CN118019767A - 优化的multabody构建体、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

在各个方面，自组装多肽复合物包含(a)多个第一融合多肽，每个第一融合多肽包含(1)Fc多肽，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中所述Fc多肽包含相对于相同Ig类别的参考Fc链具有一个或多个突变的Fc链，以及(b)多个第二融合多肽，每个第二融合多肽包含(1)抗原结合抗体片段，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基。

Description

优化的MULTABODY构建体、组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时专利申请号63/220,920(提交于2021年7月12日)和63/289,016(提交于2021年12月13日)的权益和优先权，所述临时专利申请各自的全部内容出于所有目的特此通过引用整体并入。

序列表

本申请含有已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此通过引用整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2022年7月12日，名为“Sequence Listing Jul-2022 3206-5068.txt”，大小为38,881字节。

背景技术

基于抗体或抗体片段的治疗剂正在开发用于多种用途，例如用于治疗各种疾病或病状。

然而，基于抗体的治疗剂可能需要进行调整，使得它们在施用于受试者后具有期望的特性(例如，期望的生物分布、半衰期等)。一些基于抗体的治疗剂具有与天然免疫球蛋白分子不同的形式。例如，在一些治疗剂中，抗体或抗体片段与另一种多肽融合；在一些治疗剂中，抗体或抗体片段处于自然界中未发现的构型或具有自然界中未发现的化合价。这些基于抗体的治疗剂可能也需要调整。

因此，仍然需要优化的基于抗体的治疗剂。

发明内容

本发明通过提供一套包含抗体片段的优化自组装多肽复合物来满足此需求。根据期望的特性(例如，药代动力学特性)，可以选择使用特定的自组装多肽复合物或复合物组。例如，在某些实施方案中，提供了具有与IgG分子类似的半衰期或其他药代动力学特性的自组装多肽复合物。

根据一个方面，提供了一种自组装多肽复合物，其包含

(a)多个第一融合多肽，每个第一融合多肽包含(1)Fc多肽，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中Fc多肽包含相对于相同Ig类别的参考Fc链具有一个或多个突变的Fc链，以及

(b)多个第二融合多肽，每个第二融合多肽包含(1)抗原结合抗体片段，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基。

在一个方面，(1)如果Fc多肽是IgG1 Fc多肽，则抗原结合片段不是结合SARS-CoV-2的Fab片段；且/或(2)如果纳米笼单体是小鼠铁蛋白单体并且Fc多肽是小鼠IgG2a Fc多肽，则抗原结合抗体片段不是结合CD19的Fab片段。

在一个方面，纳米笼单体是铁蛋白单体。

在一个方面，铁蛋白单体是铁蛋白轻链。

在一个方面，自组装多肽复合物不包含任何铁蛋白重链或铁蛋白重链的亚基。

在一个方面，铁蛋白单体是人铁蛋白。

在一个方面，Fc多肽是IgG1 Fc多肽。

在一个方面，Fc多肽是IgG2 Fc多肽。

在一个方面，Fc多肽是单链Fc(scFc)。

在一个方面，Fc多肽是Fc单体。

在一个方面，抗原结合抗体片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域。

在一个方面，抗原结合抗体片段是Fab片段。

在一个方面，每个第二融合多肽不包含任何CH2或CH3结构域。

在一个方面，一个或多个突变包括与改变的与FcRn的结合相关的突变或突变组。

在一个方面，突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：M252、I253、S254、T256、K288、M428和N434或其组合，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，突变或突变组包括M428和N434处的突变，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，突变或突变组包括M428L和N434S突变，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，改变的与FcRn的结合是减少的与FcRn的结合。

在一个方面，与减少的与FcRn的结合相关的突变或突变组选自由I253A、I253V和K288A及其组合组成的组，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，一个或多个突变包括与改变的效应子功能相关的突变或突变组。

在一个方面，Fc多肽是IgG1 Fc多肽，并且其中突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：L234、L235、G236、G237、P329和A330或其组合，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，改变的效应子功能是降低的效应子功能。

在一个方面，与降低的效应子功能相关的突变或突变组选自由LALA(L234A/L235A)、LALAP(L234A/L235A/P329G)、G236R、G237A和A330L组成的组，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，纳米笼单体或其亚基是铁蛋白单体亚基，并且

a.每个第一融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基；或者

b.每个第一融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基。

在一个方面，自组装多肽复合物的特征在于第一融合多肽与第二融合多肽的1:1比率。

在一个方面，在每个第一融合多肽内，Fc多肽经由氨基酸接头连接至纳米笼单体或其亚基。

在一个方面，在每个第一融合多肽内，Fc多肽在纳米笼单体或其亚基的N末端处连接至纳米笼单体或其亚基。

在一个方面，在每个第二融合多肽内，抗原结合抗体片段经由氨基酸接头连接至纳米笼单体或其亚基。

在一个方面，在每个第二融合多肽内，抗原结合抗体片段在纳米笼单体或其亚基的N末端处连接至纳米笼单体或其亚基。

在一个方面，自组装多肽复合物还包含多个第三融合多肽，每个第三融合多肽包含(1)抗原结合抗体片段，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中第三融合多肽与第二融合多肽不同。

在一个方面，第三融合多肽内的抗原结合抗体片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域。

在一个方面，第三融合多肽内的抗原结合抗体片段是Fab片段。

在一个方面，每个第三融合多肽不包含任何CH2或CH3结构域。

在一个方面，第二融合多肽的抗原结合抗体片段能够结合第一表位，第三融合多肽的抗原结合片段能够结合第二表位，并且第一表位和第二表位是不同的并且不重叠。

在一个方面，第一表位和第二表位来自相同的蛋白质。

在一个方面，自组装多肽复合物包含总共24至48个融合多肽。

在一个方面，自组装多肽复合物包含总共至少24个融合多肽。

在一个方面，自组装多肽复合物包含总共至少32个融合多肽。

在一个方面，自组装多肽复合物具有总共约32个融合多肽。

在一个方面，当施用于有需要的受试者时，自组装多肽复合物的半衰期为至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

在一个方面，自组装多肽复合物的特征在于，在施用包含自组装多肽复合物的组合物后，自组装多肽复合物具有与通过相同施用途径且在类似组合物中施用的参考IgG分子基本上类似的半衰期。

在一个方面，参考IgG分子是第二融合多肽内的抗原结合抗体片段所源自的抗体，或者是第三融合多肽内的抗原结合抗体片段所源自的抗体。

在一个方面，当施用于有需要的受试者时，自组装多肽复合物的半衰期为约3天至约35天。

在一个方面，自组装多肽复合物在施用于有需要的受试者后至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天能够在血清中检测到。

在一个方面，当施用于有需要的受试者时，自组装多肽复合物的曲线下面积(AUC)为至少10天·μg/mL、至少25天·μg/mL、至少50天·μg/mL、至少100天·μg/mL、至少200天·μg/mL、至少300天·μg/mL、至少400天·μg/mL、至少500天·μg/mL、至少750天·μg/mL、至少1000天·μg/mL、至少1500天·μg/mL、至少2000天·μg/mL、至少2500天·μg/mL、至少3000天·μg/mL、至少4000天·μg/mL、至少5000天·μg/mL、至少6000天·μg/mL、至少7000天·μg/mL或至少8000天·μg/mL。

在一个方面，当施用于有需要的受试者时，自组装多肽复合物的曲线下面积(AUC)为约10天·μg/mL至约8000天·μg/mL。

在一个方面，当施用于有需要的受试者时，自组装多肽复合物的最大浓度(C_max)为至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少250μg/mL、至少500μg/mL、至少750μg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少75mg/mL、至少100mg/mL、至少250mg/mL、至少500mg/mL或至少750mg/mL。

在一个方面，当施用于有需要的受试者时，自组装多肽复合物的最大浓度(C_max)为约10μg/mL至约750mg/mL。

在一个方面，受试者是人。

在一个方面，向受试者施用是通过肠胃外施用。

在一个方面，向受试者施用是通过皮下施用、静脉内施用、肌内施用、鼻内施用或通过吸入。

在一个方面，自组装多肽复合物的特征在于自组装多肽复合物在抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)体外模型中诱导ADCP。

在一个方面，以至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的靶标内化的水平诱导ADCP。

根据一个方面，提供了一种方法，其包括向哺乳动物受试者施用包含本文所述的自组装多肽复合物的组合物。

在一个方面，受试者是人。

在一个方面，方法包括通过全身途径施用。

在一个方面，全身途径包括皮下、静脉内或肌内注射、吸入或鼻内施用。

在一个方面，施用后，自组装多肽复合物在哺乳动物受试者中的半衰期为至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

在一个方面，施用后，自组装多肽复合物在哺乳动物受试者中的半衰期为3天至35天。

在一个方面，施用后，自组装多肽复合物在哺乳动物受试者中的曲线下面积(AUC)为至少10天·μg/mL、至少25天·μg/mL、至少50天·μg/mL、至少100天·μg/mL、至少200天·μg/mL、至少300天·μg/mL、至少400天·μg/mL、至少500天·μg/mL、至少750天·μg/mL、至少1000天·μg/mL、至少1500天·μg/mL、至少2000天·μg/mL、至少2500天·μg/mL、至少3000天·μg/mL、至少4000天·μg/mL、至少5000天·μg/mL、至少6000天·μg/mL、至少7000天·μg/mL或至少8000天·μg/mL。

在一个方面，施用后，自组装多肽复合物在哺乳动物受试者中的曲线下面积(AUC)为约10天·μg/mL至约8000天·μg/mL。

在一个方面，施用后，自组装多肽复合物在哺乳动物受试者中的最大浓度(Cmax)为至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少250μg/mL、至少500μg/mL、至少750μg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少75mg/mL、至少100mg/mL、至少250mg/mL、至少500mg/mL或至少750mg/mL。

在一个方面，施用后，自组装多肽复合物在哺乳动物受试者中的最大浓度(Cmax)为约10μg/mL至约750mg/mL。

根据一个方面，提供了一种融合多肽，其包含(1)Fc多肽，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中Fc多肽包含相对于相同Ig类别的参考Fc链具有一个或多个突变的Fc链，其中一个或多个突变包括与改变的与FcRn的结合和/或改变的效应子功能相关的突变或突变组。

在一个方面，纳米笼单体是铁蛋白单体。

在一个方面，铁蛋白单体是铁蛋白轻链。

在一个方面，融合多肽不包含任何铁蛋白重链或铁蛋白重链的亚基。

在一个方面，铁蛋白单体是人铁蛋白。

在一个方面，Fc多肽是IgG1 Fc多肽。

在一个方面，Fc多肽是IgG2 Fc多肽。

在一个方面，Fc多肽是单链Fc(scFc)。

在一个方面，突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：M252、I253、S254、T256、K288、M428和N434或其组合，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，改变的与FcRn的结合是减少的与FcRn的结合。

在一个方面，与减少的与FcRn的结合相关的突变或突变组选自由I253A、I253V和K288A及其组合组成的组，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，Fc多肽是IgG1 Fc多肽，并且其中突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：L234、L235、G236、G237、P329和A330或其组合，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，改变的效应子功能是降低的效应子功能。

在一个方面，与降低的效应子功能相关的突变或突变组选自由LALA(L234A/L235A)、LALAP(L234A/L235A/P329G)、G236R、G237A和A330L组成的组，其中编号是根据EU索引。

在一个方面，纳米笼单体或其亚基是铁蛋白单体亚基，并且

a.每个第一融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基；或者

b.每个第一融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基。

在一个方面，在每个第一融合多肽内，Fc多肽经由氨基酸接头连接至纳米笼单体或其亚基。

在一个方面，在每个第一融合多肽内，Fc多肽在纳米笼单体或其亚基的N末端处连接至纳米笼单体或其亚基。

附图说明

图1A是人铁蛋白轻链(hFTL)和示例性N-半铁蛋白和C-半铁蛋白分子的图示。

图1B、图1C和图1D是本公开的示例性Multabody形成的图示。

图2A是各自含有野生型IgG1 Fc的T-01MB、T-02MB和T-01MB.v2的负染色电子显微照片。

图2B是含有各种Fc的T-01MB的负染色电子显微照片。

图3A和图3B分别提供了在pH 5.6和pH 7.4下含有各种Fc的T-01MB与人FcRn结合的生物层干涉测量法(BLI)浓度响应曲线。

图3C、图3D和图3E分别提供了含有各种Fc的T-01MB与人FcγRIIa、人FcγRIIb和FcγRI结合的BLI浓度响应曲线。

图3F提供了含有野生型IgG1 Fc或具有M428L/N434S(LS)突变的Fc IgG1的T-01MB.v2与人Fc受体结合的BLI浓度响应曲线。

图4A提供了T-01MB、T-02MB和T-01MB.v2与PGDM1400、N49P7、10E8v4或iMab(如作为Fab包含在Multabody中)的靶标/表位结合的BLI浓度响应曲线。

图4B、图4C和图4D分别提供了含有各种Fc的T-01MB与PGDM1400(BG5050SOSIP.664D368R)、N49P7(93TH057)和10E8v4(gp41 MPER)的靶标/表位结合的BLI浓度响应曲线。

图4E提供了PGDM1400、N49P7、10E8v4或iMab IgG与BG5050SOSIP.664D368R、93TH057、gp41 MPER和CD4结合的BLI浓度响应曲线。

图5A说明了实施例4中描述的并且使用CB17/Icr-Prkdc^scid/IcrIc oCrl免疫缺陷(SCID)小鼠进行的实验。图5B、图5C、图5D和图5E说明了在SCID小鼠中皮下施用后，所测试的Multabody或IgG1对照的血清水平。

图6A示出了实施例4中描述的并且使用NOD/Shi-scid/IL-2Rγnu ll免疫缺陷(NCG)小鼠进行的实验。图6B说明了在NCG小鼠中皮下施用后，所测试的Multabody或IgG1对照的血清水平。图6C提供了施用所测试的Multabody或IgG1对照后的NCG小鼠体重。显示n＝3只小鼠的平均值±SD。

图7说明了所测试的Multabody或对照诱导的剂量依赖性吞噬作用，其被量化并表示为与未涂覆的微球相比，涂覆93TH057的微球的内化增加的百分比。*P<0.05，***P<0.001并且P****<0.0001。n＝四个生物学独立的样品。

图8A、图8B和图8C说明了所测试的Multabody(分别为T-01MB、T-01MB.v2和T-02MB)(菱形)、亲本抗体PGDM1400、N49P7和10E8v4(圆形)、IgG1对照(三角形)和N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体(倒三角形)的宽度和中值IC₅₀值(μg/mL)，使用实施例6中描述的TZM-bl测定来确定。

图8D说明了含有各种Fc的T-01MB对HIV-1的剂量依赖性中和，使用实施例6中描述的TZM-bl测定来确定。

图9A说明了T-01MB、T-01MB.v2或IgG1对照对PBMC的CXCR4趋向性HIV-1分离株IIIB感染的抑制。示出了三个技术重复的平均值±SD。图9B示出了相对于未处理的对照细胞，T-01MB、T-01MB.v2或IgG1对照后的活细胞的百分比。

图10A和图10B示出了T-01MB和T-01MB.v2在温度应力条件(40℃)下的4周稳定性。参见实施例8。

图11.HIV-1bNAb多聚化提高中和效力。(A)脱铁铁蛋白(24个亚基)和(B)单链Fab脱铁铁蛋白融合物的自组装示意图。Fab轻链(LC)和重链(HC)分别以浅粉色和深粉色显示，并通过GGS样柔性接头(深色)连接至人脱铁铁蛋白轻链(灰色)的N末端。(C)人脱铁铁蛋白上显示的不同Fab密度的示意性图示。将scFab-人脱铁铁蛋白编码质粒与未缀合的脱铁铁蛋白以1:4(深黄色)、1:1(黑色)、4:1(蓝色)和1:0(红色)的比率共转染，产生具有不同scFab价的分子，如通过尺寸排阻色谱法中的洗脱体积和SDS-PAGE中较少的未缀合脱铁铁蛋白所证实的。示出了具有最低和最高scFab价的样品的负染色电子显微照片(比例尺50nm)。(D)对五种bNAb针对五种PsV组(PVO.04、JRCSF、BG505 T332N、THRO4156.18和t278-50)的中和作用的亲合力效应。效力倍数增加计算为亲本IgG IC₅₀(μg/mL)除以Fab脱铁铁蛋白融合物IC₅₀(μg/mL)。由于中和抗性，在以下情况下省略了效力倍数增加分析：N49P7-t278-50、VRC01-T278-50和10-1074-THRO4156.18。条形(±SD)代表n＝3个生物学独立样品的平均值。

图12.scFab-脱铁铁蛋白融合物的表征。(A)使用ImageJ软件(rsb.info.nih.gov/ij/)通过光密度测定法对与scFab-脱铁铁蛋白和未缀合的脱铁铁蛋白相对应的SDS-PAGE条带进行定量。示出了每个泳道(黄色框)中的条带的强度图(B)。(C)颗粒上显示的scFab的大致数量计算如下：scFab条带的强度/总强度，并且与从用于共转染的DNA比率推断的理论数量进行比较。

图13.针对14-PsV组的HIV Multabody的设计、组装和中和谱。(A)驱动scFab-人脱铁铁蛋白亚基的异源二聚化的人脱铁铁蛋白分裂设计的示意图。(B)24聚体PGDM1400scFab-脱铁铁蛋白颗粒(黑色)和T-01MB(深红色)的尺寸排阻色谱法与多角度光散射联用。每个洗脱峰(UV吸光度下的线)的摩尔质量以MDa表示。(C)T-01MB的负染色电子显微照片(比例尺50nm)。(D)T-01MB与多个表位结合的浓度响应曲线。HIV-1Env三聚体(灰色)的表面表示上的PGDM1400、N49P7和10E8结合位点分别以红色、蓝色和粉色着色。红线代表原始数据；黑线代表全局拟合。(E)T-01MB(红色菱形)、亲本bNAb(白色圆形)、IgG组合(灰色三角形)和N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体(黑色三角形)的宽度(截止值IC₅₀设置为10μg/mL)和中值IC₅₀值(μg/mL)。14-PsV组是基于对亲本IgG的敏感性和抗性来选择的。(F)每个PsV变体的单独IC₅₀值(μg/mL)。实线表示所有14种病毒毒株的中和IC₅₀中值。那些显示出最高中和抗性的假病毒用红色框突出显示。(D)和(E)中的IC₅₀值是根据三个生物重复计算的。

图14.Multabody亲和纯化方案。蛋白A和蛋白L连续亲和纯化。与蛋白A的结合富集了具有Fc(绿色)的Multabody，而蛋白L富集了具有κ链Fab PGDM1400(蓝色)的Multabody。脱铁铁蛋白分裂设计的两半的互补确保在蛋白A纯化步骤期间存在N49P7/iMab(橙色)和10E8v4 scFab(粉色)(融合至C-铁蛋白)。在iMab的κ链的位置12处引入丙氨酸至脯氨酸点突变，以破坏与蛋白L的结合。进行凝胶过滤以分离任何聚集的材料或未组装的组分。

图15.生成交叉靶向HIV-1Env和CD4受体的Multabody。(A)MB组分的示意性图示。(B)24聚体PGDM1400 scFab-脱铁铁蛋白颗粒(黑色)和T-02MB(蓝色)的尺寸排阻色谱法与多角度光散射联用。每个样品的摩尔质量以MDa示出。(C)负染色电子显微照片(比例尺50nm)和(D)T-02MB的结合谱。(E)T-02MB(红色菱形)与其亲本bNAb(白色圆形)和IgG组合(灰色三角形)相比的宽度(截止值IC₅₀设置为10μg/mL)和中值IC₅₀值(μg/mL)。示出了对T-02MB显示出最高中和抗性的那些假病毒的三个生物重复的平均IC₅₀值(μg/mL)。

图16.HIV-1Multabody的生物物理表征。T-01/T-02MB、12聚体铁蛋白融合物、亲本IgG和N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体的T_m和T_agg温度的比较。

图17.IgG与四种不同抗原结合的结合特性。IgG与固定在Ni-NTA生物传感器上的93TH057 gp120、BG505 SOSIP.664_D368R、MPER肽和CD4结合的BLI响应曲线。BG505SOSIP.664_D368R三聚体和93TH057 gp120单体分别被选为PGDM1400和N49P7的表位特异性配体。红线代表原始数据；黑线代表全局拟合。

图18.Multabody v2的工程改造和生物物理表征。(A)与原始Multabody设计相比，第二代Multabody设计显示出两个不同的特征：1)Fc(绿色)融合至分裂铁蛋白设计中的脱铁铁蛋白的另一半的C末端；和2)与脱铁铁蛋白半原聚体C末端融合的单链Fc结构域(绿色)恢复为单体Fc链。MB.v2中每个Fc的二聚化驱动四个Fab的组装(两个Fab2和两个Fab3-底行)，而每个Fc仅将一个Fab组装成先前的MB版本(顶行)。(B)T-01MB.v2的负染色电子显微照片(比例尺50nm)。(C)T-01MB.v2与多个表位结合的浓度响应曲线。红线代表原始数据；黑线代表全局拟合。(D)T_agg的比较，以及(E)两种不同Multabody版本在温度应力条件(10mg/ml；40℃)下的长期稳定性。示出了第0周与第4周的PsV中和(两个技术重复的平均值±SD)的比较。

图19.Multabody v2特征。(A)将Fc(绿色)从N-铁蛋白的N末端(顶行)到C-铁蛋白的C末端(底行)的融合修饰逆转了Multabody中Fc的方向。(B)在脱铁铁蛋白纳米笼的4重对称轴处融合至两个独立铁蛋白亚基的C末端的两条Fc链的Fc二聚化充当Multabody v2组装的额外驱动。

图20.对Multabody上的Fc进行微调以获得IgG样特性。(A)T-01MB和T-01MB.v2与人FcRn的pH依赖性结合的浓度响应曲线。(B)MB与IgG1在酸性pH下的FcRn表观结合亲和力(K_D)的比较。示出了n＝3个生物学独立的样品。低于10^-12M(黑色虚线)的表观K_D超出仪器检测限。(C)高亲和力人FcγRI(顶部)和低亲和力人FcγRIIa(底部)的浓度响应曲线。(D)剂量依赖性吞噬作用，确定为与无抗体对照相比，涂覆93TH057的荧光微球内化的增加百分比。添加抗人FcR结合抑制剂抗体以阻断Fc介导的内化(深红色)。通过双因素ANOVA和Tukey多重比较检验来分析数据。将每组与IgG阴性对照进行比较。*P<0.05，***P<0.001并且P****<0.0001。添加对抗原涂覆的珠子没有亲和力的IgG和MB样品作为对照样品。n＝四个生物学独立的样品。(E)在雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NCG)免疫缺陷小鼠皮下施用5mg/kg Multabody或亲本IgG混合物后的血清水平。(F)在NCG小鼠中施用5mg/kg分子后的体重。n＝3只小鼠的±平均值SD在(E)和(F)中示出。

图21.Multabody v2对扩展的HIV-1PsV组具有广泛而有效的中和作用。(A)T-01Multabody版本(不同深浅的红色菱形)、单个IgG(黑色圆形)和IgG混合物(蓝色三角形)针对25-PsV组(其中56％的PsV变体对PGDM1400中和具有抗性)的宽度和中值IC₅₀值(μg/mL)。(B)每个PsV变体的单独IC₅₀值(μg/mL)。(A)和(B)中的IC₅₀值是根据三个生物重复计算的。(C)T-01Multabody版本以及亲本IgG和IgG混合物针对118种HIV-1PsV变体扩展多枝组的效力(IC₅₀)-宽度(左)和效力(IC₈₀)-宽度(右)曲线比较。(D)(C)中的每个PsV变体的单独IC₅₀(左)和IC₈₀(右)值。黄点对应于对PGDM1400中和具有高度抗性的PsV的IC₅₀值。(B)和(D)中的实线表示每组中所有病毒毒株的中值IC₅₀中和滴度。

图22.Multabody的PsV的中和作用和原发性PBMC感染的抑制。(A)比较T-01Multabody版本以及亲本IgG和IgG混合物针对118种HIV-1PsV变体组的摩尔效力(IC₅₀)-宽度(左)和摩尔效力(IC₈₀)-宽度(右)图像。(B)经由p24检测来测量来源于三名不同血液供体的PBMC培养上清液中的HIV-1复制。示出的数据代表CXCR4趋向性HIV-1分离株IIIB感染后7天的HIV-1复制水平。示出了三个技术重复的平均值±SD。(C)IgG混合物和Multabody处理对细胞活力的影响，显示在与(B)相同的实验条件下，相对于未处理的对照细胞的存活细胞的百分比。

具体实施方式

发明人先前已经描述了包含融合多肽的自组装多肽复合物，所述融合多肽包含抗体片段。这些自组装多肽复合物可被设计并适应多种治疗目的。例如，如本文所述，包含含有Fab和Fc的融合多肽的自组装多肽复合物可用于靶向表达Fab可结合的抗原的细胞，并且Fc部分可介导与体内其他分子的相互作用。

在许多情况下，可能期望优化这些自组装多肽复合物在施用后的行为，例如通过调节特性，诸如半衰期和/或介导抗体介导的效应的能力。用于优化IgG分子的技术是本领域已知的。例如，可以使用IgG分子的Fc区的修饰来调节半衰期和某些抗体介导的效应。

然而，发明人惊奇地发现，在一些情况下，当应用于发明人的自组装多肽复合物时，用于优化IgG分子的技术可能具有意想不到的效果。作为一个实例，发明人已经发现，在IgG1分子的背景下通常与减少的FcRn结合(和减少的半衰期)相关的Fc修饰实际上在发明人的自组装多肽复合物的背景下赋予更期望的生物利用度特性。

利用这些和其他见解，发明人已经开发了一套自组装多肽复合物以及相关方法，所述复合物中的每一种都针对特定期望结果进行了优化。

例如，在某些实施方案中，在施用于受试者后，所提供的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子(例如，其类别与自组装多肽复合物内的Fc多肽内的Fc链的类别相匹配的IgG分子)类似的一种或多种药代动力学特征。例如，在一些实施方案中，如本文所公开的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子类似的生物利用度。在一些实施方案中，如本文所公开的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子类似的半衰期。

在某些实施方案中，在施用于受试者后，所提供的自组装多肽复合物诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

定义

当在本文中用于提及值时，术语“约”和“大约”可互换使用并且指代与参考值类似的值。一般来讲，熟悉上下文的本领域的技术人员将理解该上下文中“约”或“大约”所涵盖的相关变化程度。例如，在一些实施方案中，术语“约”和“大约”可以涵盖落入所提及的值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值范围。

如本文所用，术语“改变”、“改变的”、“减少”、“减少的”、“增加”、“增加的”或“降低”、“降低的”(例如，提及某些结果或效果)具有相对于参考水平的含义。在一些实施方案中，在讨论Fc链或Fc多肽中的突变的上下文中，参考水平是已知的水平或使用在Fc区中不含有参考突变的IgG确定的水平。

术语“铁蛋白”和“脱铁铁蛋白”在本文中可互换使用，并且通常指代能够组装成铁蛋白复合物的多肽(例如，铁蛋白链)，所述铁蛋白复合物通常包含24个蛋白质亚基。在一些实施方案中，铁蛋白是人铁蛋白，例如人铁蛋白轻链，例如与SEQ ID NO:1或UniProtP02792具有至少85％序列同一性的人铁蛋白轻链。在一些实施方案中，铁蛋白是野生型铁蛋白。例如，铁蛋白可以是野生型人铁蛋白。

术语“铁蛋白单体”在本文中用于指代铁蛋白的单链，其在其他铁蛋白链的存在下能够自组装成包含多条铁蛋白链(例如，24条或更多条铁蛋白链)的多肽复合物。

如本文所用，术语“接头”用于指代连接两个或更多个元件以形成多元件剂的实体。例如，本领域的普通技术人员理解，其结构包括两个或更多个功能结构域或组织结构域的多肽(例如，融合多肽)通常在此类结构域之间包括将它们彼此连接的一段氨基酸。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有一般形式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可以相同或不同并且代表通过接头(L)彼此缔合的两个结构域。在一些实施方案中，接头是“氨基酸接头”，即，其包含氨基酸残基，例如，氨基酸接头可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头的特征在于其趋于不采用刚性的三维结构，而是为多肽提供柔性。

如本文所用，术语“多特异性”是指具有至少两个结合位点的特性，至少两个不同的结合配偶体(例如，抗原或受体(例如，Fc受体))可以在所述结合位点处结合。例如，包含至少两个Fab片段的多肽复合物(其中两个Fab片段中的每一个能够结合不同的抗原)是“多特异性的”。作为另一个实例，包含Fc片段(能够结合Fc受体)和Fab片段(能够结合抗原)的多肽复合物是“多特异性的”。

如本文所用，术语“多价”是指具有至少两个结合位点的特性，结合配偶体(例如，抗原或受体(例如，Fc受体))可以在所述结合位点处结合。可以与至少两个结合位点结合的结合配偶体可以相同或不同。

如本文所用，术语“纳米笼单体”是指能够与其他纳米笼单体自组装以形成包含多个纳米笼单体的自组装多肽复合物的多肽的单链。在一些实施方案中，纳米笼单体选自铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、硫氧化还原酶(SOR)、二氧四氢喋啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧酶体、穹窿蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P外壳蛋白、MS2外壳蛋白的单体、其片段及其变体。

如本文所用，术语“多肽”通常具有其本领域认可的至少三个氨基酸的聚合物的含义，例如通过肽键彼此连接。本领域的普通技术人员将理解，术语“多肽”旨在足够通用，以不仅涵盖具有本文所述的完整序列的多肽，还涵盖代表此类完整多肽的功能片段(即，保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域的普通技术人员理解蛋白质序列通常耐受一些取代而不破坏活性。因此，保留活性并且与相同类别的另一种多肽共享至少约30-40％整体序列同一性(通常大于约50％、60％、70％或80％，并且通常还包括至少一个同一性更高的区域，通常在一个或多个高度保守的区域中大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％，所述区域通常涵盖至少3-4个并且通常多达20或更多个氨基酸)的任何多肽涵盖在如本文所用的相关术语“多肽”内。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。

当用于提及大分子复合物(例如，多肽复合物)时，术语“自组装”是指当存在待形成的复合物(例如，融合多肽)的足够成分时，自发形成该复合物。在一些实施方案中，复合物在生理条件下或在对应于生理条件的缓冲液(例如，溶液)中自组装。

如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人)。在一些实施方案中，受试者罹患或易患相关疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状或特性。在一些实施方案中，受试者是具有对疾病、病症或病状的易感性或风险的一种或多种特征的人。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是正在施用和/或已经施用诊断和/或疗法的受试者。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”(以及“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全地减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征和/或原因、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的疗法的任何施用。在一些实施方案中，此类治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或病状的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者。或者或此外，此类治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种已确定体征的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有一种或多种易感因素的受试者，所述易感因素与相关疾病、病症和/或病状的发展风险增加在统计学上相关。

A.融合多肽

在许多实施方案中，与本文公开的组合物和方法相容的融合多肽通常包含连接至Fc多肽或抗原结合抗体片段的纳米笼单体或其亚基。在融合多肽内，Fc多肽或抗原结合抗体片段可以在纳米笼单体或其亚基的特定末端(例如，N末端或C末端)连接至纳米笼单体或其亚基。在一些实施方案中，Fc多肽或抗原结合抗体片段经由氨基酸接头(诸如如本文所述的接头)连接。

在一些实施方案中，(1)如果Fc多肽是IgG1 Fc多肽，则抗原结合片段不是结合SARS-CoV-2的Fab片段；且/或(2)如果纳米笼单体是小鼠铁蛋白单体并且Fc多肽是小鼠IgG2a Fc多肽，则抗原结合抗体片段不是结合CD19的Fab片段。

1.纳米笼单体及其亚基

在一些实施方案中，纳米笼单体是铁蛋白单体。

术语“铁蛋白单体”在本文中用于指代铁蛋白的单链，其在其他铁蛋白链的存在下能够自组装成包含多条铁蛋白链(例如，24条或更多条铁蛋白链)的多肽复合物。在一些实施方案中，铁蛋白单体是铁蛋白轻链。在一些实施方案中，铁蛋白单体不包括铁蛋白重链或能够与铁结合的其他铁蛋白组分。

在一些实施方案中，自组装多肽复合物内的每个融合多肽包含铁蛋白轻链或铁蛋白轻链的亚基。在这些实施方案中，自组装多肽复合物不包含任何铁蛋白重链或铁蛋白重链的亚基。

在一些实施方案中，铁蛋白单体是人铁蛋白链，例如，人铁蛋白轻链，例如，具有SEQ ID NO:1的至少残基2-175的序列的人铁蛋白轻链。在一些实施方案中，铁蛋白单体是小鼠铁蛋白链。

铁蛋白单体的“亚基”是指铁蛋白单体的一部分，其能够自发地与铁蛋白单体的另一个不同的亚基缔合，使得所述亚基一起形成铁蛋白单体，所述铁蛋白单体进而能够与其他铁蛋白单体自组装以形成多肽复合物。

在一些实施方案中，铁蛋白单体亚基包含铁蛋白单体的大约一半。如本文所用，术语“N-半铁蛋白”是指铁蛋白链的大约一半，所述一半包含铁蛋白链的N-末端。如本文所用，术语“C-半铁蛋白”是指铁蛋白链的大约一半，所述一半包含铁蛋白链的C-末端。铁蛋白链可以分开以形成N-半铁蛋白和C-半铁蛋白的确切点可根据实施方案而变化。在基于人铁蛋白轻链的铁蛋白单体亚基的上下文中，例如，这两半可以在对应于SEQ ID NO:1的约位置75至约位置100(或其大部分)的位置的点处分开。例如，在一些实施方案中，基于人铁蛋白轻链的N-半铁蛋白具有对应于SEQ ID NO:1的残基1-95(或其大部分)的氨基酸序列，并且基于人铁蛋白轻链的C-半铁蛋白具有对应于SEQ ID NO:1的残基96-175(或其大部分)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，这两半在对应于SEQ ID NO:1的约位置85至约位置92的位置的点处分开。例如，在一些实施方案中，基于人铁蛋白轻链的N-半铁蛋白具有对应于SEQ IDNO:1的残基1-90的氨基酸序列，并且基于人铁蛋白轻链的C-半铁蛋白具有对应于SEQ IDNO:1的残基91-175的氨基酸序列。

2.Fc多肽

在某些实施方案中，片段可结晶(Fc)多肽包含Fc链，所述Fc链相对于相同Ig类别的参考Fc链各自具有一个或多个突变。如下文进一步解释的，参考Fc链可以属于例如IgG1或IgG2类。

除非另有说明，否则整篇本公开中的抗体片段(例如，Fc多肽)内的突变的编号是根据EU索引。

在一些实施方案中，Fc多肽是人IgG Fc多肽，即，除了本文指出的突变之外，Fc多肽还包含与野生型人IgG内的Fc链基本上类似的Fc链。

在一些实施方案中，Fc多肽是IgG1 Fc多肽(例如，人IgG1 Fc多肽)，即，除了本文指出的突变之外，Fc多肽还包含具有与野生型IgG1 Fc内的链基本上类似的氨基酸序列的Fc链。在一些实施方案中，野生型IgG1 Fc是人IgG1 Fc，其中每条Fc链具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

例如，IgG1 Fc多肽可包含Fc链，所述Fc链具有与野生型IgG1Fc内的Fc链的氨基酸序列具有至少85％、至少87.5％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG1 Fc多肽包含Fc链，所述Fc链包含针对所述IgG1 Fc多肽具体描述的Fc突变，但是具有与野生型IgG1 Fc内的Fc链具有100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含Fc链，所述Fc链具有与SEQ ID NO:5的序列有至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸残基不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含Fc链，所述Fc链具有与SEQID NO:5的序列有不多于十个、不多于九个、不多于八个、不多于七个、不多于六个、不多于五个或不多于四个氨基酸残基不同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fc多肽是IgG2 Fc多肽(例如，人IgG2 Fc多肽)，即，除了本文指出的突变之外，Fc多肽还包含具有与野生型IgG2 Fc内的链基本上类似的氨基酸序列的Fc链。在一些实施方案中，野生型IgG2 Fc是人IgG2 Fc，其中每条Fc链具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。

例如，IgG2 Fc多肽可包含Fc链，所述Fc链具有与野生型IgG2a Fc内的Fc链的氨基酸序列具有至少85％、至少87.5％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG2 Fc多肽包含Fc链，所述Fc链包含针对所述IgG2 Fc多肽具体描述的Fc突变，但是具有与野生型IgG2 Fc内的Fc链具有100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含Fc链，所述Fc链具有与SEQ ID NO:46的序列有至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸残基不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含Fc链，所述Fc链具有与SEQ ID NO:46的序列有不多于十个、不多于九个、不多于八个、不多于七个、不多于六个、不多于五个或不多于四个氨基酸残基不同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fc多肽是单链Fc(scFc)，其包含通过共价接头(例如，经由氨基酸接头)连接在一起的两条Fc链。

在一些实施方案中，Fc多肽是Fc单体，例如具有仅一个CH2结构域(重链的第二恒定Ig结构域)和仅一个CH3结构域(重链的第三恒定Ig结构域)的单一Fc链，所述单一Fc链通常能够与另一个单一Fc链二聚化。

在一些实施方案中，一种或多种突变包括与如本文进一步描述的改变的特性相关的突变或突变组。“与...相关”意指在抗体(诸如IgG抗体)的上下文中，突变或突变组先前已被表征为赋予改变的特性(例如，改变的与FcRn的结合、改变的效应子功能等)。“改变的”意指特性(例如，与Fc受体(例如，FcRn)的结合)不同于在没有突变或突变组的情况下观察到的特性。

例如，在一些实施方案中，改变的特性包括改变的与Fc受体的结合。

在一些实施方案中，改变的特性包括改变的与FcRn的结合。

例如，与改变的与FcRn的结合相关的突变或突变组可以包括选自以下的一个或多个残基处的突变：M252、I253、S254、T256、K288、M428、N434或其组合。

在一些实施方案中，改变的与Fc受体的结合包括与FcRn的结合减少(例如，相对于参考水平的结合减少，所述参考水平对应于在没有一个或多个突变的情况下观察到的水平)。例如，在一些实施方案中，一个或多个突变包括与减少的与FcRn的结合相关的突变或突变组，例如I253A、I253V、K288A或其组合。

在一些实施方案中，一个或多个突变包括与改变的效应子功能相关的突变或突变组，例如，与效应子功能相关的改变的与Fc受体(例如，Fcγ受体，诸如FcγRI、FcγRII或FcγRIIb)的结合。

例如，一个或多个突变可包括选自以下的一个或多个残基处的突变或突变组：L234、L235、G236、G237、P329、A330及其组合。

在一些实施方案中，改变的与Fc受体的结合包括减少的效应子功能，例如LALA(L234A/L235A)、LALAP(L234A/L235A/P329G)、G236R、G237A、A330L或其组合。

3.抗原结合抗体片段

在某些实施方案中，抗原结合抗体片段包含重链可变区(例如，V_H)。在某些实施方案中，抗原结合抗体片段包含重链可变结构域(例如，V_H)和轻链可变结构域(例如，V_L或V_K)。在某些实施方案中，抗原结合抗体片段包含Fab，其包含重链可变结构域(例如，V_H)和轻链可变结构域(例如，V_L或V_K)。

在某些实施方案中，抗原结合抗体片段不包含来自Fc区的任何结构域，例如，不包含任何CH2或CH3结构域。

在一些实施方案中，抗原结合片段与传染病病原体(例如，病毒)上的抗原结合。

在一些实施方案中，抗原结合抗体片段与靶细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)上的抗原结合。

在使用具有抗原结合抗体片段的多种类型的融合多肽的实施方案中，各种类型的融合多肽中的抗原结合抗体片段可以能够结合相同的表位，或者它们可以能够结合不同且不重叠的表位。在表位不同且不重叠的一些实施方案中，表位来自相同的蛋白质。

4.接头

在某些实施方案中，接头用于融合多肽内和/或单链分子(诸如scFc)内。在一些实施方案中，接头是氨基酸接头。例如，如本文所用的接头可包含约1个至约100个氨基酸残基，例如约1个至约70个、约2个至约70个、约1个至约30个或约2个至约30个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸残基。

在某些实施方案中，接头包含甘氨酸-丝氨酸序列，例如(G_nS)_m序列(例如，GGS、GGGS(SEQ ID NO:48)或GGGGS(SEQ ID NO:49)序列)，其存在于接头内的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个拷贝中。

B.自组装多肽复合物

在一个方面，提供了包含多个如本文所公开的融合多肽的自组装多肽复合物。一般来讲，所提供的自组装多肽复合物包含(a)多个第一融合多肽，每个第一融合多肽包含(1)Fc多肽，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中Fc多肽包含相对于相同Ig类别的参考Fc链具有一个或多个突变的Fc链，以及(b)多个第二融合多肽，每个第二融合多肽包含(1)抗原结合抗体片段，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基。

在一些实施方案中，纳米笼单体是铁蛋白单体，并且自组装多肽复合物内的每个融合多肽包含铁蛋白轻链或铁蛋白轻链的亚基。在这些实施方案中，自组装多肽复合物不包含任何铁蛋白重链、铁蛋白重链亚基或能够结合铁的其他铁蛋白组分。

在一些实施方案中，纳米笼单体或其亚基是铁蛋白单体亚基，并且(a)每个第一融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基；或者(b)每个第一融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基。

在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含总共24个至48个融合多肽。在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含总共24个融合多肽。在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含总共大于24个融合多肽，例如，至少26个、至少28个、至少30个、至少32个融合多肽、至少34个融合多肽、至少36个融合多肽、至少38个融合多肽、至少40个融合多肽、至少42个融合多肽、至少44个融合多肽、至少46个融合多肽或至少48个融合多肽。在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含约32个融合多肽。

在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个第一融合多肽。

在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个第二融合多肽。

在一些实施方案中，自组装多肽复合物还包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14、至少15个或至少16个第三融合多肽。

在一些实施方案中，自组装多肽复合物包含比率为大约1:1、1:2、1:3或1:4的第一融合多肽与所有其他融合多肽。

药代动力学特性

在某些实施方案中，当施用于有需要的受试者时，所提供的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子(例如，其类别与自组装多肽复合物内的第一融合多肽的Fc多肽内的Fc链类别相匹配的IgG分子)类似的一种或多种药代动力学特征。在一些实施方案中，在将自组装多肽复合物施用于人受试者时，获得本文讨论的药代动力学特性(例如，半衰期、AUC和/或C_max)的范围。在一些实施方案中，当自组装多肽复合物经由全身途径施用(例如，经由静脉内或皮下施用)时，获得本文讨论的药代动力学特性的范围。

在一些实施方案中，如本文所公开的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子类似的半衰期。参考IgG分子可以是例如自组装多肽复合物内的第二融合多肽和/或第三融合多肽内的抗原结合抗体片段所源自的抗体。例如，如果第二融合多肽和/或第三融合多肽内的抗原结合片段包含来自“抗体A”的可变区，则在一些实施方案中，参考IgG分子可以是“抗体A”。

在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物具有约3至35天、约3至约28天、约3至约21天、约3至约14天、约3至约10天、约3至约7天、约3至约5天、约5至约35天、约5至约28天、约5至约21天、约5至约14天、约5至约10天、约5至约7天、约7至约35天、约7至约28天、约7至约21天、约7至约14天、约7至约10天、约10至约35天、约10至约28天、约10至约21天、约10至约14天、约14至约35天、约14至约28天、约14至约21天、约21至约35天或约21至约28天的半衰期。在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物具有至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天的半衰期。在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物在至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天后能够在血清中检测到。

在一些实施方案中，如本文所公开的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子(例如，自组装多肽复合物中包含的Fab片段所源自的抗体)类似的生物利用度。例如，在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物具有约10至约8000天·μg/mL、约10至约7000天·μg/mL、约10至约6000天·μg/mL、约10至约5000天·μg/mL、约10至约4000天·μg/mL、约10至约3000天·μg/mL、约10至约2500天·μg/mL、约10至约1000天·μg/mL、约10至约1500天·μg/mL、约10至约1000天·μg/mL、约10至约750天·μg/mL、约10至约500天·μg/mL、约10至约400天·μg/mL、约10至约300天·μg/mL、约10至约200天·μg/mL、约10至约100天·μg/mL、约10至约50天·μg/mL、约10至约25天·μg/mL、约25至约8000天·μg/mL、约25至约7000天·μg/mL、约25至约6000天·μg/mL、约25至约5000天·μg/mL、约25至约4000天·μg/mL、约25至约3000天·μg/mL、约25至约2500天·μg/mL、约25至约1000天·μg/mL、约25至约1500天·μg/mL、约25至约1000天·μg/mL、约25至约750天·μg/mL、约25至约500天·μg/mL、约25至约400天·μg/mL、约25至约300天·μg/mL、约25至约200天·μg/mL、约25至约100天·μg/mL、约25至约50天·μg/mL、约50至约8000天·μg/mL、约50至约7000天·μg/mL、约50至约6000天·μg/mL、约50至约5000天·μg/mL、约50至约4000天·μg/mL、约50至约3000天·μg/mL、约50至约2500天·μg/mL、约50至约2000天·μg/mL、约50至约1500天·μg/mL、约50至约1000天·μg/mL、约50至约750天·μg/mL、约50至约500天·μg/mL、约50至约400天·μg/mL、约50至约300天·μg/mL、约50至约200天·μg/mL、约50至约100天·μg/mL、约100至约8000天·μg/mL、约100至约7000天·μg/mL、约100至约6000天·μg/mL、约100至约5000天·μg/mL、约100至约4000天·μg/mL、约100至约3000天·μg/mL、约100至约2500天·μg/mL、约100至约1000天·μg/mL、约100至约1500天·μg/mL、约100至约1000天·μg/mL、约100至约750天·μg/mL、约100至约500天·μg/mL、约100至约400天·μg/mL、约100至约300天·μg/mL、约100至约200天·μg/mL、约200至约8000天·μg/mL、约200至约7000天·μg/mL、约200至约6000天·μg/mL、约200至约5000天·μg/mL、约200至约4000天·μg/mL、约200至约3000天·μg/mL、约200至约2000天·μg/mL、约200至约1000天·μg/mL、约200至约1500天·μg/mL、约200至约1000天·μg/mL、约200至约750天·μg/mL、约200至约500天·μg/mL、约200至约400天·μg/mL、约200至约300天·μg/mL、约300至约8000天·μg/mL、约300至约7000天·μg/mL、约300至约6000天·μg/mL、约300至约5000天·μg/mL、约300至约4000天·μg/mL、约300至约3000天·μg/mL、约300至约2500天·μg/mL、约300至约2000天·μg/mL、约300至约1500天·μg/mL、约300至约1000天·μg/mL、约300至约750天·μg/mL、约300至约500天·μg/mL、约300至约400天·μg/mL、约400至约8000天·μg/mL、约400至约7000天·μg/mL、约400至约6000天·μg/mL、约400至约5000天·μg/mL、约400至约4000天·μg/mL、约400至约3000天·μg/mL、约400至约2500天·μg/mL、约400至约2000天·μg/mL、约400至约1500天·μg/mL、约400至约1000天·μg/mL、约400至约750天·μg/mL、约400至约500天·μg/mL、约500至约8000天·μg/mL、约500至约7000天·μg/mL、约500至约6000天·μg/mL、约500至约5000天·μg/mL、约500至约4000天·μg/mL、约500至约3000天·μg/mL、约500至约2500天·μg/mL、约500至约2000天·μg/mL、约500至约1500天·μg/mL、约500至约1000天·μg/mL、约500至约750天·μg/mL、约750至约8000天·μg/mL、约750至约7000天·μg/mL、约750至约6000天·μg/mL、约750至约5000天·μg/mL、约750至约4000天·μg/mL、约750至约3000天·μg/mL、约750至约2500天·μg/mL、约750至约2000天·μg/mL、约750至约1500天·μg/mL、约750至约1000天·μg/mL、约1000至约8000天·μg/mL、约1000至约7000天·μg/mL、约1000至约6000天·μg/mL、约1000至约5000天·μg/mL、约1000至约4000天·μg/mL、约1000至约3000天·μg/mL、约1000至约2500天·μg/mL、约1000至约2000天·μg/mL、约1000至约1500天·μg/mL、约1500至约8000天·μg/mL、约1500至约7000天·μg/mL、约1500至约6000天·μg/mL、约1500至约5000天·μg/mL、约1500至约4000天·μg/mL、约1500至约3000天·μg/mL、约1500至约2500天·μg/mL、约1500至约2000天·μg/mL、约2000至约8000天·μg/mL、约2000至约7000天·μg/mL、约2000至约6000天·μg/mL、约2000至约5000天·μg/mL、约2000至约4000天·μg/mL、约2000至约3000天·μg/mL、约2000至约2500天·μg/mL、约2500至约8000天·μg/mL、约2500至约7000天·μg/mL、约2500至约6000天·μg/mL、约2500至约5000天·μg/mL、约2500至约4000天·μg/mL、约2500至约3000天·μg/mL、约3000至约8000天·μg/mL、约3000至约7000天·μg/mL、约3000至约6000天·μg/mL、约3000至约5000天·μg/mL、约3000至约4000天·μg/mL、约4000至约8000天·μg/mL、约4000至约7000天·μg/mL、约4000至约6000天·μg/mL、约4000至约5000天·μg/mL、约5000至约8000天·μg/mL、约5000至约7000天·μg/mL、约5000至约6000天·μg/mL、约6000至约8000天·μg/mL、约6000至约7000天·μg/mL或约7000至约8000天·μg/mL的曲线下面积(AUC)。在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物具有至少10天·μg/mL、至少25天·μg/mL、至少50天·μg/mL、至少100天·μg/mL、至少200天·μg/mL、至少300天·μg/mL、至少400天·μg/mL、至少500天·μg/mL、至少750天·μg/mL、至少1000天·μg/mL、至少1500天·μg/mL、至少2000天·μg/mL、至少2500天·μg/mL、至少3000天·μg/mL、至少4000天·μg/mL、至少5000天·μg/mL、至少6000天·μg/mL、至少7000天·μg/mL或至少8000天·μg/mL的AUC。

在一些实施方案中，如本文所公开的自组装多肽复合物具有与参考IgG分子类似的生物利用度。例如，在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物具有约10μg/mL至约750mg/mL、约25μg/mL至约750mg/mL、约50μg/mL至约750mg/mL、约75μg/mL至约750mg/mL、约100μg/mL至约750mg/mL、约250μg/mL至约750mg/mL、约500μg/mL至约750mg/mL、约750μg/mL至约750mg/mL、约1mg/mL至约750mg/mL、约10mg/mL至约750mg/mL、约25mg/mL至约750mg/mL、约50mg/mL至约750mg/mL、约75mg/mL至约750mg/mL、约100mg/mL至约750mg/mL、约250mg/mL至约750mg/mL、约500mg/mL至约750mg/mL、约10μg/mL至约500mg/mL、约25μg/mL至约500mg/mL、约50μg/mL至约500mg/mL、约75μg/mL至约500mg/mL、约100μg/mL至约500mg/mL、约250μg/mL至约500mg/mL、约500μg/mL至约500mg/mL、约750μg/mL至约500mg/mL、约1mg/mL至约500mg/mL、约10mg/mL至约500mg/mL、约25mg/mL至约500mg/mL、约50mg/mL至约500mg/mL、约75mg/mL至约500mg/mL、约100mg/mL至约500mg/mL、约250mg/mL至约500mg/mL、约10μg/mL至约250mg/mL、约25μg/mL至约250mg/mL、约50μg/mL至约250mg/mL、约75μg/mL至约250mg/mL、约100μg/mL至约250mg/mL、约250μg/mL至约250mg/mL、约500μg/mL至约250mg/mL、约750μg/mL至约250mg/mL、约1mg/mL至约250mg/mL、约10mg/mL至约250mg/mL、约25mg/mL至约250mg/mL、约50mg/mL至约250mg/mL、约75mg/mL至约250mg/mL、约100mg/mL至约250mg/mL、约10μg/mL至约100mg/mL、约25μg/mL至约100mg/mL、约50μg/mL至约100mg/mL、约75μg/mL至约100mg/mL、约100μg/mL至约100mg/mL、约250μg/mL至约100mg/mL、约500μg/mL至约100mg/mL、约750μg/mL至约100mg/mL、约1mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约25mg/mL至约100mg/mL、约50mg/mL至约100mg/mL、约75mg/mL至约100mg/mL、约10μg/mL至约75mg/mL、约25μg/mL至约75mg/mL、约50μg/mL至约75mg/mL、约75μg/mL至约75mg/mL、约100μg/mL至约75mg/mL、约250μg/mL至约75mg/mL、约500μg/mL至约75mg/mL、约750μg/mL至约75mg/mL、约1mg/mL至约75mg/mL、约10mg/mL至约75mg/mL、约25mg/mL至约75mg/mL、约50mg/mL至约75mg/mL、约10μg/mL至约50mg/mL、约25μg/mL至约50mg/mL、约50μg/mL至约50mg/mL、约75μg/mL至约50mg/mL、约100μg/mL至约50mg/mL、约250μg/mL至约50mg/mL、约500μg/mL至约50mg/mL、约750μg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL、约25mg/mL至约50mg/mL、约10μg/mL至约25mg/mL、约25μg/mL至约25mg/mL、约50μg/mL至约25mg/mL、约75μg/mL至约25mg/mL、约100μg/mL至约25mg/mL、约250μg/mL至约25mg/mL、约500μg/mL至约25mg/mL、约750μg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约10mg/mL至约25mg/mL、约10μg/mL至约10mg/mL、约25μg/mL至约10mg/mL、约50μg/mL至约10mg/mL、约75μg/mL至约10mg/mL、约100μg/mL至约10mg/mL、约250μg/mL至约10mg/mL、约500μg/mL至约10mg/mL、约750μg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约10μg/mL至约1mg/mL、约25μg/mL至约1mg/mL、约50μg/mL至约1mg/mL、约75μg/mL至约1mg/mL、约100μg/mL至约1mg/mL、约250μg/mL至约1mg/mL、约500μg/mL至约1mg/mL、约750μg/mL至约1mg/mL、约10μg/mL至约750μg/mL、约25μg/mL至约750μg/mL、约50μg/mL至约750μg/mL、约75μg/mL至约750μg/mL、约100μg/mL至约750μg/mL、约250μg/mL至约750μg/mL、约500μg/mL至约750μg/mL、约10μg/mL至约500μg/mL、约25μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约500μg/mL、约75μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约250μg/mL至约500μg/mL、约10μg/mL至约250μg/mL、约25μg/mL至约250μg/mL、约50μg/mL至约250μg/mL、约75μg/mL至约250μg/mL、约100μg/mL至约250μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约25μg/mL至约100μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约75μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约75μg/mL、约25μg/mL至约75μg/mL、约50μg/mL至约75μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL或约10μg/mL至约25μg/mL的最大浓度(C_max)。在一些实施方案中，在施用于有需要的受试者后，自组装多肽复合物具有至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少250μg/mL、至少500μg/mL、至少750μg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少75mg/mL、至少100mg/mL、至少250mg/mL、至少500mg/mL或至少750mg/mL的最大浓度(C_max)。

功能效应

在某些实施方案中，所提供的自组装多肽复合物能够进行抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，以至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的靶标内化的水平诱导ADCP。测量ADCP的方法是本领域已知的并且包括例如利用巨噬细胞系和靶标的体外测定。

C.治疗方法

在一个方面，提供了可用于治疗、改善或预防疾病或病状(例如，传染病、癌症或自身免疫性疾病)的方法，其通常包括向受试者施用包含本公开的自组装多肽复合物的组合物的步骤。

在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。

用于施用于受试者的组合物通常包含如本文所公开的自组装多肽复合物。在一些实施方案中，此类组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

组合物可配制用于多种施用途径中的任一种的施用，所述施用途径包括全身途径(例如口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用)。

实施例

实施例1.代表性Multabody的表达和分析

在本实施例中，Multabody(MB)由融合蛋白形成，所述融合蛋白通过经由接头将人铁蛋白轻链(hFTL，SEQ ID NO:1)、hFTL的N末端片段(残基1-90)(N_hFTL，SEQ ID NO:2)或hFTL的C末端片段(残基91-175)(C_hFTL，SEQ ID NO:3)与单链Fab(scFab)和/或片段可结晶区(Fc)或单链Fc二聚体(scFc)融合在一起而生成，所述接头诸如如本文所述的(Gly_n-Ser)_m肽接头。所生成的不同格式在图1中说明。

T-01MB：制备编码融合蛋白的基因(1)HIV中和抗体PGDM1400的scFab，其融合至hFTL的N末端(PGDM1400-hFTL，SEQ ID NO:27)，(2)scFc，其融合至N_hFTL的N末端(scFc-N_hFTL，SEQ ID NO:34)，(3)HIV中和抗体N49P7的scFab，其融合至C_hFTL的N末端(N49P7-C_hFTL，SEQ ID NO:28)，以及(4)HIV中和抗体10E8v4的scFab，其融合至C_hFTL的N末端(10E8v4-C_hFTL，SEQ ID NO:30)，以4:2:1:1的摩尔比混合，并且瞬时转染到HEK 293F细胞中以产生并形成T-01MB。参见，图1B。

T-02 MB：制备编码融合蛋白的基因(1)PGDM1400-hFTL(SEQ ID NO:27)，(2)scFc-N_hFTL(SEQ ID NO:34)，(3)抗CD4抗体伊巴珠单抗(ibalizumab)(iMab)的scFab，其融合至C_hFTL的N末端(iMab-C_hFTL，SEQ ID NO:31)，以及(4)10E8v4-C_hFTL(SEQ ID NO:30)，以4:2:1:1的摩尔比混合，并且瞬时转染到HEK 293F细胞中以产生并形成T-02MB。参见，图1B。

T-01 MB.v2：制备编码融合蛋白的基因(1)PGDM1400-hFTL(SEQ ID NO:27)，(2)N49P7的scFab，其融合至N_hFTL的N末端(N49P7-N_hFTL(SEQ ID NO:29)，以及(3)Fc单体，其融合至10E8-C_hFTL的C末端(10E8v4-C_hFTL-Fc，SEQ ID NO:32)，以3:1:1的摩尔比混合，并且瞬时转染到HEK 293F细胞中以产生并形成T-01MB.v2。参见，图1D。(如上文针对“T-01MB”所述，10E8-C_hFTL含有与C_hFTL的N末端融合的HIV中和抗体10E8v4的scFab。因此，构建体10E8v4-C_hFTL-Fc(SEQ ID NO:32)含有C-半铁蛋白，其具有C-半铁蛋白的N末端处的Fab3和C-半铁蛋白的C末端处的Fc。)

本实施例中描述的Multabody具有野生型(WT)Fc或工程改造的IgG1 Fc。此类工程改造的IgG1 Fc含有L234A、L235A、K288A、I253V、I253A、P329G、M428L、N434S或其任何组合(根据EU编号方案)中的任何一个或多个突变。例如，T-01MB IgG1 K288A具有工程改造的IgG1 Fc，其具有K288A突变；T-01MB IgG1 LALAP具有工程改造的IgG1 Fc，其具有L234A、L235A和P329G突变；T-01MB.v2IgG1 LS具有工程改造的IgG1 Fc，其具有M428L和N434S突变。

使用蛋白A亲和色谱法，任选地随后使用蛋白L亲和色谱法纯化Multabody。将含有Multabody的级分浓缩，并且在磷酸钠缓冲液中通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化。SEC纯化后，使用负染色电子显微镜(EM)和/或具有内联多角度光散射的SEC(SEC-MALS)来评价形成的Multabody的大小。

实施例2.通过生物层干涉测量法测定Multabody与Fc受体的结合

使用Octet RED96 BLI系统(Pall ForteBio)通过生物层干涉测量法(BLI)来确定包含不同Fc突变的Multabody与Fc受体(人Fcγ受体I(hFcγRI)、hFcγRIIa和hFcγRIIb)的结合动力学和亲和力。

简而言之，将His标记的Fc受体加载到Ni-NTA生物传感器上，以达到0.8nm的信号响应。通过将加载的生物传感器转移到含有测试Multabody(20-10-5-2.5-1.25-0.65nM)或IgG1对照(250-125-62.5-31.2-15.6-7.8nM)的系列稀释的孔中来测量缔合速率，接触时间为180秒。IgG1对照是PGDM1400、N49P7和10E8v4抗体的混合物，全部具有野生型IgG1骨架。为了评估Multabody经受内体再循环的潜力，在生理pH(7.4)和酸性pH(5.6)下测量了它们与hFcRn/β2-微球蛋白复合物的结合。

在Multabody中评价的IgG1骨架的Fc突变包括：K288A、I253V和I253A，其减少抗体与FcRn的结合；P329G、LALA(L234A、L235A)和LALAP(L234A、L235A和P329G)，其减少抗体与FcγR的结合；及其组合。(编号是根据EU编号方案。)

所得传感图的相关片段的代表性实例在图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F中提供。确定的k_on、k_off值以及所得的Multabody平衡解离常数(K_D)总结在表1和表2中。

在酸性pH(5.6)下，具有野生型IgG1 Fc的T-01MB结合FcRn的结合亲和力比IgG1对照高1000倍；对于具有K288A、I253V、P329G、LALA、LALAP、K288A+P329G或K288A+LALAP IgG1Fc突变的T-01MB也观察到同样的情况。在pH 5.6下，具有I253A或I253A+LALAP IgG1 Fc突变的T-01MB结合FcRn的结合亲和力与IgG1对照类似。在生理pH(7.4)下，具有野生IgG1 Fc、P329G IgG1 Fc突变、LALA IgG1 Fc突变、或LALAP IgG1 Fc突变的T-01MB表现出可测量的与FcRn的结合。

具有野生型IgG1 Fc的T-01MB结合hFcγRI、hFcγRIIa和hFcγRIIb的亲和力比IgG1对照高1000倍。具有P329G、LALA或LALAP IgG1 Fc突变的Multabody显示与测试的Fcγ受体的结合减少或不结合。

具有野生型IgG1 Fc或具有LS Fc突变的T-01MB.v2具有与IgG1更类似的FcRn结合谱，在酸性pH下与人FcRn具有相当的结合能力，但在生理pH下不结合。此外，具有IgG1 Fc或LS型突变的T-01MB.v2显示与高亲和力FcγRI的结合减少，并且与测试的低亲和力Fcγ受体不结合，类似于含有LALAP突变的T-01MB。

在测试的Fc突变和突变组合中，I253A+LALAP IgG1 Fc突变组合将Multabody(T-01MB格式)的Fc受体结合谱调整为IgG1样。

表1.通过BLI确定的Multabody对FcRn的动力学常数和亲和力

*在pH 7.4下，Multabody显示出与FcRn的残留结合

表2.通过BLI确定的Multabody对Fcγ受体的动力学常数和亲和力

实施例3.通过生物层干涉测量法确定的Multabody的靶标结合

使用Octet RED96 BLI系统(Pall ForteBio)通过BLI确定PGDM 1400、N49P7、10E8v4或iMab(作为包括在Multabody中的Fab)对各自的靶标的结合动力学和亲和力。

实验如实施例2中所述的类似地执行，不同之处在于Hi标记的靶标—PGDM1400、N49P7、10E8v4和iMab的BG5050 SOSIP.664D368R、gp120亚基93TH057、gp41近膜端外部区域(MPER)和可溶性CD4分别加载到Ni-NTA生物传感器上以达到0.8nm的信号响应。然后用不同浓度的测试Multabody、PGDM1400、N49P7、10E8v4或iMab抗体(具有野生型IgG1骨架)或PGDM1400、N49P7和10E8v4抗体(全部具有野生型IgG1骨架)的混合物(IgG1对照)滴定加载的生物传感器。

所得传感图的相关片段的代表性实例在图4A、图4B、图4C、图4D和图4E中提供。确定的k_on、k_off值以及所得的Multabody平衡解离常数(K_D)总结在表3和表4中。

表3.通过BLI确定的Multabody对靶标结合的动力学常数和亲和力

表4.通过BLI确定的Multabody对靶标结合的动力学常数和亲和力

实施例4.Multabody在小鼠中的药代动力学

在小鼠中对具有野生型Fc或工程改造的IgG1 Fc的Multabody的药代动力学执行了分析。

在第0天，以5mg/kg的剂量将测试Multabody或IgG1对照注射到五只CB17/Icr-Prkdc^scid/IcrIcoCrl免疫缺陷(SCID)小鼠/组中。IgG1对照是PGDM1400、N49P7和10E8v4抗体的混合物，全部具有野生型IgG1骨架。从第1天开始采集血清样品，并且每两天采集一次，持续9天。在第10天，施用额外的5mg/kg剂量，并且在第11天和第15天收集血清样品。

此外，以5mg/kg的单剂量，将含有野生型Fc、LALAP+I253A IgG1 Fc突变组合或M428L+N434S(LS)Fc突变组合的Multabody皮下注射到NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull免疫缺陷(NCG)小鼠(3只小鼠/组)中。在注射后的多个时间点收集血液样品。平行测试IgG1对照。

通过ELISA评估循环Multabody的水平。简而言之，96孔板涂覆有50μL的His标记的抗原，所述抗原被0.5μg/mL的Multabody中的Fab识别。将血清/血液样品稀释并添加到孔中。使用HRP-蛋白A作为二级分子来检测结合剂。使用微孔板读板仪对化学发光信号进行定量。制备标准蛋白质稀释液的校准曲线。

图5B-图5E和图6B示出了测试的Multabody的血浆浓度随时间的变化的图。LALAP+I235A、LALAP+K288A和K288A+P329G突变组合能够将T-01MB的血清水平恢复至与IgG1对照类似的水平；LS突变组合能够将T-01MB.v2的血清水平恢复至与IgG1对照类似的水平。因此，T-01MB IgG1 LALAP I235A、T-01MB IgG1LALAP K288A、T-01MB IgG1 K288A P329G和T-01MB.v2 IgG1 LS表现出抗体样药代动力学或有利的药代动力学谱。

实施例5.Multabody诱导的抗体依赖性细胞吞噬作用的评估

使用THP-1细胞系评估所选Multabody诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的潜力。

红色荧光FluoSpheres NeutrAvidin微球涂覆有生物素化的93TH057 gp120(N49P7的抗原)，并且在37℃下与各种浓度的T-01MB IgG1 LALAP I253A或T-01MB.v2 IgG1LS、或PGDM1400、N49P7和10E8v4 IgG1抗体的IgG1混合物一起孵育2小时，然后以5x 10⁴细胞/孔添加200μL THP-1细胞。16小时后，将细胞沉淀并且用PBS洗涤。使用存活/死亡的可固定紫染色剂确定细胞的活力。用PBS洗涤的细胞在室温下用2％多聚甲醛固定20分钟，沉淀，并用FACS缓冲液(PBS+10％ FBS，0.5mM EDTA)洗涤一次。随后使用BD LSR II流式细胞仪分析细胞，并且使用FlowJo分析数据。平行测试IgG1和对93TH057 gp120无亲和力的Multabody对照；FcR结合抑制剂抗体(Invitrogen，14-9161-73)用于阻断Fc介导的内化。

结果描绘在图7中。吞噬作用被量化并表示为与未涂覆的微球相比，93TH057涂覆的微球的内化增加的百分比。T-01MB.v2 IgG1LALAP I253A诱导与IgG1对照相当的剂量依赖性ADCP，尽管与FcγRI的结合较低(参见实施例2)。

实施例6.Multabody介导的HIV-1中和的评估

使用TZM-bl测定评估所选的Multabody中和HIV-1的能力，所述测定将HIV-1中和作用测量为在用Env假型病毒进行一轮感染后，HIV-1Tat调节的萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因表达减少的函数。

简而言之，通过将293T细胞与HIV-1亚型B骨架NL4-3.Luc.R^-E质粒(编码全长Env克隆的质粒)共转染来生成HIV-1假型病毒。将测试Multabody、Multabody中包括的Fab的抗体、IgG1对照-1(PG DM1400、N49P7和10E8v4 IgG1抗体的混合物)、IgG1对照-2(PG DM1400、iMab和10E8v4 IgG1抗体的混合物)或N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体(针对CD4bs、V1V2顶点和MPER结合位点)在37℃下与10-15％组织培养感染剂量的假病毒一起孵育1小时，然后与用假型病毒转染的细胞一起孵育44-72小时。通过向细胞中添加Brit elite plus试剂(PerkinElmer)并且使用Synergy Neo2多功能测定微孔板读板仪测量相对光单位(RLU)的发光来监测病毒中和。针对单个假病毒或一组14或25种假病毒(14-或25-PsV组)对测试制品进行测定。25-PsV组包括14-PsV组中的毒株，并在14-PsV组中添加了11种对PDGM1400具有高度抗性的HIV-1毒株。因此，25-PsV组含有56％的对PDGM1400 IgG中和具有抗性的PsV变体(截止值IC₅₀设置为10μg/mL)。

示例性结果在图8A、图8B、图8C和图8D中示出，并且确定的IC₅₀值和中和宽度总结在表5和表6中。与IgG混合物和三特异性抗体的IC₅₀值相比，Multabody的中值IC₅₀值分别表现出大约一个和两个数量级的降低。T-01MB.v2(其中抗体N49P7和10E8v4的中和谱比其他Multabody更具优势)在25-PsV组中实现了100％中和。

当针对118PsV的扩展多枝组进行测试时，T-01MB.v2与对应的IgG混合物的泛中和宽度相匹配(100％病毒覆盖率，截止值IC₅₀设置为10μg/mL)，但表现出显著的中和效力(图21C-图21D、图22A和表9)。具体而言，IgG混合物和T-01MB只能分别中和9％和8％的PsV，IC₅₀值为0.001μg/mL，而在T-01MB.v2的情况下，50％的PsV仍然被中和，IC₅₀值仅为0.001μg/mL(图21C)。值得注意的是，Multabody实现了仅0.0009μg/mL(0.4pM)的中值IC₅₀值，因此与IgG混合物相比，在质量和摩尔浓度上分别实现了更有效32倍和490倍的泛中和(图21D)。此外，T-01MB.v2的IC₈₀证实了其优于单个IgG和IgG混合物的中和倾向，中和了所测试的所有病毒株的96％，中值IC₈₀值为0.005μg/mL(2.2pM)(图21C-图21D、图22A和表9)。重要的是，Multabody还阻断了具有复制能力的CXCR4趋向性HIV-1IIIB毒株对原代外周血单核细胞(PBMC)的感染(图22B)，显示出比匹配的IgG混合物增强的效力，并且对细胞活力没有任何影响(图22C)。

表5.Multabody的HIV中和

表6.Multabody的HIV中和

Multabody	IC50
		T-01MB IgG1	0.014nM
T-01MB IgG2	0.018nM
		T-01MB IgG1 P329G	0.0094nM
T-01MB IgG1 LALA	0.0041nM
		T-01MB IgG1 LALAP	0.012nM
T-01MB IgG1 K288A	0.014nM
		T-01MB IgG1 I253A	0.015nM
T-01MB IgG1 K288A P329G	0.0042nM
		T-01MB IgG1 LALAP K288A	0.0060nM
T-01MB IgG1 LALAP I253A	0.0074nM

实施例7.Multabody对HIV-1感染的抑制的评估

使用人外周血单核细胞(PBMC)评估了所选的Multabody抑制HIV-1感染的能力。

简而言之，从三名健康血液供体获得PBMC，并且在补充有10％胎牛血清(FBS)的完全RPMI培养基中在重组人IL-2的存在下用植物血凝素(PHA)激活72小时，然后进行HIV-1感染。将实验室CXCR4趋向性HIV-1分离株IIIB与测试的Multabody或IgG1对照在室温下孵育1小时，然后一式三份添加到激活的PBMC中。IgG1对照是PGDM1400、N49P7和10E8v4抗体的混合物，全部具有野生型IgG1骨架。在存在或不存在测试的Multabody或抗体对照的情况下以0.01-10ug/mL的剂量培养受感染的细胞。根据制造商的方案，在感染后第7天，通过使用BioTEK Synergy读板仪上的高灵敏度AlphaLISA p24检测试剂盒测量细胞游离培养物上清液中的p24 Gag蛋白的细胞外释放来评估HIV-1复制水平。还在感染第7天通过将细胞固定在2％ PFA中来评估细胞活力，并使用BD LSRFortessa(Becton Dickinson)通过流式细胞术来计数细胞的绝对数量。

示例性结果在图9A和图9B中示出。Multabody(T-01MB和T-01MB.v2)能够抑制具有复制能力的CXCR4趋向性HIV-1分离株IIIB对原代PBMC的感染，与IgG1对照相比效力增强，并且对细胞活力没有任何影响。

实施例8.Multabody的热稳定性的表征

使用UNit系统测定Multabody和参考分子(亲本抗体PGDM1400、N49P7、10E8v4和iMab；PGDM1400x10E8v4三特异性抗体)的解链温度(T_m)和聚集温度(T_agg)。将样品浓缩至1.0mg/mL，并且以1℃的增量从25℃升温至95℃。通过测量重心平均荧光来获得T_m；T_agg确定为在266nm波长下观察到静态光散射相对于基线增加50％时的温度。使用UNit分析软件计算3次独立测量的平均值和标准误差。表7总结了T_m和T_agg。

在加速条件下进一步分析Multabody的稳定性。将样品浓缩至10mg/mL，并且在40℃下孵育四周。每周，基于SEC的可溶性含量来计算正确折叠蛋白质的百分比。Multabody在这些条件下高度稳定，超过70％的样品在30天内保持可溶。(参见，图10A)。

此外，在PsV中和测定中评估了孵育期之前(第0周)和之后(第4周)的样品，以比较分子的生物学功能。与第0周时的效力相比，第4周时中和效力仅略有损失，从而进一步证实了稳定性。(参见，图10B)。

与参考分子相比，所测试的Multabody具有类似的热稳定性，并且在40℃下储存时可稳定至少四个星期，中和效力损失最小。

表7.Multabody的解链温度(T_m)和聚集温度(T_agg)

实施例9.通过多特异性抗体亲合力工程改造泛HIV-1中和效力

摘要

对HIV-1感染个体的B细胞库的深入挖掘已经导致分离出数十种HIV-1广泛中和抗体(bNAb)。然而，仍不确定任何此类bNAb是否足够广泛和有效以用于治疗。在这里，我们工程改造了HIV-1bNAb，经由将其Fab片段直接基因融合到人脱铁铁蛋白轻链上，将其组合在单个多特异性和亲合的分子上。所得分子表现出显著的0.0009μg/mL的中值IC₅₀值，并且在4μg/mL截止浓度下对广泛的HIV-1假病毒组(118个分离株)具有100％中和覆盖率–病毒中和效力与对应的HIV-1bNAb混合物相比增强32倍。重要的是，将Fc掺入分子中并进行工程改造以调节Fc受体结合，导致在体内产生IgG样生物利用度。这种稳健的即插即用抗体设计适用于同时利用多特异性和亲合力来介导最佳生物活性的适应症。

HIV-1的高度遗传多样性仍然是开发用于预防和治疗的治疗剂的主要障碍。在这里，我们描述了一种抗体平台的设计，所述平台允许组装高亲合力的多特异性分子，所述分子同时靶向HIV-1包膜糖蛋白上最保守的表位。组合的多价和多特异性转化为对HIV-1毒株的非凡中和效力和泛中和作用，超过了最有效的抗HIV广泛中和抗体混合物。

简介

尽管进行了数十年的研究，仍然不存在针对I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的有效疫苗或治疗方法。然而，一小部分HIV-1感染个体在循环的HIV-1分离株中产生具有优越中和效力的抗体，这一事实突显了抗体介导的HIV-1控制的潜力。自从分离出第一代广泛中和抗体(bNAbs)2F5(1)、4E10(2,3)、2G12(4)和b12(5,6)以来，由于新技术(诸如Env特异性单B细胞分选(7-9)、抗体克隆和高通量中和测定(10-13)以及最近的蛋白质组解卷积(14))的实施，bNAb的数量急剧增加。现在已经描述了若干种HIV-1bNAb，其主要靶向三聚体HIV包膜糖蛋白(Env)上的六个保守位点，包括三聚体顶点的V1/V2环、V3环聚糖、CD4结合位点(CD4bs)、gp120-g41界面、Env沉默面和近膜外部区域(MPER)(7，9，11–20)。

人们对bNAb作为对抗HIV-1的治疗剂的兴趣源于在猕猴(21-25)和人源化小鼠(26-29)的攻击研究中观察到的有效抗病毒活性，以及输注bNAb后感染人的中的病毒血症的减少(30–34)。此外，与口服抗逆转录病毒疗法(ART)相比，抗体具有关键优势：它们具有更长的循环半衰期，并且可以形成增强宿主对病毒的免疫力的免疫复合物。这些观察结果导致了对基于抗体的疗法的临床评价，通过被动施用bNAb来赋予针对HIV-1感染的保护(35)，并努力控制和/或清除感染个体中的HIV-1(31-33)。

最近的抗体介导预防(AMP)试验探索了bNAb VRC01赋予针对HIV-1的被动免疫的能力。在这些研究中，从TZM-bl中和测定中推断出的抗体宽度和效力被提议作为人抗体功效的有效预测因子。具体而言，低于1μg/ml的IC₈₀值被确定为生物治疗剂需要实现以赋予针对特定HIV-1病毒株的保护的效力阈值(35)。VRC01在试验中仅达到了针对30％ HIV-1毒株的阈值，因此无法赋予广泛的保护，这突显了对更有效、更广泛作用的分子的迫切需要。虽然这样的覆盖宽度可以通过施用多种bNAb来实现，尽管最近在IgG工程改造方面做出了努力(36-40)，但效力可能仍然限制抗体混合物的治疗功效。

在此，我们通过工程改造人脱铁铁蛋白亚基以驱动单个分子上的三种不同的HIV-1bNAb的多聚化，克服了HIV-1巨大的序列多样性，具有非凡的中和效力。所得多特异性、多亲和力的抗体(Multabody)能够实现泛中和作用(100％病毒覆盖)，中值IC₅₀值为0.0009μg/mL(0.4pM)。本文所述的Multabody设计代表了一个稳健而强大的即插即用平台，其对抗体进行多聚化，以增强其在范围最广的分离株中的HIV-1中和作用。

材料和方法

仅Fab脱铁铁蛋白多聚体的表达和纯化。合成编码人脱铁铁蛋白轻链和scFab-人脱铁铁蛋白融合物的基因，并通过GeneArt(Life Technologies)将其克隆到pHLsec表达载体中。将200mL的HEK 293F细胞(Thermo Fisher Scientific)以0.8x 10⁶细胞/mL的密度接种在Freestyle表达培养基中，并在Multitron Pro振荡器(Infors HT)中在37℃、8％ CO₂和70％湿度下在125rpm振荡下孵育。接种后24小时内，使用50μg过滤的DNA与转染试剂FectoPRO(Polyplus Tr ansfections)以1:1的比率在室温(RT)下预孵育10分钟，对细胞进行瞬时转染。将编码scFab-人脱铁铁蛋白的质粒和人脱铁铁蛋白以1:4、1:1、4:1和1:0的比率混合。6-7天后，通过以5000×g离心15分钟来收获细胞悬浮液，并通过0.22μm Steritop过滤器(EMD Millipore)过滤上清液。通过Fab亲和色谱法纯化颗粒并在洗涤后洗脱。将含有蛋白质的级分合并，浓缩并加载到20mM磷酸钠，pH 8.0，150m M NaCl中的Superose 610/300GL尺寸排阻柱(GE Heathcare)上。

Multabody的设计、表达和纯化。通过缺失人脱铁铁蛋白轻链的残基1至90(C-铁蛋白)和91至175(N-铁蛋白)，生成编码与半铁蛋白连接的scFab和scFc片段的基因。此外，通过将抗体轻链的丙氨酸12定点诱变为脯氨酸残基，破坏了蛋白质L对iMab-C-铁蛋白的结合特异性(69)。通过将66μg的质粒PGDM1400 scFab-人脱铁铁蛋白:scFc-N-铁蛋白:N49P7scFab-C-铁蛋白:10E8v4 scFab-C-铁蛋白以4:2:1:1的比率混合，获得HEK 293F细胞中的T-01MB的瞬时转染。在T-02MB的情况下，质粒N49P7 scFab-C-铁蛋白被iMab scFab-C-铁蛋白取代。在T-01MB.v2的情况下，使用比率为3:1:1的63μg的质粒PGDM1400 scFab-人脱铁铁蛋白:N49P7 scFab-N-铁蛋白:10E8v4scFab-C-铁蛋白-Fc。将DNA混合物过滤并在室温下与60μl的FectoPRO一起孵育，然后添加到细胞培养物中。基于驱动自组装所需的异源寡聚化，通过两步骤亲和纯化实现了具有四种组分的Multabody的纯化：蛋白A HP柱(GEHealthcare)，其具有20mM Tris pH 8.0、3M MgCl₂和10％甘油洗脱缓冲液(Fc结合)，以及蛋白L(GE Healthcare)(PGDM1400结合，因为10E8和N49P7不与蛋白L结合，并且iMab-蛋白L结合被A12P突变破坏)。使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)在两个亲和色谱法步骤之间执行缓冲液交换步骤。将含有蛋白质的级分浓缩，并且通过在20mM磷酸钠，pH 8.0，150mMNaCl中的Superose 6 10/300GL柱(GE Healthcare)上进行凝胶过滤而进一步纯化。

负染色电子显微镜。将浓度为大约0.02mg/mL的3μL Multab ody添加到涂覆碳的铜网上，持续30秒，并且用3μl的2％甲酸双氧铀染色。立即使用Whatman 1号滤纸从网格中去除过量的染色，并且添加额外的3μl的2％甲酸双氧铀，持续20秒。使用在200kV下运行并配备Orius电荷耦合器件(CCD)照相机(Gatan Inc)的场发射FE I Tecnai F20电子显微镜对网格进行成像。

生物层干涉测量。在PBS pH 7.4，0.01％ BSA和0.002％ Twee n中使用OctetRED96 BLI系统(Pall ForteBio)系统进行结合动力学测量。为每个Multabody组分和Fc受体选择独特的His标记的配体，并且将其加载到Ni-NTA生物传感器上，以达到0.8nm的信号响应。通过将加载的生物传感器转移到含有Multabody(10-5-2.5-1.25-0.65-0.32nM)或IgG(500-250-125-62.5-31.2-15.6nM)的系列稀释的孔中来测量缔合速率。通过将生物传感器浸入含有缓冲液的孔中来测量解离速率。这两个步骤的持续时间均为180秒。为了实现与PGDM1400的选择性结合，在BG5050 SOSIP.664三聚体的CD4b中引入了D368R突变，因此破坏了N49P7与此抗原的结合。类似地，产生与β2-微球蛋白复合的gp120亚基93TH057、可溶性CD4和hFcRn，分别作为N49P7、iMab和Fc的配体。使用His标记的MPER肽(HHHHH HNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKKKK(SEQ ID NO:47)，购自GenScript)测试与10E8的结合。使用重组表达的hFcγRI和hFcγRIIa来测量具有效应子功能沉默突变的IgG和Multabody的结合亲和力。使用Ni-NTA纯化，然后使用20mM磷酸盐，pH 8.0，150mM NaCl缓冲液中的尺寸排阻色谱法，以纯化BG5050 SOSIP.664D368R、CD4、93TH057、hFcRn、hFcγRI和hFcγRIIa。

尺寸排阻色谱法与多角度光散射联用(SEC-MALS)。将MiniDA WN TREOS和OptilabT-rEX折射剂(Wyatt)与Agilent Technologies1260infinity II HPLC联用。将50μg的24聚体PGDM1400 scFab-铁蛋白融合物、T-01MB和T-02MB加载到20mM磷酸钠，pH 8.0，150mMNaCl中的Superose 6 10/300(GE Healthcare)柱上。使用ASTRA软件(Wyatt)执行数据收集和分析。

稳定性测量。使用UNit系统(Unchained Labs)确定Multabody、亲本IgG、12聚体同源寡聚Fab和Fc以及N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体的解链温度(T_m)和聚集温度(T_agg)。通过测量重心平均(BCM)荧光来获得T_m，同时T_agg确定为在266nm波长下观察到静态光散射相对于基线增加50％时的温度。将样品浓缩至1.0mg/mL，并且以1℃的增量从25℃升温至95℃。使用UNit分析软件计算三次独立测量的平均值和标准误差。

在加速应力条件下进一步分析稳定性。将Multabody稀释在20mM磷酸钠，pH 8.0，150mM NaCl中，浓缩至10mg/mL，并且在40℃下孵育四周。每周，基于SEC的可溶性含量来计算正确折叠蛋白质的百分比。在PsV中和测定中评估了孵育期之前(第0周)和之后(第4周)的样品，以比较分子的功能活性。

病毒生产和TZM-bl中和测定。通过将293T细胞与HIV-1亚型B骨架NL4-3.Luc.R^-E质粒(AIDS研究和参考试剂程序(ARRRP))以及编码全长Env克隆的质粒共转染来生成一组14个HIV-1假型病毒，如上所述(45)。HIV分离株X2088.c09、ZM106.9和3817.v2.c59由艾滋病疫苗发现合作组织(CAVD)友情提供，并且pCNE8、1632_S2_B10、THRO4156.18、278-50、ZM197M.PB7、SF162、t257-31、Du422.1和BG505来自NIH ARRRP。使用KOD-Plus诱变试剂盒(Toyobo,Osaka,Japan)通过定点诱变在BG505 Env表达载体中引入突变T332N。通过添加从NIH ARRRP获得的HIV分离株p1054.TC4.1499、6535、ZM214M.PL15、AC10.29、p16845、P6244_13.B5.4576、pM246F_C1G、TRJO4551、QH0692和pCAAN5342生成扩展的25个假型HIV-1的组。使用标准TZM-bl中和测定在单循环中和测定中确定中和作用(45)。简而言之，将IgG和Multabody与10-15％组织培养感染剂量的假病毒在37℃下孵育1小时，然后与TZM-bl细胞一起孵育44-72小时。通过向细胞中添加Britelite plus试剂(PerkinElmer)并且使用Synergy Neo2多功能测定微孔板读板仪(Biotek Instruments)测量相对光单位(RLU)的发光来监测病毒中和。通过将具有全长、Env缺陷型HIV基因组SG3dEnv的Env表达质粒转染到293T细胞中，生成118个PsV的扩展多枝组中的HIV-1Env假病毒。HIV-1假病毒与Multabody(初始浓度为10μg/ml，并且滴定6倍七次)在37℃下一起孵育1小时，然后添加TZM-bl细胞。感染后48小时，细胞裂解并添加荧光素底物(Promega)，对荧光素酶表达进行定量。对于用亲本IgG进行的中和测定，使用了哈佛医学院病毒学和疫苗研究中心的历史数据(初始浓度为50μg/ml，滴定5倍七次)。10μg/mL的截止值限度用于确定抗体宽度。

抗体依赖性吞噬作用。5μL红色荧光Neutravidin微球(Invitrogen,F8775)用PBS+0.1％ BSA洗涤两次，并与10μg的生物素化的93TH057抗原一起孵育。按照制造商说明，使用EZ-link Sulfo-NHS生物素化试剂盒(Thermo Scientific，2143)执行生物素化。用PBS/0.1％BSA将最终体积调节至200μL，并且在4℃下旋转孵育过夜。使用前将珠子洗涤两次以去除未结合的蛋白质，并以每5μL未标记珠子体积重悬在200μL中。

通过将93TH057涂覆的荧光珠(每个样品10μL)与10μL的1、5和10μg的Multabody或抗体制剂在37℃下孵育2小时，形成免疫复合物。THP-1细胞(ATCC TIB-202)以低于5x 10⁵细胞/mL维持在RMPI+10％ FBS(Wisent)中；并且以5x 10⁴细胞/孔(200μL)的浓度添加到免疫复合物中，然后在37℃、5％ CO₂下孵育16小时。孵育后，将细胞沉淀并用PBS洗涤，然后根据制造商的方案用Live Dead可固定紫色染色剂(Invitrogen，L34995)染色。用PBS洗涤细胞，并且用2％多聚甲醛在室温下固定20分钟。将固定的细胞沉淀并且用FACS缓冲液(PBS+10％ FBS，0.5mM EDTA)洗涤一次，并且在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。在FlowJo(BD Biosciences，Ashland，OR)中分析数据，并且将吞噬作用定量为与不存在抗体的情况下的涂覆93TH057的珠子相比，吞噬作用增加的百分比。将抗人FcR结合抑制剂抗体(Invitrogen，14-9161-73)以推荐浓度添加到指定样品中作为额外对照。

PBMC感染。外周血单核细胞(PBMC)从三名健康血液供体获得，所有供体都提供了书面知情同意书。本研究得到了多伦多大学研究伦理委员会的批准(协议#00037384)。将血液收集在肝素化真空采血管(BD Biosciences)中，随后使用Lymphoprep(StemCellTechnologies，目录号07861)进行密度离心，分离PBMC。在重组人IL-2(50U/mL)存在下，在含有10％胎牛血清(FBS，Wisent)、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素的完全RPMI培养基(Wisent)中，用植物凝集素(PHA；Gibco)激活PBMC 72小时，然后进行HIV-1感染。激活三天后，通过将CXCR4趋向性实验室分离株IIIB(每孔150pg的p24 Gag抗原)添加到圆底96孔板中的激活的PBMC的一式三份培养物中来执行HIV-1细胞感染，所述圆底96孔板接种有RPMI+10％ FBS+25U/mL IL-2中的2×10⁵细胞/孔。在用病毒覆盖细胞之前，将Multabody(T-01MB和T-01MB.v2)或IgG混合物与病毒在室温下预孵育1小时。如所示，在存在/不存在Multabody或抗体对照的情况下以0.01-10ug/mL的剂量培养受感染的细胞。根据制造商的方案，通过在感染后第7天使用BioTEK Synergy读板仪上的高灵敏度AlphaLISA p24检测试剂盒(PerkinElmer,Waltham,MA)测量细胞游离培养物上清液中的p24 Gag蛋白的细胞外释放来评估HIV-1复制水平。

细胞活力和流式细胞术。在感染第7天，将细胞固定在2％ PFA中，并且收获细胞，以通过使用BD LSRFortessa(Becton Dickinson)执行的流式细胞术经由绝对计数进行活力测试。通过将Multabody或抗体处理的孔中的存活设门细胞总数与从未处理的对照孔中回收的细胞数进行比较来确定细胞活力。使用FACSDiva分析细胞活力数据。

药代动力学研究。使用三只6周龄雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NCG毒株代码572，Charles River Laboratories)免疫缺陷小鼠/组执行体内研究。小鼠以4/6个体为一组进行饲养。每只小鼠都有独特的标识。在以下受控条件下将动物饲养在通风笼中(II型(16x19x35 cm，占地面积＝500cm²))：22℃、55％湿度和12:12小时光暗周期，上午7点:下午7点。本研究得到了当地伦理委员会(CELEAG)的审查和批准。本研究中使用T-01MB，其由抗体PGDM1400、N49P7和10E8v4的scFab以及含有以下的IgG1 Fc的scFc片段组成：i)无突变，以及ii)效应子功能沉默突变L234A、L235A和P329G(LALAP)和I253A突变。此外，T-01MB.v2由相同的抗体特异性组成，其中i)无Fc突变，以及ii)IgG1 Fc中具有半衰期延长突变(M428L/N434S)。小鼠接受单次皮下注射200μL PBS(pH 7.5)中的5mg/kg Multabody或对照样品(与Multabody的Fab特异性相匹配的IgG混合物)。在多个时间点收集血液样品，并通过ELISA评估血清样品的循环抗体水平。简而言之，96孔Pierce镍涂层板(Thermo Fisher)涂覆有50μL的浓度为0.5μg/ml的由MB:BG5050 D368R SOSIP.664三聚体识别的His_6x标记的抗原、gp120亚基93TH057和MPER肽中的每一种，从而使用IgG和Multabody的试剂特异性标准曲线来确定循环样品浓度。HRP-蛋白A(Invitrogen)用作二级分子，并使用Epoch 2微孔板分光光度计和软件Biotek Gen5 3.03对化学发光信号进行定量。

结果

HIV-1bNAb的效力可通过亲合力增强

脱铁铁蛋白是由24个相同亚基的自寡聚作用形成的具有大约6nm流体动力学半径的球形纳米笼(图11A)。为了研究多价对中和效力的影响，我们使用人脱铁铁蛋白轻链的自组装性质，对源自最有效和最广泛的HIV-1bNAb的抗原结合(Fab)片段进行多聚化，所述片段靶向不同的HIV-1Env表位。脱铁铁蛋白亚基与单链Fab(scFab)进行基因融合。scFab是使用轻链与重链之间的柔性接头生成的，以确保正确的Fab异源二聚化。脱铁铁蛋白自组装驱动scFab的多聚化并在纳米笼外围展示抗体片段(图11B)。通过将scFab-人脱铁铁蛋白编码质粒与不同比率的非基因修饰的人脱铁铁蛋白共转染，实现不同密度的多聚化Fab(图11C、图12)。使用小的HIV-1假病毒(PsV)组将scFab-脱铁铁蛋白融合物阻断HIV-1感染的能力与对应的IgG进行比较(图11D)。引人注目的是，PGDM1400是迄今为止描述的最有效的抗HIVbNAb之一，与传统IgG形式相比，当经由脱铁铁蛋白轻链进行多聚化时，显示出高10至40倍的中和效力。bNAb 10-1074还显示出中和效力的相当大的提高(4至40倍)，而bNAb 10E8、N49P7和VRC01则没有显示出效果或显示出较温和的增强。

Multabody有效且广泛地中和HIV-1

鉴于这些结果，我们试图使用我们先前描述的基于脱铁铁蛋白分裂设计的Multabody平台来增加PGDM1400的覆盖范围(41)。所述策略包括将四螺旋脱铁铁蛋白亚基分离成两半(N-铁蛋白和C-铁蛋白)并且将它们的N末端融合至不同特异性的scFab(图13A)。这种方法允许在纳米笼表面包含更多数量的Fab，从而产生具有更高亲合力的最终分子。此外，所述设计允许三种不同抗体特异性以及可结晶片段(Fc)的有效组合，以赋予分子IgG样性质，诸如易于利用蛋白A亲和力纯化(图14)。具体而言，我们将scFab PGDM1400与近泛中和抗体10E8v4(具有改善的溶解度的修饰的10E8(42))和N49P7的scFab以及人IgG1同种型的Fc的单链构建体(scFc)组合(图13A)。为了探索是否还可以设计交叉靶向HIV-1Env及其主要受体CD4的Multabod y，我们用伊巴珠单抗(iMab)替代了N49P7，伊巴利珠单抗是一种CD 4导向的附着后抑制剂，已被证明有效抑制HIV-1进入(43，44)(图15A)。所得的三特异性Multabody，分别称为T-01MB和T-02MB，形成约2.4MDa的高度装饰且均质的颗粒(图13B-图13C，图15B-图15C)，其具有与对应的IgG类似的热稳定性(图16)。使用表位特异性分子：BG505 SOSIP D368R(PGDM1400)、93TH057 gp120/C D4(N49P7/iMab)和MPER肽(10E8v4)，在结合动力学实验中评估三特异性Multabody的表位接合(图17)。以高表观结合亲和力与三种表位特异性抗原结合并且没有可检测到的解离证实了Multabody中三种抗体特异性的存在(图13d、图15d)。

首先在标准化体外TZM-bl中和测定中针对一组14个PsV评估Multabody的中和效力和宽度(45)。14-PsV组被设计为包括低灵敏度PsV，其中至少有一个PsV对所评价的每种bNAb具有抗性(截止值IC₅₀设置为10μg/mL)。将Multabody的IC₅₀值和宽度与以下比较：(i)每个单独的IgG，(ii)IgG混合物，其含有Multabody中存在的相同相对量的每种IgG，(iii)N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体(46)。T-01MB和T-02MB针对此组分别表现出93％和100％宽度(截止值IC₅₀设置为10μg/mL)，中值IC₅₀值分别为0.009μg/mL(3.9pM)和0.008μg/mL(3.5pM)(图13E、图15E和表8)。因此，当以μg/mL和nM计算Multabody时，与IgG混合物和三特异性抗体的IC₅₀值相比，中值IC₅₀值分别存在大约一个和两个数量级的降低。对各个IC₅₀值的检查揭示了对PGDM1400 IgG中和具有抗性的PsV对Multabody也不太敏感(图13F、图15E和表8)。这些数据表明，Multabody的中和性质很大程度上取决于颗粒内的三种抗体特异性之一，在本例中为PGDM1400。

工程改造脱铁铁蛋白支架

为了进一步提高Multabody的中和性质，我们对其设计引入了一些修改，并制作了第二代版本(MB.v2)。在原始MB中，scFc位于N-铁蛋白半部的N末端，并且只有一个Fab(Fab2或Fab3)掺入到每个功能性Fc同源二聚体的Multabody中(图18A，顶部)。相比之下，优化的MB.v2每个Fc同源二聚体含有更多数量的Fab。为了实现这一点，单体Fc片段(即，一条Fc链)和scFab分别位于C-铁蛋白半部的C末端和N末端(图18A底部，图19A)。结果，功能性Fc同源二聚体的二聚化驱动MB.v2颗粒的组装以及分裂铁蛋白互补和铁蛋白亚基寡聚化(图18A，图19B)。重要的是，形成一个功能性Fc的同源二聚化确保了不同于PGDM1400的四个Fab(即，两个Fab2和两个Fab3)的组装，从而有利于完全组装的MB.v2中三个Fab中每一个的更平衡的亲合力。

优化的Multabody设计在T-01背景(PGDM1400、N49P7、10E8v4)中进行了测试，所述背景靶向HIV-1Env上的三个表位。所得Multabody(T-01MB.v2)组装成形状良好的球形颗粒，与之前表征的T-01MB相比在形态上没有显著差异(图18B)。抗原与BG505 SOSIP D368R、93TH057 gp120和MPER肽的结合证实了T-01MB.v2中三个Fab特异性的正确折叠(图18C)。此外，新的Multabody版本保留了与T-01MB报道的相同的高热稳定性，T_agg值为67℃(图18D)。将Multabody浓缩至10mg/mL，并且通过在40℃下孵育四周来进行加速稳定性测试。随着时间的推移对可溶性蛋白量的评估揭示了，Multabody在这些条件下高度稳定，超过70％的样品在30天内保持可溶。与第0周时的效力相比，第4周时观察到Multabody的中和效力仅略有损失，从而进一步证实了稳定性(图18E)。

Multabody的药代动力学与对应的IgG类似

抗体Fc结构域能够与多种受体相互作用，包括Fcγ受体(FcγR)和新生儿Fc受体(FcRn)，其分别赋予效应子功能和体内半衰期。然而，Fc亲合力会对具有多个Fc片段的分子的循环时间产生负面影响(41，47)。实际上，T-01MB显示出与Fc受体的强结合，包括在生理pH下与人FcRn的结合(图20A-图20B)，以及高亲和力和低亲和力FcγR的结合(图20C)。因此，我们在T-01MB的Fc中引入了LALAP(L234A、L235A和P329G)和I253A突变的独特组合，以分别减少与FcγR和FcRn的结合，并且实现了对于IgG1分子观察到的相当的结合(图20A-图20C)。T-01MB.v2显示出与IgG1更类似的结合谱，在酸性pH下与人FcRn具有相当的结合，并且在生理pH下没有结合，即使在半衰期延长突变LS(M428L/N434S)的情况下也是如此(图20A-图20B)。T-01MB.v2与FcγR的结合产生了与使用T-01MB中的LALAP FcR沉默突变获得的低结合谱类似的低结合谱(图20C)。对于两个MB版本观察到的不同结合模式可能是由于Fc片段在分子内的不同排列(图18A、图19A)。尽管FcγRI结合较低，但是使用抗原涂覆的珠子的吞噬实验显示两种Multabody形式在THP-1细胞中诱导Fc依赖性内化，其水平与用对应的IgG混合物实现的水平类似(图20D)。

接下来，我们检查了具有和不具有工程改造的Fc的两种Multabody形式的体内生物利用度。对NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NCG)免疫缺陷小鼠皮下施用5mg/kg单剂量，并且连续15天，每两天测量血清中每种分子的量。正如体外表征所预期的，只有具有IgG样结合谱的Fc工程改造的Multabody显示出数天的体内暴露，衰减率与亲本IgG混合物类似(图20E)。Multabody施用具有良好的耐受性，没有体重下降(图20F)或可见的副作用。

通过MB.v2实现了非凡的效力和泛中和宽度

我们评估了T-01MB.v2针对PsV组的中和谱，所述中和谱是通过将11种对PGDM1400具有高度抗性的HIV-1毒株添加到我们先前的组中而生成的。所得25-PsV组含有56％的对PGDM1400 IgG中和具有抗性的PsV变体(截止值IC₅₀设置为10μg/mL)(图21A-图21B)。正如所预期的，T-01MB的宽度和效力在PGDM1400抗性PsV的存在下受到极大影响(图21A-图21B，表8)。然而，按照工程改造，抗体N49P7和10E8v4的中和谱在T-01MB.v2中更占优势，从而允许此优化的Multabody实现泛中和，同时保留先前观察到的这种类型的分子的增强的中和效力(图21A-图21B，表8)。当针对118PsV的扩展多枝组进行测试时，T-01MB.v2与对应的IgG混合物的泛中和宽度相匹配(100％病毒覆盖率，截止值IC₅₀设置为10μg/mL)，但表现出显著的中和效力(图21C-图21D、图22A和表9)。具体而言，IgG混合物和T-01MB只能分别中和9％和8％的PsV，IC₅₀值为0.001μg/mL，而在T-01MB.v2的情况下，50％的PsV仍然被中和，IC₅₀值仅为0.001μg/mL(图21C)。值得注意的是，Multabody实现了仅0.0009μg/mL(0.4pM)的中值IC₅₀值，因此与IgG混合物相比，在质量和摩尔浓度上分别实现了更有效32倍和490倍的泛中和(图21D)。此外，T-01MB.v2的IC₈₀证实了其优于单个IgG和IgG混合物的中和倾向，中和了所测试的所有病毒株的96％，中值IC₈₀值为0.005μg/mL(2.2pM)(图21C-图21D、图22A和表9)。重要的是，Multabody还阻断了具有复制能力的CXCR4趋向性HIV-1IIIB毒株对原代外周血单核细胞(PBMC)的感染(图22B)，显示出比匹配的IgG混合物增强的效力，并且对细胞活力没有任何影响(图22C)。

讨论

最近的AMP临床试验突显了bNAb的效力和宽度的预期重要性，使其成为能够保护免受HIV-1感染的治疗剂。利用我们先前描述的Multabody技术中使用的抗体亲合力原理来提高抗体针对SARS-CoV-2的效力(41)，我们在此设计了第二代Multabody平台，以针对HIV-1的巨大序列多样性提供优越的中和宽度和效力。

与第一代Multabody格式(41)相比，优化的Multabody设计的最显著特征是每个功能性Fc结构域自缔合的Fab的相对数量。与先前描述的Multabody平台的设计所强加的1:1Fc:10E8v4/N49P7比率相比，在T-01MB.v2的设计中，每个二聚体Fc的MB中掺入两个N49P7Fab和两个10E8v4 Fab。优化的Multabody中这两个Fab的较高数量有利于它们的亲合力，因此，它们对颗粒的中和特征的贡献更大。这与T-01MB形成对比，T-01MB主要依赖于PGDM1400的中和性质。每种抗体更平衡的贡献反映在T-01MB.v2更好的功能性质上，其表现出100％的跨进化枝中和覆盖率，中值IC₅₀值为0.0009μg/mL。此外，测试的118种假病毒中的83％的病毒感染被T-01MB.v2阻断，IC₈₀值低于1μg/ml，所述值最近被提议为在人中赋予体内保护所需的效力阈值(35)。然而，仍不清楚是否应当以质量或摩尔浓度考虑保护的预测因子。实际上，尽管Multabody与IgM相比具有类似的流体动力学半径和几何尺寸(41)，但Multabody的摩尔质量比IgG重大约10倍。因此，如果摩尔浓度是与保护相关的体内测量值，则T-01MB.v2表现出0.4pM的极低的中值IC₅₀。对应地，在118-HIV-1PsV毒株的96％中实现了低于6.7nM的IC₈₀效力(IgG的摩尔当量为1μg/ml)。这些显著的中和性质超过了使用先前描述的双特异性和三特异性抗体所获得的中和性质(46，48–50)。在这些抗体形式中，有限的亲合力阻碍了高亲合力和多特异性的组合，因此，效力和宽度仅限于亲本mAb。

生物治疗领域越来越倾向于开发高价分子。策略范围从将IgM的μ尾端添加至IgG的恒定区后生成十二价IgM样分子(51，52)，到设计替代抗体形式。其中包括Fab以线性头尾方式的融合物(53)、附加的IgG(54–56)或串联的(Tamdab)(57)或与IgG的CH3融合(双-双抗体)的双抗体组合(58)。此外，还使用多聚化支架来克服IgG二价的限制并提高抗体的生物活性，所述支架诸如p53(59)、亮氨酸拉链螺旋(60)、链霉亲和素(61)、barnase-barstar模块(62)、病毒样纳米颗粒(63)以及最近的从头抗体笼形成蛋白(de novo antibody cage-forming protein)(64)。尽管这些方法很有吸引力，但它们作为治疗剂的成功开发面临着不同的挑战。依赖于抗体可变片段(Fv)的多聚抗体形式通常与低稳定性相关，因此具有较高的聚集倾向(65)。此外，由复合物的亲和常数决定的非共价融合物的解离会限制分子的体内长期稳定性。与此形成鲜明对比的是，Multabody建立在完整的IgG组分(Fab和Fc)之上，所述组分与热稳定、功能沉默的人脱铁铁蛋白轻链支架融合，因此即使在热应力下也是高度稳定的IgG样分子。先前在具有免疫能力的C57BL/6小鼠中皮下施用的小鼠替代Multabody显示出与其亲本IgG类似的不可检测水平的抗药物抗体，这为Multabody平台潜在的低固有免疫原性提供了原理验证(41)。未来对高等生物体的研究将有助于确定由人源序列编码的Multabody的免疫原性，我们认为所述免疫原性可能主要由基础抗体序列的性质决定。

大生物制剂的生物利用度是与提高亲合力的工程改造方法相关的另一个挑战(63)。Multabody已被工程改造为包含Fc结构域，从而实现FcRn介导的分子再循环。由于Fc亲合力，T-01MB在pH 6.0下与FcRn的结合提高了几个数量级，然而，pH 7.4下亲和力的同时提高限制了此策略在延长半衰期方面的应用，并且需要若干个突变以减少Fc与FcRn和FcγR的结合，以免超过观察到的IgG的结合亲和力。在T-01MB.v2的情况下未观察到这种增强的Fc受体亲合力，其中脱铁铁蛋白C末端的Fc链融合导致形成具有倒置且位置更远的Fc结构域的颗粒，因此，Fc亲合力降低。与先前使用小鼠替代Multabody的研究类似(41)，Fc亲合力调节策略成功地导致Multabody分子随着时间推移的衰减速率与亲本IgG混合物非常类似。除了有利的药代动力学谱外，对FcγR具有残留结合的两种形式的Multabody在体外将Fc介导的吞噬作用诱导至与亲本IgG混合物类似的水平，至少在共表达FcγRI和FcγRIIa两者的THP-1系统中(66)。需要未来的实验以充分表征Multabody触发免疫效应子功能的能力及其体内影响。

从我们在本研究中表征的有限数量的抗体特异性来看，我们观察到，靶向位于HIV-1 Env三聚体顶点的表位的抗体(诸如PGDM1400)在配制为Multabody时似乎对中和效力具有最大的益处。当表位更靠近病毒膜时，这种效力的增加不太明显，如10E8的情况。效力增强对表位位置的依赖性可能进一步受到低表面刺突密度(67)、HIV-1表面上那些稀疏Env三聚体的排列(68)或某些表位的可及性的影响，所述表位可能或多或少存在空间封闭。有鉴于此，探索如何通过Multabody平台增强针对具有较高表面密度和紧密间隔的刺突的病毒的抗体效力，并进一步确定表位位置对亲合力介导的效力增强的影响将是很有趣的。

用iMab(一种CD4导向的附着后抑制剂)替换N49P7，产生了具有有效中和活性的功能性Multabody，证明这种类型的颗粒可以实现病毒表位和细胞受体的交叉靶向。这些数据提出了一个有趣的可能性，即Multabody技术也可以实施于其他领域，所述领域促进受体在不同实体之间的结合，诸如免疫疗法中的细胞间相互作用。总体而言，我们的蛋白质工程改造研究证明了人脱铁铁蛋白作为模块化纳米笼共同构建抗体亲合力和多特异性以增强功能的多功能性。

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序列表

序列内的下划线表示接头序列；序列内的粗体表示铁蛋白或铁蛋白亚基序列；方框和粗体残基表示相对于参考分子(例如，相对于IgG1Fc)发生突变的残基。

等效方案/其他实施方案

尽管已经结合其具体的实施方案描述本发明，但应当理解能够对本发明进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖大体上符合本发明的原理的、包括虽然不属于本公开的范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的手段并可以应用于上文中阐述的必要特征中的任何变型、用途或者变更。

Claims (80)

1.一种自组装多肽复合物，其包含

(a)多个第一融合多肽，每个第一融合多肽包含(1)Fc多肽，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中所述Fc多肽包含相对于相同Ig类别的参考Fc链具有一个或多个突变的Fc链，以及

(b)多个第二融合多肽，每个第二融合多肽包含(1)抗原结合抗体片段，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基。

2.如权利要求1所述的自组装多肽复合物，

其中(1)如果所述Fc多肽是IgG1 Fc多肽，则所述抗原结合片段不是结合SARS-CoV-2的Fab片段；且/或(2)如果所述纳米笼单体是小鼠铁蛋白单体并且所述Fc多肽是小鼠IgG2aFc多肽，则所述抗原结合抗体片段不是结合CD19的Fab片段。

3.如权利要求1或2所述的自组装多肽复合物，其中所述纳米笼单体是铁蛋白单体。

4.如权利要求3所述的自组装多肽复合物，其中所述铁蛋白单体是铁蛋白轻链。

5.如权利要求4所述的自组装多肽复合物，其不包含任何铁蛋白重链或铁蛋白重链的亚基。

6.如权利要求3、4或5所述的自组装多肽复合物，其中所述铁蛋白单体是人铁蛋白。

7.如权利要求1-6中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述Fc多肽是IgG1 Fc多肽。

8.如权利要求1-6中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述Fc多肽是IgG2 Fc多肽。

9.如权利要求1-8中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述Fc多肽是单链Fc(scFc)。

10.如权利要求1-8中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述Fc多肽是Fc单体。

11.如权利要求1-10中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述抗原结合抗体片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域。

12.如权利要求11所述的自组装多肽复合物，其中所述抗原结合抗体片段是Fab片段。

13.如权利要求1-12中任一项所述的自组装多肽复合物，其中每个第二融合多肽不包含任何CH2或CH3结构域。

14.如权利要求1-13中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述一个或多个突变包括与改变的与FcRn的结合相关的突变或突变组。

15.如权利要求14所述的自组装多肽复合物，其中所述突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：M252、I253、S254、T256、K288、M428和N434或其组合，其中编号是根据EU索引。

16.如权利要求15所述的自组装多肽复合物，其中所述突变或突变组包括M428和N434处的突变，其中编号是根据EU索引。

17.如权利要求16所述的自组装多肽复合物，其中所述突变或突变组包括M428L和N434S突变，其中编号是根据EU索引。

18.如权利要求14或15所述的自组装多肽复合物，其中所述改变的与FcRn的结合是减少的与FcRn的结合。

19.如权利要求15所述的自组装多肽复合物，其中与减少的与FcRn的结合相关的所述突变或突变组选自由I253A、I253V和K288A及其组合组成的组，其中编号是根据EU索引。

20.如权利要求1-19中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述一个或多个突变包括与改变的效应子功能相关的突变或突变组。

21.如权利要求20所述的自组装多肽复合物，其中所述Fc多肽是IgG1 Fc多肽，并且其中所述突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：L234、L235、G236、G237、P329和A330或其组合，其中编号是根据EU索引。

22.如权利要求所述的自组装多肽复合物，其中所述改变的效应子功能是减少的效应子功能。

23.如权利要求22所述的自组装多肽复合物，其中与减少的效应子功能相关的所述突变或突变组选自由LALA(L234A/L235A)、LALAP(L234A/L235A/P329G)、G236R、G237A和A330L组成的组，其中编号是根据EU索引。

24.如权利要求1-23中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述纳米笼单体或其亚基是铁蛋白单体亚基，并且

a.每个第一融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基；或者

b.每个第一融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基。

25.如权利要求1-24中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述自组装多肽复合物的特征在于第一融合多肽与第二融合多肽的1:1比率。

26.如权利要求1-25中任一项所述的自组装多肽复合物，其中在每个第一融合多肽内，所述Fc多肽经由氨基酸接头连接至所述纳米笼单体或其亚基。

27.如权利要求1-26中任一项所述的自组装多肽复合物，其中在每个第一融合多肽内，所述Fc多肽在所述纳米笼单体或其亚基的N末端处连接至所述纳米笼单体或其亚基。

28.如权利要求1-27中任一项所述的自组装多肽复合物，其中在每个第二融合多肽内，所述抗原结合抗体片段经由氨基酸接头连接至所述纳米笼单体或其亚基。

29.如权利要求1-28中任一项所述的自组装多肽复合物，其中在每个第二融合多肽内，所述抗原结合抗体片段在所述纳米笼单体或其亚基的N末端处连接至所述纳米笼单体或其亚基。

30.如权利要求1-29中任一项所述的自组装多肽复合物，其还包含多个第三融合多肽，每个第三融合多肽包含(1)抗原结合抗体片段，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中所述第三融合多肽与所述第二融合多肽不同。

31.如权利要求30所述的自组装多肽复合物，其中所述第三融合多肽内的所述抗原结合抗体片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域。

32.如权利要求31所述的自组装多肽复合物，其中所述第三融合多肽内的所述抗原结合抗体片段是Fab片段。

33.如权利要求30-32中任一项所述的自组装多肽复合物，其中每个第三融合多肽不包含任何CH2或CH3结构域。

34.如权利要求31-33中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述第二融合多肽的所述抗原结合抗体片段能够结合第一表位，所述第三融合多肽的所述抗原结合片段能够结合第二表位，并且所述第一表位和所述第二表位是不同的并且不重叠。

35.如权利要求34所述的自组装多肽复合物，其中第一表位和第二表位来自相同的蛋白质。

36.如权利要求35中任一项所述的自组装多肽复合物，其包含总共24至48个融合多肽。

37.如权利要求1-36中任一项所述的自组装多肽复合物，其包含总共至少24个融合多肽。

38.如权利要求37所述的自组装多肽复合物，其包含总共至少32个融合多肽。

39.如权利要求38所述的自组装多肽复合物，其具有总共约32个融合多肽。

40.如权利要求1-39中任一项所述的自组装多肽复合物，其中当施用于有需要的受试者时，所述自组装多肽复合物的半衰期为至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

41.如权利要求1-40中任一项所述的自组装多肽复合物，其特征在于，在施用包含所述自组装多肽复合物的组合物后，所述自组装多肽复合物具有与通过相同施用途径且在类似组合物中施用的参考IgG分子基本上类似的半衰期。

42.如权利要求41所述的自组装多肽复合物，其中所述参考IgG分子是所述第二融合多肽内的所述抗原结合抗体片段所源自的抗体，或者是所述第三融合多肽内的所述抗原结合抗体片段所源自的抗体。

43.如权利要求40-42中任一项所述的自组装多肽复合物，其中当施用于有需要的受试者时，所述自组装多肽复合物的半衰期为约3天至约35天。

44.如权利要求1-43中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述自组装多肽复合物在施用于有需要的受试者后至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天能够在血清中检测到。

45.如权利要求1-44中任一项所述的自组装多肽复合物，其中当施用于有需要的受试者时，所述自组装多肽复合物的曲线下面积(AUC)为至少10天·μg/mL、至少25天·μg/mL、至少50天·μg/mL、至少100天·μg/mL、至少200天·μg/mL、至少300天·μg/mL、至少400天·μg/mL、至少500天·μg/mL、至少750天·μg/mL、至少1000天·μg/mL、至少1500天·μg/mL、至少2000天·μg/mL、至少2500天·μg/mL、至少3000天·μg/mL、至少4000天·μg/mL、至少5000天·μg/mL、至少6000天·μg/mL、至少7000天·μg/mL或至少8000天·μg/mL。

46.如权利要求1-45中任一项所述的自组装多肽复合物，其中当施用于有需要的受试者时，所述自组装多肽复合物的曲线下面积(AUC)为约10天·μg/mL至约8000天·μg/mL。

47.如权利要求1-46中任一项所述的自组装多肽复合物，其中当施用于有需要的受试者时，所述自组装多肽复合物的最大浓度(C_max)为至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少250μg/mL、至少500μg/mL、至少750μg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少75mg/mL、至少100mg/mL、至少250mg/mL、至少500mg/mL或至少750mg/mL。

48.如权利要求1-47中任一项所述的自组装多肽复合物，其中当施用于有需要的受试者时，所述自组装多肽复合物的最大浓度(C_max)为约10μg/mL至约750mg/mL。

49.如权利要求40-48中任一项所述的自组装多肽复合物，其中所述受试者是人。

50.如权利要求40-49中任一项所述的自组装多肽复合物，其中向所述受试者施用是通过肠胃外施用。

51.如权利要求40-49中任一项所述的自组装多肽复合物，其中向所述受试者施用是通过皮下施用、静脉内施用、肌内施用、鼻内施用或通过吸入。

52.如权利要求1-51中任一项所述的自组装多肽复合物，其特征在于所述自组装多肽复合物在抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)体外模型中诱导ADCP。

53.如权利要求52所述的自组装多肽复合物，其中以至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的靶标内化的水平诱导所述ADCP。

54.一种方法，其包括向哺乳动物受试者施用包含如权利要求1-53中任一项所述的自组装多肽复合物的组合物。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述受试者是人。

56.如权利要求54或55所述的方法，其包括通过全身途径施用。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述全身途径包括皮下、静脉内或肌内注射、吸入或鼻内施用。

58.如权利要求54-57中任一项所述的方法，其中在施用后，所述自组装多肽复合物在所述哺乳动物受试者中的半衰期为至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中在施用后，所述自组装多肽复合物在所述哺乳动物受试者中的半衰期为3天至35天。

60.如权利要求54-59中任一项所述的方法，其中在施用后，所述自组装多肽复合物在所述哺乳动物受试者中的曲线下面积(AUC)为至少10天·μg/mL、至少25天·μg/mL、至少50天·μg/mL、至少100天·μg/mL、至少200天·μg/mL、至少300天·μg/mL、至少400天·μg/mL、至少500天·μg/mL、至少750天·μg/mL、至少1000天·μg/mL、至少1500天·μg/mL、至少2000天·μg/mL、至少2500天·μg/mL、至少3000天·μg/mL、至少4000天·μg/mL、至少5000天·μg/mL、至少6000天·μg/mL、至少7000天·μg/mL或至少8000天·μg/mL。

61.如权利要求54-60中任一项所述的方法，其中在施用后，所述自组装多肽复合物在所述哺乳动物受试者中的曲线下面积(AUC)为约10天·μg/mL至约8000天·μg/mL。

62.如权利要求54-61中任一项所述的方法，其中在施用后，所述自组装多肽复合物在所述哺乳动物受试者中的最大浓度(Cmax)为至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少250μg/mL、至少500μg/mL、至少750μg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少75mg/mL、至少100mg/mL、至少250mg/mL、至少500mg/mL或至少750mg/mL。

63.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中在施用后，所述自组装多肽复合物在所述哺乳动物受试者中的最大浓度(Cmax)为约10μg/mL至约750mg/mL。

64.一种融合多肽，其包含(1)Fc多肽，其连接至(2)纳米笼单体或其亚基，其中所述Fc多肽包含相对于相同Ig类别的参考Fc链具有一个或多个突变的Fc链，其中所述一个或多个突变包括与改变的与FcRn的结合和/或改变的效应子功能相关的突变或突变组。

65.如权利要求64所述的融合多肽，其中所述纳米笼单体是铁蛋白单体。

66.如权利要求65所述的融合多肽，其中所述铁蛋白单体是铁蛋白轻链。

67.如权利要求66所述的融合多肽，其不包含任何铁蛋白重链或铁蛋白重链的亚基。

68.如权利要求65-67中任一项所述的融合多肽，其中所述铁蛋白单体是人铁蛋白。

69.如权利要求64-68中任一项所述的融合多肽，其中所述Fc多肽是IgG1 Fc多肽。

70.如权利要求64-68中任一项所述的融合多肽，其中所述Fc多肽是IgG2 Fc多肽。

71.如权利要求64-70中任一项所述的融合多肽，其中所述Fc多肽是单链Fc(scFc)。

72.如权利要求64-71中任一项所述的融合多肽，其中所述突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：M252、I253、S254、T256、K288、M428和N434或其组合，其中编号是根据EU索引。

73.如权利要求64-72中任一项所述的融合多肽，其中所述改变的与FcRn的结合是减少的与FcRn的结合。

74.如权利要求73所述的融合多肽，其中与减少的与FcRn的结合相关的所述突变或突变组选自由I253A、I253V和K288A及其组合组成的组，其中编号是根据EU索引。

75.如权利要求64-71中任一项所述的融合多肽，其中所述Fc多肽是IgG1 Fc多肽，并且其中所述突变或突变组包括以下残基中的一个或多个处的突变：L234、L235、G236、G237、P329和A330或其组合，其中编号是根据EU索引。

76.如权利要求64-71以及75中任一项所述的融合多肽，其中所述改变的效应子功能是减少的效应子功能。

77.如权利要求76所述的融合多肽，其中与减少的效应子功能相关的所述突变或突变组选自由LALA(L234A/L235A)、LALAP(L234A/L235A/P329G)、G236R、G237A和A330L组成的组，其中编号是根据EU索引。

78.如权利要求64-77中任一项所述的融合多肽，其中所述纳米笼单体或其亚基是铁蛋白单体亚基，并且

a.每个第一融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基；或者

b.每个第一融合多肽包含作为N-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基，并且每个第二融合多肽包含作为C-半铁蛋白的铁蛋白单体亚基。

79.如权利要求64-78中任一项所述的融合多肽，其中在每个第一融合多肽内，所述Fc多肽经由氨基酸接头连接至所述纳米笼单体或其亚基。

80.如权利要求64-79中任一项所述的融合多肽，其中在每个第一融合多肽内，所述Fc多肽在所述纳米笼单体或其亚基的N末端处连接至所述纳米笼单体或其亚基。