以在75μm-100μm之间变化，如所示。
在某些实施方案中，物镜92可以是平凸(PCX)透镜，其平坦表面面向样品以避免当物镜用于液体浸没成像时液体流动的湍流。在此类实施方案中，物镜92可以浸没在流体中，这可以允许其具有比干物镜可能的数值孔径显著更高的数值孔径，因为数值孔径将与物镜周围的介质的折射率成线性比例。这继而可以增加基于本公开实现的系统的通量，因为通量将与数值孔径的平方成比例。
虽然液体浸没可以允许数值孔径的增加，但是当执行多表面成像时，它也可以增加像差，诸如波前误差(例如，球面像差)。这可以在图8中看到，图8显示了用于在双表面成像配置中进行顶部表面801和底部表面802成像的从光源到物镜的第一透镜的光线追踪。如该图中所示，边缘光线上的区段McMi的长度将随着顶部表面成像和底部表面成像两者中的角度θi而增加。因此，由于可以通过轴向光线和边缘光线之间的光程差来评估最大波前误差，因此将物镜与顶部表面分开的介质的折射率(ni)越大，角度θi越大，且因此使用所描绘的光学布局的测序中的误差越大。
虽然液体浸没增加了波前误差，但是该误差是可预测的，因此可以通过物镜92的设计来补偿。例如，通过设计物镜以补偿对于顶部表面成像所预期的波前误差，可以获得顶部表面的衍射受限质量图像。然而，如图8中所示，因为当在支撑结构16的不同表面上成像时光所采取的光程是不同的，所以针对第一表面18上成像的优化将导致来自第二表面20的图像的劣化。这在图9中以图解方式显示，该图示出了在图7所示的配置中对应于上板42的厚度(例如，300微米)的支撑结构16的第一表面18和第二表面20所预期的示例性图像，其中成像系统针对第一表面18进行了优化。如所示的，成像系统能够提供第一表面18上的高图像质量，因为在图9的示例中，它就是为此而设计的。然而，在针对从第一表面成像而优化的系统中，针对第二表面20拍摄的图像可能包含像差。类似地，如果针对从第二表面20成像而优化系统，则从第一表面18拍摄的图像可能包含像差。
在下面的公式1-3中以数学方式表达了针对不同表面成像而优化的系统在从一个表面成像时可能遇到的误差。在这些公式中，W顶部是上表面的波前误差，W底部是底部表面的波前误差，nc是盖玻片的折射率，ni是浸没流体的折射率，ng是物镜的第一透镜的折射率，nb是试剂溶液的折射率，θc是穿过盖玻片的边缘光线和轴向光线之间的角度，θi是穿过浸没流体的边缘光线和轴向光线之间的角度，θg是穿过物镜第一透镜的边缘光线和轴向光线之间的角度，θb是穿过试剂溶液的边缘光线与轴向光线之间的角度，tc是盖玻片的厚度，ti是用于顶部表面成像的浸没流体的厚度，ti|'是用于底部表面成像的浸没流体的厚度，tg是物镜的第一透镜的厚度，tb是试剂溶液的厚度，并且Δ是顶部表面与底部表面之间的波前误差差(例如，与针对顶部表面成像而优化的系统中的底部表面成像相关联的像差)。
可以使用多种方法来将该球面像差的影响降到最低。例如，可以使用诸如在美国专利号RE48,561中描述的补偿器，该专利在此全文以引用方式并入。然而，对于一些系统，像差可能足够显著，使得基于补偿器的系统的费用和/或复杂性可能成为障碍。因此，在一些实施方案中，除了将补偿器并入到成像系统中之外或作为其替代，可以通过以下方式来解决像差：协调浸没流体的选择与物镜92在不同表面(例如，顶部表面和底部表面)的成像之间的移动，使得在给定与系统相关联的nb、tb和θb的值的情况下，公式3中Δ的值将下降到0。为了说明，考虑浸没流体被选择为具有与支撑结构16的内部体积46中的试剂溶液相同的折射率(例如，nb＝1.36)的情况。这可以例如在使用与缓冲流体和浸没流体相同的流体并且保持这些流体的温度恒定的一些系统中完成，这些系统使用其中溶解有盐水或其他有机化合物的水以获得适当的折射率，或者在其他类型的系统(例如，使用匹配液体的系统)中完成。在这种情况下，nb将等于ni，并且θb将等于θi，由此允许将公式5简化为以下的公式4。
使用该公式，可以通过将ti设定为等于ti-tb来实现Δ为0的值(即，对于底部表面获得与顶部表面相同的图像质量)。因此，通过使用折射率等于其试剂溶液的浸没流体，在物镜与盖玻片分开距离ti的情况下执行顶部表面的第一成像运行，然后在物镜与盖玻片分开等于ti减去tb的距离的情况下执行底部表面的第二成像运行，成像系统可以获得流通池的顶部表面和底部表面两者的衍射受限图像质量。
除了在RE48,561中所述的基于补偿器的方法或者匹配nb和ni并且设定ti'使得Δ减小到0之外，其他方法也是可能的。例如，在一些情况下，不是使nb和ni之间的差等于0，而是基于本公开所实施的系统使用具有在nb的某个容差内的ni的值的浸没液体，使得在假定采用该系统的应用的情况下仍然可以获得足够的图像质量。为了说明在实践中如何实施这种类型的方法，考虑具有1.2的数值孔径的系统，只要初阶和高阶球面像差的组合小于或等于0.07波，该系统就能够实现衍射受限性能。在这种情况下，由缓冲流体和浸没流体的折射率之间的错配产生的高阶和低阶球面像差可以通过使用下面的公式5和6应用泽尼克(Zernike)分析来计算。
在公式5和6中，ρ是单位圆中的sin(ψ)的值，ψ是等于θb-θi的角度，cqm是对应于泽尼克径向变量的泽尼克膨胀系数并且δm0是归一化变量，如果m是0则该变量等于1，否则等于0。将该分析应用于示例性1.2NA系统提供了下表1中列出的关于各种示例性理论浸没流体的初阶和高阶球面像差信息，这些流体与该系统中使用的缓冲液具有指定的折射率差(即Δn)。
表1
从表1中可以看出，在该实施例中，只要缓冲液和浸没流体之间的折射率差不大于0.0003，就可以实现衍射受限性能，这意味着可以使用浸没流体G、H、I或J，尽管事实是仅浸没流体J具有与系统中所用的缓冲流体相同的折射率。
作为另一类型的变型，虽然上述示例讨论了物镜被配置为补偿顶部表面成像期间的预期像差并且然后可操纵参数被选择为允许底部表面匹配的系统，但是物镜可以被配置为补偿底部表面成像期间的预期像差，其中可操纵参数被选择为使顶部表面成像与该像差匹配。还可以将上述方法应用于多于两个的表面，诸如通过选择浸没流体并且在成像运行之间操纵物镜的位置，使得轴向光线和边缘光线之间的差对于每个表面是相同的。其他变型(例如，设定系统的可操纵参数以充分减小像差，以允许使用较不复杂的补偿器，而不是设定它们以完全消除对补偿器的需要)也是可能的，并且根据本公开对于本领域技术人员来说将是立即显而易见的。因此，解决表面之间的像差差异的方法以及关于其的示例性变型的上述描述应被理解为仅是说明性的，而不应被视为限制性的。
在特定实施方案中，基于本公开实现的系统可利用边合成边测序(SBS)。在SBS中，使用一种或多种经荧光标记的修饰核苷酸来确定存在于支撑结构(诸如流通池)的表面上的核酸的核苷酸序列。可以与本文所述的装置和方法一起利用的示例性SBS系统和方法描述于美国专利号7057026；美国专利申请公布号2005/0100900、2006/0188901、2006/0240439、2006/0281109和2007/0166705；以及PCT公布号WO 05/065814、WO 06/064199和WO07/010251中；这些专利中的每一篇均以引入方式并入本文。
在本文的装置和方法的特定用途中，通过整个测序过程的若干重复循环来处理含有排列的核酸的流通池。核酸被制备成使得它们包含与未知靶序列相邻的寡核苷酸引物。为了启动第一SBS测序循环，使一种或多种不同标记的核苷酸和DNA聚合酶流入流通池中。可一次添加单个核苷酸，或者可将测序过程中所用的核苷酸特别地设计成具有可逆终止属性，从而使测序反应的每个循环在存在所有四个带标记的核苷酸(A、C、T、G)的情况下同时发生。在添加核苷酸后，可以对表面上的特征进行成像，以确定掺入的核苷酸的特性(identity)(基于核苷酸上的标记)。然后，可以将试剂添加到流通池中以去除封闭的3'末端(如果适当的话)并从每个掺入的碱基去除标记。然后重复此类循环，并经多个化学循环读取每个簇的序列。在进一步的具体实施中，氟化核苷酸或其他可检测组分可以仅暂时与未知靶序列缔合，以用于在与前进到下一核苷酸分开的步骤中成像。
还可以使用利用循环反应的其他测序方法，诸如焦磷酸测序和通过连接进行测序，其中每个循环包括将一种或多种试剂递送到表面上的核酸并对表面结合的核酸进行成像的步骤。有用的焦磷酸测序反应描述于例如美国专利号7,244,559和美国专利申请公布号2005/0191698中，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文。通过连接反应进行测序描述于例如Shendure等人Science 309:1728-1732(2005)；以及美国专利号5,599,675和5,750,341中，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文。
本文所述的方法和装置还可用于检测在基因分型测定、表达分析和本领域已知的其他测定中使用的表面上出现的特征，诸如在美国专利申请公布2003/0108900、US2003/0215821和US2005/0181394中所述的那些，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文。
虽然以上已描述了本公开的各种具体实施，但应当理解，它们仅以举例而非限制的方式来呈现。同样，各个图可描绘本公开的示例性架构或其他配置，这样做是为了帮助理解可包括在本公开中的特征和功能。本公开不限于所示的示例性架构或配置，但可使用各种替代架构和配置来实现期望的特征。实际上，对于本领域的技术人员来说显而易见的是，可如何实现替代的功能、逻辑或物理分区和配置以实现本公开的期望特征。此外，除了本文描述的那些之外的许多不同的组成模块名称可应用于各种分区。另外，关于流程图、操作描述和方法权利要求，除非上下文另有规定，否则本文中呈现的动作的次序不应强制实施各种具体实施以相同次序执行所述功能。
Claims (20)
1.一种机器，所述机器包括：
透镜，所述透镜具有视场并且被浸没在具有第一折射率的第一流体中；
流通池，所述流通池包括由具有第二折射率的第二流体分开的第一表面和第二表面；和
控制器，所述控制器用于：
将所述透镜从与所述流通池具有第一距离的第一位置移动到与所述流通池具有第二距离的第二位置；
当所述透镜与所述流通池分开所述第一距离时，使用所述透镜捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸发射的光；
当所述透镜与所述流通池分开所述第二距离时，使用所述透镜捕获从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸发射的光；以及
基于所发射的光来确定用于生物样品的核酸序列；
其中当所述透镜与所述流通池分开所述第一距离时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差基本上等于当所述透镜与所述流通池分开所述第二距离时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差。
2.根据权利要求1所述的机器，其中所述第一折射率和所述第二折射率基本上相等。
3.根据权利要求2所述的机器，其中：
所述透镜包括光学器件，所述光学器件适于捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许所述生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像；并且
所述第一折射率和所述第二折射率基本上相等，意味着由所述第一折射率和所述第二折射率之间的任何差异引起的球面像差足够低而不阻止所述生物样品的衍射受限成像，所述衍射受限成像基于：
从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光；以及
从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸序列发射的光。
4.根据权利要求2所述的机器，其中所述第一流体和所述第二流体是相同的流体。
5.根据权利要求2所述的机器，其中所述第一流体和所述第二流体是不同的流体。
6.根据权利要求1所述的机器，其中所述流通池的所述第一表面是所述流通池的顶部表面，并且所述流通池的所述第二表面是所述流通池的底部表面。
7.根据权利要求1所述的机器，其中：
所述透镜包括光学器件，所述光学器件适于捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许所述生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像；并且
当所述透镜与所述流通池分开所述第一距离时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的所述光程差基本上等于当所述透镜与所述流通池分开所述第二距离时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的所述光程差，意味着球面像差足够低而不阻止所述生物样品的衍射受限成像，所述衍射受限成像基于：
从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光；以及
从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸序列发射的光。
8.一种方法，所述方法包括：
使用透镜捕获从设置在流通池的第一表面上的核酸发射的光，所述透镜具有视场并且所述透镜：
位于距所述流通池第一距离处；并且
被浸没在具有第一折射率的第一流体中；
将所述透镜移动到距所述流通池第二距离的位置；
当所述透镜位于距所述流通池所述第二距离处时，使用浸没在具有所述第一折射率的所述第一流体中的所述透镜捕获从设置在所述流通池的第二表面上的核酸发射的光，其中所述流通池的所述第一表面由具有第二折射率的第二流体与所述流通池的所述第二表面分开；以及
基于从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸发射的所述光和从设置在所述流通池的所述第二表面上的所述核酸发射的所述光确定生物样品的核酸序列；
其中当所述透镜位于距所述流通池所述第一距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差基本上等于当所述透镜位于距所述流通池所述第二距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一折射率和所述第二折射率基本上相等。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
所述透镜包括光学器件，所述光学器件适于捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许所述生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像；并且
所述第一折射率和所述第二折射率基本上相等，意味着由所述第一折射率和所述第二折射率之间的任何差异引起的球面像差足够低而不阻止所述生物样品的衍射受限成像，所述衍射受限成像基于：
从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光；以及
从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸序列发射的光。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一流体和所述第二流体是相同的流体。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一流体和所述第二流体是不同的流体。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述流通池的所述第一表面是所述流通池的顶部表面，并且所述流通池的所述第二表面是所述流通池的底部表面。
14.根据权利要求8所述的方法，其中：
所述透镜包括光学器件，所述光学器件适于捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许所述生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像；并且
当所述透镜位于距所述流通池所述第一距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的所述光程差基本上等于当所述透镜位于距所述流通池所述第二距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的所述光程差，意味着球面像差足够低而不阻止所述生物样品的衍射受限成像，所述衍射受限成像基于：
从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光；以及
从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸序列发射的光。
15.一种存储指令的非暂态计算机可读介质，所述指令在由处理器执行时，使生物样品成像系统执行动作，该动作包括：
使用位于距所述流通池第一距离处的透镜捕获从设置在流通池的第一表面上的核酸发射的光，所述透镜具有视场并且被浸没在具有第一折射率的第一流体中；
将所述透镜移动到距所述流通池第二距离的位置；
当所述透镜位于距所述流通池所述第二距离处时，使用浸没在具有所述第一折射率的所述第一流体中的所述透镜捕获从设置在所述流通池的第二表面上的核酸发射的光，其中所述流通池的所述第一表面由具有第二折射率的第二流体与所述流通池的所述第二表面分开；以及
基于从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸发射的所述光和从设置在所述流通池的所述第二表面上的所述核酸发射的所述光确定生物样品的核酸序列；
其中当所述透镜位于距所述流通池所述第一距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差基本上等于当所述透镜位于距所述流通池所述第二距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的光程差。
16.根据权利要求15所述的非暂态计算机可读介质，其中所述第一折射率和所述第二折射率基本上相等。
17.根据权利要求16所述的非暂态计算机可读介质，其中：
所述透镜包括光学器件，所述光学器件适于捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许所述生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像；并且
所述第一折射率和所述第二折射率基本上相等，意味着由所述第一折射率和所述第二折射率之间的任何差异引起的球面像差足够低而不阻止所述生物样品的衍射受限成像，所述衍射受限成像基于：
从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光；以及
从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸序列发射的光。
18.根据权利要求15所述的非暂态计算机可读介质，其中所述流通池的所述第一表面是所述流通池的顶部表面，并且所述流通池的所述第二表面是所述流通池的底部表面。
19.根据权利要求15所述的非暂态计算机可读介质，其中：
所述透镜包括光学器件，所述光学器件适于捕获从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光，并且允许所述生物样品以衍射受限的成像质量在检测器上成像；并且
当所述透镜位于距所述流通池所述第一距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的所述光程差基本上等于当所述透镜位于距所述流通池所述第二距离处时所述透镜的所述视场中的边缘光线与轴向光线之间的所述光程差，意味着球面像差足够低而不阻止所述生物样品的衍射受限成像，所述衍射受限成像基于：
从设置在所述流通池的所述第一表面上的核酸序列发射的光；以及
从设置在所述流通池的所述第二表面上的核酸序列发射的光。
20.根据权利要求15所述的非暂态计算机可读介质，其中所述第一流体和所述第二流体是相同的流体。
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