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CN118091137B - 一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物及其应用 - Google Patents

一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物及其应用 Download PDF

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CN118091137B CN202311716423.9A CN202311716423A CN118091137B CN 118091137 B CN118091137 B CN 118091137B CN 202311716423 A CN202311716423 A CN 202311716423A CN 118091137 B CN118091137 B CN 118091137B
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Abstract

本申请涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物及其应用；所述抗体组合物包括抗CD5抗体、抗CD19抗体、抗CD45抗体、抗CD4抗体、抗kappa抗体、抗CD56抗体、抗Lambda抗体、抗7‑AAD抗体、抗CD7抗体、抗CD3抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗CD20抗体和抗CD8抗体；该抗体组合物可以一管法筛查B、T、NK及浆细胞肿瘤，应用于量少的组织样本初筛，一管初筛可以节省样本，而留一管样本进行加做，同时加入抗7‑AAD抗体，可排除组织样本中坏死细胞干扰，从而提高诊断的敏感性和特异性。

Description

一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物及其 应用
技术领域
本申请涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物及其应用。
背景技术
随着计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)等诊断成像工具的日益普及和进步，纵隔和腹部淋巴瘤的检出率也呈上升趋势。而明确的组织病理结果对于诊断的准确和分期至关重要，同时也对以药物治疗为主的治疗方式至关重要。与位于头部的浅表淋巴结相比，颈部和腋窝区域肿大的深层淋巴结通常无法采用穿刺活检的方式对目标病灶组织进行检查，因此一般采用开放探查或者使用胸腔镜结合腹腔镜的方法，虽然这些方法可以为全面的病理检查提供大量的活检组织样本，但由于它们具有高度侵入性，会增加经济成本。
目前内镜超声引导下的细针穿刺(EUS-FNA)或内镜超声引导下的细针活组织切片(FNB)具有安全、敏感和经济的特点，已成为一种被广泛应用的诊断胸腹深部淋巴瘤的有效工具，且正迅速成为在纵隔、上消化道、胰腺和肝脏采集肿块时的首选诊断方法，并有可能取代上述侵入性方法。然而EUS-FNA的准确率在50.0％～99.4％之间，并且该准确率还取决于淋巴结的位置。在医学领域中，流式细胞术(FCM)结合单克隆免疫荧光抗体的组合技术已成为一种可定量检测细胞表面、细胞内抗原和膜受体的技术，与免疫组化(IHC)相比FCM具有检测速度快、灵敏度高、样品分析成本低等优点，因此在常规组织学评估不确定的情况下，FCM可以提供独特的诊断见解。目前有研究表明FCM联合EUS-FNA具有更高的灵敏度和准确性，由于FCM检测速度快，可以适用于危重患者的快速诊断，并且对于细胞数量少或多种肿瘤细胞并存的组织样本，FCM能够对肿瘤细胞独立圈门进行分析，具有高灵敏性、高特异性等特点，并且能显著提高穿刺活检诊断的敏感性和特异性，同时该技术尤其适用于临床上无法获取手术切除组织样本时并仅能获得少量活检样本的患者，或反复多次取材均不能明确诊断的患者，特别是淋巴瘤、浆细胞肿瘤、髓系肿瘤等血液肿瘤的病变经常发生于髓外组织的病患。因此FCM已成为诊断淋巴增殖性疾病的基本辅助工具，也是血液肿瘤诊断、分类、疗效监测、预后评价的重要检测手段之一。
目前利用FCM对9大类白血病/淋巴瘤进行全面而精准的诊断，共需要近90种抗体(髓系相关标志约23种，B系和浆细胞相关标志约30种，T系相关标志约22种，NK相关标志约14种)，考虑组织样本FCM检测涉及的主要疾病范围及组织样本经常出现标本量少的特殊性，为了尽可能地合理利用样本并实现对不同疾病的精确诊断，在现阶段的临床检验中多采用两步法，即第一步采用相对少的抗体对待测样本进行B-NHL、T-NHL、NK-NHL、浆细胞疾病进行初步筛查，并根据第一步分类的结果选取相应的抗体进行第二步检测，第二步主要针对疾病亚型分型、微量残留病监测及预后相关和治疗靶点以及基因异常相关标志的筛查。通过两步检测以达到应用相对少的抗体即可以对每一种类型白血病、淋巴瘤进行准确及全面的诊断。然而穿刺物或内窥镜活检样本经常会面临细胞不够的问题，因此当组织样本送检类型是淋巴瘤筛查时，在细胞量极少的情况下需优先筛查B、T、NK、浆细胞来源的肿瘤，但是常规流式筛查时是采用T和NK及B细胞各一管分开筛查的方式进行，因此至少需要2管的细胞量进行检测，操作复杂；同时与常规骨髓和外周血相比组织样本容易出现大量的坏死组织及碎片，会干扰结果的分析。
发明内容
本申请提供了一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物及其应用，以解决现有技术中常规流式筛查需要至少需要2管的细胞量进行检测且坏死组织及碎片会干扰结果分析的技术问题。
第一方面，本申请提供了一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，所所述抗体组合物包括抗CD5抗体、抗CD19抗体、抗CD45抗体、抗CD4抗体、抗kappa抗体、抗CD56抗体、抗Lambda抗体、抗7-AAD抗体、抗CD7抗体、抗CD3抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗CD20抗体和抗CD8抗体。
可选的，所述抗CD5抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD19抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD45抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗kappa抗体和所述抗体组合物的体积比为0.02～0.03；和/或，
所述抗CD4抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；和/或，
所述抗Lambda抗体和所述抗体组合物的体积比为0.02～0.03；和/或，
所述抗CD56抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；和/或，
所述抗7-AAD抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；和/或，
所述抗CD7抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD3抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗CD138抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗CD38抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗CD8抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD20抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06。
可选的，所述抗体组合物为荧光标记抗体组合物，所述荧光标记所用荧光素包括以下至少一种：
BV605、BV421、V500-C、FITC、PE、PerCP-cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-R700和APC-Cy7中的至少一种。
可选的，所述抗CD5抗体的荧光素为BV605；和/或，
所述抗CD19抗体的荧光素为BV421；和/或，
所述抗CD45抗体的荧光素为V500-C；和/或，
所述抗kappa抗体的荧光素为FITC；和/或，
所述抗CD4抗体的荧光素为FITC；和/或，
所述抗Lambda抗体的荧光素为PE；和/或，
所述抗CD56抗体的荧光素为PE；和/或，
所述抗7-AAD抗体的荧光素为PerCP-cy5.5；和/或，
所述抗CD7抗体的荧光素为PE-Cy7；和/或，
所述抗CD3抗体的荧光素为APC；和/或，
所述抗CD138抗体的荧光素为APC；和/或，
所述抗CD38抗体的荧光素为APC-R700；和/或，
所述抗CD8抗体的荧光素为APC-Cy7；和/或，
所述抗CD20抗体的荧光素为APC-Cy7。
可选的，所述抗Kappa抗体为多克隆抗体。
可选的，所述抗Lambda抗体为多克隆抗体。
第二方面，本申请提供了一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，将第一方面所述的抗体组合物用于筛查微量细胞样本的筛查试剂中。
可选的，所述筛查的步骤为：
在单个试样容器中向微量细胞样本中加入所述抗体组合物，后进行第一孵育，得到孵育样本；
混合所述孵育样本和溶血素，并进行第二孵育，后进行离心和PBS洗涤，得到重悬细胞液；
对所述重悬细胞液进行流式细胞检测，以完成筛查。
可选的，所述第一孵育的时间为10mnin～20min。
可选的，所述第二孵育的时间≥5min。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，通过将14种抗体组合使用，相比传统的2管法抗体组合物，利用鸡尾酒组合的原理搭配不同的抗体组合，以单个试样容器中微量细胞样本的数量为前提，仅仅加入14个抗体就能在一个试样容器中完成对微量细胞样本的准确筛查，避免现有技术中采用至少2管法导致的多管细胞数量太小而降低灵敏度，同时引入的抗7-AAD抗体可以有效的排除组织样本中坏死细胞，避免坏死组织及碎片干扰分析结果，有助于提高筛查的准确率，以及大大节省样本，一管法筛查T细胞、B细胞、NK细胞及浆细胞有无免疫表型异常，应用简单经济，可广泛用于淋巴结、穿刺物、皮肤组织等微量样本的筛查。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物在筛查正常淋巴结组织推荐的逻辑圈门方法示意图；
图2为本申请实施例提供的筛查步骤的流程示意图；
图3为本申请实施例提供的髓外多发性骨髓瘤(MM)初筛示例结果示意图；
图4为本申请实施例提供的非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL，DLBCL)初筛示例结果示意图；
图5为本申请实施例提供的B淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(B-LBL/ALL)初筛示例结果示意图；
图6为本申请实施例提供的非霍奇金T细胞淋巴瘤(T-NHL，AITL)初筛示例结果示意图；
图7为本申请实施例提供的T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)初筛示例结果示意图；
图8为本申请实施例提供的NK细胞淋巴瘤初筛示例结果示意图；
图9为本申请实施例提供的神经母细胞瘤初筛示例结果示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请的创造性思维为：
目前有一套8色EuroFlow抗体组合，采用二步法对急性、慢性白血病和淋巴瘤进行免疫分型，其方案包括LST(淋巴瘤筛查管)共12个抗体；PCD(浆细胞克隆性疾病)检测管，共16个抗体，通过筛查管，可以对B-NHL、T-NHL、NK-NHL、PCN进行初筛查。中华病理学杂志(vol46:217-222)发表了“流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识”，可以采用2管抗体组合用于B-NHL、T、NK及浆细胞肿瘤的筛查。现有技术的抗体组合达不到单管即可全面、准确地筛查微量组织样本血液肿瘤的目的。
而且目前流式检测组织样本还未形成常规项目，大部分检测中心主要使用2管抗体组合物进行初筛，对于细胞量极少的样本，若分成2管进行初筛，每管的细胞数明显减少，这降低了检测的灵敏度；如果初筛2管将细胞用完，无法进行下一步的加做；另外组织样本中经常会有大量坏死及结缔组织干扰结果的分析，均影响诊断的准确性；因此目前对于微量组织样本需要设计一种全面、精确、经济且高效的血液肿瘤初筛的抗体组合，解决临床的实际困难，为患者造福。
如图1所示，本申请实施例提供一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，所述抗体组合物包括抗CD5抗体、抗CD19抗体、抗CD45抗体、抗CD4抗体、抗kappa抗体、抗CD56抗体、抗Lambda抗体、抗7-AAD抗体、抗CD7抗体、抗CD3抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗CD20抗体和抗CD8抗体。
需要说明的是，该抗体组合物可以形成包括CD5抗体、抗CD19抗体、抗CD45抗体和、抗CD4抗体、抗kappa抗体、抗CD56抗体、抗Lambda抗体、抗7-AAD抗体、抗CD7抗体、抗CD3抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗CD20抗体和抗CD8抗体共计14种抗体，这14种抗体可以分别与B、T、NK及浆细胞特异性结合，可以在一个试样容器中完成对微量细胞样本的准确筛查，同时抗7-AAD抗体还能有效的排除组织样本中坏死细胞，避免坏死组织及碎片干扰分析结果，有助于提高筛查的准确率。
在一些可选的实施方式中，所述抗CD5抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD19抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD45抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗kappa抗体和所述抗体组合物的体积比为0.02～0.03；和/或，
所述抗CD4抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；和/或，
所述抗Lambda抗体和所述抗体组合物的体积比为0.02～0.03；和/或，
所述抗CD56抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；和/或，
所述抗7-AAD抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；和/或，
所述抗CD7抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD3抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗CD138抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗CD38抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；和/或，
所述抗CD8抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；和/或，
所述抗CD20抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06。
本申请实施例中，限定14种抗体的具体体积比，可以明确14种抗体的具体加入量，从而可以在一个试样容器中完成对微量细胞样本的准确筛查。
在一些可选的实施方式中，所述抗体组合物为荧光标记抗体组合物，所述荧光标记所用荧光基团包括以下至少一种：
BV605、BV421、V500-C、FITC、PE、PerCP-cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-R700和APC-Cy7中的至少一种。
在一些可选的实施方式中，所述抗CD5抗体的荧光素为BV605；和/或，
所述抗CD19抗体的荧光素为BV421；和/或，
所述抗CD45抗体的荧光素为V500-C；和/或，
所述抗kappa抗体的荧光素为FITC；和/或，
所述抗CD4抗体的荧光素为FITC；和/或，
所述抗Lambda抗体的荧光素为PE；和/或，
所述抗CD56抗体的荧光素为PE；和/或，
所述抗7-AAD抗体的荧光素为PerCP-cy5.5；和/或，
所述抗CD7抗体的荧光素为PE-Cy7；和/或，
所述抗CD3抗体的荧光素为APC；和/或，
所述抗CD138抗体的荧光素为APC；和/或，
所述抗CD38抗体的荧光素为APC-R700；和/或，
所述抗CD8抗体的荧光素为APC-Cy7；和/或，
所述抗CD20抗体的荧光素为APC-Cy7。
本申请实施例中，限定荧光标记所用的具体荧光基团，可以通过这10种荧光基团充分标记这14种抗体，从而可以在一个试样容器中经过10色通道就可以完成对微量细胞样本的准确筛查。
在一些可选的实施方式中，所述抗Kappa抗体为多克隆抗体。
在一些可选的实施方式中，所述抗Lambda抗体为多克隆抗体。
基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，将所述抗体组合物用于筛查微量细胞样本的筛查试剂中。
该应用是基于上述抗体组合物来实现，该抗体组合物的具体组成可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
需要说明的是，该微量细胞样本包括B、T、NK及浆细胞肿瘤样本。
如图2所示，在一些可选的实施方式中，所述筛查的步骤为：
S1.在单个试样容器中向微量细胞样本中加入所述抗体组合物，后进行第一孵育，得到孵育样本；
S2.混合所述孵育样本和溶血素，并进行第二孵育，后进行离心和PBS洗涤，得到重悬细胞液；
S3.对所述重悬细胞液进行流式细胞检测，以完成筛查。
本申请实施例中，限定筛查的具体步骤，基于本申请设计的抗体组合物，可以通过第一孵育的方式使得抗体组合物与微量细胞样本混合反应充分，最后加入溶血素进行后续的第二孵育，从而可以在一个试样容器中完成对微量细胞样本的准确筛查。
在一些可选的实施方式中，所述第一孵育的时间为10mnin～20min。
在一些可选的实施方式中，所述第二孵育的时间≥5min。
本申请实施例中，限定第一孵育的具体时间，可以使得抗体组合物与微量细胞样本混合反应充分，提高后续筛查的准确性。
限定第二孵育的具体时间，可以使得抗体组合物与微量细胞样本混合后的孵育样本中细胞被溶解完全，从而可以方便后续得到特异性的抗体组合物和微量细胞样本中抗原的结合物，提高检测的准确性。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
1.实验材料：
(1)用于组织样本的血液肿瘤初筛，尤其是细胞量少的组织样本。
(2)用于发热、全身淋巴结肿大、肝脾肿大，局部组织占位性病变，临床高度怀疑淋巴瘤的患者送检的组织样本。
2.标本类型：
淋巴结、穿刺物、皮肤组织、各种内镜活检样本等。
3.仪器与试剂：
(1)仪器：BD Canto II
(2)抗体组合物包括以下抗体：抗CD5抗体、抗CD19抗体、抗CD45抗体、抗kappa抗体、抗CD4抗体、抗Lambda抗体、抗CD56抗体、抗7-AAD抗体、抗CD7抗体、抗CD3抗体、抗CD138抗体、抗CD8抗体、抗CD20抗体，抗体组合物中的各抗体均为荧光素标记抗体，具体抗体和荧光标记基团如表1所示。
表1所用抗体组合物、单克隆抗体和荧光标记基团的分布情况表
4.实验方法：
(1)单细胞悬液制备与评估：对于胸腺、脾脏、淋巴结等部位来源的样本，常用手工法制备单细胞悬液，有条件的实验室也可用全自动组织处理器制备。
手工法制备流程：将组织放入培养皿中，生理盐水冲洗后剪碎用组织研磨器轻轻研磨，避免研磨过重导致破碎。用200目筛网过滤去渣，300g速度离心洗涤，再用生理盐水重悬细胞，并对细胞进行计数，调整细胞浓度106个/mL～107个/mL；
对于实体脏器来源的样本如胃肠道、肺脏、肝脏、皮肤等部位来源的样本，由于组织内含有较多的结缔组织，因此研磨前需将脏器剪碎后加入消化酶在振荡器上37℃条件下消化(不同的酶和组织消化时间稍有差异，从15min到6h不等，具体可参考产品说明书)，消化后的组织再用研磨棒直接研磨，后续步骤及注意事项同免疫器官组织的单细胞悬液制备，计数备用。
(2)将待检测样本加入到流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106个/管-1×107个/管；对于细胞量极少，如穿刺组织，加入一半细胞量。每管的样本体积通常不超过150μL；
(3)将步骤(2)所得到的样本，加满NH4CI，吸管吹匀裂解红细胞10min；洗涤标本三次，1300rpm离心5min后去上清；与本发明所述抗体组合物混匀后，室温避光孵育10min～20min；
(4)向步骤(3)孵育后的流式管中加入1×溶血素，室温避光孵5min；
(5)向步骤(4)孵育后的流式管离心去上清(离心力为300g～450g离心5min)；
(6)向步骤(5)流式管中加入PBS缓冲液混匀，离心去上清，用PBS缓冲液重悬细胞(加入量约为500μL)；
(7)对步骤(6)重悬细胞进行流式细胞上机检测，分析结果。上机仪器为美国BD公司Canto II 3激光10色。
5.数据分析：
(1)按照上述实验方法处理好标本，在美国Becton Dickinson公司3激光10色FACSCanto II流式细胞仪上机检测，其中，流式细胞上机检测时按照以下方式设门：
①分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
②在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有无CD45-CD56+异常细胞或CD45-CD19+的异常B细胞或浆细胞；
③浆细胞：用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；分析浆细胞膜轻链Kappa及Lambda(浆细胞多数时候不表达膜轻链，少数病例表达)、CD19、CD45、CD38及CD56表达情况；
④B细胞：在非浆细胞门内通过CD20/CD19圈出B淋巴细胞，观察B细胞的CD5、膜轻链Kappa及Lambda表达情况；
⑤T细胞：在淋巴细胞门内，通过CD3/CD19组合，圈出CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD3-CD19-细胞群；在CD3+T细胞门内观察T细胞CD4、CD8表达情况，计算CD4/CD8比值，同时在有核细胞门内观察T细胞CD4、CD8、CD7、CD5及CD3的表达情况；
⑥T/NK细胞：在CD3-CD19-细胞门内，利用CD56/CD7组合分析NK细胞或异常T细胞CD5的表达；
⑦其它细胞：在CD3-CD19-CD7-门内观察CD4、CD38、CD5的表达情况，判断是否为单核细胞或异常T细胞；
⑧幼稚细胞：首先观察幼稚细胞门的比例，其比例增加时，需特别注意CD7、CD5、CD19、CD10、CD56及CD38等的表达情况，具体设门逻辑如图1所示。
(2)筛查管可能出现的异常结果分析：
1)浆细胞：在全部有核细胞门内，若出现CD38bri+CD138+/-细胞群，观察其在CD45/SSC图中的位置及CD19、CD20、CD56和轻链的表达，可出现以下情况：
①浆细胞表型为CD38+CD138+CD56-/+CD19-CD20-/+CD45-/dim+，细胞SSC较大，可疑为异常浆细胞，可以加做浆细胞其他标记来确定浆细胞单克隆性和异常免疫表型；
②若单克隆性浆细胞同时伴有单克隆性B细胞，且二者轻链表达一致，多考虑伴浆细胞分化的成熟B细胞淋巴瘤，此类型的浆细胞多为CD45+CD38bri+CD19+CD20+/-CD56-；若浆细胞和B细胞轻链克隆性的表达不一致，可能提示为复合肿瘤；
③浆细胞表型为CD45+CD38bri+CD138+CD19+CD20-CD56-，在CD45/SSC图中的位置多位于淋巴细胞及中性粒细胞之间，表型大致正常，则提示为反应性浆细胞增生，但其克隆性需要加做确定。在血管免疫母性T细胞淋巴瘤，不同来源的样本中均可能出现多克隆性的浆细胞增多；新型布尼亚病毒感染、IgG4疾病及结核感染等的患者也可出现多克隆性浆细胞增多。故在初筛管中若发现浆细胞升高，需要紧密结合病史，在细胞数量足够时应加做以鉴别浆细胞的克隆性。
2)B细胞：首先在非浆细胞门内，利用CD19/CD20圈B细胞门，可以同时对CD19+CD20+的成熟B细胞及CD19+CD20-/+的可疑幼稚B细胞进行设门，若出现下列情况，应怀疑B细胞系肿瘤：
①CD19/CD20表达强度的异常(包括增强、减弱、缺失)，或CD19+CD20+成熟B细胞在CD45/SSC图上有明显的分群如CD45表达增强或减弱、前向散射光(FSC)/侧向散射光(SSC)变大或变小；
②B细胞比例较高，多数细胞异常表达CD5，可疑CD5+B细胞系肿瘤；
③成熟B细胞出现细胞膜轻链Kappa或Lambda限制性表达，如Kappa/Lambda比值>3：1或<1：3，或细胞膜轻链不表达；
④若出现CD19+CD20-的B细胞群在CD45/SSC图上位于原始幼稚细胞区域，或CD45呈现阴性至弱阳性异质性表达，可疑为幼稚B细胞；
若出现上述异常，在标本量允许的条件下进行下一步加做。
3)T细胞：需利用不同的组合设门分析，若出现下列异常，应怀疑T细胞系肿瘤：
①淋巴细胞门内T细胞(CD3+CD19-)的比例显著增多；
②T细胞门内CD4+/CD8+比值>10:1或<1:10；或CD4+CD8+或CD4-CD8-的T细胞比例增加；
③在全部有核细胞门内，观察泛T细胞标记(CD3、CD5、CD7)的异常表达(丢失，增强或减弱)，如出现CD3-CD5+、CD5+CD7-、CD3+CD5-异常表型的细胞群；
④在CD3-CD7+门内出现CD5+表型的细胞群；
⑤在CD3-CD7-门内出现CD5+或CD4+(需除外CD4弱阳性的单核细胞)表型的细胞群；
⑥在有核细胞门下，若出现CD5-CD7bri+细胞群，在CD45/SSC图中的位置位于原始幼稚细胞区域或淋巴细胞下方，可疑为幼稚T淋巴细胞；
若出现上述异常，在标本量允许的条件下进行第二步检测。
4)NK细胞：首先在CD3-CD19-细胞门内，利用CD7/CD56组合圈出CD3-CD7+的细胞门，再利用CD5/CD56分析，此时正常NK细胞表型为CD56+CD5-或CD56+CD5p+。若出现CD56+CD5-T淋巴细胞集中表达或不表达CD8，或CD45表达增强，SSC明显增大，均需要进一步加做NK细胞标记；若出现表型为CD7+CD56-CD5-、CD56+CD5+或CD56-CD5+细胞群，需要对照细胞群在CD45/SSC图中的位置及CD4、CD8、CD38的表达情况，区分是NK细胞还是异常T细胞，若为T细胞，则参考T细胞肿瘤分析步骤加做第二步检测。
5)髓系细胞：在非浆细胞门内，若原始幼稚细胞区域出现独立细胞群，表达CD38，CD7dim+或部分表达，不表达B系标记CD19、CD20，可疑为异常髓系细胞(髓系原始幼稚细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞)。根据标本量情况，进一步检测鉴定是否为混合表型及异常髓系原始细胞的具体免疫表型以及有无幼稚单核细胞。
6)非造血细胞：在有核细胞门内，若出现CD45-CD56+细胞群，不表达初筛管中的造血细胞系别标记，则倾向于非造血细胞。可继续加做非造血相关标记，进一步鉴别异常细胞是上皮来源还是神经母细胞来源。
首先选择20例正常淋巴结标本进行测试，所有的正常淋巴结主要由成熟淋巴细胞及少量粒细胞、单核细胞、浆细胞组成，均严格遵循正常比例、发育规律、表达模式。
本实施例除提供正常淋巴结作为示例圈门逻辑外(如图1所示)，另外提供髓外多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL，DLBCL)、B淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(B-LBL/ALL)、非霍奇金T细胞淋巴瘤(T-NHL，AITL)、T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)、NK细胞淋巴瘤及神经母细胞瘤病例各1例作为该抗体组合初筛示例。分别按照图1正常淋巴结标本描述严格设门与观察。
髓外多发性骨髓瘤(MM)初筛示例结果如图3所示，非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL，DLBCL)初筛示例结果如图4所示，B淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(B-LBL/ALL)初筛示例结果如图5所示，非霍奇金T细胞淋巴瘤(T-NHL，AITL)初筛示例结果如图6所示，T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)初筛示例结果如图7所示，NK细胞淋巴瘤初筛示例结果如图8所示，神经母细胞瘤初筛示例结果如图9所示。
具体而言，如图3所示(MM)，分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有CD45-CD56+异常细胞；用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；分析浆细胞膜轻链Kappa及Lambda(浆细胞多数时候不表达膜轻链，少数病例表达)、CD19、CD45、CD38及CD56表达情况；
观察有CD45弱阳CD56阳性异常细胞，SSC与单核细胞或原始细胞类似，细胞大，表达CD38，弱表达CD138dim，不表达CD5、CD4、CD8、CD7、CD19；(此处髓外浆细胞瘤，膜轻链表达较少，如果表达也较弱，表达CD38、CD138，结合CD45、CD56及SSC的表达情况及临床病史，可疑异常浆细胞)，可进一步完善胞浆轻链、CD27、CD28、CD117等(结果如图3所示)。
具体而言，如图4(B-NHL，DLBCL)所示：分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有无CD45-CD56+异常细胞或CD45-CD19+的异常B细胞或浆细胞；用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；分析浆细胞膜轻链Kappa及Lambda(浆细胞多数时候不表达膜轻链，少数病例表达)、CD19、CD45、CD38及CD56表达情况；
在非浆细胞门内通过CD20/CD19圈出B淋巴细胞，观察B细胞的CD5、膜轻链Kappa及Lambda表达情况；经第一步筛查在CD19+细胞群中单克隆表达胞膜轻链Kappa，不表达Lambda，CD45与正常淋巴细胞相似，FSC及SSC均较正常淋巴细胞稍大，可疑B细胞淋巴瘤，需要进一步加做FMC-7、Bcl-2、CD79b、CD10、Ki-67、CD200、CD23等确定淋巴瘤亚型(结果如图4所示)；
具体而言，如图5(B-LBL/ALL)所示：分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有CD45-CD19+的异常B细胞；用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；分析浆细胞膜轻链Kappa及Lambda(浆细胞多数时候不表达膜轻链，少数病例表达)、CD19、CD45、CD38及CD56表达情况；
在非浆细胞门内通过CD20/CD19圈出B淋巴细胞，观察CD45-CD19+的异常B细胞CD5、膜轻链Kappa及Lambda表达情况；
经第一步筛查，CD45/CD19组合找出异常细胞SSC小，CD45阴性，表达CD19，不表达CD20、CD38、CD7、CD4、CD8、CD5、CD3、CD56、CD138，可疑B-LBL或B-ALL，需要进一步完善系别标记，加做幼稚标记CD34、CD10、TdT及其他髓系伴系标记(结果如图5)
具体而言，如图6(T-NHL，AITL)所示：
①分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
②在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有无CD45-CD56+异常细胞或CD45-CD19+的异常B细胞或浆细胞；
③浆细胞：用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；分析浆细胞膜轻链Kappa及Lambda(浆细胞多数时候不表达膜轻链，少数病例表达)、CD19、CD45、CD38及CD56表达情况；
④B细胞：在非浆细胞门内通过CD20/CD19圈出B淋巴细胞，观察B细胞的CD5、膜轻链Kappa及Lambda表达情况；
⑤T细胞：在淋巴细胞门内，通过CD3/CD19组合，圈出CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD3-CD19-细胞群；在CD3+T细胞门内观察T细胞CD4、CD8表达情况，计算CD4/CD8比值，同时在有核细胞门内观察T细胞CD4、CD8、CD7、CD5及CD3的表达情况；
⑥T/NK细胞：在CD3-CD19-细胞门内，利用CD56/CD7组合分析NK细胞或异常T细胞CD5的表达；
经筛查，在CD3-CD19-细胞门内，可见表达CD7、CD4、CD5，不表达CD3、CD56、CD8的异常T淋巴细胞，SSC小，CD45与正常淋巴细胞相似，可疑偏成熟阶段异常T淋巴细胞，表达CD4，需要进一步加做TRBC1、CD279、CD10、CD30、CD26等鉴别血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、间变T细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病或外周T细胞淋巴瘤非特指型等，结合T细胞受体基因重排、二代测序等分子学检查，进一步验证诊断(结果如图6所示)；
具体而言，如图7(T-LBL/ALL，ETP)所示：
①分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
②在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有无CD45-CD56+异常细胞或CD45-CD19+的异常B细胞或浆细胞；
③浆细胞：用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；
经第一步筛查，在CD45/SSC图中原始幼稚细胞区域可见CD45弱阳性可疑幼稚细胞，表型为CD7强阳性，CD45、CD38弱阳性，不表达CD3、CD4、CD5、CD8、CD56、CD19、CD138，需要进一步完善系别标记cCD3、MPO，幼稚细胞标记CD34、TdT、CD1a、CD99及其他髓系伴系标记CD117、CD13、CD33(结果如图7所示)等；
具体而言，如图8(NK淋巴瘤)所示：
①分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
②在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有无CD45-CD56+异常细胞或CD45-CD19+的异常B细胞或浆细胞；
③浆细胞：用CD138/CD38圈出浆细胞和非浆细胞门，在非浆细胞门内根据CD45/SSC分群圈出淋巴细胞，单核细胞、粒细胞及CD45弱阳性或阴性细胞群；
分析浆细胞膜轻链Kappa及Lambda(浆细胞多数时候不表达膜轻链，少数病例表达)、CD19、CD45、CD38及CD56表达情况；
④B细胞：在非浆细胞门内通过CD20/CD19圈出B淋巴细胞，观察B细胞的CD5、膜轻链Kappa及Lambda表达情况；
⑤T细胞：在淋巴细胞门内，通过CD3/CD19组合，圈出CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD3-CD19-细胞群；在CD3+T细胞门内观察T细胞CD4、CD8表达情况，计算CD4/CD8比值，同时在有核细胞门内观察T细胞CD4、CD8、CD7、CD5及CD3的表达情况；
⑥T/NK细胞：在CD3-CD19-细胞门内，利用CD56/CD7组合分析NK细胞或异常T细胞CD5的表达；
经筛查，在CD3-CD19-细胞门内，可见CD56阳性，CD7阴性异常细胞群，CD45强阳性(较正常淋巴细胞强)，FSC及SSC较正常淋巴细胞大，CD45/SSC图上位于正常淋巴细胞右上方，表达CD56bri、CD38bri，部分弱表达CD8，不表达CD7、CD4、CD5、CD3、CD20、CD19、CD138，结合病史，可疑异常NK细胞，需要进一步完善NK细胞标记(结果如图8所示)等；
具体而言，如图9(非造血来源肿瘤，神经母细胞瘤)所示：
①分别利用Time/CD45点图先圈出液流稳定的液稳门，SSC/7-AAD圈出活细胞门，FSC-A/FSC-H去除粘连细胞圈出单个细胞门，FCS-A/SSC-A圈出有核细胞门；
②在有核细胞门内CD45/CD56及CD45/CD19组合，观察有CD45-CD56+异常细胞，占有核细胞97.84％，FSC及SSC较正常淋巴细胞大，不表达初筛管中的造血细胞系别标记，倾向于非造血细胞。结合患者为儿童及其他相关临床病史，加做GD2、CD326、cytokeratin(CK)后证实表达GD2，不表达CD326和CK，为神经肌肉来源肿瘤细胞，神经母细胞瘤可能性大(结果如图9所示)等，故利用该抗体组合，还可以筛查排除非造血系统肿瘤；
综上所述，本申请实施例提供的一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，使用多种流式抗体标志物的组合检测微量组织样本，相比于传统2管法抗体组合物，该抗体组合物采用鸡尾酒组合，10色通道中加入14个抗体，采用一管法筛查B、T、NK及浆细胞肿瘤，以免分管太多每管细胞数太少降低灵敏度；另外可剩一管细胞进一步加做确认，有助于提高诊断的敏感性和准确性。
同时本申请实施例提供的一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，在初筛抗体组合物中还使用了7-AAD抗体，可以有效的排除组织样本中坏死细胞，有助于提高诊断的准确率；同时该抗体组合物尤其适用于筛查细胞量极少的组织样本中，特别是组织穿刺物、皮肤活检组织以及各种内镜活检标本等，有利于提高诊断的精确性。
本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物由抗CD5抗体、抗CD19抗体、抗CD45抗体、抗CD4抗体、抗kappa抗体、抗CD56抗体、抗Lambda抗体、抗7-AAD抗体、抗CD7抗体、抗CD3抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗CD20抗体和抗CD8抗体组成；
所述抗CD5抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；
所述抗CD19抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；
所述抗CD45抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；
所述抗kappa抗体和所述抗体组合物的体积比为0.02～0.03；
所述抗CD4抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；
所述抗Lambda抗体和所述抗体组合物的体积比为0.02～0.03；
所述抗CD56抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；
所述抗7-AAD抗体和所述抗体组合物的体积比为0.12～0.13；
所述抗CD7抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；
所述抗CD3抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；
所述抗CD138抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；
所述抗CD38抗体和所述抗体组合物的体积比为0.07～0.08；
所述抗CD8抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；
所述抗CD20抗体和所述抗体组合物的体积比为0.05～0.06；
所述微量组织样本为细胞量为1×106个/管，每管的样本体积不超过150μL的样本。
2.根据权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物为荧光标记抗体组合物，所述荧光标记所用荧光素包括以下至少一种：
BV605、BV421、V500-C、FITC、PE、PerCP-cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-R700和APC-Cy7中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的抗体组合物，其特征在于，所述抗CD5抗体的荧光素为BV605；和/或，
所述抗CD19抗体的荧光素为BV421；和/或，
所述抗CD45抗体的荧光素为V500-C；和/或，
所述抗kappa抗体的荧光素为FITC；和/或，
所述抗CD4抗体的荧光素为FITC；和/或，
所述抗Lambda抗体的荧光素为PE；和/或，
所述抗CD56抗体的荧光素为PE；和/或，
所述抗7-AAD抗体的荧光素为PerCP-cy5.5；和/或，
所述抗CD7抗体的荧光素为PE-Cy7；和/或，
所述抗CD3抗体的荧光素为APC；和/或，
所述抗CD138抗体的荧光素为APC；和/或，
所述抗CD38抗体的荧光素为APC-R700；和/或，
所述抗CD8抗体的荧光素为APC-Cy7；和/或，
所述抗CD20抗体的荧光素为APC-Cy7。
4.根据权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于，所述抗Kappa抗体为多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于，所述抗Lambda抗体为多克隆抗体。
6.一组用于检测微量组织样本筛查血液肿瘤的抗体组合物，其特征在于，将如权利要求1-5任一项所述的抗体组合物用于筛查微量细胞样本的筛查试剂中。
7.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于，所述筛查的步骤为：
在单个试样容器中向微量细胞样本中加入所述抗体组合物，后进行第一孵育，得到孵育样本；
混合所述孵育样本和溶血素，并进行第二孵育，后进行离心和PBS洗涤，得到重悬细胞液；
对所述重悬细胞液进行流式细胞检测，以完成筛查。
8.根据权利要求7所述的抗体组合物，其特征在于，所述第一孵育的时间为10mnin～20min。
9.根据权利要求7所述的抗体组合物，其特征在于，所述第二孵育的时间≥5min。
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