CN118126155A - 一种人nbs1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原、抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原、抗体及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽，并采用该抗原肽制备针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体。本发明的针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究人NBS1蛋白的乳酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点；本发明的针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体可以检测人NBS1蛋白的乳酸化水平，探究其与肿瘤诊断、放化疗耐药的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

Description

一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原、抗体及其制备方 法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原、抗体及其制备方法与应用。

背景技术

MRN(MRE11-RAD50-NBS1)复合物在DNA损伤的感知和修复中起着至关重要的作用。双链断裂被认为是最致命的DNA损伤形式之一，因为一个未修复的双链断裂足以引起永久性生长停滞或细胞死亡。MRN复合物能保持基因组稳定性并防止正常细胞的恶性转化，在癌症发展中的功能及其作为抗癌靶点的潜力已在各种类型的癌症中得到广泛探索。对化疗后手术切除的胃癌标本的分析表明，MRN复合物的低表达水平与对化疗和手术切除的强烈反应有关。体外实验表明，随着DNA损伤和细胞毒性的增加，MRN复合物或其成分的破坏可赋予癌细胞对顺铂的敏感性。MRN复合物的过表达能够赋予直肠癌放射抗性。

NBS1是一种多功能蛋白，作为损伤传感器定位于双链断裂位点，将关键传感器ATM激酶招募到双链断裂位点，使信号扩增并转导至众多下游效应器。在肿瘤发生研究中，乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和肝内胆管癌中观察到NBS1变异与癌症易感性增加有关。在肿瘤进展机制研究中，NBS1诱导热休克蛋白家族成员HSPA4或HSPA14的表达，从而诱导肿瘤迁移、侵袭和转化活性。在化疗耐药机制研究中，NBS1的下调表达与髓母细胞瘤细胞中缺氧诱导的化疗耐药、双链断裂修复途径的抑制和p53活化有关。在放疗抵抗机制研究中，NBS1能够稳定缺氧诱导因子，并在电离辐射下促进癌细胞迁移和侵袭。

乳酸化、磷酸化、泛素化等翻译后修饰在细胞信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用。鉴于NBS1在肿瘤发生和发展过程中发挥的重要作用，因而进一步研究NBS1蛋白的翻译后修饰具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原、抗体及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽，所述抗原肽的活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的赖氨酸被乳酸化修饰。

本发明还提供一种针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体，所述抗体是以所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽为免疫原免疫动物制备得到。

本发明还提供所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1.将所述的抗原肽的N末端与载体蛋白进行偶联，得抗原；

S2.采用S1的抗原免疫动物，并收集抗血清；

S3.对抗血清进行筛选和纯化，得所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体。

优选地，所述载体蛋白包括血蓝蛋白(KLH)。

优选地，所述免疫动物包括大白兔。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中的免疫采用双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原；免疫次数为4次，包括第1、21、35和54天；从第3次免疫后进行4次取血，分别是第一次免疫后第45、50、64、69天。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤S3中的筛选和纯化具体为将收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对权利要求1所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽的效价，并采用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化。

优选地，所述亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化具体为：采用合成肽偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；采用非乳酸化合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非乳酸化抗体，得到含乳酸化抗体流出液；接着使用乳酸化合成肽(抗原肽)偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去乳酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

本发明还提供所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽在制备用于检测人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化的制剂中的应用。

本发明还提供所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体在制备用于检测人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化的制剂中的应用。

本发明还提供所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体在制备用于肿瘤的诊断、疗效判断或预后判定的产品中的应用。

本发明还提供一种用于肿瘤的诊断、疗效判断或预后判定的试剂盒，所述试剂盒包括所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽或所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽，并采用该抗原肽制备针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体。本发明的针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究人NBS1蛋白的乳酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点；本发明的针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体可以检测人NBS1蛋白的乳酸化水平，探究其与肿瘤诊断、放化疗耐药的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为NBS1蛋白结构图。

图2为本发明实施例制备与纯化人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗体的技术路线图。

图3为乳酸化修饰质谱检测NBS1蛋白乳酸化情况。

图4为采用斑点印迹实验鉴定NBS1-K388la抗体的结果图。

图5为免疫组化实验鉴定抗体特异性的结果图。

图6为人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗体的预后分析结果，其中A为收集94例胃癌患者的肿瘤组织，进行免疫组化染色的典型的免疫组化图；B为人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗体的生存预后结果。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

参见图1、图2，本发明根据人NBS1蛋白结构分区图，提供的针对人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗体的制备方法与应用，包括以下步骤：

(1)人NBS1蛋白K388位点特异性乳酸化抗体的制备；

(2)人NBS1蛋白K388位点特异性乳酸化抗体的纯化；

(3)人NBS1蛋白K388位点特异性乳酸化抗体的鉴定及保存。

以下结合具体实施例参照附图，对本发明提供的针对人NBS1蛋白K388位点特异性乳酸化抗体的制备技术路线，进一步进行阐述和说明。

实施例1人NBS1蛋白乳酸化位点的确定

具体方法如下：

(1)首先通过生物信息软件NetPhorest 2.0和NetPhos 2.0筛选人NBS1蛋白中可能发生乳酸化的位点，随后通过质谱确证K388是人NBS1氨基酸序列中的一个乳酸化位点(图3)。

(2)设计人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗原肽。以人NBS1蛋白K388位点为中心，N端毗邻四个NBS1氨基酸序列，C端连接五个NBS1氨基酸序列，设计的合成肽(抗原肽)序列，在氨基酸K388上添加乳酸化基团，肽段序列为：KEIKVS-(lactyl)K-MEQKFR。

实施例2合成含K388乳酸化位点的抗原肽和动物免疫具体方法如下：

(1)根据半抗原合成肽的设计，分别在K388位点上添加一个乳酸化基团得到乳酸化合成肽(抗原肽)，并与血蓝蛋白(KLH)偶联得到全抗原用于家兔免疫(K388la-KLH)。将乳酸化合成肽(抗原肽)通过戊二醛法与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和纯化层析柱的填料(K388la-BSA)。与之相对应，合成一段K388对应的非乳酸化合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和分离层析柱的填料(K388-BSA)。合成肽都经Mass Spectral的检测，结果如图5所示。

(2)制备阴性血清：从用于注射的新西兰大白兔(2-3kg，雌性，健壮，购于中国科学院斯莱克实验动物中心)的耳静脉采取3mL血液于采血管中，用棉球压迫止血。将血液置室温1h左右，待血液凝固形成血块，4℃下放置2h使血清析出，2500g离心10min，吸取上清，标记为阴性对照血清，分装并贮存于-20℃待测。

(3)动物免疫：

a.用无菌的1×PBS分别溶解K388la-KLH合成肽粉末，用一个无菌注射器吸取抗原溶液，另一个注射器吸取等量弗氏完全佐剂(CFA)，二者之间以塑料管连接，来回反复抽吸，将K388la-KLH肽段分别与CFA混匀，直至形成完全乳化的乳状液，滴于水中不扩散；

b.首次免疫分别双肩皮下两点和双后腿肌肉两点多部位多点注射抗原乳状液。两种抗原的首次免疫总量约为0.61mg；

c.首次免疫21、35、54天后进行第一、二、三次加强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)代替CFA作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.9mg；

d.在首次免疫45、50、64、69天后进行采血，大量收集血清。将收集了血液的烧杯封闭后室温静置过夜，使血块收缩。次日无菌操作将析出的血清分装于50mL离心管中，4000g离心10min，取上清，分装1mL/管，标记为免疫后抗血清，贮存于-20℃。

实施例3人NBS1蛋白K388位点特异性乳酸化抗体的筛选和纯化

(1)免疫后抗血清的效价测定和筛选，具体步骤如下：

a.用抗原包被液(CBS)分别将乳酸化抗原K388la-BSA和非乳酸化抗原K388-BSA包被，加入至96孔酶标板中，每孔0.1mL，封盖滴定板后振荡混匀，4℃过夜包被(12h以上)；

b.包被完毕，弃去孔中的液体，1×PBST充分洗涤滴定板的各包被孔，弃去洗涤液，重复3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。各包被孔内加入封闭缓冲液(0.25％BSA/PBST)，200μL/孔，37℃孵育2h，1×PBST洗涤滴定板3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体；

c.用1×PBST将免疫后抗血清按1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:243000、1:729000的比例稀释，以1×PBS缓冲液作为空白对照，分别加入至96孔酶标板，盖封滴定板，37℃孵育1h；

d.弃去孔中液体，用1×PBST洗涤滴定板3次。加入用1×PBST按1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗稀释液，100μL/孔，37℃孵育1h。盖封滴定板，37℃孵育1h。用1×PBST洗涤滴定板5次，扣干。加入临时配制的TMB显色液，100μL/孔，室温避光反应30min。加入2MH2SO4终止反应，50μL/孔。酶标仪450nm测各孔OD值；

e.免疫K388抗原后抗血清稀释度为1:1000、1:3000、1:9000的免疫后抗血清ELISA检测值均在1.0以上，筛选血清(OD450>1.0)达到1:10,000视为达标可以进行后续的纯化，筛选结果如下表1所示。

表1免疫K388抗原后抗血清ELISA检测的OD值

原血清稀释度	K388-BSA	K388la-BSA
			1:1000	2.689	2.698
1:3000	2.235	2.242
			1:9000	1.523	1.862
1:27000	0.529	0.758
			1:81000	0.136	0.192
1:243000	0.025	0.036
			1:729000	0.012	0.015
BLANK	0.002	0.009

(2)乳酸化合成肽层析柱与非乳酸化合成肽层析柱的制备，合成肽偶联层析柱是使用Thermo scientific Coupling Resin试剂盒制备，具体步骤如下：

a.用偶联缓冲液分别溶解K388-BSA、K388la-BSA，溶解浓度均为0.7mg/mL。分别取7mg K388-BSA、6mg K388la-BSA溶解液加入至5mL树脂，混匀后分别加入至层析柱室温混匀15分钟，将层析柱室温正置30分钟，分别取下层析柱上下两端的帽子，收集流出的液体，并用3倍体积树脂的偶联缓冲液冲洗柱子；

b.盖上层析柱底端盖子，向偶联缓冲液中加入50mM L-Cysteine·HCl，混匀后取等体积的缓冲液于层析柱，室温混匀15分钟后，静置30分钟；

c.取下底端盖子，释放偶联缓冲液，用6倍体积的洗涕液(1M NaCl)清洗层析柱，再用2倍体积储存缓冲液冲洗层析柱，盖上盖子，加入1倍体积的储存缓冲液，4度保存备用。

(3)乳酸化抗体的纯化，抗体纯化是使用Thermo scientific Coupling Resin试剂盒制备，具体步骤如下：

a.取下层析柱底端盖子，释放储存缓冲液，加入6mL的结合缓冲液洗涕层析柱。将K388抗血清加入至对应的非乳酸化层析柱子，收集流出液，重复两次，得到K388流出液，然后用12mL洗涕液清洗层析柱，保留底端留出的洗脱液，最后用洗脱液洗脱层析柱得到对应的非乳酸化抗体；

b.将a中收集的流出液加入至对应的冲洗后的乳酸化柱子，之后用12mL洗涤液清洗层析柱，最后用洗脱液洗脱层析柱得到对应的K388乳酸化抗体，抗体溶于1×PBS，加入0.1％NaN3备用。

实施例4人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗体的放化疗敏感性的应用检定

(1)使用斑点印迹实验(dot blot)试剂盒(货号：IEMed-K236)检测纯化后抗体的乳酸肽特异性：利用合成的无乳酸化化的NBS1多肽(对照肽)和NBS1第388位氨基酸有乳酸化修饰的多肽(修饰肽)，将它们(修饰肽和对照肽)作为抗原以1、4、16、64ng/点滴分别滴于醋酸纤维素膜上并风干，然后用浓度梯度稀释的多克隆抗体与之反应进行斑点印迹实验。

结果如图4所示，NBS1第388位氨基酸有乳酸化的多克隆抗体可识别NBS1第388位氨基酸有乳酸化的多肽序列，但不识别无乳酸化的NBS1多肽序列，且抗体效价>1:100000。

(2)免疫组化学鉴定抗体特异性

通过免疫组化实验鉴定抗体的特异性，鉴定该抗体能否用于免疫组化实验，收集胃癌肿瘤组织免疫组化切片两份，一份加入乳酸化修饰肽段NBS1肽段处理，另一份不加入乳酸化修饰肽段NBS1肽段处理，然后进行免疫组化实验，具体实验步骤如下：

组织固定：脱蜡之前，将切片置入恒温箱中60℃烘烤60min。

脱蜡：用二甲苯浸泡切片15min，更换新的二甲苯再浸泡15min。

水化：用无水乙醇浸泡5min，更换新的无水乙醇再浸泡5min，95％乙醇浸泡5min，85％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min。

洗涤：dd H2O浸泡5min，洗涤3次。

抗原修复(微波辐射法)：0.3％H2O2甲醇处理10min，自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗，切片放入pH 6.0柠檬酸盐缓冲液的专用修复盒内加热至沸腾，10min。待修复液降至室温后，PBS洗涤3次。

洗涤：dd H2O浸泡5min，洗涤2次，PBST浸泡5min，洗涤2次。

灭活酶：20ml灭活酶试剂浸泡切片，避光，室温作用15min。

洗涤：PBST浸泡5min，洗涤3次。

封闭：加入适量封闭液，湿盒中室温作用60min。

一抗反应：中性树胶画圈围成槽，每个组织中加入稀释好的一抗NBS1K388la，4℃湿盒中过夜孵育。

复温：4℃中取出后，室温孵育60min。

洗涤：PBST轻柔冲洗后浸泡5min，浸洗4次。

酶标二抗反应：每个组织中加入稀释好的HRP标记二抗，室温孵育60min。洗涤：PBST轻柔冲洗后浸泡5min，浸洗4次。

显色DAB法：配置DAB显色液，避光反应10-15min，滴加到切片上，显色1-5min。

终止显色：蒸馏水终止显色反应。

复染：每个组织中滴加适量苏木素染液，染色5-10min，蒸馏水冲洗干净。

脱色反蓝：将切片置入1％盐酸-乙醇中脱色2-3秒后迅速取出，放入蒸馏水中终止，再放入PBST中反蓝5-10min。

封片：分别在75％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；无水乙醇中浸泡5min。用二甲苯浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡15min，加盖玻片封片。

结果如图5所示，NBS1 K388la抗体的特异性良好，可以用于免疫组化。

实施例5人NBS1蛋白K388位点乳酸化抗体的预后分析具体方法如下：

(1)利用实施例4中的免疫组化方法对胃癌患者肿瘤切片进行染色，对切片进行评分。评分方法如下：染色强度的分数被定为：阴性0分；弱1分；中等2分；强阳性3分。阳性细胞的频率被定义为：少于5％，0分：5％-25％，1分：26％-50％，2分：51％-75％，3分:大于75％，4分。染色强度的分数与阳性细胞的频率得分相乘为最后免疫组化得分。

(2)根据免疫组化评分分为高低表达两组，结合患者的预后信息进行预后分析：收集了94例胃癌患者肿瘤组织，利用NBS1 K388la抗体进行免疫组化染色，并且进行患者预后分析，结果如图6所示，NBS1蛋白乳酸化修饰的表达量越高，肿瘤患者的预后越差。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽，其特征在于，所述抗原肽的活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的赖氨酸被乳酸化修饰。

2.一种针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体，其特征在于，所述抗体是以权利要求1所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽为免疫原免疫动物制备得到。

3.权利要求2所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述的抗原肽的N末端与载体蛋白进行偶联，得抗原；

S2.采用S1的抗原免疫动物，并收集抗血清；

S3.对抗血清进行筛选和纯化，得所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的免疫采用双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原；免疫次数为4次，包括第1、21、35和54天；从第3次免疫后进行4次取血，分别是第一次免疫后第45、50、64、69天。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的筛选和纯化具体为将收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对权利要求1所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽的效价，并采用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化。

6.权利要求1所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽在制备用于检测人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化的制剂中的应用。

7.权利要求2所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体在制备用于检测人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化的制剂中的应用。

8.权利要求2所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体在制备用于肿瘤的诊断、疗效判断或预后判定的产品中的应用。

9.一种用于肿瘤的诊断、疗效判断或预后判定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原肽或权利要求2所述针对人NBS1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗体。