CN118236539A - 一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶，包括微球结构、包覆在微球结构外表面的膜层以及接种在膜层表面的间充质干细胞；其中，所述微球结构包括聚乙烯醇、海藻酸钠以及H2O2；所述膜层包括海藻酸钠和H2O2酶；本发明与现有技术相比，释放出的氧气可持续提供给水凝胶表面的细胞及创伤部位，提高细胞存活率并促进伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及可释氧载细胞水凝胶技术领域，具体涉及一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶及其制备方法。
背景技术
近年来随着干细胞研究的进展，基于干细胞的疗法已成为治疗创伤和改善患者预后的方法。例如：论文为Yi-Zhou Huang,Min Gou,Lin-Cui Da,et al.Mesenchymal semcells for chronic wound healing:Current status of preclinical and clinicalstudies.Tissue Eng Part B Rev.2020Dec；26(6):555-570中介绍到局部移植间充质干细胞可通过旁分泌EGF、VEGF和SDF-1，从而促进新血管形成、增强伤口细胞募集并收缩伤口；论文为Na Song,Martijn Scholtemeijer,Khalid Shah.Mesenchymal stem cellimmunomodulation:Mechanisms and therapeutic potential.Trends PharmacolSci.2020Sep；41(9):653-664中介绍到同时间充质干细胞可以被炎症细胞因子激活，通过释放一系列可能促进祖细胞分化和增殖的因子来控制组织再生过程，参与免疫调节和抑制炎症反应。尽管间充质干细胞治疗在国内外进行的大量基础研究(包括体外和体内动物实验)中取得了成功，但移植的干细胞在外周组织中的保留率仍然极低，严重限制了干细胞治疗的疗效和临床应用潜力；在论文为Loubna Mazini,Luc Rochette,Brahim Admou,etal.Hopes and limits of adipose-derived stem cells(ADSCs)and mesenchymal stemcells(MSCs)in wound healing.Int J Mol Sci.2020Feb 14；21(4):1306中提及到这一观点。
值得注意的是，伤口部位属于缺氧环境，高水平的氧自由基容易引起氧化应激，导致干细胞存活率非常低；在论文为Seahyoung Lee,Eunhyun Choi,Min-Ji Cha,et al.Celladhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells:Aprerequisite for cell therapy.Oxid Med Cell Longev.2015:2015:632902中提及到这一观点。此外，血管供应中断和慢性炎症引起的慢性缺氧会阻碍伤口愈合这一过程，因此改善伤口组织氧合能有效提高干细胞的存活，改善伤口愈合并促进上皮化过程。虽然常见的低氧预处理和高压氧预处理可以在一定程度上提高干细胞的存活率，但效果相对不具有特异性。此外，一些研究还开发了用于局部植入的释氧系统，通过改善细胞植入部位的缺氧微环境来提高细胞存活率，从而更好地利用干细胞的治疗效果。然而，这些氧合系统通常在不到两周的时间内释放氧气，而血管生长、肉芽形成和上皮再形成需要至少三周；这一观点在论文为Tarun Agarwal,Sara Kazemi,Marco Costantini,et al.Oxygen releasingmaterials:Towards addressing the hypoxia-related issues in tissueengineering.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.2021Mar:122:111896当中提及。
因此，需迫切开发氧气释放系统来长时间为受损组织提供氧气，从而提高细胞存活率，更好地利用干细胞的治疗效果。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶及其制备方法，以解决现有技术中，现没有氧气释放系统来长时间为受损组织提供氧气这一技术问题。
为实现上述目的，本发明第一方面采用了如下的技术方案：一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶，包括微球结构、包覆在微球结构外表面的膜层以及接种在膜层表面的间充质干细胞；其中，所述微球结构包括聚乙烯醇、海藻酸钠以及H2O2；所述膜层包括海藻酸钠和H2O2酶。
本发明第二方面采用了如下的技术方案：一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，包括微球结构制备、膜层形成以及间充质干细胞接种；其中，所述微球结构制备步骤包括：制备聚乙烯醇溶胶；在聚乙烯醇溶胶表面滴加交联剂；配制海藻酸钠/H2O2混合溶液，并将海藻酸钠/H2O2混合溶液覆盖在滴加交联剂后的聚乙烯醇溶胶表面来形成初始微球结构；将初始微球结构置于一定温度下反应后再在初始微球结构表面滴加交联剂来形成微球结构。
进一步，所述膜层形成步骤包括：配制海藻酸钠/H2O2酶混合溶液，并将海藻酸钠/H2O2酶混合溶液覆盖在微球结构表面；再将上述制备后的结构置于一定温度下反应后静置消泡；将上述静置后的结构置于放入去离子水中浸泡，得到可释氧水凝胶。
进一步，所述间充质干细胞接种步骤包括：将可释氧水凝胶灭菌，后在可释氧水凝胶表面接种间充质干细胞，再培养一段时间得到可释氧载细胞水凝胶。
进一步，所述交联剂为戊二醛/氯化钙溶液；优先地，所述戊二醛/氯化钙溶液中戊二醛的质量浓度为2.5％-10％，氯化钙的质量浓度为0.5％-5％；进一步优选地，戊二醛的质量浓度为5％，氯化钙的质量浓度为1％。
进一步，所述一定温度为40℃-60℃，且反应时间为30-180分钟；优先地，所述一定温度为45℃，且反应时间为40分钟。
进一步，所述聚乙烯醇溶胶中聚乙烯醇的质量浓度为10％-30％；优先地，聚乙烯醇的质量浓度为15％。
进一步，所述海藻酸钠/H2O2混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为1％-16％，H2O2的质量浓度为1％-10％；
优选地，海藻酸钠的质量浓度为8％，H2O2的质量浓度为5％。
进一步，所述海藻酸钠/H2O2酶混合溶液中的海藻酸钠的质量浓度为2％-16％，H2O2酶的质量浓度为0.25-1mg/mL；优选地，海藻酸钠的质量浓度为8％，H2O2酶的质量浓度为0.5mg/mL。
进一步，所述间充质干细胞的接种密度为2×103-8×103个/cm2；优选地，间充质干细胞的接种密度为5×103个/cm2。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本可释氧载细胞水凝胶内部为多孔互连结构，允许代谢物和营养交换、可模拟细胞外基质环境，利于细胞在体外增殖。发明人通过反复研究和筛选发现，聚乙烯醇具有生物相容性好、机械性能优异等特点，将干细胞接种在聚乙烯醇水凝胶表面，可维持细胞在体外长期存活。进一步的，海藻酸钠作为药物缓释系统，将H2O2封装在海藻酸钠微球中使其缓慢释放。由于H2O2在常温下不易分解为氧气，将H2O2酶与海藻酸钠形成膜层包裹在微球表面，可达到缓慢释放氧气的效果。更进一步的，释放出的氧气可持续提供给可释氧载细胞水凝胶表面的细胞及创伤部位，提高细胞存活率并促进伤口愈合。
附图说明
图1为本发明实施例1中可释氧水凝胶外观图；
图2为本发明实施例3中可释氧载细胞水凝胶力学性能、透气率及溶胀曲线图；
图3为本发明实施例4中可释氧载细胞水凝胶氧气释放曲线图；
图4为本发明实施例5中可释氧载细胞水凝胶细胞活性曲线图；
图5为本发明实施例6中可释氧载细胞水凝胶大鼠创伤修复图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
本发明第一方面采用了如下的技术方案：一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶，包括微球结构、包覆在微球结构外表面的膜层以及接种在膜层表面的间充质干细胞；其中，所述微球结构包括聚乙烯醇、海藻酸钠以及H2O2；所述膜层包括海藻酸钠和H2O2酶。本可释氧载细胞水凝胶内部为多孔互连结构，允许代谢物和营养交换、可模拟细胞外基质环境，利于细胞在体外增殖。发明人通过反复研究和筛选发现，聚乙烯醇具有生物相容性好、机械性能优异等特点，将干细胞接种在聚乙烯醇水凝胶表面，可维持细胞在体外长期存活。进一步的，海藻酸钠作为药物缓释系统，将H2O2封装在海藻酸钠微球中使其缓慢释放。由于H2O2在常温下不易分解为氧气，将H2O2酶与海藻酸钠形成膜层包裹在微球表面，可达到缓慢释放氧气的效果。更进一步的，释放出的氧气可持续提供给可释氧载细胞水凝胶表面的细胞及创伤部位，提高细胞存活率并促进伤口愈合。
本发明第二方面采用了如下的技术方案：一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，包括微球结构制备、膜层形成以及间充质干细胞接种；其中，所述微球结构制备步骤包括：制备聚乙烯醇溶胶；在聚乙烯醇溶胶表面滴加交联剂；配制海藻酸钠/H2O2混合溶液，并将海藻酸钠/H2O2混合溶液覆盖在滴加交联剂后的聚乙烯醇溶胶表面来形成初始微球结构；将初始微球结构置于一定温度下反应后再在初始微球结构表面滴加交联剂来形成微球结构。其中，制备聚乙烯醇溶胶这一步骤具体包括：在65℃温度下将聚乙烯醇溶于DMSO中来配制聚乙烯醇溶液，后将聚乙烯醇溶液倒入聚四氟乙烯模具中；将含聚乙烯醇溶液的模具放入水中浸泡一段时间后取出，形成聚乙烯醇溶胶。且所述含聚乙烯醇的模具放入水中静置3～6小时；其中，所述静置时间可以为3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时或6小时；优选地，所述静置时间为3小时。
进一步，所述膜层形成步骤包括：配制海藻酸钠/H2O2酶混合溶液，并将海藻酸钠/H2O2酶混合溶液覆盖在微球结构表面；再将上述制备后的结构置于一定温度下反应后静置消泡；将上述静置后的结构置于放入去离子水中浸泡，得到可释氧水凝胶。
进一步，所述间充质干细胞接种步骤包括：将可释氧水凝胶灭菌，后在可释氧水凝胶表面接种间充质干细胞，再培养一段时间得到可释氧载细胞水凝胶。
进一步，所述交联剂为戊二醛/氯化钙溶液；优先地，所述戊二醛/氯化钙溶液中戊二醛的质量浓度为2.5％-10％，氯化钙的质量浓度为0.5％-5％；其中，戊二醛的质量浓度可以为2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，氯化钙的质量浓度可以为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％；进一步优选地，戊二醛的质量浓度为5％，氯化钙的质量浓度为1％。
进一步，所述一定温度为40℃-60℃，且反应时间为30-180分钟；其中，所述一定温度可以为40℃、45℃、50℃、55℃或60℃，且反应时间可以为30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、120分钟、140分钟、150分钟、160分钟或180分钟；优先地，所述一定温度为45℃，且反应时间为40分钟。
进一步，所述聚乙烯醇溶胶中聚乙烯醇的质量浓度为10％-30％；其中，所述聚乙烯醇溶胶中聚乙烯醇的质量浓度可以为10％、15％、20％、25％或30％；优先地，聚乙烯醇的质量浓度为15％。
进一步，所述海藻酸钠/H2O2混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为1％-16％，H2O2的质量浓度为1％-10％；其中，所述海藻酸钠的质量浓度可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；优选地，海藻酸钠的质量浓度为8％，H2O2的质量浓度为5％。
进一步，所述海藻酸钠/H2O2酶混合溶液中的海藻酸钠的质量浓度为2％-16％，H2O2酶的质量浓度为0.25-1mg/mL；其中，所述海藻酸钠的质量浓度可以为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，H2O2酶的质量浓度可以为0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL或1mg/mL；优选地，海藻酸钠的质量浓度为8％，H2O2酶的质量浓度为0.5mg/mL。
进一步，所述间充质干细胞的接种密度为2×103-8×103个/cm2；其中，所述间充质干细胞的接种密度可以为2×103个/cm2、3×103个/cm2、4×103个/cm2、5×103个/cm2、6×103个/cm2、7×103个/cm2或8×103个/cm2。优选地，间充质干细胞的接种密度为5×103个/cm2。
进一步，所述灭菌方法为伽马辐照灭菌。
实施例1可释氧水凝胶的制备
将15g聚乙烯醇溶于100mL DMSO中，在65℃温度下搅拌2小时使其完全溶解配制成质量浓度为15％的聚乙烯醇溶液。
将聚乙烯醇溶液倒入聚四氟乙烯模具中，随后放入水中浸泡3小时后取出，形成聚乙烯醇溶胶。
将8g海藻酸钠溶于80mL去离子水中，在65℃温度下搅拌3小时使其完全溶解，配制成质量浓度为10％的海藻酸钠溶液；放置于4℃温度环境下过夜消去气泡。
将1mL且质量浓度为30％的H2O2与5mL海藻酸钠溶液混合，后稀释成海藻酸钠/H2O2混合溶液；其中，海藻酸钠/H2O2混合溶液中H2O2的质量浓度为5％，海藻酸钠的质量浓度为8％。
将5mg H2O2酶溶于2mL PBS溶液中并与8mL海藻酸钠溶液混合，配制成海藻酸钠/H2O2酶混合溶液；其中，海藻酸钠/H2O2酶混合溶液中H2O2酶的质量浓度为0.5mg/mL，海藻酸钠的质量浓度为8％。
将1g无水氯化钙溶于100mL去离子水中，搅拌均匀配制成1％氯化钙溶液。
取5mL质量浓度为50％的戊二醛溶于45mL氯化钙溶液中，稀盐酸调节pH值至3.0，来制备戊二醛/氯化钙溶液。
在聚乙烯醇溶胶表面滴加戊二醛/氯化钙溶液。
使用滴注法将海藻酸钠/H2O2混合溶液滴加到聚乙烯醇溶胶表面，形成海藻酸钠/H2O2微球，放入45℃温度的烘箱反应30分钟后取出。
再在微球表面滴加戊二醛/氯化钙溶液，后使用滴注法将海藻酸钠/H2O2酶混合溶液滴加微球表面，则在微球表面形成形成海藻酸钠/H2O2酶膜；继续放入45℃温度的烘箱反应30分钟后取出，再放入4℃温度环境下静置过夜。
将模具放入去离子水中浸泡48小时，每6小时更换去离子水，脱模后得到可释氧水凝胶；如图1所示。
实施例2可释氧载细胞水凝胶的制备
脐带间充质干细胞的提取：无菌取脐带，剥除外膜和动静脉后剪碎成1mm3的组织块，将组织块放置在完全培养基(购自普诺赛)中，置于37℃，浓度为5％的CO2细胞培养箱中培养，3天后可见贴壁细胞从组织边缘爬出，约7天后能铺满瓶底，胰蛋白酶液消化后以3×104个/cm2的密度继代接种，取第三代细胞用于后续实验。
将实施例1制备的可释氧水凝胶进行伽马辐照灭菌，后将脐带间充质干细胞以5×103个/cm2的密度接种在可释氧水凝胶表面，后放入37℃，浓度为5％的CO2培养箱中放置2小时后，继续补充完全培养基至覆盖水凝胶来获得可释氧载细胞水凝胶。
实施例3可释氧水凝胶的力学性能、水蒸气透过率及溶胀率检测
力学性能检测：参考YY/T 1435-2016组织工程医疗器械产品水凝胶表征指南，分别将质量浓度为10％的PVA含量的水凝胶、质量浓度为15％的PVA含量的水凝胶以及质量浓度为20％的PVA含量的水凝胶均剪成40mm×10mm的长条状，使用万能拉力机试验机，在室温下以50mm/min的拉伸速度进行试验，计算拉伸强度(σ)和断裂伸长率(ε)，计算公式分别如下：
(1)σ＝F/(b×h)
式中σ为拉伸强度，单位为MPa；F为最大拉力，单位为N；b为样条的宽度，单位为mm；h为样条的厚度，单位为mm。
(2)ε＝(L-L0)/L0×100％
式中ε为断裂伸长率；L为样条拉伸后的长度，单位为mm；L0为样品本身长度，单位为mm。
水蒸气透过率检测：按照YYT0471.2-2004接触性创面敷料试验方法第2部分-透气膜敷料水蒸气透过率的方法，将不同PVA浓度的可释氧水凝胶固定在透湿杯上，如图2所示。对初始水凝胶、透湿杯及杯中液体称重，放入37℃的烘箱中4小时后再次称重。根据下列公式计算水凝胶水蒸气透过率：
水蒸气透过率(MVTR)＝(W1-W2)×1000×24/T
其中水蒸气透过率(MVTR)，单位为克每平方米每24小时(g·m-2·24h-1)；W1为容器、样品和液体的质量，单位为克(g)；W2为试验期后容器、样品和液体的质量，单位为克(g)；T为试验期时间，单位为小时(h)。
水凝胶溶胀度检测：将水凝胶在烘箱中完全干燥、称重，然后浸入37℃的PBS溶液中以评价样品的溶胀情况。每2小时去除多余液体后再次称重每个样品。记录每个样品的重量，直到重量变化变得可以忽略不计。溶胀率由下列方程式计算可得。
溶胀率(％)＝(Wt-W0)/W0×100％
其中Wt是浸入PBS后的样品重量，W0是初始干样品重量。
水凝胶的拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过率及溶胀率结果如图2及表1、表2所示。
表1不同PVA浓度水凝胶拉伸强度及断裂伸长率统计表
表2不同PVA浓度水凝胶水蒸气透过率统计表
由结果可知，质量浓度为10％的PVA含量的水凝胶平均拉伸强度为0.028Mpa，平均断裂伸长率为168.238％，质量浓度为15％的PVA含量的水凝胶平均拉伸强度为0.037Mpa，平均断裂伸长率为183.986％，质量浓度为20％的PVA含量的水凝胶平均拉伸强度为0.046Mpa，平均断裂伸长率为200.680％。随着PVA浓度的增加水凝胶力学性能有所提高。质量浓度为10％的PVA含量的水凝胶平均水蒸气透过率为4596g·m-2·24h-1，质量浓度为15％的PVA含量的平均水凝胶水蒸气率为2616g·m-2·24h-1，质量浓度为20％的PVA含量的平均水凝胶水蒸气率为1992g·m-2·24h-1。随着PVA浓度的增加，水凝胶水蒸气透过率减少，但仍高于正常皮肤500g·m-2·24h-1的透过率，可有效减少渗液的堆积。水凝胶作为一种理想的创面敷料材料，其吸收和保存液体的能力是评价其效果的一个重要方面。水凝胶的溶胀率是评价凝胶吸收液体能力的重要指标。16小时后，水凝胶的溶胀速率逐渐缓慢，20小时后基本达到溶胀平衡。水凝胶的溶胀率随着PVA浓度的增加而降低。质量浓度为10％-20％的PVA含量的水凝胶的溶胀率在200％～350％，具有良好的吸水性。
在本实施例中：质量浓度为15％的PVA含量的水凝胶即为实施例1制备的可释氧水凝胶；质量浓度为10％的PVA含量的水凝胶与实施例1制备的可释氧水凝胶的区别仅在于：将10g聚乙烯醇溶于100mL DMSO中，在65℃温度下搅拌2小时使其完全溶解配制成质量浓度为10％的聚乙烯醇溶液；质量浓度为20％的PVA含量的水凝胶与实施例1制备的可释氧水凝胶的区别仅在于：将20g聚乙烯醇溶于100mL DMSO中，在65℃温度下搅拌2小时使其完全溶解配制成质量浓度为10％的聚乙烯醇溶液。
实施例4可释氧水凝胶氧气释放检测
分别制备H2O2含量为1.25％、2.5％和5％的水凝胶，在本实施例中，制备H2O2含量为5％的水凝胶即为实施例1制备的可释氧水凝胶；制备H2O2含量为1.25％的水凝胶与实施例1的区别仅在于：将0.25mL且质量浓度为30％的H2O2与5mL海藻酸钠溶液混合，后稀释成海藻酸钠/H2O2混合溶液；其中，海藻酸钠/H2O2混合溶液中H2O2的质量浓度为1.25％，海藻酸钠的质量浓度为8％；制备H2O2含量为2.5％的水凝胶与实施例1的区别仅在于：将0.5mL且质量浓度为30％的H2O2与5mL海藻酸钠溶液混合，后稀释成海藻酸钠/H2O2混合溶液；其中，海藻酸钠/H2O2混合溶液中H2O2的质量浓度为1.25％，海藻酸钠的质量浓度为8％。
将制备的H2O2含量为1.25％、2.5％和5％的水凝胶分别命名为1.25％H2O2组、2.5％H2O2组以及5％H2O2组。
分别将1.25％H2O2组、2.5％H2O2组以及5％H2O2组按照如下方式操作：
将水凝胶放入装有PBS溶液的容器中，将容器放在缺氧室中，测试开始时将氮气注入PBS溶液中3分钟来脱氧，37℃下孵育24小时使用溶氧计测量当天对应的释放氧气。在不同时间点测量PBS中的溶解氧浓度，每次测量后，PBS溶液需要再次脱氧；其中，还设置有不含H2O2的可释氧水凝胶作为空白对照(空白对照与1.25％H2O2组、2.5％H2O2组或5％H2O2组的区别仅在于H2O2的含量)。水凝胶氧气释放曲线如图3所示。
由结果可知1.25％H2O2组、2.5％H2O2组和5％H2O2组在第一天均检测出比对照组高的溶解氧浓度，且5％H2O2组释放的氧气溶度显著性增加。1.25％H2O2组、2.5％H2O2组和5％H2O2这三组水凝胶在第7天氧气的释放均达到峰值，随后溶解氧浓度逐渐降低，在第20天仍略高于对照组。结果表明该水凝胶具有长期释放氧气的功能。
实施例5可释氧载细胞水凝胶细胞毒性检测
按照实施例2的方式还制备H2O2的质量浓度为1.25％和2.5％的可释氧载细胞水凝胶，其与实施例2的区别在于可释氧载细胞水凝胶中在海藻酸钠/H2O2混合溶液时，加入H2O2的量不同。
分别在第1、3、7天使用刃天青试剂盒对H2O2的质量浓度为1.25％、2.5％和5％的可释氧载细胞水凝胶进行细胞毒性检测。使用酶标仪在570nm处测量吸光度值(OD值)，同时还设计仅区别在于不含H2O2的可释氧载细胞水凝胶作为对照。相对增殖率(RGR，％)的计算公式如下所示：
RGR(％)＝(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100％
不同时间段的细胞相对增殖率如图4所示。由结果可知含H2O2的质量浓度为1.25％和5％的可释氧载细胞水凝胶对细胞无明显毒性，且含H2O2的质量浓度2.5％的可释氧载细胞水凝胶在培养3天后细胞相对增殖率显著提高。结果表明适量浓度的溶解氧对细胞增殖有利。
实施例6可释氧载细胞水凝胶细胞毒性检测
构建大鼠全层皮肤损伤模型：SD大鼠质量浓度为7％水合氯醛(剂量为5mL/kg)麻醉，医用胶带俯卧固定于操作板，背部备皮，脱毛，消毒，在正中偏上的背部做一个边长2厘米的正方形切口标识。切开标记处的全层皮肤至筋膜层。造模后，将大鼠随机分为4组，每组10只，进行分笼饲养，四组大鼠分别为空白组、细胞注射组、2.5％H2O2未载细胞敷料组、2.5％H2O2载细胞敷料组。其中空白组用医用纱布进行包扎处理，细胞注射组在伤口处多点注射共计5×106个脐带间充质干细胞后用医用纱布进行包扎处理，2.5％H2O2未载细胞敷料组在伤口处贴附含2.5％H2O2水凝胶，2.5％H2O2载细胞敷料组在伤口处贴附含2.5％H2O2水凝胶(在水凝胶表面接种5×106个脐带间充质干细胞)。
上述中“2.5％H2O2未载细胞敷料组在伤口处贴附含2.5％H2O2水凝胶”即在2.5％H2O2未载细胞敷料组是在伤口处贴附可释氧水凝胶，此可释氧水凝胶与实施例1中制备的可释氧水凝胶区别仅在于：可释氧水凝胶在配制海藻酸钠/H2O2混合溶液中加入H2O2的量不同，实施例1中海藻酸钠/H2O2混合溶液中H2O2的质量浓度为5％，在此处H2O2的质量浓度为2.5％。上述中“2.5％H2O2载细胞敷料组在伤口处贴附含2.5％H2O2水凝胶(在水凝胶表面接种5×106个脐带间充质干细胞)”即在2.5％H2O2载细胞敷料组是在伤口处贴附可释氧载细胞水凝胶，此可释氧载细胞水凝胶与实施例2中制备的可释氧载细胞水凝胶区别仅在于：可释氧水凝胶在配制海藻酸钠/H2O2混合溶液中加入H2O2的量不同，实施例1中海藻酸钠/H2O2混合溶液中H2O2的质量浓度为5％，在此处H2O2的质量浓度为2.5％。在创伤后1天、3天、7天、11天、15天和20天时，观察创面结痂程度，拍照记录并利用Image J图像分析软件测量创面面积，根据下式计算不同时间点各组的创面愈合率(Wound Healing Rate，WHR)：
WHR(％)＝(S－S′)/S×100％
其中S为致伤时所切除皮肤的面积，S′为不同时间点的伤口面积。
TNF是由单核-巨噬细胞产生，作为一种重要的炎性介质尤其受到重视，分泌适量时可发挥免疫调节、抗感染作用，但分泌过多时可致机体感染性休克和多脏器功能衰竭。TNF-α能刺激其他细胞因子如IL-6、IL-8等的释放，扩大其生物学效应。IL-6由T细胞、单核细胞等产生，能诱导B细胞产生免疫球蛋白和急性期蛋白，可作为反映机体炎症与疾病严重程度的重要指标，而IL-10为种酸性蛋白主要由TH2细胞产生，IL-10能抑制巨噬细胞抗原提呈，抑制巨噬细胞抗原活化及继发的细胞免疫反应，对单核-巨噬细胞、细胞因子的合成和功能有广泛的抑制作用。以TNF-α和IL-6、IL-10这3种炎症因子作为炎症反应的评价指标。在伤后3天、7天、11天、15天和20天时，将各组大鼠处死，取伤口处的皮肤组织，提取组织匀浆液中的蛋白，采用ELISA试剂盒检测组织中TNF-α和IL-6、IL-10的表达水平。
表3不同时间点不同敷料组的创面愈合率统计表
与空白组比较：*p<0.05，**p<0.01。
由表3及图5所知，该可释氧载细胞水凝胶在第7天表现出良好的促伤口愈合功能，而细胞注射组见效时间较长。此外，可释氧载细胞水凝胶表现出较好的炎症抑制功能，可显著减少炎性因子TNF-α和IL-6表达，同时提高抑炎因子IL-10的表达。结果表明可释氧载细胞水凝胶可增强间充质干细胞在体内的修复能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶，其特征在于，包括微球结构、包覆在微球结构外表面的膜层以及接种在膜层表面的间充质干细胞；
其中，所述微球结构包括聚乙烯醇、海藻酸钠以及H2O2；
所述膜层包括海藻酸钠和H2O2酶。
2.一种根据权利要求1所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于，包括微球结构制备、膜层形成以及间充质干细胞接种；
其中，所述微球结构制备步骤包括：
制备聚乙烯醇溶胶；
在聚乙烯醇溶胶表面滴加交联剂；
配制海藻酸钠/H2O2混合溶液，并将海藻酸钠/H2O2混合溶液覆盖在滴加交联剂后的聚乙烯醇溶胶表面来形成初始微球结构；
将初始微球结构置于一定温度下反应后再在初始微球结构表面滴加交联剂来形成微球结构。
3.根据权利要求2所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于，所述膜层形成步骤包括：
配制海藻酸钠/H2O2酶混合溶液，并将海藻酸钠/H2O2酶混合溶液覆盖在微球结构表面；
再将上述制备后的结构置于一定温度下反应后静置消泡；
将上述静置后的结构置于放入去离子水中浸泡，得到可释氧水凝胶。
4.根据权利要求3所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞接种步骤包括：
将可释氧水凝胶灭菌，后在可释氧水凝胶表面接种间充质干细胞，再培养一段时间得到可释氧载细胞水凝胶。
5.根据权利要求2所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于：所述交联剂为戊二醛/氯化钙溶液；
优先地，所述戊二醛/氯化钙溶液中戊二醛的质量浓度为2.5％-10％，氯化钙的质量浓度为0.5％-5％；
进一步优选地，戊二醛的质量浓度为5％，氯化钙的质量浓度为1％。
6.根据权利要求2或3所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于：所述一定温度为40℃-60℃，且反应时间为30-180分钟；
优先地，所述一定温度为45℃，且反应时间为40分钟。
7.根据权利要求2所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚乙烯醇溶胶中聚乙烯醇的质量浓度为10％-30％；
优先地，聚乙烯醇的质量浓度为15％。
8.根据权利要求2所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠/H2O2混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为1％-16％，H2O2的质量浓度为1％-10％；
优选地，海藻酸钠的质量浓度为8％，H2O2的质量浓度为5％。
9.根据权利要求3所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠/H2O2酶混合溶液中的海藻酸钠的质量浓度为2％-16％，H2O2酶的质量浓度为0.25-1mg/mL；
优选地，海藻酸钠的质量浓度为8％，H2O2酶的质量浓度为0.5mg/mL。
10.根据权利要求4所述的用于创伤修复的可释氧载细胞水凝胶的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞的接种密度为2×103-8×103个/cm2；
优选地，间充质干细胞的接种密度为5×103个/cm2。
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