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CN118068017A - 鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法及应用 - Google Patents

鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法及应用 Download PDF

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CN118068017A
CN118068017A CN202410467308.0A CN202410467308A CN118068017A CN 118068017 A CN118068017 A CN 118068017A CN 202410467308 A CN202410467308 A CN 202410467308A CN 118068017 A CN118068017 A CN 118068017A
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lysate
antigen
antigenic
dendritic cells
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宫雅楠
翟康乐
张建中
孙路
何利华
肖迪
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Original Assignee
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种系统鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法及应用。本发明提供的方法包括：制备幽门螺杆菌裂解液；使用树突状细胞摄取所述幽门螺杆菌裂解液中的抗原肽，形成MHC‑II抗原肽复合物；裂解提呈抗原的树突状细胞，从树突状细胞裂解液中捕获所述MHC‑II抗原肽复合物；通过质谱法鉴定幽门螺杆菌抗原肽。本发明提供的方法能极大地增加进入DC的病原体蛋白含量，使其被提呈的概率增高，同时消除了吞噬完整病原体对DC抗原提呈功能的影响。由本发明方法筛选出的抗原表位具有更高的可靠性，覆盖度更高，可筛选出优势抗原的优势表位，为H.pylori疫苗研发提供重要的抗原表位选择，具有重要的应用前景。

Description

鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法及应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法及应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)可在胃黏膜表面定植，引起严重的胃肠道疾病，包括慢性和萎缩性胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤和胃癌。全世界90%的非贲门胃癌是由H. pylori感染引起的。目前根除H. pylori 感染的一线治疗方案是基于PPI和抗生素的四联疗法，但随着H. pylori 对常用抗生素的耐药性不断增强，根除率已经下降到80%以下。针对H. pylori感染带来的严重疾病负担以及耐药现状，目前认为发展和应用H. pylori疫苗是预防和治疗感染最有效的措施。
抗原及表位的选择是疫苗研发中最关键的环节，抗原表位筛选常用方法包括免疫印迹联合质谱法、蛋白质芯片联合免疫荧光法、免疫组库测序联合噬菌体展示随机多肽库法、免疫亲和联合质谱法以及生物信息学预测法。其中免疫亲和联合质谱法具有高分辨率、高灵敏度和高通量的优势，在肿瘤抗原发现和病原体的抗原表位筛选等领域具有重要的应用。
人树突状细胞（DC）是目前抗原提呈功能最强的细胞，病原体蛋白通过DC以MHC-II抗原肽复合物形式提呈至DC表面，构成了病原体的抗原提呈肽谱，特异激活不同初始T细胞，形成了该病原体感染后的T细胞群，决定了后续免疫应答的方向。因此，对病原体DC抗原提呈肽谱的鉴定和分析，能为理解病原感染后的免疫反应提供重要线索，也是疫苗研发中抗原表位筛选的重要方法。
针对H. pylori，基于单一抗原的疫苗很难覆盖H. pylori高度的菌株差异，同时还存在单一抗原所诱发的保护性免疫应答强度不足等问题，而联合使用多个抗原或表位成为新的方向，因此有必要筛选出更多具有高菌株覆盖度且能诱发保护性免疫应答的抗原和表位。此外，在H. pylori中已经报道多种免疫优势抗原，包括应用在疫苗研发领域的分子伴侣GroEL、尿素酶、过氧化氢酶等，从这些优势抗原中筛选出可以诱发保护性免疫应答的优势表位至关重要。
目前在H. pylori中，大多数筛选抗原表位的研究是基于表位共用基序的预测方法，主要通过生物信息学方法预测可能的表位，然后测试每个表位所引起的免疫应答情况。但基于生物信息学方法预测的表位数量通常超出实验室测试的能力，只有少数肽段能被实验验证。使用免疫亲和联合质谱法所鉴定出的肽段，免疫应答的阳性验证率更高。但该方法具有一定难度，且目前通过人树突状细胞进行抗原提呈来筛选抗原表位在H. pylori中还未见报道，因此基于免疫亲和联合质谱法在鉴定抗原肽方面的明显优势，有必要建立一种新的鉴定H. pylori抗原肽的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明通过对人树突状细胞提呈的H. pylori抗原肽谱的鉴定和分析，提出一种鉴定H. pylori抗原肽的方法，以此筛选出的抗原表位具有更高的可靠性，覆盖度更高，可筛选出优势抗原的优势表位，为H. pylori疫苗研发提供重要的抗原表位选择，具有重要的应用前景。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法，包括如下步骤：制备幽门螺杆菌裂解液；使用树突状细胞摄取所述幽门螺杆菌裂解液中的抗原肽，形成MHC-II抗原肽复合物；裂解提呈抗原的树突状细胞，从树突状细胞裂解液中捕获所述MHC-II抗原肽复合物；通过质谱法鉴定幽门螺杆菌抗原肽。
免疫亲和联合质谱法鉴定抗原肽的最大难点在于抗原肽本身含量极低，在脱盐等实验操作中还会有不可避免的丢失，导致最终可在质谱仪上检测的抗原肽含量低于质谱仪的检出限。本发明中为克服现有技术中存在上述缺陷，提供一种H. pylori抗原肽的鉴定方法，通过人树突状细胞在摄取H. pylori蛋白后自然加工和呈递，再采用免疫亲和联合质谱法鉴定出的肽段，相比于生物信息学预测的结果，具有更高的可靠性。
优选地，所述幽门螺杆菌裂解液通过反复冻融结合超声的方法获得；
进一步优选地，所述反复冻融采用37℃水浴融解和液氮冷冻；37℃水浴融解的时间为10-20min；液氮冷冻的时间为1-3min；所述反复冻融的重复次数为5-10次；
进一步优选地，所述超声的功率为150-300W；所述超声的工作程序为：工作4-6s，间隔4-6s，总持续时长为1-2h。
优选地，所述树突状细胞由人外周血单核细胞经诱导分化得到。
优选地，所述诱导分化使用的培养基为Dc-M完全培养基。
进一步优选地，所述诱导分化使用的培养基中包含20-60ng/ml的rhGM-CSF和10-30ng/ml的rhIL-4。
优选地，本发明使用树突状细胞摄取幽门螺杆菌裂解液中的抗原肽的方法包括：向树突状细胞悬液中加入幽门螺杆菌裂解液，混合培养。
优选地，所述混合培养的温度为37±3℃，时间为18±6h。
优选地，所述树突状细胞悬液的细胞浓度为1-3×106/ml。
优选地，所述幽门螺杆菌裂解液中蛋白质的浓度为2-8mg/ml。
优选地，所述幽门螺杆菌裂解液相较于所述树突状细胞悬液的加入量为50-200μl/ml。
本发明对传统使用病原体直接感染DC的方案进行了改进，通过病原体的裂解液代替病原体，该方法能极大地增加进入DC的病原体蛋白含量，使其被提呈的概率增高，同时消除了吞噬完整病原体对DC抗原提呈功能的影响。
第二方面，本发明提供了前面所述方法筛选得到的幽门螺杆菌优势抗原肽谱，所述幽门螺杆菌优势抗原肽谱中的优势抗原包括分子伴侣GroEL、尿素酶α亚基、尿素酶ß亚基、过氧化物酶和延伸因子Tu。
利用本发明建立的方法鉴定出的优势抗原，也可用于基于抗原直接识别的H. pylori诊断方法中，用于H. pylori感染诊断试剂的开发。针对本发明鉴定出的抗原肽，结合抗体制备，可用于不同样本（粪便、唾液、牙菌斑、胃黏液、胃组织切片）中H. pylori抗原检测。
有益效果：
本发明提供了一种鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法及应用。本发明所述方法使用树突状细胞摄取幽门螺杆菌裂解液中的抗原肽，形成MHC-II抗原肽复合物；裂解提呈抗原的树突状细胞，从树突状细胞裂解液中捕获所述MHC-II抗原肽复合物，再通过质谱法鉴定幽门螺杆菌抗原肽。本发明提供的方法能极大地增加进入DC的病原体蛋白含量，使其被提呈的概率增高，同时消除了吞噬完整病原体对DC抗原提呈功能的影响。由本发明方法筛选出的抗原表位具有更高的可靠性，覆盖度更高，可筛选出优势抗原的优势表位，为H. pylori疫苗研发提供重要的抗原表位选择，具有重要的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例1中未成熟树突状细胞的典型形态图。在10倍显微镜下可见细胞整体发黄发焦，边缘一圈白色；40倍显微镜下可见细胞表面密集的短刺状突起。
图2为本发明实施例1中流式细胞圈门策略结果。其中，A表示通过细胞大小和颗粒度圈出细胞门；B表示在细胞门中通过大小和颗粒度圈出树突状细胞所在的门；C表示CD11c和MHC-II (HLA-DR)双阳的细胞可认定为从单核细胞诱导分化后形成的树突状细胞；D表示CD80和CD80双阳的细胞可认为是诱导培养过程中预先被活化的成熟树突状细胞。
图3为本发明实施例1中树突状细胞在抗原刺激后的典型形态。
具体实施方式
本发明通过对人树突状细胞提呈的H. pylori抗原肽谱的鉴定和分析，提出了一种鉴定H. pylori抗原肽的方法及应用。
本发明在前期研究过程中，利用免疫亲和联合质谱法，以7株不同基因组序列的H. pylori菌株的蛋白刺激人树突状细胞，在一定程度上克服了H. pylori菌株的高度差异性。
本发明提供的方法包括以下技术要点：通过反复冻融结合超声的方法制备幽门螺杆菌裂解液；分离人外周单核细胞并诱导分化为树突状细胞（DC）；使用树突状细胞摄取幽门螺杆菌裂解液中的蛋白，形成MHC-II抗原肽复合物；裂解提呈抗原的树突状细胞，从细胞裂解液中捕获所述MHC-II抗原肽复合物；通过质谱法鉴定幽门螺杆菌抗原肽。
本发明提供的方法能极大地增加进入DC的病原体蛋白含量，使其被提呈的概率增高，同时消除了吞噬完整病原体对DC抗原提呈功能的影响。由本发明方法筛选出的抗原表位具有更高的可靠性，覆盖度更高，可筛选出优势抗原的优势表位，为H. pylori疫苗研发提供重要的抗原表位选择，具有重要的应用前景。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了一种鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法，具体如下：
1、H. pylori裂解液制备
从培养基上刮取培养48h的H. pylori菌，在PBS中重悬，4℃，8000g离心10min，用PBS洗涤菌体2次，按1g菌体湿重加入10ml PBS的比例重悬菌体，至裂解液澄清为止。在液氮和37℃水浴中反复冻融5次，冰上超声破碎，条件为300W，超声5s，间隔5s，时间1h左右。4℃，14000g离心20min，上清为裂解液。用BCA法测定蛋白浓度。
2、人单核细胞诱导分化为树突状细胞
贴壁法分选单核细胞：将人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell，PBMC）按每孔10x106细胞铺板至六孔板中，放入37℃培养箱中2h后，用移液器吸取并弃掉孔板中的培养液，用RPMI1640轻轻吹打洗涤2次，彻底去除悬浮细胞，保留在孔板底部的贴壁细胞即为单核细胞。
诱导分化：每孔中加入3ml含40ng/ml rhGM-CSF和20ng/ml rhIL-4的Dc-M完全培养基，在37℃细胞培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。隔天用移液器小心吸取并弃掉1.5ml培养液，再加入1.5ml新鲜Dc-M完全培养基。在用移液器吸取旧培养液时要严格从上层培养液中吸取，并随着液面的下降逐渐下移移液器。如图1所示，诱导168h后，大多数细胞变为悬浮细胞，多呈卵圆型，细胞表面出现短刺状突起，表现为未成熟树突状细胞的典型形态特征。
3、流式细胞术检测诱导后的树突状细胞
从6孔板中将诱导培养7天后的细胞收集到15ml离心管中，300g离心10min，弃去上清，用1ml预冷的PBS重悬，300g离心10min，用600 μl 1%BSA重悬细胞沉淀，充分吹打后以100 μl每管将细胞悬液加至6个1.5ml离心管中，阴性对照管不做任何处理，单染管4管分别加入1μl FITC antihumanCD80, 1μl PE anti human CD11c, 1μl PE/Cyanine7 anti-human HLA-DR，1μl APC anti-human CD86，用作荧光补偿调节，样品管1管中加入上述抗体各1μl，4℃避光孵育30 min，各管中加入1ml 1%BSA，300g离心10min，弃去上清，用500 μl1%BSA重悬细胞后，转移至玻璃管中，进行流式检测。使用FlowJo(v10.8.1)软件对流式检测结果进行分析。如图2所示，为使用流式细胞术对诱导后的未成熟树突状细胞表型的鉴定。
4、H. pylori抗原刺激诱导后的树突状细胞
收集诱导分化后的未成熟树突状细胞，300g离心10min，用培养液将细胞重悬至浓度约2x106/ml，在12孔板中每孔加入1ml细胞悬液，实验组加入100μl 5mg/mlH. pylori裂解液至细胞悬液中，LPS刺激组加入100μl 10xLPS，阴性对照组加入100μl PBS，轻轻吹打混匀后，将细胞置于37℃培养箱中培养18h，间隔4h在显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。刺激完成后，用细胞刮刀将细胞从孔板刮下，吹打混匀后转移至1.5ml离心管中，300g离心10 min，用600 μl PBS重悬细胞沉淀，充分吹打使细胞分散均匀，从每管中取出200μl细胞悬液用于流式检测，流式检测管中加入步骤3中所列抗体。剩余400 μl细胞悬液加1mlPBS离心管中，300g离心10 min，弃上清后用预冷的PBS再次洗涤细胞，以彻底去除游离的H. pylori抗原，收集的细胞沉淀中加入200μl NP-40细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂复合物和PMSF），冰上裂解30min，每间隔10min涡旋1次，裂解完成后4℃，14000rpm离心10min，转移上清液至新的1.5ml 离心管中，-80℃保存用于后续的免疫沉淀分析。如图3所示，树突状细胞在抗原刺激后形态发生明显变化，细胞由卵圆形变为长梭状，伸出的长突可达150-200μm。
5、免疫沉淀
使用Dynabeads Protein G免疫沉淀试剂盒从前述细胞裂解液中捕获MHC-II抗原肽复合物，按照试剂盒说明进行操作。
6、抗原提呈肽的质谱鉴定
取步骤5洗脱的MHC-II抗原肽复合物20μl，加入1μl 1M的碳酸氢铵，吹打混匀。加入1μl 200mM的三(2-羧乙基)膦（TCEP），室温静置1h。加入1μl 375mM的碘乙酰胺（IAA），室温避光静置30min。加入1μg胰酶，37℃过夜。用C18脱盐柱脱盐后，真空离心浓缩，用10μl0.1%甲酸重悬，经HPLC-MS/MS获取原始谱图。用PEAKS（V.5.3）软件对原始谱图进行蛋白库（UniProtKB/Swiss-Prot）搜索，采用从头测序算法（de novo）与搜库（Peaks DB）结合的方法，分析鉴定相应肽段及所匹配到的蛋白质，将FDR<1%的肽段认为是可信的。将7株菌在3次重复（即21次提呈中）试验中鉴定到5次及以上的肽段认为是优势抗原表位。鉴定出多肽频次最高的前5位蛋白分别为分子伴侣GroEL、尿素酶α亚基、尿素酶ß亚基、过氧化物酶、延伸因子Tu。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.鉴定幽门螺杆菌抗原肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：制备幽门螺杆菌裂解液；使用树突状细胞摄取所述幽门螺杆菌裂解液中的抗原肽，形成MHC-II抗原肽复合物；裂解提呈抗原的树突状细胞，从树突状细胞裂解液中捕获所述MHC-II抗原肽复合物；通过质谱法鉴定幽门螺杆菌抗原肽。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌裂解液通过反复冻融结合超声的方法获得；
所述反复冻融采用37℃水浴融解和液氮冷冻；37℃水浴融解的时间为10-20min；液氮冷冻的时间为1-3min；所述反复冻融的重复次数为5-10次；
所述超声的功率为150-300W；所述超声的工作程序为：工作4-6s，间隔4-6s，总持续时长为1-2h。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述树突状细胞由人外周血单核细胞经诱导分化得到。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述诱导分化使用的培养基为Dc-M完全培养基；
所述诱导分化使用的培养基中包含20-60ng/ml的rhGM-CSF和10-30ng/ml的rhIL-4。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，使用树突状细胞摄取幽门螺杆菌裂解液中的抗原肽的方法包括：向树突状细胞悬液中加入幽门螺杆菌裂解液，混合培养。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述混合培养的温度为37±3℃，时间为18±6h。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述树突状细胞悬液的细胞浓度为1-3×106/ml。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌裂解液中蛋白质的浓度为2-8mg/ml。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌裂解液相较于所述树突状细胞悬液的加入量为50-200μl/ml。
10.权利要求1-9任意一项所述方法筛选得到的幽门螺杆菌优势抗原肽谱，其特征在于，所述幽门螺杆菌优势抗原肽谱中的优势抗原包括分子伴侣GroEL、尿素酶α亚基、尿素酶ß亚基、过氧化物酶和延伸因子Tu。
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