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CN118159645A - 组合物及使用其治疗肝纤维化的方法 - Google Patents

组合物及使用其治疗肝纤维化的方法 Download PDF

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CN118159645A
CN118159645A CN202280070261.3A CN202280070261A CN118159645A CN 118159645 A CN118159645 A CN 118159645A CN 202280070261 A CN202280070261 A CN 202280070261A CN 118159645 A CN118159645 A CN 118159645A
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落谷孝广
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Avia Life Sciences Co ltd
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Abstract

提供了组合物、制备组合物的方法和使用组合物治疗肝脏疾病、病症和损伤的方法。所述组合物包括化学诱导的肝祖细胞(CLiP)和/或由CLiP形成的无细胞材料，例如细胞外囊泡(EV)，例如外泌体。在一些实施方案中，所述组合物和/或方法有效地减少有需要的受试者中现有的肝胶原或新的肝胶原的形成；和/或减少现有纤维化的量或新纤维化的形成。

Description

组合物及使用其治疗肝纤维化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年10月18日提交的美国临时申请63/256,840的权益和优先权，该申请的全部内容通过引用具体纳入本文。
对序列表的引用
根据37C.F.R.§1.834(c)(1)，创建于2022年10月18日，大小为18,496字节的命名为“EVIA102PCT.xml”的，以xml文件提交的序列表通过引用纳入本文。
技术领域
本发明的领域大体涉及化学诱导的肝祖细胞、用其制备和由其制备的组合物以及使用其治疗肝纤维化的方法。
背景技术
肝细胞被认为是细胞移植治疗肝脏疾病的唯一有效细胞来源；然而，由于供体短缺，肝细胞的可用性有限。因此，必须开发改进的细胞来源和替代治疗方法。结果表明，使用小分子抑制剂的适当组合，可以从成熟的啮齿动物肝细胞和人类婴儿肝细胞中获得具有再生(repopulative)能力的肝祖细胞(Katsuda等人,Cell Stem Cell 20,41-55,(2017),dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.007,Katsuda等人,eLife 8:e47313,31页,(2019)doi.org/10.7554/eLife.47313)。然而，这些细胞改善肝功能的能力的潜在机制及其治疗肝脏疾病和病症的用途范围尚不清楚。
因此，本发明的目的是深入了解化学诱导的肝祖细胞改善肝功能的能力的机制，以及基于此开发的改进的组合物及其使用方法。
发明内容
提供了组合物、制备组合物的方法和使用组合物治疗肝脏疾病、病症和损伤的方法。所述组合物包括化学诱导的肝祖细胞(CLiP)和/或由CLiP形成的无细胞材料，例如细胞外囊泡(EV)，例如外泌体。在一些实施方案中，所述组合物和/或方法在需要的受试者中有效地减少现有的肝胶原或新的肝胶原的形成；减少现有纤维化的量或新纤维化的形成；诱导一种或多种肝纤维化相关基因表达的变化，任选地Mmp2 mRNA的表达增加，Timp1、αSMA和/或Col1a mRNA和/或蛋白的表达减少，或其任意组合；诱导肝星状细胞活化的一种或多种标志物(如αSMA)的表达减少，优选在肝星状细胞中；诱导与细胞周期、自噬、细胞膜融合和/或锌指蛋白相关的一种或多种基因的表达变化，任选地，其中所述一种或多种基因为Dmtf1、Zfp612、Itga6、Trim24、Eaf2、Zfp119a、Dido1、Masp2、Sgk1、Sm11567、Eml5、Srsf5、Rab35、Fam206a、Zfp131、Zkscan14、Insc、Ntn3或其组合；诱导肝星状细胞中MMP1和/或MMP13 mRNA和/或蛋白的增加；和/或诱导肝星状细胞中TNFαmRNA和/或蛋白的减少。
还提供了制备由CLiP形成的EV的方法。所述方法通常包括培养CLiP和收获由CLiP分泌的EV。通常，用TGFβ信号传导抑制剂如A83-01培养细胞，例如浓度为约1μM至约10μM，或约0.1μM至10μM，或约0.5μM。通常，细胞也与GSK3抑制剂如CHIR99021一起培养，例如浓度为约0.1μM至约20μM，约1μM至约10μM，或约3μM。
通常，细胞开始于从哺乳动物肝脏分离/纯化的肝细胞。
在一些实施方案中，特别是在起始细胞为人肝细胞的那些实施方案中，将细胞与血清如胎牛血清(FBS)一起培养，例如以培养基的5-20％或培养基的约10％的浓度培养。
在一些实施方案中，特别是在起始细胞为啮齿类动物细胞(例如来自小鼠或大鼠的细胞)的那些实施方案中，用ROCK抑制剂(例如Y-27632)培养细胞，例如浓度为约1μM至约100μM，或约5μM至约25μM，或约10μM。在一些实施方案中，特别是在其中细胞是来自人的那些实施方案中，ROCK抑制剂可以从培养中排除。
细胞可以与一种或多种抑制剂和/或血清一起培养至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天；或约5天至约25天，或其间的任何子范围或整数的天数，任选地约7天至约22天，约5天至约25天，或约10天至约20天，或约12天至约17天；或约13、14或15天。
还提供了包括有效量的CLiP和/或由其形成的EV的药物组合物。
所述组合物可用于治疗有需要的受试者的治疗性和非治疗性方法，所述方法通常包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包括有效量的CLiP和/或由其形成的EV。在一些实施方案中，所述方法对于治疗受试者的肝纤维化是有效的。
在一些实施方案中，所述组合物包括EV或分泌EV的CLiP，所述EV具有一种或多种微小RNA(例如hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa-miR-510-3p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p和hsa-miR-99b-5p中的一种或多种)和/或一种或多种细胞因子任选地其中所述一种或多种细胞因子是或包括TNFα或其任意组合。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二活性剂。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用TNFα。
所述方法可用于治疗患有肝脏疾病或病症的受试者，例如感染，任选地甲型、乙型或丙型肝炎；免疫系统问题，任选地自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎；癌症，任选地肝癌、胆管癌或肝细胞腺瘤；遗传性肝脏病症，任选地血色素沉着症、高草酸尿症、威尔逊病或α-1抗胰蛋白酶缺乏症；酗酒和/或药物过量造成的损害；或非酒精性脂肪性肝病。
附图说明
图1A和1B是显示肝纤维化小鼠模型中血液生化检验结果的折线图。移植后，总胆红素值为正常值，血小板计数高于参考值(表2)。在移植后一段时间内确定AST(图1A)和ALT(图1B)，发现移植组和非移植组之间没有显著差异。
图2是显示有和没有hCLiP移植的肝组织中胶原量的图。
图3A是显示有和没有hCLiP移植的肝组织中Col1a阳性区域的图。图3B是显示通过hCLiP移植的病理性肝纤维化的变化的图。
图4A-4D是显示hCLiP移植引起的肝纤维化相关基因表达的变化的条形图：Mmp1mRNA(图4A)、Timp1 mRNA(图4B)、Col1a mRNA(图4C)、αSMA mRNA(图4D)。
图5是显示肝组织中hCLiP的存在的图。从冷冻肝组织中收集总DNA，并使用小鼠Tfrc和人RNase P来测量它们各自的拷贝数。在移植组中检测到0-1％的人细胞。
图6是显示hCLiP移植引起的基因谱的变化的热图。hCLiP移植导致18种类型的基因的表达显著降低。
图7是显示肝星状细胞和hCLiP共培养的肝星状细胞活化水平的变化的柱状图。
图8A-8D为分别显示通过诱导图8A-8D中永生化hCLiP“A”-“D”的肝分化而产生的CYP3A4酶活性的柱状图。
图9是显示肝星状细胞和永生化hCLiP共培养的肝星状细胞活化水平的变化的柱状图。
图10A-10D是显示由于肝星状细胞和hCLiP的共培养，肝星状细胞中基因表达的变化的柱状图：TNFαmRNA(图10A)、TIMP3 mRNA(图10B)、MMP13 mRNA(图10C)和MMP1 mRNA(图10D)。
图11A-11C是显示由于肝星状细胞和hCLiP在TGF存在下共培养，hCLiP基因表达的变化的柱状图：MMP13 mRNA(图11A)、TIMP3 mRNA(图11B)和TNFαmRNA(图11C)。
图12是显示向肝星状细胞中添加10、20或50ng/ml TNFα后，αSMA mRNA基因表达的变化的柱状图。
图13A和13B是显示由于向肝星状细胞中添加源自hCLiP的外泌体而引起的肝星状细胞活化水平的变化的柱状图。图13A显示了在有外泌体和无外泌体以及有TGFβ和无TGFβ的肝星状细胞中，肝星状细胞活化标志物αSMA在蛋白质水平上的变化。图13B显示了添加的外泌体中mRNA(MMP13、TIMP3、IL-13和TNFα)的水平。
图14A-14C是显示在存在或不存在TGFβ的情况下，源自hCLiP的外泌体中的mRNA：MMP13(图14A)、TIMP3(图14B)和TNFα(图14C)的柱状图。n＝1。
图15是说明提出的解释hCLiP诱导的肝纤维化改善的作用机制的模型。显示了提出的TNFα(其为源自hCLiP的细胞因子)和源自hCLiP的外泌体的作用。
图16是显示在hCLiP EV中检测到的各种微小RNA的相对水平的柱状图。带圆圈的miRNA表示那些可能对抑制肝纤维化特别有影响的miRNA。
发明详述
I.定义
如本文所用，术语“载体”或“赋形剂”是指制剂中的有机或无机成分、天然或合成非活性成分，一种或多种活性成分与之组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物学活性的有效性的无毒材料。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任意标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液例如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以缓解正在治疗的病症、疾病或病况的一种或多种症状或以其他方式提供所需的药理学和/或生理学效果的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，例如依赖于受试者的变量(例如，年龄、免疫系统健康情况等)、正在治疗的疾病或病症以及施用途径和正在施用的药剂的药代动力学。
如本文所用的，术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指将组合物施用于处于由疾病或病症引起的一种或多种症状的风险或具有由疾病或病症引起的一种或多种症状的倾向的受试者或系统，以引起疾病或病症的特定症状的停止、疾病或病症的一种或多种症状的减少或预防、疾病或病症的严重程度的降低、疾病或病症的完全消融、疾病或病症的发展或进展的稳定或延迟。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”是指为使用所公开的组合物的治疗靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人。受试者可以有症状或无症状。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者，无论是男性还是女性，都将被涵盖。受试者可以包括对照受试者或测试受试者。
如本文所用，“实质上改变”是指相对于对照至少例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％、100％或更大的改变。
如本文所用，术语“纯化的”、“分离的”和类似术语涉及处于基本上不含(至少60％不含，优选75％不含，最优选90％不含)通常与天然环境中的所述分子或化合物缔合的其他组分的形式的分子或化合物的分离。
如本文所用，“治疗”是指对患者的医疗管理，旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。该术语包括积极治疗，即具体涉及改善疾病、病理状况或病症的治疗，并且还包括病因治疗，即涉及消除相关疾病、病理状况或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即设计为减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即涉及最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种特定疗法的治疗，所述另一种特定疗法涉及相关疾病、病理状况或病症的改善。
除非本文中另有说明，否则本文中的值范围的引用仅旨在作为单独引用落在该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在约+/-10％范围内高于或低于规定值的值；在其他形式中，这些值的范围可以在约+/-5％的范围内高于或低于规定值；在其他形式中，这些值的范围可以在约+/-2％的范围内高于或低于规定值；在其他形式中，该值的范围可以在约+/-1％的范围内高于或低于规定值。上述范围旨在通过上下文明确，不暗示进一步的限制。
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，也特别设想和考虑公开的是从一个特定值和/或到另一个特定值的范围，除非上下文另有具体说明。类似地，当使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解为该特定值形成了另一个应被视为公开的、特别设想的实施方案，除非上下文另有明确说明。将进一步理解的是，除非上下文另有明确说明，否则每个范围的端点相对于另一端点都是显著的，并且独立于另一端点。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单独的值和值的子范围也都是特别设想的，并且应当被视为公开的，除非上下文另有明确说明。最后，应该理解的是，所有范围既指所列举的范围作为范围，又指从第一端点并包括第一端点到第二端点并包括第二端点的单个数字的集合。在后一种情况下，应该理解的是，任何单个数字都可以选择为范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从第一端点并包括第一端点到第二端点并包括第二端点的数字或值的集合，从所述集合可以选择该集合的单一成员(即单一数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论是否在特定情况下明确公开了这些实施方案中的一些或全部，上述内容都适用。
本文公开的每一种化合物旨在并且应当被认为是本文具体公开的。此外，在本公开中可以识别的每个子组旨在并且应当被认为是在本文具体公开的。因此，特别考虑的是，任何化合物或化合物的子组都可以被具体地包括在使用中或被排除在使用之外，或被包括在化合物列表中或从化合物列表中排除。
公开了用于制备公开的组合物的组分以及在本文公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的各种单独和集体组合和排列的具体引用，但本文中具体设想和描述了每一种。例如，如果公开和讨论了特定的多肽，并且讨论了可以对多个多肽进行的多个修饰，则特别考虑的是多肽的每一种组合和排列以及可能的修饰，除非有明确相反的说明。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子A-D的实例，则即使没有单独列举每一种，也可以单独和总体地设想考虑每一种，意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F被视为公开了。同样地，还公开了这些的任意子集或组合。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组被视为公开了。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行。
II.组合物
本文公开了用于治疗肝脏疾病、病症和损伤的组合物和方法。所述组合物可以包括和/或由化学诱导的肝祖细胞(CLiP)形成。所述组合物可以是基于细胞的组合物或无细胞的组合物。还提供了制造CLiP的方法。
A.化学诱导的肝祖细胞(CLiP)
所公开的组合物和方法通常由化学诱导的肝祖细胞(CLiP)(优选人化学诱导的肝祖细胞(hCLiP))组成或由其形成。细胞优选地不有意地进行基因修饰，例如通过重组遗传技术、定向基因编辑等进行修饰。然而，也可以考虑进行基因修饰的细胞。实例包括但不限于永生化的CLiP，例如具有CDK4、CCND1(细胞周期蛋白D1)和/或TERT的那些，通常在条件或组成型活性启动子的控制下(参见例如下面的实施例)。
1.起始肝细胞的来源
用作化学诱导起始材料的肝脏细胞，也称为肝细胞，通常包括至少一种类型的肝细胞标记基因(例如，白蛋白(ALB)、运甲状腺素蛋白(TTR)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、色氨酸-2,3-双加氧酶(TDO2)、细胞色素P450(CYP)、miR-122等)，优选2种或更多种类型，更优选3种或更多种类型，还更优选4种或更多种类型，特别优选5种或更多种类型，最优选选自ALB、TTR、G6PC、TAT、TDO2和CYP的6种类型中的所有类型。优选地，肝细胞是功能性的。功能性肝细胞是指保留一种或多种，优选2种或更多，更优选3种或更多种，还更优选4种或更多种并且最优选选自以下的所有功能的肝细胞：(i)具有胆小管结构并在小管中积累药物代谢产物；(ii)在细胞膜中表达ABC转运蛋白(例如MDR1、MRP等)；(iii)分泌表达ALB；(iv)积累糖原；和(v)具有作为药物代谢酶(例如CYP1A1、CYP1A2等)的活性。
肝细胞可以从任何来源提供，只要它们是(例如，通过上述肝细胞标记基因的表达表征的)肝细胞。例如，肝细胞可以从哺乳动物获得，例如人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、绵羊、马、猪、牛、猴子等，优选人、大鼠或小鼠。肝细胞可以通过分化诱导方法从胚胎干细胞(ES细胞)或多能干细胞如iPS细胞获得，或者通过直接重编程从成纤维细胞获得。在一些实施方案中，肝细胞不进行基因修饰。
示例性来源是从哺乳动物的肝脏分离/纯化的肝细胞。例如，在非人类哺乳动物的情况下，可以切除肝脏。对于人类来说，成人肝组织块可以通过手术切除，也可以从最近去世的捐赠者(可以是成年人或青少年)身上切除。也可以使用从终止妊娠的胎儿身上切下的肝脏。细胞可以是新鲜分离的或可以是冷冻保存的细胞，所述冷冻保存的细胞是先前从切除的肝脏中分离/纯化的。肝脏可以是健康的肝脏。在一些实施方案中，肝细胞对于待治疗的受试者来说是自体的。
肝细胞可以通过灌注法从哺乳动物肝脏或其组织块中纯化(“Handbook ofCultured Cell Experiments”(Yodosha,2004)等)。具体而言，在经由门静脉用EGTA溶液预灌注之后，可以通过灌注诸如胶原酶或分散酶的酶溶液(Hank溶液等)来消化肝脏，可以通过过滤、低速离心等去除细胞碎片和非实质细胞来纯化肝细胞。
2.抑制剂、血清和其他因素
为了形成CLiP，肝细胞通常与一种或多种TGF-β受体抑制剂和一种或多种GSK3抑制剂接触。在一些实施方案中，还使细胞与一种或多种ROCK抑制剂和/或血清接触。通常，在体外或离体发生接触。
下文更详细地讨论的每种抑制剂可以是减少或阻止靶分子或信号传导通路(例如TGF-β、GSK3、ROCK等)表达的蛋白质、核酸、小分子、抗体或其他试剂。
抑制剂可以直接或间接抑制或以其他方式降低靶分子的表达或活性。例如，ROCK活化的负调控因子包括小GTP结合蛋白，如Gem、RhoE和Rad，它们可以减弱ROCK活性。ROCK的自身抑制活性也已在羧基末端与激酶结构域相互作用以降低激酶活性时得到证明。
抑制剂可以是但不限于小分子、抗体、反义化合物和负调控因子。优选一种或多种或所有抑制剂是低分子量化合物(例如小分子)。
在其他实例中，抑制剂是反义化合物。通常，反义技术背后的原理是反义化合物与靶核酸杂交，并影响基因表达活性或功能(如转录、翻译或剪接)的调节。基因表达的调节可以通过例如靶RNA降解或基于占位的抑制来实现。通过降解调节靶RNA功能的一个实例是在与DNA样反义化合物例如反义寡核苷酸杂交时靶RNA的基于RNase H的降解。反义寡核苷酸也可用于通过基于占位的抑制(例如通过阻断进入剪接位点)来调节基因表达，例如剪接。
反义化合物包括但不限于反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、shRNA和核酶。反义化合物可以特异性靶向编码待抑制的靶标的核酸。上述反义化合物中的每一种提供序列特异性靶基因调控。这种序列特异性使反义化合物成为选择性调节目标靶核酸的有效工具。设计、制备和使用特异性靶向核酸的反义化合物的方法在本领域技术人员的能力范围内。
在另一个实施方案中，抑制剂可以是功能阻断抗体。
a.TGF-β受体抑制剂
通常使肝细胞在体外与一种或多种低分子量信号传导通路抑制剂(包括TGF-β受体抑制剂)接触。用于本发明的TGF-β受体抑制剂可以是任何抑制剂，只要其抑制转化生长因子(TGF)-β受体的功能，并且包括TGF-β/Smad信号传导的抑制剂，例如小分子、抗体、反义化合物和TGF-β/Smad信号传导分子的负调控因子。抗体、反义化合物和负调控因子可设计为靶向TGF-β信号传导分子，如ALK4、5和/或7。
TGF-β/Smad信号传导的示例性小分子抑制剂包括但不限于A83-01、SB431542、LDN-193189、Galuniserib(LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、RepSox(E-616452)、LDN-193189 2HCl、K02288、BIBF-0775、TP0427736 HCl、LDN-214117、SD-208、Vactosertib(TEW-7197)、ML347、LDN-212854、DMH1、多索吗啡(Dorsomorphin)(化合物C)、2HCl、吡非尼酮(Pirfenidone)(S-7701)、柳氮磺胺吡啶(NSC667219)、AUDA、PD 169316、TA-02、ITD-1、LY 3200882、阿兰内酯(Alantolactone)、常山酮(Halofuginone)、SIS3 HCl、多索吗啡(Dorsomorphin)(化合物C)和橙皮素(Hesperetin)。
其他实例包括但不限于2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-1H-吡唑(A-83-01)、2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基胺(SD-208)、3-(吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基]-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘吡啶(均来自Merck)和SB431542(Sigma Aldrich)。
优选的实例是A-83-01，在本文中也称为“A”。通常，例如，抑制剂A83-01以约0.1μM至约10μM，或约0.5μM的浓度使用。
b.GSK3抑制剂
通常使肝细胞也在体外与一种或多种GSK3抑制剂接触。GSK3抑制剂可以是任何GSK3抑制剂，只要其抑制糖原合成酶激酶(GSK)3的功能即可。实例包括SB216763(Selleck)、CHIR98014、CHIR99021(均来自Axon medchem)、SB415286(Tocris Bioscience)和Kenpaulone(Cosmo Bio)。优选的实例是CHIR99021，在本文中也称为“C”。通常，例如，抑制剂CHIR99021以约0.1μM至约20μM，约1μM至约10μM，或约3μM的浓度使用。
c.ROCK抑制剂
在一些实施方案中，还使肝细胞与一种或多种ROCK抑制剂接触。在一些实施方案中，例如当肝细胞是人细胞时，可以排除ROCK抑制剂。
Rho相关激酶(也称为和/或本文中称为ROCK、Rock、Rho相关卷曲螺旋激酶和Rho激酶，包括ROCK1(也称为ROKβ或p160ROCK)和ROCK2(也称为ROCKα)。ROCK蛋白是与Rho GTP酶相互作用的丝氨酸-苏氨酸激酶。优选地，ROCK抑制剂是小分子。示例性的小分子ROCK抑制剂包括Y-27632(美国专利号4,997,834)和法舒地尔(也称为HA 1077；Asano等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.241:1033-1040,1987)。这些抑制剂与激酶结构域结合以抑制ROCK酶活性。据报道特异性抑制ROCK的其他小分子包括H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪，Ikenoya等人,J.Neurochem.81:9,2002；Sasaki等人,Pharmacol.Ther.93:225,2002)；N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)脲(Takami等人,Bioorg.Med.Chem.12:2115,2004；和3-(4-吡啶基)-1H-吲哚(Yarrow等人,Chem.Biol.12:385,2005)、GSK269962A和盐酸法舒地尔(Tocris Bioscience)。
另外的小分子Rho激酶抑制剂包括PCT公开号WO 03/059913、WO 03/064397、WO05/003101、WO 04/112719、WO 03/062225和WO 03/062227；美国专利号7,217,722和7,199,147；以及美国专利申请公开号2003/0220357、2006/0241127、2005/0182040和2005/0197328中描述的那些。
在特别优选的实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632，在本文中也称为“Y”。Y-27632也称为(+/-)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺，是一种选择性抑制Rho相关激酶活性的小分子抑制剂。在美国专利号4,997,834和PCT公开号WO 98/06433中公开了Y-27632。在一些实施方案中，当ROCK抑制剂为Y-27632时，ROCK抑制剂的有效量为约1至约100μM，或约5至约25μM，或约10μM。
当使GSK3抑制剂和ROCK抑制剂单独与肝细胞接触时，它们几乎不诱导肝干细胞/祖细胞，而与仅使TGF-β受体抑制剂与肝细胞相接触的情况相比，当使GSK3-抑制剂与TGF-β受体抑制剂一起与肝细胞接触时，诱导肝干细胞/祖细胞的效率(也称为“重编程效率”)显著增加。此外，与仅使TGF-β受体抑制剂与肝细胞接触的情况相比，当使ROCK抑制剂与TGF-β受体抑制剂一起与肝细胞相接触时，大鼠和小鼠细胞的重编程效率也增加(Katsuda等人,Cell Stem Cell 20,41-55,(2017),dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.007，其通过引用的方式具体地全部纳入本文。因此，在一些实施方案中，除了TGF-β受体抑制剂之外，使GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂与肝细胞接触。
d.血清和其他因子
结果还显示，当使用一些人肝细胞，例如婴儿原代人肝细胞(IPHH)时，细胞优选不与ROCK抑制剂接触，并且另外地或可替代地与血清，例如胎牛血清接触(Katsuda等人,eLife 8:e47313,31页,(2019)doi.org/10.7554/eLife.47313，其通过引用具体地全部纳入本文)。因此，在一些实施方案中，除了TGF-β受体抑制剂之外，使GSK3抑制剂和/或血清与肝细胞接触。
血清的实例包括来自哺乳动物，包括但不限于牛、人、马、山羊、兔子、绵羊、猪、大鼠和小鼠的血清。在特定实施方案中，血清是胎牛血清(FBS)、胎儿或新生小牛血清(FCS)、成年牛血清(ABS)和人血清。当存在时，血清通常以培养基的5-20％存在。在特定的实施方案中，血清是10％FBS。
在无血清培养基的情况下，可以添加血清替代物(BSA、HAS、KSR等)。
通常，进一步添加诸如生长因子、细胞因子或激素的因子。此类因子的实例包括但不限于表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、制癌蛋白M(OsM)、氢化可的松21-半琥珀酸酯或其盐和地塞米松(Dex)中的一种或多种。
e.MEK抑制剂
除了GSK3抑制剂和ROCK抑制剂之外的低分子量信号传导通路抑制剂也可以与TGF-β受体抑制剂组合。这种抑制剂的实例包括但不限于MEK抑制剂。MEK抑制剂没有特别限制，并且可以使用任何抑制剂，只要其抑制MEK(MAP激酶-ERK激酶)的功能即可，其中实例包括AZD6244、CI-1040(PD184352)、PD0325901、RDEA119(BAY869766)、SL327、U0126(均来自Selleck)、PD98059、U0124和U0125(均来自Cosmo Bio)。
f.示例性优选实施方案
特别地，优选使细胞与至少以下接触：
作为TGF-β受体抑制剂的A-83-01(A)与作为GSK3抑制剂的CHIR99021(C)组合(AC)，任选地进一步与血清(例如FBS)组合(FAC)；
作为TGF-β受体抑制剂的A-83-01(A)与作为ROCK抑制剂的Y-27632(Y)组合(YA)，任选地进一步与血清(例如FBS)组合(FYA)；
作为TGF-β受体抑制剂的A-83-01(A)与作为GSK3抑制剂的CHIR99021(C)和作为ROCK抑制剂的Y-27632(Y)组合(YAC)，任选地进一步与血清(例如FBS)组合(FYAC)。
用于培养小鼠和大鼠肝细胞的优选制剂是YAC。
用于培养IPHH的优选制剂是FAC。
在特定的实施方案中，添加到培养基中的TGF-β受体抑制剂的浓度可以适当地选择，例如，在0.01-10μM的范围内，优选0.1-1μM；添加到培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以适当地选择，例如，在0.01-100μM的范围内，优选1-10μM；添加到培养基中的ROCK抑制剂的浓度可以适当地选择，例如，在0.0001-500μM的范围内，优选1-50μM；并且添加到培养基中的血清的浓度可以适当地选择，例如，在5％-20％的范围内，优选8％-12％，例如10％。
抑制剂和/或制备CLiP的方法也描述在WO 2020/080550、WO 2017/119512、美国专利号10,961,507、U.S.S.N.17/285,038、Katsuda等人,Cell Stem Cell 20,41-55,(2017),dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.007和Katsuda等人,eLife 8:e47313,31页,(2019)doi.org/10.7554/eLife.47313中的一个或多个中，其中每一个都通过引用全部内容具体纳入本文中。
3.培养和选择指南
肝细胞与一种或多种抑制剂和任选地血清之间的接触可以通过在这些材料存在下培养肝细胞来进行。具体地，将这些抑制剂和任选的血清以有效浓度添加到培养基中以进行培养。合适的培养基的实例包括但不限于基础培养基。也可以使用市售的基础培养基，其中实例包括但不特别限于极限必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的极限必需培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、Ham F12培养基和William E培养基，其可以单独使用或者它们的两种或更多种类型可以组合使用。培养基添加剂的实例包括各种氨基酸(例如，L-谷氨酰胺、L-脯氨酸等)、各种无机盐(亚硒酸盐、NaHCO3等)、各种维生素(烟酰胺、抗坏血酸衍生物等)、各种抗生素(例如，青霉素、链霉素等)、抗真菌剂(例如，两性霉素等)和缓冲剂(HEPES等)。
当这些抑制剂是水不溶性或水溶性差的化合物时，它们可以溶解在少量低毒性有机溶剂(例如DMSO等)中，然后将所得物添加到培养基中以得到上述最终浓度。
用于该培养的培养容器没有特别限制，只要其适合于贴壁培养即可，其中实例包括培养皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多皿(multidish)、微板、微孔板、多板、多孔板、室载玻片、Schale、管、托盘和培养袋。为了增强与细胞的粘附性，所使用的培养容器的内表面可以涂覆有细胞支持基质。这种细胞支持基质的实例包括胶原、明胶、Matrigel、聚-L-赖氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白，并且优选为胶原和/或Matrigel。
肝细胞可以以102-106个细胞/cm2，优选103-105个细胞/cm2的细胞密度接种到培养容器上。培养可以在CO2培养箱中进行，在CO2浓度为1-10％，优选2-5％，更优选约5％，30-40℃，优选35-37.5℃，和更优选约37℃的气氛中进行。培养期可以是例如1-4周，优选1-3周，更优选约2周。培养基可以每1-3天新鲜更换一次。
以这种方式，使肝细胞与TGF-β受体抑制剂接触，并任选地与GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂和/或血清接触，从而将肝细胞重新编程为肝干细胞/祖细胞。尽管成熟肝细胞通常被认为不在体外增殖，但如Katsuda等人,Cell Stem Cell 20,41-55,(2017),dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.007所述，在用YAC培养2周后，发现它们增殖约15倍。同样，IPHH用FAC培养2周有效增殖并成为主要群体(Katsuda等人,eLife 8:e47313,31页,(2019)doi.org/10.7554/eLife.47313)。
在优选实施方案中，CLiP具有
(a)自我再生能力；和
(b)分化为肝细胞和胆管上皮细胞两者的双潜能能力。在本文中，术语“胆管上皮细胞”(也称为“BEC”)是指表达细胞角蛋白19(CK19)和GRHL2作为BEC标志物的细胞。
CLiP还可以包括胎儿肝成肝细胞和肝损伤后出现的卵圆细胞。
在优选实施方案中，上述特征(a)和(b)和类似于常规已知的肝脏干细胞(LSC)，通过所公开的重编程方法获得的CLiP：
(c)表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)作为表面抗原标志物，但不表达由其他已知LSC表达的δ同源物1(Dlk1)。此外，根据一些实施方案，CLiP不表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGRS)和FoxL1，它们是已知的LSC标志物。
CLiP还可以具有以下一个或多个特征：
(d)表观生长速率至少10代，优选20代或更多代不减慢；
(e)分化为肝细胞和BEC的效力保留至少10代，优选20代或更多代；
(f)核质(N/C)比值高于肝细胞；
(g)与肝细胞相比，选自由α-胎蛋白(AFP)、SRY盒(Sox)9、EpCAM、Thy-1/CD90、肝细胞核因子1同源盒B(HNF1-β)、叉头盒J1(FoxJ1)、HNF6/单切-1(one cut-1)(OC1)、CD44、整联蛋白α6(A6)和CK19基因组成的组的一种或多种LSC标记基因的表达增加。
(h)与肝细胞相比，选自由AFP、CD44、EpCAM、CK19、Sox9、A6和CD90组成的组的一种或多种蛋白质的表达增加。
在一些实施方案中，CLiP具有所有上述特征(d)-(h)。
因此，CLiP可以通过使肝细胞与TGF-β受体抑制剂接触，最典型地在体外或离体接触，并且优选地进一步与有效量的GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂和/或血清接触，并在合适的条件下从肝细胞诱导，以诱导具有一个或多个，优选地大部分或全部上述特征的细胞。
4.CLiP的维持/增殖
CLiP可以通过在一种或多种抑制剂和任选地血清的存在下，例如，
(i)在胶原或Matrigel包被的培养容器上进行第一至第四次传代；和
(ii)在包被有Matrigel的培养容器上进行第五次传代等来有效地维持/增殖。
作为培养容器，可以使用与用于从肝细胞诱导CLiP的培养容器类似的培养容器。用于第一至第四次传代的培养容器用胶原或Matrigel包被。
一旦如上所述获得的原代CLiP达到70-100％的汇合度，就可以将它们以103-105个细胞/cm2的密度接种到这种胶原或Matrigel包被的培养容器上。作为培养基，可以类似地使用描述用于诱导培养CLiP的培养基。添加的一种或多种抑制剂和任选地血清的浓度也可以适当地选自上述用于诱导培养CLiP的浓度范围。培养温度和CO2浓度也遵循诱导培养CLiP的条件。一旦达到70-100％的汇合度，就可以用胰蛋白酶处理细胞，使其解离并传代。
对于第五次传代等，优选使用包被有Matrigel的培养容器。在大约5-8次传代后可以获得稳定的CLiP。10次或更多次传代后，可以通过常规程序进行克隆。
如上所述，可以添加一种或多种抑制剂和任选地血清到培养基中，不仅用于CLiP诱导培养，而且用于维持/增殖培养。
5.CLiP向肝细胞的再分化
在一些实施方案中，CLiP被用作CLiP。在其他实施方案中，CLiP被再分化为肝细胞。诱导CLiP再分化为肝细胞可以通过任何已知的方法进行。这种方法可以是，例如，在添加了制癌蛋白M(OsM)、地塞米松(Dex)、肝细胞生长因子(HGF)等的培养液中培养的方法(Journal of Cellular Physiology,Vol.227(5),p.2051-2058(2012)；Hepatology,Vol.45(5),p.1229-1239(2007))，或与Matrigel覆盖法相结合的方法(Hepatology 35,1351-1359(2002))。用于诱导分化为肝细胞的培养基可以添加也可以不添加，但优选添加一种或多种抑制剂和任选地血清。
通过诱导CLiP分化获得的肝细胞可以具有成熟肝细胞典型的胆小管样结构，从而可以在小管中积累药物代谢产物。此外，它们可以在细胞膜中表达ABC转运蛋白，例如MRP2蛋白。此外，它们可能发挥一系列肝脏功能，如白蛋白的分泌表达、糖原积累和细胞色素p450(CYP)药物代谢酶活性。具体而言，CLiP可以被再分化为功能性肝细胞。
6.诱导CLiP分化为BEC
CLiP分化为BEC的诱导可以通过任何已知的方法进行。例如，这种方法可以是在含有EGF和胰岛素样生长因子2(IGF2)的培养基中使用胶原凝胶进行培养的方法。
在一些实施方案中，分化的CLiP可以形成胆管样结构。在特定实施方案中，BEC诱导方法包括以下步骤：
(i)在一种或多种抑制剂和任选地血清的存在下，在饲养细胞上以低密度培养CLiP；和
(ii)在含有Matrigel的培养基中进一步培养步骤(i)中获得的细胞。
步骤(i)中使用的饲养细胞没有特别限制，并且可以使用通常用于支持维持和培养目的的任何细胞。例如，它们可以是小鼠胎儿来源的成纤维细胞(MEF)和STO细胞(ATCC，CRL-1503)，优选MEF。
低密度是指低于通常用于支持维持和培养目的的细胞密度的密度，例如，在1×103-5×104个细胞/cm2的范围内的细胞密度，优选5×103-3×104个细胞/cm2。用于接种饲养细胞的培养容器可以是包被有细胞支持基质如胶原或明胶的培养容器。原代或传代的CLiP可以用胰蛋白酶处理以解离，重悬于含有一种或多种抑制剂和任选地血清的培养基中，并以104-105个细胞/cm2的细胞密度接种在饲养细胞上。如有必要，可在培养基中加入血清。
第二天，培养基可替换为多能干细胞的维持培养基，如mTeSRTM(StemcellTechnologies)，并在一种或多种抑制剂和任选地血清的存在下培养3-10天，优选4-8天。培养基可以每1-3天新鲜更换一次。随后，可以将培养基更换为含有Matrigel的培养基，并进一步培养3-10天，优选4-8天。培养基可以每1-3天新鲜更换一次。添加到培养基中的Matrigel的浓度可以适当地在1-5％，优选1-3％的范围内选择。通过总共约1-3周的培养，形成胆管样结构，其中细胞高水平表达CK19和GRHL2作为BEC的标志物。此外，水孔蛋白如AQP1和AQP9以及离子通道如CFTR和AE2的基因和蛋白质表达增加。此外，在导管结构的管腔中观察到作为紧密连接标志物的ZO-1的强表达。此外，由于这些细胞具有运输水的能力以及在管腔中运输和积累药物代谢产物的能力，因此本发明的LSC可以分化为功能性BEC。
B.无细胞材料
一般来说，基于细胞的疗法可能有局限性，如不受控制的分化、副作用、肿瘤形成和同种异体使用的不相容性。相反，来自CLiP的细胞外囊泡(EV)的治疗性和非治疗性用途有可能克服这些缺点。因此，还提供了源自CLiP的无细胞组合物。
提供了包括EV的无细胞组合物及其使用方法。EV可以是因子的非均质混合物的一部分，诸如条件培养基或者是从中分离的部分。在其他实施方案中，从CLiP的条件培养基中分离或以其他方式收集EV或其一种或多种亚型。EV或其一种或多种亚型可在施用于受试者之前悬浮于药学上可接受的组合物中，例如载体或基质或贮库。
1.细胞外囊泡
所公开的组合物可以是或包括源自CLiP的细胞外囊泡，或其分离或分级的一种或多种亚型。细胞外囊泡是由脂质双层界定的颗粒，从细胞中自然释放，与细胞不同，其不能复制。EV的直径范围从接近最小物理上可能的单层脂质体的大小(约20-30纳米)到大至10微米或更大，尽管绝大多数EV小于200nm。
已经提出了多种EV亚型，包括核外粒体(ectosome)、微囊泡(MV)、微粒、外泌体、癌小体、凋亡小体(AB)、隧道纳米管(TNT)等(-Mó,等人,J Extracell Vesicles.4:27066(2015)doi:10.3402/jev.v4.27066.PMC 4433489)。这些EV亚型由各种通常重叠的定义来定义，主要基于生物发生(细胞途径、细胞或组织身份、起源条件)(Théry,等人,JExtracell Vesicles.7(1):1535750(2018).doi:10.1080/20013078.2018.1535750)。然而，EV亚型也可以通过大小、组成分子、功能或分离方法来定义。正如Théry等人所讨论的，EV的亚型可以通过以下方式定义：
a)EV的物理特性，如尺寸(“小型EV”(sEV)和“中型/大型EV”(m/lEV)，定义的范围分别例如<100nm或<200nm[小型]或>200nm[大型和/或中型])或密度(低、中、高，定义的每个范围)；
b)生物化学组成(CD9+/CD63+/CD81+-EV、膜联蛋白A5染色的EV等)；或
c)条件或起源细胞的描述(足细胞EV、缺氧性EV、大癌小体、凋亡小体)。
因此，在一些实施方案中，组合物是或包括如上所述根据(a)、(b)或(c)定义的一种或多种EV亚型。
在一些实施方案中，囊泡是或包括外泌体。外泌体具有促进内吞作用的表面蛋白质，并且具有递送大分子的潜能。此外，如果外泌体是从它们所递送到的同一个体获得的，则外泌体将具有免疫耐受性。
外泌体是大小为30-150nm，通常为40-100nm的囊泡，在大多数细胞类型中都可以观察到。外泌体通常与MV相似，但有一个重要区别：它们不是直接起源于质膜，而是通过向内出芽进入多泡体(MVB)而产生的。外泌体的形成包括三个不同的阶段：(1)从质膜形成内吞囊泡，(2)内体囊泡膜向内出芽，产生由管腔内囊泡(ILV)组成的MVB，以及(3)这些MVB与质膜融合，释放囊泡内容物，称为外泌体。
外泌体具有平均厚度为～5nm的脂质双层(参见例如Li,Theranostics,7(3):789-804(2017)doi:10.7150/thno.18133)。外泌体的脂质成分包括神经酰胺(有时用于区分外泌体和溶酶体)、胆固醇、鞘脂和具有长饱和脂肪酰基链的磷酸甘油酯。外泌体的外表面通常富含糖链，如甘露糖、聚乳糖胺(polylactosamine)、α-2,6唾液酸和N-连接聚糖。
许多外泌体含有蛋白质，如血小板衍生的生长因子受体、乳铁蛋白、跨膜蛋白和溶酶体相关的膜蛋白-2B、膜转运和融合蛋白，如膜联蛋白、筏蛋白(flotillin)、GTP酶、热休克蛋白、四跨膜蛋白、参与多泡体生物发生的蛋白质，以及脂质相关蛋白和磷脂酶。因此，这些特征蛋白可以作为分离和定量外泌体的良好生物标志物。外泌体携带的另一个关键货物是核酸，包括脱氧核酸(DNA)、编码和非编码核糖核酸(RNA)，如信使RNA(mRNA)和微小RNA(miRNA)。
在一些实施方案中，囊泡包括或是一种或多种替代的细胞外囊泡，例如AB、MV、TNT或本文或其他地方所讨论的其他囊泡。
ABs在大小上是不均匀的，并且来源于质膜。它们可以从所有类型的细胞中释放出来，大小约为1-5μm。
MV的大小为20nm-1μm，是由于起泡掺入胞质蛋白而形成的。与ABs相比，MV的形状是均匀的。它们起源于质膜，在大多数细胞类型中都能观察到。
TNT很薄(例如，50-700nm)，并且由质膜形成的含有肌动蛋白的管长达100μm。
在一些实施方案中，EV在约20nm和约500nm之间。在一些实施方案中，EV在约20nm和约250nm或200nm，或150nm或100nm之间。
以下实施例表明，从CLiP分离的EV包括许多miRNA和细胞因子。以下实施例显示，从CLiP分离的EV包括hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa-miR-510-3p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p和hsa-miR-99b-5p(参见例如图16)和TNFα。
因此，在一些实施方案中，EV包括hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa-miR-510-3p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p,hsa-miR-99b-5p中的一种或多种，和/或一种或多种细胞因子(如TNFα)或其任意组合。
2.制备细胞外囊泡的方法
a.制备细胞外囊泡的细胞来源
如本文所用，EV，包括AB、MV、外泌体和TNT，通常是指由细胞或组织形成的脂质囊泡。它们可以直接从受试者的组织、细胞和/或流体中分离，包括培养的和未培养的组织、细胞或流体，以及由培养细胞衍生或调节的流体(例如，条件培养基)。例如，外泌体存在于生理液中，如血浆、淋巴液、恶性胸腔积液、羊水、母乳、精液、唾液和尿液，并分泌到培养细胞的培养基中。
所公开的组合物的EV通常由CLiP形成。CLiP可以如本文上文和下文或在其他地方所述制备和维持，例如(Katsuda等人,Cell Stem Cell 20,41-55,(2017),dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.007,Katsuda et al.,eLife8:e47313,31页,(2019)doi.org/10.7554/eLife.47313和美国专利号10,961,507，其中每一个都通过引用全部具体纳入本文)。
从直接来自受试者的组织、细胞和流体，包括培养的和未培养的组织、细胞或流体，以及由培养细胞衍生或调节的流体(例如，条件培养基)中分离细胞外囊泡的方法是本领域已知的。
例如，参见Li,Thernaostics,7(3):789-804(2017)doi:10.7150/thno.18133,Ha,等人,Acta Pharmaceutica Sinica B,6(4):287-296(2016)doi:10.1016/j.apsb.2016.02.001,Skotland,等人,Progress in Lipid Research,66:30-41(2017)doi:10.1016/j.plipres.2017.03.001,Phinney和Pittenger,Stem Cells,35:851-858(2017)doi:10.1002/stem.2575，每一个都通过引用具体纳入本文，并描述了分离细胞外囊泡，特别是外泌体。
EV可以从原代细胞、组织或流体中收集。在一些实施方案中，囊泡从待治疗受试者的细胞、组织或流体中分离。利用从天然来源分离的EV的优点包括避免可能与人工产生的脂质囊泡相关的免疫原性。
EV也可以从细胞系或组织中收集。示例性细胞系是市售的，并且包括那些各种来源，包括人骨髓、人脐带、人胚胎组织和人脂肪(包括来源于脂肪抽吸物或从成熟脂肪细胞去分化的那些)。
b.收集细胞外囊泡的方法
可以使用差速离心、浮选密度梯度离心、过滤、高效液相色谱和免疫亲和捕获来分离细胞外囊泡，包括外泌体。
例如，从细胞培养物中分离外泌体的最常见的分离技术之一是差速离心，即使用200-100,000×g的离心力分离培养基中的大颗粒和细胞碎片，并通过在约100,000×g沉淀外泌体将外泌体与上清液分离。然而，可以通过使用蔗糖或Optiprep的浮选密度梯度离心来离心样品，提高纯度。切向流过滤与基于氘/蔗糖的密度梯度超速离心相结合用于分离用于临床试验的治疗性外泌体。
在以下实例中，将hCLiP悬浮在SHM+FAC中，接种并培养4天。最后一次培养基更换是无血清的。收集培养物上清液并在20000g下离心。过滤其上清液并在35000rpm下超速离心。超速离心后，弃去上清液，并将外泌体形成粒状沉淀(pellet)(根据培养物上清液的量可以重复超速离心)。向沉淀中加入PBS，再次对其混合物进行超速离心，弃去上清液，并洗涤所得产物。将粒状沉淀用留在管中的极少量PBS(约100μL)溶解，以制备外泌体溶液。
超滤和高效液相色谱(HPLC)是基于其尺寸差异分离EV的另外的方法。通过HPLC制备的EV是高度纯化的。
流体静压过滤透析已被用于从尿液中分离细胞外囊泡。
EV收集的其他常见技术包括使用基于亲和性的方法进行阳性和/或阴性选择。抗体可以固定在不同的培养基条件下，并与磁珠、色谱基质、平板和微流体设备结合进行分离。例如，针对外泌体相关抗原的抗体——如分化簇(CD)分子CD63、CD81、CD82、CD9、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和Ras相关蛋白(Rab5)——可用于外泌体的基于亲和力的分离。携带这些或不同抗原的非外泌体囊泡也可以以类似的方式分离。
基于微流体的设备也已被用于快速有效地分离EV，如外泌体，在微尺度上利用外泌体的物理和生物化学特性两者。除了尺寸、密度和免疫亲和性之外，还可以实施诸如声学、电泳和电磁操作等的分选机制。
表征包括外泌体的EV的方法也是本领域已知的。外泌体可以根据其大小、蛋白质含量和脂质含量进行表征。外泌体是尺寸在40-100nm之间的球形结构，与其他系统(如尺寸在100-500nm之间的微泡)相比要小得多。数种方法可用于表征EV，包括流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、动态光散射、蛋白质印迹、质谱和显微镜技术。EV也可以基于其蛋白质组成进行表征和标记。例如，整联蛋白和四跨膜蛋白是在外泌体中发现的两种最丰富的蛋白质。其他蛋白质标志物包括TSG101、ALG-2相互作用蛋白X(ALIX)、筏蛋白1和细胞粘附分子。与蛋白质类似，脂质是EV的主要成分，可用于表征它们。
C.药物组合物
还提供了药物组合物，其包括CLiP、EV和本文所述的用于调节肝功能的其他分子(例如，一种或多种miRNA或细胞因子，或编码其的核酸等)。药物组合物可以肠胃外施用(例如，肌内(IM)、腹膜内(IP)、静脉内(IV)、皮下(SubQ)或皮下注射或输注)、经皮(被动地或使用离子电渗或电穿孔)或通过任何其他合适的方式施用，并且可以以适合于每种施用途径的剂型配制。
在一些实施方案中，组合物以有效地将组合物递送至靶细胞的量来全身施用，例如通过静脉内或腹膜内施用。
在一些实施方案中，所述组合物是局部施用的，例如，通过直接注射到待治疗部位中或邻近待治疗部位。例如，在一些实施方案中，例如用于治疗肝脏，将组合物直接注射或以其他方式施用至肝脏或与其相邻的区域，尽管也可以考虑其他部位。例如，原位肝移植是治疗数种肝脏疾病(例如肝硬化、暴发型肝炎和几种致命的遗传性酶缺乏症)的治疗性应对方式(Sharma,等人,Toxicologic Pathology,40(1):83-92(2012).doi:10.1177/0192623311425061)。尽管这种程序现在是常规的，但它也有缺点，包括移植后并发症以及供体短缺。因此，已经研究了支持肝功能的替代程序。其中包括将分离的肝细胞移植到不同的全身部位。已经检查了许多部位，包括脂肪垫、肌肉、皮下组织、腹膜、肺、肾、肝和脾脏。因此，在一些实施方案中，所公开的组合物包括将细胞和/或无细胞材料局部施用至一个或多个上述部位。
在一些实施方案中，局部注射导致组合物的局部浓度增加，其大于通过全身施用所能达到的浓度。
在一些实施方案中，通过使用导管或注射器将组合物局部递送到适当的位置。局部递送这些组合物的其它方法包括使用输注泵(例如，来自Alza Corporation，Palo Alto，Calif.)或将组合物掺入到聚合物植入物中(参见，例如，P.Johnson和J.G.Lloyd-Jones,编辑,Drug Delivery Systems:Fundamentals and Techniques(Chichester,England:EllisHorwood Ltd.,1988ISBN-10:0895735806)，可以影响材料持续释放到植入物的邻近区域。
可以直接地(例如通过将其与细胞接触)或间接地(例如通过任何生物学过程的作用)向细胞提供组合物。例如，囊泡可以配制在生理学上可接受的载体中，并注射到细胞周围的组织或流体中。
体内方法的示例性剂量在下面的实验中讨论。随着进一步研究的进行，将出现关于治疗各种患者的各种病症的适当剂量水平，并且普通技术人员，考虑到接受者的治疗背景、年龄和总体健康，将能够确定适当的剂量。所选择的剂量取决于所需的治疗效果、施用途径和所需的治疗持续时间。
一般来说，对于局部注射或输注，剂量可能较低。通常，使用所公开的囊泡施用至个体的活性剂的总量可以小于为了获得相同的期望或预期效果而必须施用的活性剂的量，和/或可以表现出降低的毒性。
在优选的实施方案中，组合物在水溶液中通过胃肠外注射施用，例如肌内、腹膜内、静脉内、皮下、真皮下等。
制剂可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供的药物组合物包括有效量的一种或多种活性剂，任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这样的组合物可以包括在各种pH和离子强度下的稀释剂、无菌水、各种缓冲剂含量的缓冲盐水(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)；以及任选地添加剂，如洗涤剂和增溶剂(如20、/>80也称为聚山梨醇酯20或80)、抗氧化剂(如抗坏血酸、焦亚硫酸氢钠)、防腐剂(如硫柳汞(Thimersol)、苯甲醇)和膨胀剂(bulking substance)(如乳糖、甘露醇)。非水溶剂或运载体的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射有机酯(如油酸乙酯)。制剂可以冻干并在使用前立即重新溶解/重新悬浮。可以通过例如通过细菌保留过滤器过滤，通过将灭菌剂掺入组合物中，通过照射组合物，或通过加热组合物来灭菌。
还可以制备透皮制剂。这些通常是药膏、乳液、喷雾剂或贴剂，所有这些都可以使用标准技术制备。透皮制剂可包括渗透增强剂。化学增强剂和物理方法(包括电穿孔和微针)，可以与这种方法结合使用。
III.方法
所公开的组合物可用于治疗肝脏疾病、病症和损伤。所述方法通常包括向有需要的受试者施用有效量的一种或多种所公开的组合物，以减少或逆转肝脏疾病或病症、或肝损伤的一个或多个症状。
所述肝脏疾病和病症包括但不限于感染，如甲型、乙型和丙型肝炎；免疫系统问题，如自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎和原发性硬化性胆管炎；癌症如肝癌、胆管癌和肝细胞腺瘤；遗传性肝脏病症，如血色素沉着症、高草酸尿症、威尔逊病和α-1抗胰蛋白酶缺乏症；酗酒和/或药物过量造成的损害；非酒精性脂肪性肝病。肝脏疾病的严重并发症包括急性肝功能衰竭和肝硬化。在一些实施方案中，肝脏疾病或病症是或包括肝纤维化。
在一些实施方案中，所述组合物减少了现有的肝纤维化和/或新纤维化的形成。在一些实施方案中，所述组合物减少了现有肝胶原的量或新肝胶原的形成(例如，通过羟脯氨酸的量测量的)。在一些实施方案中，所述组合物减少现有纤维化的量或新纤维化的形成，如通过用抗Col1a抗体染色、一种或多种肝纤维化相关基因的表达变化(例如，Mmp2 mRNA的表达增加、Timp1、αSMA和/或Col1a mRNA和/或蛋白质的表达减少，或其任何组合)来检测的。
在优选的实施方案中，所述组合物诱导肝星状细胞活化的一种或多种标志物如αSMA的表达减少，优选在肝星状细胞中。
在一些实施方案中，所述组合物诱导与细胞周期、自噬、细胞膜融合和/或锌指蛋白相关的一种或多种基因，例如Dmtf1、Zfp612、Itga6、Trim24、Eaf2、Zfp119a、Dido1、Masp2、Sgk1、Sm11567、Eml5、Srsf5、Rab35、Fam206a、Zfp131、Zkscan14、Insc和Ntn3的表达变化(参见例如图6)。
在一些实施方案中，所述组合物诱导肝星状细胞中MMP1和/或MMP13 mRNA和/或蛋白的增加和/或TNFαmRNA和/或蛋白质的减少。
以下实验结果表明，TNFα可降低肝星状细胞中αSMAmRNA的表达。因此，在一些实施方案中，TNFα包含在组合物中或以其他方式与所公开的组合物共同施用。
所述组合物包括但不限于CLiP、由其形成的材料如外泌体及其活性元件，所述活性元件包括但不局限于微小RNA如hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa-miR-510-3p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p，和/或hsa-miR-99b-5p，和/或一种或多种细胞因子，例如TNFα。
在以下实例中，通过潜在功能/活性对鉴定为存在于hCLiP产生的外泌体中的一些微小RNA进行分类。因此，在一些实施方案中，选择用于特定用途的外泌体可以具有治疗靶疾病或功能障碍所需的一种或多种功能/活性，如概述的：
检测到的miRNA也根据外泌体功能/活性的潜在贡献进行分类：
1)抑制纤维化的微小RNA
·miR-29b-3p:miR-29b-3p/HMGB1/TLR4/NF-κB信号传导，aSMA↓
·miR-24、miR-27b：TGF-β信号传导↓
·miR-192-5p：与TGF-β信号传导相关的Zeb1和Zeb2；
抑制EMT
2)用于肝脏再生的微小RNA：
·miR-24：细胞生长和迁移抑制，促进分化；
抑制TGF-β信号传导；
3)具有抗炎作用的微小RNA：
·miR-16：TNF↑；抗细胞凋亡
4)对NASH具有治疗作用的微小RNA：
·miR-182-5p；miR-183-5p
5)具有抑制肝癌作用的微小RNA：
·miR-23a；miR-27b、miR-31-5p；miR-182-5p；miR-183-5p
所述组合物可以例如悬浮在合适的等渗缓冲液(例如PBS)中。一些实施方案进一步包括药学上可接受的添加剂。
尽管例如细胞或EV的悬浮液可以根据肝脏疾病的类型、肝损伤的严重程度等而不同，例如，在成人的情况下，108-1011个细胞可以通过门静脉内施用、脾内施用等进行移植。
还设想了联合疗法。因此，在一些实施方案中，将CLiP和/或由CLiP形成的EV与第二活性剂一起共同施用至有需要的受试者。第二活性剂可以与CLiP和/或EV在相同或不同的混合物中，并且可以在相同或不同时间施用。在一些实施方案中，另外的活性剂是对受试者所患的疾病或病症(例如肝脏疾病或病症)的常规治疗。
实施例
实施例1：hCLiP移植改善肝纤维化
材料和方法
使用的细胞
原代人肝细胞(批号：FCL)购自Veritas Corporation(日本东京)。购买人肝星状细胞(Science cell research laboratories)作为肝星状细胞。
培养基的组成
SHM被用作原代人肝细胞的基础培养基。通过将2.4g/l NaHCO3和L-谷氨酰胺包含在DMEM/F12(Life Technologies，MA)中并向其中添加5mM HEPES(Sigma，MO)、30mg/l L-脯氨酸(Sigma)、0.05％牛血清白蛋白(Sigma)、10ng/ml表皮生长因子(Sigma)、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸-X(Life Technologies)、10-7M地塞米松(Sigma)、10mM烟酰胺(Sigma)、1mM抗坏血酸-2磷酸盐(Wako，大阪，日本)和抗生素/抗真菌溶液(Life Technologies)来制备SHM。通过将10％FBS(Life Technologies)、0.5μMA-83-01(Wako)和3μM CHIR99021(AxonMedchem，Reston，VA)添加到该基础培养基SHM中制备的SHM+AC+10％FBS(SHM+FAC)用于培养hCLiP。将星状细胞生长补充剂、2％FBS和P/S各自添加到星状细胞培养基(Science cellresearch laboratories)中，并根据实验用作肝星状细胞的基础培养基。
从原代人肝细胞产生hCLiP
将大约一半冷冻保存的原代人肝细胞在37℃的水浴中融化，并溶解在添加了Glutamax(Life Technologies)和抗生素/抗真菌溶液的10ml Leibovitz的L-15培养基(Life Technology)中。将50g其混合物离心5分钟后，将细胞粒状沉淀重新悬浮在添加有10％FBS、GlutaMAX、抗生素/抗真菌溶液和10-7M胰岛素(Sigma)的William E培养基中。使用台盼蓝(Life Technologies)来测量活细胞的数量。将儿童原代人肝细胞(批次：FCL)以2×104个活细胞/cm2接种在I型胶原包被板(IWAKI,静冈,日本)上。3-6小时后，将培养基更换为SHM+FAC。随后，每2-3天更换一次培养基，并将细胞培养14天。
hCLiP的继代培养
使用TrypLE Express(Life Technologies，MA)从培养皿中剥离70-100％汇合度的hCLiP，并以1×105个细胞/皿重新接种在10cm胶原包被的板上。
肝纤维化模型小鼠的制备
将四氯化碳(0.5ml/kg)以1:4的比例溶于橄榄油中，并腹腔内施用至8周龄的NOD-SCID小鼠(其为免疫缺陷小鼠)，每周两次，持续8周，从而引起肝纤维化。
将hCLiP移植到肝纤维化模型小鼠中
通过使用TrypLE Express(Life Technologies，MA)将制备的hCLiP形成细胞粒状沉淀，然后将其悬浮在DMEM中。将用异氟醚麻醉的肝纤维化模型小鼠进行剖腹手术，暴露小鼠的脾脏，并以5×105或1×106个细胞/小鼠的剂量注射细胞溶液，从而脾内移植细胞。移植2周后，解剖小鼠并评估肝纤维化程度。
RNA提取
通过使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN，Venlo，荷兰)提取总RNA。
逆转录
对于逆转录，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies)。
实时PCR
对于cDNA，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG(Lifetechnologies)或TaqManTMUniversal PCR Master Mix(无AmpEraseTMUNG)(Applied Biosystems)进行实时PCR。使用ACTB作为内标研究基因表达的变化。所使用的引物如下表1所示。
表1：实时PCR中使用的引物
MMP1：Gene Exp Mmp1 Hs00899658M1(Thermo Fisher)
β-ACTIN：Gene Exp Actb Hs03023880G1(Thermo Fisher)
组织免疫染色
用于组织免疫染色的抗体如下。用福尔马林固定后制备石蜡块样品。用乙醇和二甲苯脱蜡后，使用将ImmunoSaver(Nissin EM，东京，日本)稀释200倍制备的溶液，在98℃下45分钟进行抗原回收。在室温下在包含0.3％H2O2的甲醇中浸渍30分钟以使内源性过氧化物酶失活。用含有0.1％Triton X-100的PBS渗透后，使用封闭一号(Blocking One)溶液在4℃下进行封闭30分钟。然后将一抗在室温下孵育1小时或在4℃下孵育过夜。使用ImmPRESSIgG过氧化物酶试剂盒(Vector Labs，Burlingame，CA)和金属增强的DAB底物试剂盒(LifeTechnologies)对样品进行染色。最后，将样品浸入苏木精溶液中，并在其上放置盖玻片以观察样品。
用于免疫组织化学的抗体
数字PCR
通过使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)从冷冻肝组织中收集总DNA。使用Taqman拷贝数参考测定，Mousae Tfrc(VIC)的探针和Taqman RNase P检测试剂盒(FAM)，通过QuantStudioTM3D数字PCR Master Mix v2和Quant Studio 3D数字PCR系统(ThermoFisher Scientific)，使用总DNA检测移植hCLiP后小鼠肝脏中所含的人细胞。
羟脯氨酸定量
通过羟脯氨酸测定试剂盒(Bio Vsion)使用肝组织来定量羟脯氨酸。
结果
腹膜内施用四氯化碳制备肝纤维化模型小鼠
通过切开尾巴采集血液，使用AST和ALT监测纤维化程度，并研究四氯化碳施用后经过的时间的条件。对于剂量，适当地研究了条件，以每周两次100-400mg/kg的剂量作为参考。参考先前的研究，对6周大的小鼠腹膜内施用200mg/kg的四氯化碳，这导致1/3的小鼠在10天内死亡。所有死亡的小鼠在施用后最初具有较低的体重或具有显著降低的体重。鉴于这些事实，认为用6周龄小鼠开始施用太早，因此将开始施用的小鼠改为8周龄小鼠以再次进行研究。从8周大的小鼠开始施用，只有一只小鼠死亡，纤维化小鼠的稳定生产成功。纤维化程度通过天狼星红染色或使用Col1a抗体的免疫染色进行病理学观察。
肝纤维化模型小鼠的血液生化试验
移植后，切开尾巴采血，分离血清，测定AST、ALT、总胆红素和血小板计数。
表2：血液生化检验结果(另见图1A-1B)。
总胆红素显示为正常值(表2)。AST和ALT在一段时间内每周测量两次，在首次给药时显著升高后，它们变得稳定并高于参考值。这些事实表明，产生了轻度肝纤维化的模型。移植后，将模型与非移植组的AST/ALT进行比较，没有发现显著差异(图1A-1B)。
hCLiP移植引起肝组织胶原量减少
羟脯氨酸是构成胶原蛋白的一种氨基酸。在hCLiP移植后两周进行解剖，并定量肝组织中羟脯氨酸的量。在用hCLiP移植的组中，羟脯氨酸的量显著减少(图2)。这表明hCLiP移植抑制胶原产生或溶解胶原的可能性。
hCLiP移植对病理性肝纤维化的改善作用
通过天狼星红染色或使用1a型胶原(Col1a)抗体的免疫染色对纤维化程度进行病理学评估。在用hCLiP移植的组中，Col1a阳性面积显著减少(图3A)。用天狼星红染色，观察到hCLiP移植有改善的趋势。此外，还发现天狼星红染色与羟脯氨酸含量呈正相关(图3B)。
hCLiP移植后肝纤维化相关基因表达的变化
用实时PCR观察与肝纤维化相关的基因(Mmp2、Timp1、αSMA和Col1a)的表达变化。在用hCLiP移植的组中，Mmp2 mRNA的表达水平显著增加，而Timp1、αSMA和Col1a mRNA的表达水平显著降低(图4A-4D)。作为hCLiP移植的结果，在患有纤维化的肝脏中观察到溶解胶原的基因的表达增加和产生胶原的基因的表达减少。
肝组织中hCLiP的存在
为了研究从脾脏移植的hCLiP存在的位置，使用肝组织切片用人线粒体抗体进行免疫染色。但是，检测失败。因此，从冷冻肝组织中收集总DNA，并使用小鼠Tfrc和人RNase P来测量它们各自的拷贝数。在移植组中检测到0-1％的人细胞(图5)。由于有5×105个移植细胞，而小鼠肝脏中有约1×108个细胞，因此移植的hCLiP的数量/小鼠肝脏中的细胞数量为0.5％。在移植后的第2周，人细胞存在于小鼠肝脏中的百分比最大为1％，这表明hCLiP可能在移植后在小鼠肝脏中增殖。
hCLiP移植引起的基因谱变化
使用非移植组和移植组的RNA进行微阵列分析。hCLiP移植导致18种基因(Dmtf1、Zfp612、Itga6、Trim24、Eaf2、Zfp119a、Dido1、Masp2、Sgk1、Sm11567、Eml5、Srsf5、Rab35、Fam206a、Zfp131、Zkscan14、Insc和Ntn3)的表达显著降低(图6)。这些是与细胞周期、自噬、细胞膜融合或锌指蛋白相关的基因，hCLiP移植极大地改变了它们的基因谱。
实施例2：与肝星状细胞共培养揭示hCLiP的治疗机制
材料和方法
肝星状细胞与hCLiP共培养
将肝星状细胞悬浮在通过向星状细胞培养基(Science cell researchlaboratories)中添加星状细胞生长补充剂、2％FBS和P/S制备的培养基中，并以1×104个活细胞/cm2接种。过夜后，将培养基更换为通过向星状细胞培养基中添加TGFβ和P/S制备的培养基。孵育24小时后，将hCLiP悬浮在SHM培养基中，并使用Transwell-COL插入物(Corning)以1×105个活细胞/孔进行共培养48小时。
向肝星状细胞中添加TNFα
将肝星状细胞悬浮在通过向星状细胞培养基(Science cell researchlaboratories)添加星状细胞生长补充剂、2％FBS和P/S制备的培养基中，并以1×104个活细胞/cm2接种。过夜后，将培养基更换为通过向星状细胞培养基中添加TGFβ和P/S制备的培养基。孵育24小时后，加入5、10、20、50ng/ml的TNFα并暴露24小时。
外泌体的收集
将hCLiP悬浮在SHM+FAC中，并以2×103个活细胞/cm2接种。每2天更换一次培养基，在培养的第4天用SHM+AC更换培养基。培养24小时后，收集培养物上清液。将收集的培养物上清液在20000g，4℃下离心10分钟。其上清液用Stericup Quick Release-GP无菌真空过滤系统(Millipore)过滤。将上述处理的培养物上清液在35000rpm，4℃下超离心1小时10分钟。在超速离心后，立即弃去上清液，并将外泌体形成粒状沉淀(根据培养物上清液的量重复超速离心2-5次)。向沉淀中加入PBS，再次对其混合物进行超速离心，弃去上清液，并洗涤所得产物。将粒状沉淀用留在管中的极少量PBS(约100μL)溶解，以制备外泌体溶液。
源自hCLiP的外泌体中miRNA的分析
分析收集的外泌体中是否存在miRNA。使用Qiagen microRNAeasy试剂盒从CLiPEV中纯化miRNA。将纯化的微小RNA放入综合miRNA表达分析中，使用3DmiRNA标记试剂盒和3D/>人miRNA寡聚芯片(均为Toray Industries,Inc.)进行分析，该芯片设计为检测在miRBase发布21数据库中注册的2588个miRNA序列(http://www.mirbase.org/)。Kamakura Techno-Science Inc.进行了微阵列实验。信号强度>26的miRNA被认为是检测到的miRNA。
向肝星状细胞添加源自hCLiP的外泌体
将肝星状细胞悬浮在通过向星状细胞培养基(Science cell researchlaboratories)添加星状细胞生长补充剂、2％FBS和P/S制备的培养基中，并以1×104个活细胞/cm2接种。过夜后，将培养基更换为通过向星状细胞培养基中添加TGFβ和P/S制备的培养基。孵育24小时后，加入10μg/mL源自hCLiP的外泌体溶液，并将其混合物培养48小时。
永生化hCLiP的生产
引入了三种基因，CDK4、CCND1(细胞周期蛋白D1)和TERT，并根据启动子的差异产生了4种类型的细胞(A-D)。
肝分化的诱导
将hCLiP以5×104个细胞/孔(2.5×104个细胞/cm2)的接种密度接种在胶原I包被的24孔板上。当其达到50-80％汇合度时，将培养基更换为包含2％FBS、0.5mM A-83-01和3mM CHIR99021的SHM。对于分化诱导组(Hep-i(+))，添加5ng/ml人OSM(R&D)和10-6M地塞米松。将细胞培养6天，其中每2天更换一次培养基。在第6天，将1:7的比例的Matrigel(Corning，Corning，NY)和培养基的混合物而不是培养基倒入分化诱导组(Hep-i(+))中。在第8天，吸取凝胶并用补充有Ca2+和Mg2+的HANK平衡盐溶液(Life Technologies)洗涤。
CYP活性的测定
为了测量CYP活性，使用包含2％FBS的SHM作为基础培养基。用10μM利福平或1mM苯巴比妥诱导CYP3A4。用50μM奥美拉唑诱导CYP1A2。每天更换包含CYP诱导物的培养基。3天后，使用P450-GloTMCYP3A4测定系统(Promega)测量CYP活性。
蛋白质的提取
细胞用M-PERTM哺乳动物蛋白提取试剂充分吸取并溶解。将裂解物在15000g，4℃下离心10分钟，上清液用作蛋白质溶液。使用2.0荧光计测量蛋白质浓度。
蛋白质印迹
将蛋白质溶液与4X SDS样品缓冲液(Merck)混合，并将其混合物在95℃下孵育5分钟以制备迁移样品。使用Precision Plus ProteinTM双色标准品(BIORAD)作为分子量标记。将4-20％Mini-TGXTM预制蛋白凝胶(BIORAD)放置在迁移罐中，并施加样品和分子量标记。用900ml miliQ稀释100ml 10xTris/甘氨酸/SDS用作运行缓冲液，并在100V下迁移1小时10分钟。为了转移，用720ml milliQ稀释80ml 10x Tris/甘氨酸，并加入200ml甲醇作为转移缓冲液，在100V下转移到固定-P膜(Merck)上1小时。用封闭一号溶液在室温下封闭1小时，用加入10％封闭一号溶液的TBS-T稀释一抗，并在4℃下放置过夜。将所得产物用TBS-T洗涤三次后，用TBS-T稀释二抗，并在室温下孵育1小时。将所得产物再次用TBS-T洗涤三次，并用ImmunoStar LD(Wako，Japan)染色，并用Molecular Imager ChemiDoc XRS系统(BIORAD)进行检测。
用于蛋白质印迹的抗体
统计分析
采用SPSS进行统计分析。进行斯氏t检验和Dunnett检验。下文将使用p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.001：*的符号。
结果
肝星状细胞和hCLiP共培养降低肝星状细胞活化水平
肝星状细胞在肝纤维化的病理生理进展中发挥着核心作用。肝星状细胞的活化使肝星状细胞产生细胞外基质物质，并在肝纤维化中发挥核心作用。因此，设计了实验来研究其与hCLiP共培养对肝星状细胞活化的影响。接种肝星状细胞，过夜后，将培养基更换为通过向星状细胞培养基中添加TGFβ和P/S制备的培养基。孵育24小时后，使用Transwell-COL插入物共培养hCLiP 48小时。作为肝星状细胞和hCLiP共培养的结果，肝星状细胞中肝星状细胞活化标志物αSMA的表达在mRNA和蛋白质水平上显著降低(图7)。
肝星状细胞与永生化hCLiP共培养降低肝星状细胞活化水平
虽然hCLiP具有显著更高的增殖能力，但由于非实质细胞的污染，在重复传代后非实质细胞群体增加。因此，很难正确评估hCLiP在多次传代后的功能和治疗效果。因此，产生永生化hCLiP以评估它们是否具有与hCLiP相同的功能。首先，根据启动子等的差异产生四种类型(A-D)的永生化hCLiP。为了研究永生化hCLiP是否具有与hCLiP相同的功能，对永生化hCLiP进行分化诱导，并测量CYP酶活性。在A和D中，CYP酶活性由于分化诱导而增加(图8A-8D)，而在B和C中，分化诱导没有引起变化，酶活性较低。鉴于这些结果，可能混合的其他类型的细胞如胆管上皮细胞是永生化的而不是肝祖细胞永生化。因此，A和D被用作永生化hCLiP。接下来，共培养肝星状细胞和永生化hCLiP。作为肝星状细胞和永生化hCLiP的共培养的结果，肝星状细胞中肝星状细胞活化标志物αSMA mRNA的表达显著降低(图9)。
肝星状细胞与hCLiP的共培养引起肝星状细胞基因表达的变化
共培养肝星状细胞和hCLiP，以证实参与肝星状细胞活化和胶原纤维化溶解的信号的基因表达的变化。由于肝星状细胞和hCLiP共培养，MMP1和MMP13 mRNA在肝星状细胞中的表达增加。由于添加TGFβ，TNFαmRNA的表达降低(图10A-10D)。
肝星状细胞与hCLiP的共培养引起hCLiP基因表达的变化
共培养肝星状细胞和hCLiP，以证实在存在和不存在TGFβ的情况下，参与肝星状细胞活化和胶原纤维化溶解的信号的基因表达的变化。由于肝星状细胞和hCLiP在TGFβ存在下共培养，MMP13 mRNA在hCLiP中的表达显著增加。TNFαmRNA的表达增加，而TIMP3 mRNA的表达减少(图11A-11C)。
向肝星状细胞中添加TNFα后基因表达的变化
由于肝星状细胞和hCLiP在TGFβ存在下的共培养导致hCLiP中TNFαmRNA的表达增加，因此认为来自hCLiP的作为细胞因子的TNFα的分泌增加。因此，将一种细胞因子TNFα，添加到活化的肝星状细胞中。在10、20和50ng/ml组中，添加TNFα导致αSMA mRNA表达显著降低(图12)。
将源自hCLiP的外泌体添加到肝星状细胞时，肝星状细胞活化水平降低
肝星状细胞和hCLiP的共培养表明，由于源自hCLiP的分泌，αSMA的表达减少。存在各种源自细胞的分泌物，例如细胞因子或外泌体。外泌体稳定且易于用于无细胞治疗。因此，收集源自hCLiP的外泌体，并将外泌体溶液添加到肝星状细胞中，观察表达的变化。接种肝星状细胞，过夜后，将培养基更换为通过向星状细胞培养基中添加TGFβ和P/S制备的培养基。孵育24小时后，加入10μg/mL源自hCLiP的外泌体溶液，并将其混合物培养48小时。向肝星状细胞中添加源自hCLiP的外泌体导致肝星状细胞中肝星状细胞活化标志物αSMA在蛋白质水平上的表达降低。此外，证实了添加的外泌体中mRNA的基因表达，发现含有许多TNFαmRNA(图13A-13B)。
TGFβ存在下源自hCLiP的外泌体中的mRNA
在存在和不存在TGFβ的情况下收集外泌体，并观察外泌体中基因表达的变化。在TGFβ存在的情况下，MMP13和TIMP3 mRNA在外泌体中的表达水平降低。此外，TNFα在外泌体中的表达水平增加(图14A-14C)。
源自hCLiP的外泌体中的miRNA
还分析收集的外泌体是否存在miRNA。结果如图16所示。带圆圈的miRNA被认为有助于抑制纤维化。
检测到的miRNA也根据外泌体功能/活性的潜在贡献进行分类：
1)抑制纤维化的微小RNA
·miR-29b-3p:miR-29b-3p/HMGB1/TLR4/NF-κB信号传导，aSMA↓
·miR-24、miR-27b：TGF-β信号传导↓
·miR-192-5p：与TGF-β信号传导相关的Zeb1和Zeb2；
抑制EMT
2)用于肝脏再生的微小RNA：
·miR-24：细胞生长和迁移抑制，促进分化；
抑制TGF-β信号传导；
3)具有抗炎作用的微小RNA：
·miR-16：TNF↑；抗细胞凋亡
4)对NASH具有治疗作用的微小RNA：
·miR-182-5p；miR-183-5p
5)具有抑制肝癌作用的微小RNA：
·miR-23a；miR-27b、miR-31-5p；miR-182-5p；miR-183-5p
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和引用的材料通过引用具体纳入。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在包含在以下权利要求中。

Claims (31)

1.制备细胞外囊泡(EV)的方法，其包括培养化学诱导的肝祖细胞(CLiP)并收获由CLiP分泌的EV。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CLiP通过包括用TGFβ信号传导的抑制剂培养肝细胞的方法形成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述TGFβ信号传导的抑制剂为A83-01。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述A83-01的浓度为约1μM至约10μM，或约0.1μM至约10μM，或约0.5μM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述CLiP通过包括用GSK3抑制剂培养肝细胞的方法形成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述GSK3抑制剂为CHIR99021。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述CHIR99021的浓度为约0.1μM至约20μM，约1μM至约10μM，或约3μM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CLiP通过包括用血清培养肝细胞的方法形成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述血清为胎牛血清(FBS)。
10.根据权利要求8和9所述的方法，其中所述血清为培养基的约5-20％，或培养基的约10％。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述CLiP通过包括用ROCK抑制剂培养肝细胞的方法形成。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述ROCK抑制剂为Y-27632。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Y-27632的浓度为约1μM至约100μM，或约5μM至约25μM，或约10μM。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞开始于从哺乳动物肝脏分离/纯化的肝细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞与一种或多种所述抑制剂和/或血清一起培养至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天；或约5天至约25天，或其间的任何子范围或整数天数，任选地约7天至约22天，约5天至约25天，或约10天至约20天，或约12天至约17天；或约13、14或15天。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述EV包含外泌体或由外泌体组成。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞，并且所述培养包含TGBβ抑制剂、GSK3抑制剂和血清，并且任选地不包括ROCK抑制剂。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是小鼠或大鼠细胞，并且所述培养包含TGBβ抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，并且任选地不包括血清。
19.细胞外囊泡(EV)，其根据权利要求1-18中任一项所述的方法制备。
20.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求19所述的EV。
21.治疗受试者的治疗性或非治疗性方法，其包括向受试者施用根据权利要求20所述的药物组合物。
22.治疗受试者的肝纤维化的方法，其包括向受试者施用包含有效量的CLiP的药物组合物或根据权利要求20所述的药物组合物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述CLiP由人细胞形成。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含CLiP。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CLiP分泌EV，所述EV包含hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa-miR-510-3p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p和hsa-miR-99b-5p中的一种或多种，和/或一种或多种细胞因子，任选地其中所述一种或多种细胞因子是或包含TNFα，或其任意组合。
26.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是无细胞的。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含EV，所述EV包含hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa-miR-510-3p,hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p和hsa-miR-99b-5p中的一种或多种，和/或一种或多种细胞因子，任选地其中所述一种或多种细胞因子是或包含TNFα，或其任意组合。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用TNFα。
29.根据权利要求20-28中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肝脏疾病或病症。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肝脏疾病或病症选自感染，任选地甲型、乙型或丙型肝炎；免疫系统问题，任选地自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎；癌症，任选地肝癌、胆管癌或肝细胞腺瘤；遗传性肝脏病症，任选地血色素沉着症、高草酸尿症、威尔逊病或α-1抗胰蛋白酶缺乏症；酗酒和/或药物过量造成的损害；或非酒精性脂肪性肝病。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物或方法，其中所述CLiP或EV能够减少现有肝胶原的量或减少新肝胶原的形成；减少现有纤维化的量或新纤维化的形成；诱导一种或多种肝纤维化相关基因表达的变化，任选地Mmp2mRNA的表达增加，Timp1、αSMA和/或Col1a mRNA和/或蛋白的表达减少，或其任意组合；诱导肝星状细胞活化的一种或多种标志物如αSMA的表达减少，优选在肝星状细胞中；诱导与细胞周期、自噬、细胞膜融合和/或锌指蛋白相关的一种或多种基因的表达变化，任选地，其中所述一种或多种基因为Dmtf1、Zfp612、Itga6、Trim24、Eaf2、Zfp119a、Dido1、Masp2、Sgk1、Sm11567、Eml5、Srsf5、Rab35、Fam206a、Zfp131、Zkscan14、Insc、Ntn3或其组合；诱导肝星状细胞中MMP1和/或MMP13mRNA和/或蛋白的增加；和/或诱导肝星状细胞中TNFαmRNA和/或蛋白的减少。
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