CN118006735B - 一种snp芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SNP芯片及其制备方法和应用，所述SNP芯片包括其包括修饰有两种引物的固相载体，通过所述引物，在该固相载体上固定有由多个文库序列制备的寡核苷酸探针的簇，所述寡核苷酸探针从5’末端至3’末端依次包括P7序列，接头序列1、特异性杂交序列和所述文库序列经酶切后产生的至少四个核苷酸的序列，所述核苷酸任意选自A、T、C、G。本发明还提供所述SNP芯片的制备方法和由所述SNP芯片构成的试剂盒，所述SNP芯片具有高密度，能够检测2000万个以上的SNP位点，通量更高，可以适用于需要大通量地检测SNP变异位点的需求，通过规模效应降低成本。

Description

一种SNP芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种SNP芯片及其制备方法和应用。

背景技术

基因芯片(gene chip)，又叫单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)微阵列(array)，将数百万DNA标记序列有规律地排列在玻片或特殊硅片上，固定形成DNA或SNP探针阵列。它的工作原理是通过固定在芯片上的DNA标记序列与目标基因组发生碱基配对反应，从而精准鉴定基因信息。在植物育种中应用最多的是SNP芯片，即通过芯片上的SNP探针检测生物个体中大量的SNP变异位点，从而可以推测基因组的基因型和关键的遗传变异。专门为基因组育种设计的SNP芯片，被称之为“基因组育种芯片”。目前，市场上有两家美国生物技术公司，Illumina和Affymetrix提供基因组育种芯片制作技术。Illumina公司主要基于Infinium平台技术制作SNP芯片，Affymetrix公司则利用Axiom平台技术制作SNP芯片。Illumina Infinium芯片是基于光纤微珠的高密度芯片，将特定的基因探针序列与直径3μm的微珠偶联，然后在基质的微孔中进行自我组装，从而形成微珠芯片。AffymetrixAxiom芯片采用的是原位光刻技术，通过光刻在基片上原位合成基因探针序列。这两款芯片在人类和动物基因组变异研究中已得到广泛应用，近年来在植物基因组育种中也得到了应用。

目前常规所制作的SNP芯片最多能检测500多万个SNP位点，通量相对较小，成本较高。而植物基因组育种中会涉及到需要大通量的SNP芯片，如何实现更高通量的SNP芯片，有待进一步开发。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种SNP芯片及其制备方法和应用，本发明所述制备方法，可以用于制作高密度的SNP芯片，检测1000万个以上的SNP位点，通量更高，同时通过规模效应降低成本。

实现上述目的的技术方案包括如下。

本发明的第一个方面，是提供一种SNP芯片，其包括修饰有两种引物的固相载体，通过所述引物在该固相载体上固定有由多个文库序列制备的寡核苷酸探针的簇，所述寡核苷酸探针从5’末端至3’末端依次包括P7序列，接头序列1、特异性杂交序列和所述文库序列经酶切后产生的至少四个核苷酸的序列，所述核苷酸任意选自A、T、C、G。

本发明的第二个方面，是提供上述任一种SNP芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1.设计至少一个文库序列，所述文库序列由5’末端至3’末端依次包括P7序列，接头序列1、特异性杂交序列、限制性内切酶酶切位点序列、接头序列2、P5序列，所述限制性内切酶酶切位点序列是在酶切之后能产生3’端至少四个任意核苷酸的序列；

S2.将至少一个文库序列混合，加载到在固相载体上，扩增和测序，所述固相载体上固定有文库序列簇，其中，所述P7序列与所述固相载体上的引物杂交，使文库在芯片表面扩增；

S3.进行酶切，所述文库序列经酶切后形成固定于固相载体寡核苷酸探针簇，干燥，即得。

在其中一些实施例中，所述限制性内切酶是能够对酶切位点序列在酶切之后能产生3’端至少四个任意核苷酸的内切酶，在一些优选实施例中，是BaeⅠ、BarⅠ。

在其中一些实施例中，所述至少四个任意核苷酸为4-6个核苷酸，所述核苷酸任意选自A、T、C、G。

在其中一些实施例中，混合时每种所述文库序列的用量比是等量。

在其中一些实施例中，步骤S2中的扩增和测序，是按照单端测序方式进行。

本发明的第三个方面，是提供上述任一种SNP芯片在植物育种中检测SNP变异位点的应用。

本发明的第四个方面，是提供一种检测物种SNP变异位点的方法，包括以下步骤：

S1)获得上述任一种SNP芯片；

S2)将待测样本与所述SNP芯片杂交，杂交完成后探针捕获到对应的基因，以基因为模板进行一个碱基的延伸反应，延伸所用的dNTP为带荧光基团的阻断dNTP，延伸完成后对芯片拍照获得各个捕获区域聚合的碱基类型。

在其中一些实施例中，所述物种是植物或动物。

本发明的第五个方面，是提供一种检测物种SNP变异位点的试剂盒，其包括任一种上述SNP芯片。

在其中一些实施例中，还包括限制性内切酶，优选所述限制性内切酶是BaeⅠ、BarⅠ。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明是以测序芯片为基础制作SNP芯片，以测序过程中扩增的方式生成多种探针，并通过测序的方式获得探针的位置信息；通过限制性内切酶酶切的办法获得捕获探针，由于芯片上检测SNP位点需要检测各种不同的基因，每个不同cluster区域的探针序列都不同，因此使用的内切酶必须为酶切后产生3’端NNNN序列的，如BaeⅠ、BarⅠ等等。本发明获得的SNP芯片在检测相同数量的SNP位点情况下最多可同时检测70-80个样本，或者在检测相同样本数量时最多可检测2000-2500万个SNP位点，通量显著提高，可以大通量地用于植物基因组育种中检测SNP变异位点，通过规模效应降低成本。

附图说明

图1是文库序列的构成示意图。

图2是SNP芯片制备时扩增、测序和酶切的示意图。

图3是实施例1中制备的芯片通过Salus Pro测序仪进行扫描拍照的结果示意图。

图4是实施例1中制备的芯片通过荧光信号计算酶切的效率的结果示意图。

图5是SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4每种文库在芯片上生成cluster点位置信息示意图。

图6是SNP碱基信息检测图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的一些实施例中，提供了制备SNP芯片的方法以及使用该SNP芯片的检测方法，包括以下步骤：

设计文库：文库序列主要分为5个部分，其中P5、P7是测序前在构成芯片的基片(修饰有两种引物的固相载体)上进行扩增的序列，接头序列1、接头序列2(adaptor1、adaptor2)是两段固定序列，接头序列2是对探针(特异性杂交序列)进行测序以获得探针位置信息的引物，而探针则是用来与待测样本中需要检测SNP位点的DNA杂交，接头序列2和探针之间包含限制性内切酶酶切位点，限制性内切酶可以是在酶切之后产生3’端NNNN(N为任意选自A、T、C、G的核苷酸)的任意一种，比如BaeⅠ、BarⅠ等等，以便在测序之后进行酶切暴露探针端。所述文库序列的构成参加图1。

其中，所述“固相载体指核苷酸分子可以与其附着的任意不溶的底物或基质，例如乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、黄金表面、玻璃表面和硅片。作为固相载体可以是平坦的玻璃表面。固相载体可以被安装在流通池内部，以允许各种试剂溶液相互作用。以此固相载体构成芯片的基片。

在某些实施方案中，固相载体可包含已被“官能化”的惰性底物或基质，例如通过添加一层或一涂层中间材料，所述中间材料包含允许与分子例如多核苷酸共价附着的反应基团。作为非限制性实例，此类载体可包括在惰性底物例如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶层。在此类实施方案中，多核苷酸可以直接共价附着到中间层(例如水凝胶)上，但是中间层自身可能非共价地附着于底物或基质(例如玻璃底物)的其它层。因此，对固相载体的共价附着应被解释为涵盖此类设计。

扩增、测序和酶切：扩增和测序按照单端测序方式进行。将设计好的文库加载到芯片表面，芯片表面修饰了P7、P5的互补序列，从而使文库杂交到芯片表面，接着进行聚合酶延伸、变性、聚合酶延伸、变性的循环过程直至完成扩增，随后进行测序，获得每个探针区域在芯片表面的位置信息，随后进行酶切，获得能最终进行样本捕获的芯片。参见图2。

杂交和检测：将芯片与待检测样本(例如DNA待检测样本)进行杂交，杂交完成后探针捕获到对应的基因，以基因为模板进行一个碱基的延伸反应，延伸所用的dNTP为带荧光基团的阻断dNTP，延伸完成后对芯片拍照获得各个捕获区域聚合的碱基类型，同时与第一次测序的照片进行配准，这样即有了探针位置信息和聚合碱基信息，从而分析出基因的SNP信息。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：SNP芯片制作以及酶切效率检测

在金斯瑞生物科技股份有限公司合成以下四种文库序列，将合成的序列干粉用Low TE buffer按合成管上所标浓度稀释到4nM，随后取该四种文库各2ul等比例混合在一起，加入1992ul的3XSSC溶液振荡混匀，获得2ml的混合文库溶液。

以下四种文库序列，分别地，从5’末端至3’末端依次包括P7序列，接头序列1、特异性杂交序列(下划线部分)、限制性内切酶酶切位点序列、接头序列2、P5序列构成。

SEQ ID NO.1:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACTGCGATGCTGGATGTTTGCACTCTGGATTCATCTCTGTTT TTCTTTAAGTTttcacNNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNNNNNNNCCCGTTCGCAACATGTCTGGCGTCATATCTTGTGACTACAGCACCCTCGACTCTCGC。

SEQ ID NO.2:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCAGCCTGCTATCTGTTTACGTATCTCCTTCAAGTTTCTAAGTC AGTGTGGCAAGcccaaNNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNNNNNNNCCCGTTCGCAACATGTCTGGCGTCATATCTTGTGACTACAGCACCCTCGACTCTCGC。

SEQ ID NO.3:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTTTTCCTGAAACAATCAAGGGATAGAAAAGAAAAACATGTGA TACAAATCTCCtcattNNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNNNNNNNCCCGTTCGCAACATGTCTGGCGTCATATCTTGTGACTACAGCACCCTCGACTCTCGC。

SEQ ID NO.4:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGCTGTGTACCCCGTATGCCATCTCAAAATGGTTGAGGGACGTAATGGTTTATAttcatNNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNNNNNNNCCCGTTCGCAACATGTCTGGCGTCATATCTTGTGACTACAGCACCCTCGACTCTCGC。

其中，N指ATCG中的任一种，Y代表CT中的任一种。

将第一步中混合好的2ml溶液加入到Salus Pro测序试剂套装(SRM-SE75)的样本孔中，其中测序试剂套装包含测序试剂盒以及测序芯片(修饰有两种引物的固相载体，两种引物分别是P5序列和P7序列)，SNP捕获芯片是以测序芯片为基础制作而成，在随后参照测序套装说明书对测序芯片在Salus Pro测序仪上进行SE75的测序，测序结果如表1所示。

通过Salus Pro测序仪上的basecall算法获得SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4每种文库在芯片上生成cluster点(图5)的位置信息((SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4每种文库分别对应图5和图6中的SEQ 1文库、SEQ 2文库、SEQ 3文库、SEQ 4文库)。

表1.测序结果：

3)测序完成后，测序芯片上有两条流道，分别为流道1、流道2，用200ulwashbuffer清洗芯片，随后取100ul BaeI(10ul rCutSmartbuffer、5ul BaeI、85ulNuclease-free water)溶液加入芯片流道2进行BaeⅠ或BarⅠ酶切，将芯片置于37℃烘箱反应30min。

4)反应完成后在测序芯片两条流道中加入100ul甲酰胺formamide，55℃反应10min，接着用200ul washbuffer清洗芯片，SNP捕获芯片制作完成，此时芯片流道1做为对照组，芯片流道2上的文库序列已经酶切之后暴露探针端(红色标记)，如下所示；

SEQ ID NO.5:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACTGCGATGCTGGATGTTTGCACTCTGGATTCATCTCTGTTT TTCTTTAAGTTTTCAC。其中，TTCAC为酶切后留在寡核苷酸探针上的3’末端的随机序列。

SEQ ID NO.6:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCAGCCTGCTATCTGTTTACGTATCTCCTTCAAGTTTCTAAGTC AGTGTGGCAAGCCCAA。其中，CCCAA为酶切后留在寡核苷酸探针上的3’末端的随机序列。

SEQ ID NO.7:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTTTTCCTGAAACAATCAAGGGATAGAAAAGAAAAACATGTGA TACAAATCTCCTCATT。其中，TCATT为酶切后留在寡核苷酸探针上的3’末端的随机序列。

SEQ ID NO.8:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGCTGTGTACCCCGTATGCCATCTCAAAATGGTTGAGGGACGT AATGGTTTATATTCAT。其中，TTCAT为酶切后留在寡核苷酸探针上的3’末端的随机序列。

5)在上海生工合成以下荧光引物(SEQ ID NO.9)，将合成的荧光引物干粉用LowTE buffer按合成管上所标浓度稀释到100μM，随后取2uL稀释后的引物溶于198μL的3XSSC溶液中，芯片两条流道各通入100μL溶液，随后55℃反应3min，25℃反应3min，反应完成后用200ul washbuffer清洗芯片，置于Salus Pro测序仪上进行扫描拍照，拍照结果如图3所示。其中流道1由于没有进行酶切，杂交上SEQ ID NO.9荧光引物的信号较强，流道2经过酶切暴露探针端，能杂交上荧光引物的序列已经被切除，导致产生的荧光信号变弱。

通过荧光信号计算酶切的效率约为65％，如图4所示。

SEQ ID NO.9:Cy5-TATGACGCCAGACATGTTGCGAACGGG。

6)进行样本检测：取100ul需要进行SNP位点检测的DNA样本加入芯片，42℃反应10min，随后使用步骤2所述测序试剂盒再额外进行1个碱基的延伸，通过测序仪拍照获得图片上各个cluster(簇)点所发荧光，从而判断SNP位点的碱基信息，同时将这次拍照的图片与步骤2中的测序图片进行比对获得相应每个cluster点的基因信息，完成SNP检测(图6)；以SEQ ID NO.1文库经酶切后形成的探针为例，在经过步骤2的SE75测序之后，获得了SEQID NO.1探针在芯片上的位置信息，随后在杂交检测样本后进行额外一个碱基延伸，通过测序图片可以获得该对应位置延伸上的碱基信息，图6上对应的cluster点在A碱基通道发光，则说明在这个样本中SEQ ID NO.1检测的基因SNP位点碱基为A碱基；同理可推，SEQ IDNO.2检测的基因SNP位点为C碱基，SEQ ID NO.3检测的基因SNP位点为T碱基，SEQ ID NO.4检测的基因SNP位点为G碱基。说明这4种文库所形成的探针，捕获到样本中对应基因的SNP碱基信息，获得这些信息后可以应用到下游生信分析。

本发明与现有技术相比检测通量更高，可以检测同一个样本内更多的SNP位点，或者同时检测多个样本，在通量更高的情况下通过规模效应显著降低检测成本，以illumina和Affymetrix的SNP芯片为例，芯片最多只能检测500多万个SNP位点，同时检测样本8-24个，从表1的结果可以推算出，表1的Raw Q30表明测序质量，total reads表明了芯片上4种文库的数量，平均每种文库大约21230K个；假如需要检测一个样本50K的位点，那就需要50K种文库，每个文库重复80次，则一共是4000K文库，按照表1的84919K的数量，除以4000K，则表明一条流道可以至少检测20个样本，而一张芯片可以做成4条流道，则一张芯片可以检测80个样本；假如把样本数量缩减，一条流道只检测4个样本，那么就可以检测一个样本250K个位点，与前面所列信息可对应起来。可见，本发明在检测相同数量的SNP位点情况下最多可同时检测70-80个样本，或者在检测相同样本数量时最多可检测2000-2500万个SNP位点，通量显著提高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种SNP芯片的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

S1.设计至少一个文库序列，所述文库序列由5’末端至3’末端依次包括P7序列，接头序列1、特异性杂交序列、限制性内切酶酶切位点序列、接头序列2、P5序列，所述限制性内切酶酶切位点序列是在酶切后能在特异性杂交序列的3’端产生至少5个任意核苷酸的序列；

S2.将至少一个文库序列混合，加载到在固相载体上，扩增和测序，所述固相载体上固定有文库序列簇，其中，所述P7序列与所述固相载体上的所述文库序列簇中的引物杂交，使文库在芯片表面扩增；

S3. 进行限制性内切酶酶切，所述文库序列经酶切后形成固定于固相载体寡核苷酸探针簇，所述寡核苷酸探针从5’末端至3’末端依次包括P7序列、接头序列1、特异性杂交序列，和所述文库序列经酶切后在特异性杂交序列的3’端产生5个任意核苷酸的序列，所述5个任意核苷酸的序列中的核苷酸任意选自A、T、C、G，干燥，即得；

所述限制性内切酶是BaeⅠ或BarⅠ；

所述P7序列如CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT所示，

所述接头序列1如TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT所示，

所述接头序列2如CCCGTTCGCAACATGTCTGGCGTCATA所示，

所述P5序列如TCTTGTGACTACAGCACCCTCGACTCTCGC所示。

2.根据权利要求1所述的SNP芯片的制备方法，其特征是，混合时每种所述文库序列的用量比是等量。

3.根据权利要求1-2任一项所述的SNP芯片的制备方法，其特征是，步骤S2中的扩增和测序，是按照单端测序方式进行。

4.根据权利要求1-3任一项所述制备方法获得的SNP芯片。

5.权利要求4所述的SNP芯片在植物育种中检测SNP变异位点中的应用。

6.一种检测物种SNP变异位点的试剂盒，其特征是，包括权利要求4所述SNP芯片。

7.一种检测物种SNP变异位点的方法，其特征是，包括以下步骤：

S1)获得权利要求4所述SNP芯片；

S2)将待测样本与所述SNP芯片杂交，杂交完成后探针捕获到对应的基因，以基因为模板进行一个碱基的延伸反应，延伸所用的dNTP为带荧光基团的阻断dNTP，延伸完成后对芯片拍照获得各个捕获区域聚合的碱基类型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述物种是植物或动物。