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CN118006559A - 一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用 Download PDF

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CN118006559A
CN118006559A CN202410414441.XA CN202410414441A CN118006559A CN 118006559 A CN118006559 A CN 118006559A CN 202410414441 A CN202410414441 A CN 202410414441A CN 118006559 A CN118006559 A CN 118006559A
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CN
China
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dopaminergic
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Application number
CN202410414441.XA
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Inventor
陈志国
韩德强
王雪瑶
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Beijing Geriatrics Medical Research Center
Xuanwu Hospital
Original Assignee
Xuanwu Hospital
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用，该制备方法包括对诱导神经干细胞进行基因编辑，使其表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di，得到编辑后的诱导神经干细胞；对所述编辑后的诱导神经干细胞进行分化培养，使其表达多巴胺能神经细胞的标志物，即制备得到受调控的多巴胺能神经细胞。通过该制备方法可在体外高效率定向分化得到多巴胺能神经细胞，且CNO可调控其细胞功能；将该细胞移植入帕金森病小鼠模型中可在脑内分化为中脑A9区域多巴胺能神经元，改善帕金森病小鼠行为学，并且受到CNO远程调控。

Description

一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用。
背景技术
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是全球第二大发病率的神经退行性疾病，具有庞大的发病人群。PD的发病病理是中脑黑质多巴胺能细胞的减少。因此，利用干细胞的替代治疗PD是目前研究治疗方案的重点。
在神经系统干细胞领域内，干细胞向多巴胺能（dopamine，DA）神经元分化能力、分化效率、体内存活率、临床安全性、供体组织的可用性和伦理问题等一直是研究者们关心的重点。研究者们已经研究出各种不同类型的细胞，如胎脑细胞、胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）、间充质干细胞（MSC）等。其中ESC、iPSC是目前神经系统应用最广泛的干细胞。他们可以分化为多种细胞类型，其中包括多巴胺能神经元前体细胞（DAP），为应用于帕金森病的干细胞治疗提供了基础。但ESC、iPSC的应用可能会增加肿瘤发生的风险。
近日来，诱导神经干细胞来源的多巴胺能前体细胞（induced neural stem cell-derived dopaminergic precursors cells, iNSC-DAPs）在离体和动物在体实验中表现出良好的治疗效果，同时其具有低免疫原性和低致瘤性的特点。然而，由于引入外来细胞，细胞替代治疗PD仍存在不可控性，存在移植物诱导异动症的副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用，通过该制备方法可在体外高效率定向分化得到多巴胺能神经细胞，且CNO可调控其细胞功能；将该细胞移植入帕金森病小鼠模型中可在脑内分化为中脑A9区域多巴胺能神经元，改善帕金森病小鼠行为学，并且受到CNO远程调控。
为此，第一方面，本发明提供一种受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，包括对诱导神经干细胞（iNSCs）进行基因编辑，使其表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di，得到编辑后的诱导神经干细胞；对所述编辑后的诱导神经干细胞进行分化培养，使其表达多巴胺能神经细胞的标志物，即制备得到受调控的多巴胺能神经细胞。
通过本发明提供的方法可制备得到受氯氮平-n-氧化物（CNO）调控的多巴胺能神经细胞。在体外和体内均验证了其细胞功能可受CNO调控，具有良好的临床应用前景。
在一些实施方式中，所述标志物包括FoxA2、NURR1、TH、Tuj1中的至少一种。例如，所述标志物为FoxA2、NURR1中的至少一种。
上述标志物中，FoxA2是底板区域多巴胺能前体细胞（dopaminergic precursorcells，DAP）特异性蛋白，可提示细胞向中脑A9区域DA神经元分化。NURR1是中脑A9区域成熟DA神经元的表面标志物。TH、Tuj1是成熟DA神经元的分子标志物，在A9区域和A10区域成熟DA神经元内均有表达。
在一些实施方式中，所述分化培养的步骤包括：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
第一阶段培养，在分化培养的前10天，应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有SAG1和FGF8；
第二阶段培养，在第一阶段培养之后，应用第二阶段培养基进行培养；所述第二阶段培养基含有cAMP、DAPT、ascorbic acid、BDNF、GDNF、TGF-b3。
在一些实施方式中，所述第二阶段培养的时间为3-26天。
在一些实施方式中，所述第一阶段培养基的包括：DMEM/F12，胰岛素（Insulin），N2添加剂，B27添加剂，GlutaMAX，ENAA，SAG1，FGF8。
在一些实施方式中，所述第二阶段培养基包括：DMEM/F12，胰岛素（Insulin），N2添加剂，B27添加剂，GlutaMAX，ENAA，cAMP，DAPT，抗坏血酸（ascorbic acid），BDNF，GDNF，TGF-b3。
在一些实施方式中，所述基因编辑的方法包括：采用CRISPR/Cas9技术向诱导神经干细胞的AAVS1位点敲入表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di。
在一些实施方式中，所述基因编辑的方法包括：向所述诱导神经干细胞转染表达Cas9、靶向AAVS1位点的gRNA的质粒，兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di的供体质粒。
在一些实施方式中，所述gRNA的序列为SEQ ID NO：1。
在一些实施方式中，所述表达Cas9、靶向AAVS1位点的gRNA的质粒的构建方法包括：将所述gRNA的对应DNA序列可操作性地连接至px458质粒中。
在一些实施方式中，所述抑制性受体hM4Di的供体质粒的构建方法包括：将AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry质粒的mcherry切割，并且在hM4Di的下游插入T2A-ZsGreen片段，使hM4Di与T2A-ZsGreen片段由T2A序列连接，即所述抑制性受体hM4Di的供体质粒。
在一些实施方式中，所述兴奋性受体hM3Dq的供体质粒的构建方法包括：将AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry质粒的mcherry切割，并且在hM3Dq的下游插入T2A-ZsGreen片段，使hM3Dq与T2A-ZsGreen片段由T2A序列连接，即所述兴奋性受体hM3Dq的供体质粒。
本发明的第二方面，提供一种受调控的多巴胺能神经细胞，其通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到。
在一些实施方式中，所述多巴胺能神经细胞为多巴胺能前体细胞（DAP）、多巴胺能（DA）神经元中的至少一种。
通过分化培养，使得编辑后的诱导神经干细胞向多巴胺能神经元方向分化；在此过程中，编辑后的诱导神经干细胞依次分化为多巴胺能前体细胞和多巴胺能神经元。通过FoxA2标志物阳性，可表征分化得到多巴胺能前体细胞；当NURR1、TH或Tuj1标志物阳性时，可表征分化得到多巴胺能神经元。在一些实施例中，按照本发明提供的分化培养步骤，由所述第一阶段培养10天以及第二阶段培养0~8天可获得多巴胺能前体细胞；由所述第一阶段培养以及第二阶段培养20天以上，可获得多巴胺能神经元。
在一些实施方式中，所述多巴胺能神经元为A9区多巴胺能神经元。通过NURR1标志物阳性，可表征A9区多巴胺能神经元。
在一些实施方式中，所述受调控的多巴胺能神经细胞包括第一阶段细胞和第二阶段细胞；
所述第一阶段细胞通过以下方法制备得到：对所述编辑后的诱导神经干细胞进行第一阶段培养；所述第一阶段培养包括应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有SAG1和FGF8；所述第一阶段培养的时间为10天；
所述第二阶段细胞通过以下方法制备得到：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
第一阶段培养，在分化培养的前10天，应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有SAG1和FGF8；
第二阶段培养，在第一阶段培养之后，应用第二阶段培养基培养3天；所述第二阶段培养基含有cAMP、DAPT、ascorbic acid、BDNF、GDNF、TGF-b3；
所述第一阶段细胞和第二阶段细胞的比例为1-2:7；例如可为1:7。
本发明的第三方面，提供所述受调控的多巴胺能神经细胞在制备治疗帕金森病药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明提供了从诱导神经干细胞出发制备得到受调控的多巴胺能神经细胞的方法。通过该方法可高效率、快速制备得到受CNO调控的多巴胺能神经细胞，已经过了体内、体外试验的验证。
iNSC被敲入外源基因，有可能会对iNSC本身神经干细胞特性造成破坏，使其失去干性、自我更新能力和向神经系统细胞定向分化的能力。根据本发明提供的方法，在敲入兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di后，iNSC可在体外定向分化，制备得到多巴胺能前体细胞、多巴胺能神经元；将经体外分化得到的多巴胺能前体细胞移植到帕金森病小鼠模型中，可进一步分化为DA神经元，通过给予CNO进行药物依赖性的精确调控。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：iNSC鉴定结果；
其中，（A）iNSC免疫荧光染色鉴定：SOX1、SOX2、PAX6、NESTIN、Olig2、Ki67均为阳性结果；标尺：200 μm；（B）iNSC免疫荧光染色鉴定：OCT4、SSEA4、TRA-1-60均为阴性结果；标尺：200 μm；（C）iNSC核型分析结果显示诱导未使细胞基因组突变；
图2：AAVS1-hM4Di-T2A-ZsGreen质粒模型图；
图3：AAVS1-hM3Dq-T2A-ZsGreen质粒模型图；
图4：EGFP-iNSC、hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC三种细胞系的鉴定结果；
其中，（A）EGFP-iNSC、hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC三种细胞系活细胞荧光照片，显示各克隆及克隆内细胞均表达绿色荧光；上图为光镜照片；下图为荧光照片；标尺：100μm；（B）Genotyping PRC结果显示，EGFP-iNSC、hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC三种细胞系均获得异质性（红色星星）和同质性（白色星星）两种克隆；上图为插入位点正确性检测DNA电泳图，箭头表示正确插入位点的条带位置；下图为细胞同质性和异质性检测，箭头表示异质性或未插入外源基因的条带位置；
图5：EGFP-iNSC、hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC三种细胞系可在体外向DA神经元方向定向分化；
其中，（A）iNSC体外向DA神经元定向分化策略示意图；（B）免疫荧光染色结果，显示FoxA2、NURR1、TH和Tuj1均呈现阳性结果，具有阳性信号；标尺：200 μm；（C）对（B）中的免疫荧光染色鉴定定量结果，显示FoxA2+细胞可达90%以上，NURR1+细胞可达90%以上，TH+细胞存在约20%，FoxA2+ TH+的双阳性细胞占TH+细胞的比例约为95%；
图6：EGFP-iDA、hM4Di-iDA、hM3Dq-iDA全细胞膜片钳结果；
其中，（A）基线、加入CNO、洗脱CNO的实时动作电位；（B）在基线、加入CNO、洗脱CNO时，动作电位频率和静息膜电位的统计学结果；n=3；
图7：EGFP-DAP、hM4Di-DAP、hM3Dq-DAP细胞系在帕金森病小鼠模型中的存活和分化情况；
其中，（A）免疫荧光照片显示移植物在帕金森病小鼠模型移植后位置、存活情况和TH和 ZsGreen表达情况；白色框指示移植物；标尺：500 μm；（B）免疫荧光照片显示三种细胞系在帕金森病小鼠模型中的存活和分化情况；三组移植物在体内存活且分化，表达FoxA2，TH，NURR1，HNA，Tuj1，STEM121和ZsGreen或EGFP；其中，ZsGreen或EGFP、FoxA2和TH，ZsGreen或EGFP、NURR1和TH存在共表达；标尺：左侧大图片100 μm，右侧小图片250 μm；（C）定量分析FoxA2，TH，NURR1在移植物中的表达量和FoxA2和TH，NURR1和TH共表达的统计；
图8：细胞移植前后的阿扑吗啡诱导旋转结果统计图；展示了EGFP组，hM4Di组，hM3Dq组，6-OHDA单侧损伤组，假手术组和正常组在移植前，移植后4周、8周和12周的诱导旋转结果；
图9：细胞移植前后的转棒试验结果统计图；展示了EGFP组，hM4Di组，hM3Dq组，6-OHDA单侧损伤组，假手术组和正常组在移植前（bT），移植后4周（pT 4weeks）、8周（pT8weeks）的掉落时间结果；
图10：对细胞移植后小鼠施加CNO，对小鼠转棒试验的影响结果统计图；展示了EGFP组，hM4Di组，hM3Dq组，6-OHDA单侧损伤组，假手术组和正常组在移植前（bT），移植后4周（pT）腹腔注射生理盐水（Saline）、CNO、CNO代谢后（pCNO）的掉落时间结果；
上述附图中，*p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, and ****p<0.0001。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
仙台病毒转染试剂盒（CytoTune®-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit），购自Life Technologies。
PBMC完全培养基：StemProTM-34培养基，100 ng/mL重组人干细胞生长因子SCF，20ng/mL IL-3，20 ng/mL IL-6，100 ng/mL FLT-3，2 mM L-Glutamine。
PBMC培养基：StemProTM-34培养基，1×GlutaMax。
iNSCs基础培养基（按500mL计算）：240mL DMEM/F12，240mL NeuralBasal-A，5mLN2添加剂，5mL B27添加剂，5mL GlutaMAX，5mL ENAA。
iNSCs完全培养基：iNSCs基础培养基，3 μM CHIR99021，2 μM SB431542，10 ng/mLhrLIF。
iNSCs分化基础培养基（按500 mL计算）：480 mL DMEM/F12，5 μg/mLInsulin，5mLN2添加剂，5mL B27添加剂，5mL GlutaMAX，5mL ENAA。
iNSCs体外DA分化一阶段培养基：iNSCs分化基础培养基，1 μMSAG1，100 ng/mLFGF8。
iNSCs体外DA分化二阶段培养基：iNSCs分化基础培养基，10 ng/mLBDNF，10 ng/mLGDNF，0.2 mL Ascorbic acid，0.5 mM cAMP，10 μM DAPT，1 ng/mL TGFβⅢ。
px458质粒，购自Addgene，货号#48138。
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry质粒，购自Addgene，货号#80947。
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry质粒，购自Addgene，货号#80948。
AAVS1-Pur-CAG-EGFP质粒，购自Addgene，货号#80945。
除另外指出，细胞培养条件均为37℃，5%CO2。
实施例1
利用仙台病毒（SEV）将健康志愿者血液单个核细胞（PBMC）重编程为诱导神经干细胞（induced neural stem cells，iNSCs），通过免疫荧光染色实验和核型分析来确认获得的iNSCs细胞特性。具体包括：
纳入一名健康志愿者，抽取志愿者80 mL血液。对获得的新鲜血液使用Ficoll进行梯度密度离心，分离出PBMC，使用PBMC完全培养基培养4天。Day 0时，采用仙台病毒转染试剂盒，将携带c-MYC、KOS、Klf4的SEV转染PBMC，获得SEV-PBMC，此时细胞培养基为PBMC基础培养基。Day 3时，将SEV-PBMC放入PDL/Laminin包被的六孔板中进行培养，并将细胞培养上清更换为iNSC完全培养基。Day 7时，观察细胞，可见iNSC细胞克隆出现。Day 14-21时，观察到iNSC细胞克隆增殖明显，选择细胞呈不规则形态、细胞间连接紧密、细胞克隆成极性分布的iNSC细胞克隆进行克隆挑选。将挑选后的细胞克隆放入PDL/Laminin包被的六孔板中继续培养，重复多次克隆挑选，获得稳定维持的iNSC细胞克隆。
将上述步骤获得的细胞克隆进行免疫荧光染色鉴定，iNSC细胞核内大量表达SOX1、SOX2、PAX6和Ki67，表达量（对比DAPI表达）可达95%以上（图1A）；胞质内可见大量NESTIN、Olig2蛋白表达，表达量（对比DAPI表达）超过90%（图1A）。同时，iNSC在OCT4、SSEA4、TRA-1-60表达中呈现阴性，表达量低于1%（图1B）。将诱导获得的iNSC送核型鉴定，可见与正常健康细胞核型一致（图1C）。鉴于此，表明上述使用SEV诱导获得的iNSC属于神经干细胞，具有神经干细胞的干性和自我更新能力，且具有神经干细胞向神经系统细胞定向分化的能力。同时，SEV的介入未引起基因组核型的改变，未对基因组造成不可逆改变和损伤。
实施例2
本实施例制备得到了分别敲入hM4Di、hM3Dq的iNSC细胞，同时设置了敲入EGFP的对照细胞。具体步骤包括：
（1）gRNA的选择与Cas9-gRNA质粒的构建
设计多条靶向AAVS1区域的gRNA，将gRNA构建入px458质粒中，然后将构建得到的gRNA-px458质粒用脂质体转染方法转染至HEK293T细胞；培养转染后的细胞并选取表达绿色荧光的细胞进行基因组提取，然后通过T7 touchdown PCR检测测试各gRNA的活性，筛选的得到活性最高的gRNA为SEQ ID NO：1（GTCACCAATCCTGTCCCTAG），选用由该gRNA构建得到的gRNA-px458质粒进行后续基因编辑。
（2）hM4Di供体质粒、hM3Dq供体质粒的构建
首先采用AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry质粒作为敲入hM4Di的供体质粒（donorplasmid），将其与步骤（1）构建的gRNA-px458共转染至细胞，并试图通过红色荧光和绿色荧光双重筛选目标细胞系，然而实际操作中发现gRNA-px458表达的绿色荧光无法捕捉，而AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry的红色荧光信号弱，不利于观察，使得筛选效率显著较低。
鉴于此，将AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry质粒的mcherry切割，并且在hM4Di的下游插入T2A-ZsGreen片段（二者由T2A序列连接），制备得到的质粒简称为AAVS1-hM4Di-T2A-ZsGreen，其质粒谱图如图2所示。从而，当其敲入基因组后可表达绿色荧光，可通过单荧光（绿色荧光）来达到筛选目标细胞系的目的。
类似地，构建得到hM3Dq供体质粒。将AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry质粒的mcherry切割，并且在hM3Dq的下游插入T2A-ZsGreen片段（二者由T2A序列连接），制备得到的质粒简称为AAVS1-hM3Dq-T2A-ZsGreen，其质粒谱图如图3所示。
（3）hM4Di-iNSC细胞、hM3Dq-iNSC细胞及对照细胞
通过CRISPR/Cas9技术利用脂质体转染将AAVS1-hM4Di-T2A-ZsGreen质粒和步骤（1）得到的gRNA-px458质粒转染入实施例1制备得到的iNSC细胞，转染72小时后，可荧光显微镜观察到有细胞表达绿色荧光，然后利用流式细胞仪分选得到表达绿色荧光的细胞。继续培养分选得到的细胞一周，再次通过流式细胞仪分选表达绿色荧光的细胞；继续培养十天，细胞增殖形成单克隆，保留克隆内细胞全部表达绿色荧光的克隆（图4A），并进行genotyping PCR检测（引物如下：引物1-F：AACCTGTCGTGCCAGCGGAT，引物1-R：TGAGTTTGCCAAGCAGTCACCC；引物2-F：GCTCAGTCTGGTCTATCTGCC，引物2-R：GATCCTCTCTGGCTCCATCG），根据检测结果（图4B）确认获得目的基因敲入正确位点且DNA双链均敲入目的基因的细胞单克隆，将其命名为hM4Di-iNSC细胞。
采用相同的方法，将AAVS1-hM3Dq-T2A-ZsGreen质粒和gRNA-px458质粒转染至iNSC细胞并经培养、筛选得到hM3Dq-iNSC细胞。
此外，采用AAVS1-Pur-CAG-EGFP作为EGFP供体质粒，采用相同的方法，得到对照细胞EGFP-iNSC。
对制备得到的hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC、EGFP-iNSC三种细胞系进行免疫荧光染色鉴定，鉴定结果表明，SOX1、SOX2、PAX6、NESTIN、Olig2、Ki67均为阳性结果且定量结果显示阳性率均达90%以上；MAP2、NEUN、S100b均为阳性结果。
实施例3
本实施例对hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC、EGFP-iNSC三种细胞系进行定向分化，得到多巴胺能神经元（DA神经元）。
iNSC具有向神经系统细胞定向分化的能力，其中包括DA神经元。自然分化状态下，即不添加任何诱导分化小分子，仅维持细胞正常营养的状态下，iNSC分化细胞可见DA神经元，但分化效率低下，仅有1%的细胞可见DA神经元特异性蛋白。
因此，本发明引入诱导分化小分子提高分化效率，参考图5A，将体外定向分化DA神经元分为两个培养阶段：
（1）第一阶段：在分化培养的前10天，在培养基中添加SAG1和FGF8对iNSC进行第一阶段分化；采用的培养基具体为：iNSCs体外DA分化一阶段培养基（iNSCs分化基础培养基，1μMSAG1，100 ng/mLFGF8），隔天换液；
（2）第二阶段：SAG1和FGF8作用10天后，去除上述两小分子，开始添加cAMP、DAPT、ascorbic acid、BDNF、GDNF、TGF-b3小分子进行第二阶段分化；采用的培养基具体为：iNSCs体外DA分化二阶段培养基（iNSCs分化基础培养基，10 ng/mL BDNF，10 ng/mL GDNF，0.2 mLAscorbic acid，0.5 mM cAMP，10 μM DAPT，1 ng/mL TGFβⅢ），隔天换液。
在分化至不同天数时，取样固定细胞，通过免疫荧光对以下标志物进行鉴定：FoxA2，底板区域DAP特异性蛋白，可提示细胞向中脑A9区域DA神经元分化；NURR1，中脑A9区域成熟DA神经元的表面标志物；TH、Tuj1，成熟DA神经元的分子标志物，在A9区域和A10区域成熟DA神经元内均有表达。通过鉴定上述标志物，可观察细胞是否向DA神经元定向分化及其分化效率。经鉴定，在第一阶段分化第10天（DIV 10）至第二阶段分化第8天（DIV 18）的细胞具有向中脑A9区域DA神经元分化的能力，即称为多巴胺能前体细胞（DAP），细胞可分别命名为hM4Di-DAP、hM3Dq-DAP。
在二阶段分化第5天（DIV 15）、第8天（DIV 18）、第20天（DIV 30）时固定细胞，通过免疫荧光对上述标志物进行鉴定，免疫荧光鉴定的成像结果如图5所示。
根据图5可知，定向分化细胞大量包含FoxA2+、NURR1+、TH+和Tuj1+细胞（图5B），其中FoxA2+细胞可达90%以上；同样NURR1+细胞可达90%以上；TH+细胞存在约20%。FoxA2+、TH+的双阳性细胞占TH+细胞的比例约为95%（图5C）。综上所述，hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC、EGFP-iNSC可向中脑A9区域DA神经元定向分化，分化效率较高，分化至第30天（DIV 30）时NURR1+细胞可达90%，表明获得大量多巴胺能神经元细胞（DA），将分化为DA的细胞系命名为hM4Di-iDA、hM3Dq-iDA、EGFP-iDA。此外，三种细胞系在体外向DA方向定向分化时，实时荧光显微镜和免疫荧光染色检测均显示分化细胞始终表达EGFP或ZsGreen的绿色荧光，证明在DA分化过程中EGFP、hM4Di、hM3Dq三种外源基因被稳定表达。
实施例4
本实施例验证了实施例3分化得到的DA神经元细胞系在体外具有电生理活性，且可受CNO调节。具体步骤包括：
按照实施例3中的分化方法，在体外分化36天（DIV 36）时，取出分化细胞进行检测。将分化细胞放入含有人工脑脊液的小室孵育30分钟。30分钟后，利用电阻为5 MΩ的毛细玻璃微针作为电极，选取细胞形态完整饱满且具有绿色荧光的神经元细胞进行全细胞膜片钳实验。记录静息电位和施加5mV电刺激时的诱发动作电位：先进行基线测量8分钟，然后向小室液体加入50μM氯氮平-n-氧化物（CNO），测量16分钟；将小室液体更换为不含CNO的人工脑脊液并冲洗15分钟，测量5分钟。测量结果如图6所示。
基线测量结果显示，三种细胞系体外分化DA神经元均具有约-70 mV的静息电位，同时对外源人工给予的电刺激（5 mV）具有可诱发动作电位的能力。因此，EGFP、hM4Di、hM3Dq三种细胞系体外分化的DA神经元具有完整神经元功能，可产生神经电活动。
加入CNO后的测量结果显示，作为对照组的EGFP-iDA，在CNO的作用下，膜静息电位、诱发动作电位和基线水平保持一致。hM4Di-iDA在CNO的作用下，与基线水平相比，膜静息电位出现超极化现象，电位负值增大；诱发动作电位频率明显降低。相反，hM3Dq-iDA在CNO的作用下，与基线水平相比，膜静息电位出现去计划现象，电位负值减小；诱发动作电位频率明显提高。
洗脱CNO后的测量结果显示，EGFP-iDA的膜静息电位、诱发动作电位和基线水平保持一致。hM4Di-iDA、hM3Dq-iDA的膜静息电位、诱发动作电位均恢复至基线水平。
上述结果表明，通过本发明的技术方案分化得到的DA神经元具有完整成熟神经元功能，具有神经电生理活性；CNO可抑制hM4Di-iDA、激活hM3Dq-iDA的神经元电活动，调控细胞功能，控制神经递质的释放，同时，CNO的结合和洗脱对上述分化的DA神经元不会造成电生理上的损伤。
实施例5
本实施例鉴定了hM4Di-DAP、hM3Dq-DAP在帕金森病小鼠模型脑内的存活及分化状况。
具体步骤包括：
以SCID-Beige免疫缺陷鼠作为动物模型，通过单侧脑区注射六羟多巴胺（6-OHDA）实施造模手术，经行为学评估、脑片免疫组化染色评价，构建得到单侧6-OHDA损毁帕金森病小鼠模型。
分组和基线采集结束后，在单侧6-OHDA造模手术后第5周开始进行造模侧细胞移植手术。将EGFP-iNSC、hM4Di-iNSC、hM3Dq-iNSC三种细胞系按照实施例3的方法在体外向DA神经元定向分化，将分化第10天和分化第13天的细胞以1:7的比例进行混合，总细胞浓度为1×105/µL，注射位点和6-OHDA注射位点相同。移植手术结束后，正常喂养小鼠。
在细胞移植手术后12周，采集完行为学后灌注小鼠，获得小鼠脑片对以下标志物进行免疫荧光染色：FoxA2、NURR1、TH、Tuj1、STEM121、HNA等，用于评估移植细胞在小鼠脑内12周的存活及分化情况。
免疫荧光结果如图7所示，三组移植小鼠脑内移植物存在大量绿色荧光表达，可观察到绝大部分绿色荧光分布在移植原位点，无细胞迁移发生（图7A）。在三组移植物中，FoxA2、NURR1、TH、Tuj1、STEM121、HNA均有表达（图7B）。TH+细胞可见和EGFP+或ZsGreen+重叠，证明移植的三种细胞系在小鼠脑内均可分化为多巴胺能神经元，TH+ ZsGreen+/ HNA+和TH+ EGFP+/ HNA+的比例均为6%左右（图7C）。另一方面，移植细胞在小鼠脑内存在大量FoxA2+细胞，FoxA2+HNA+/ HNA+的比例约为90%（图7C）；同时，能观察到有部分细胞存在FoxA2和TH共表达现象，FoxA2+ TH+/ TH+的比例约为95%（图7C），以上可说明移植细胞在小鼠脑内可向中脑A9区域DA神经元方向分化。此外，移植细胞可见NURR1+细胞，NURR1+/ HNA+的比例约为7%（图7C）；NURR1和TH也存在共表达现象，TH+ NURR1+/ HNA+的比例约为6%（图7C）。而Tuj1+、STEM121+细胞也可见于移植细胞，Tuj1和TH、STEM121和TH存在共表达（图7B）。因此，三组移植物在小鼠脑内存活情况良好，且可分化为中脑A9区域DA神经元，发挥其功能。
实施例6
本实施例检测了移植hM4Di-DAP、hM3Dq-DAP后，帕金森病小鼠模型行为学改善情况。
单侧6-OHDA帕金森病小鼠模型存在不对称肢体运动特征，主要原因为损伤侧失去DA神经元支配，导致对侧肢体运动功能异常，肌痉挛，非随意运动减少。通过阿扑吗啡诱导旋转试验、转棒试验对单侧6-OHDA帕金森病小鼠模型的运动损伤情况进行评估。
在实施例5的细胞移植手术之前，对EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组、6-OHDA组（经造模，但后续不移植细胞）、Sham组（假手术组，未注射6-OHDA，后续不移植细胞）、Normal组（正常组，未经造模手术，且后续不进行手术）进行阿扑吗啡诱导旋转试验、转棒试验，采集基线；在细胞移植移植手术之后4周、8周、12周，再进行相同的试验以评估小鼠行为学改善情况。
1、阿扑吗啡诱导旋转试验
阿扑吗啡诱导旋转试验是评价单侧6-OHDA帕金森病小鼠模型运动损伤的经典试验之一。阿扑吗啡是DA受体激动剂之一，进入体内可激活脑内DA神经元释放多巴胺能神经递质。6-OHDA损伤侧DA神经元大量丢失，导致两侧脑区DA含量存在明显差异，进而引起不对称的肢体运动。
阿扑吗啡诱导旋转试验结果如图8所示，移植细胞前，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组、6-OHDA组向未损伤侧诱导旋转圈数均数约200圈/ 30 min；Sham组、Normal组不存在诱导旋转行为。在细胞移植手术后4周，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组诱导旋转行为有所改善，诱导旋转圈数均数约120圈/ 30 min，呈现下降趋势；6-OHDA组诱导旋转圈数保持均数约200圈/30 min。在细胞移植手术后8周，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组诱导旋转圈数较之前减少，均数约50圈/ 30 min；6-OHDA组诱导旋转圈数保持均数约200圈/ 30 min。在细胞移植手术后12周，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组诱导旋转圈数仍保持下降趋势，均数约15圈/ 30 min；6-OHDA组诱导旋转圈数有所下降，均数约180圈/ 30 min，无统计学差异。行为学采集过程中，Sham组、Normal组在各时间点均不存在诱导旋转行为。
2、转棒试验
转棒试验可评估小鼠脑区支配四肢运动协调情况。当小鼠脑区支配四肢运动正常、四肢运动协调时，则运动敏捷，可很快适应转棒疲劳仪，持续在转棒上跑动；当小鼠脑区对肢体支配能力下降，肢体运动不对称时，则运动迟缓，无法适应转棒疲劳仪，很快从转棒上掉落。主要表现为：经过3天转棒训练后，正常小鼠在正式试验中可长时间在匀加速转棒上运动，掉落前时间较长；而单侧6-OHDA帕金森病小鼠模型损伤侧支配肢体运动能力下降、运动迟缓，在正式试验中不可长时间在匀加速转棒上运动，将很快从转棒上掉落。
转棒试验结果如图9所示，纵轴表示小鼠从转棒开始至掉落所经历的时间。移植细胞前，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组、6-OHDA组较Sham组、Normal组均有行为障碍表现，具体表现为转棒掉落时间加快。在细胞移植手术后4周和8周时，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组较6-OHDA组行为和移植前行为均有所恢复，转棒掉落时间减慢。
上述结果表明，EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组在进行细胞移植后，诱导旋转行为明显好转，细胞在脑内存活分化并分泌DA，进而改善小鼠行为障碍；同时，对照组6-OHDA组、Sham组、Normal组的结果说明侧6-OHDA模型未出现自发行为改善，手术对小鼠脑区未造成影响。
实施例7
在实施例6验证了细胞移植对治疗单侧6-OHDA帕金森病小鼠模型有效的基础上，本实施例测试了是否可以在不进行立体定位，不直接接触细胞的条件下远程调控小鼠脑内的细胞系。
在细胞移植手术前（图中记为bT）、细胞移植手术后4周（图中记为pT），对EGFP组、hM4Di组、hM3Dq组、6-OHDA组、Sham组、Normal组进行转棒试验数据采集。并且在细胞移植手术后4周测试CNO调控功能，首先，采集腹腔注射生理盐水的行为学数据，作为对照（图中记为Saline）；然后，对小鼠进行腹腔注射CNO（1.2 mg/kg），注射20分钟后，进行CNO作用下行为学数据采集（图中记为CNO）；最后，注射CNO五天后，CNO代谢结束（图中记为pCNO）进行再一轮三种行为学采集。
转棒试验数据统计结果如图10所示，在给予腹腔注射CNO时，与注射生理盐水相比，hM4Di组小鼠可见掉落时间明显缩短，与6-OHDA组掉落时间相当，且具有统计学意义；相反，hM3Dq组小鼠可见掉落时间明显延长，但未达到Sham组、Normal组小鼠掉落时间水平。当腹腔注射CNO5天后，CNO代谢结束时，hM4Di组小鼠可见掉落时间恢复至注射生理盐水水平，对比腹腔注射CNO时出现明显延长，具有统计学差异；相反，hM3Dq组小鼠可见掉落时间对比腹腔注射CNO时出现明显回落，恢复至注射生理盐水水平。同时，EGFP组、6-OHDA组、Sham组、Normal组小鼠在CNO作用下和CNO代谢后，掉落时间表现并无差异，和注射生理盐水水平相近，但EGFP组比移植细胞前有所延长且具有统计学差异。
上述结果表明，CNO在不进行立体定位脑注射直接接触细胞的前提下，可以通过腹腔注射吸收，远程调控激活hM4Di组的细胞、抑制hM3Dq组的细胞，使其释放DA减少或增加，进而调节小鼠躯体运动功能，达到平衡。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，包括对诱导神经干细胞进行基因编辑，使其表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di，得到编辑后的诱导神经干细胞；对所述编辑后的诱导神经干细胞进行分化培养，使其表达多巴胺能神经细胞的标志物，即制备得到受调控的多巴胺能神经细胞。
2.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述标志物包括FoxA2、NURR1、TH、Tuj1中的至少一种。
3.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述分化培养的步骤包括：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
第一阶段培养，在分化培养的前10天，应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有SAG1和FGF8；
第二阶段培养，在所述第一阶段培养之后，应用第二阶段培养基进行培养；所述第二阶段培养基含有cAMP、DAPT、ascorbic acid、BDNF、GDNF和TGF-b3。
4.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述基因编辑的方法包括：采用CRISPR/Cas9技术向所述诱导神经干细胞的AAVS1位点敲入表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di；
向所述诱导神经干细胞转染表达Cas9、靶向AAVS1位点的gRNA的质粒，兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di的供体质粒；所述gRNA的序列为SEQ ID NO：1。
5.如权利要求4所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述抑制性受体hM4Di的供体质粒的构建方法包括：将AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry质粒的mcherry切割，并且在hM4Di的下游插入T2A-ZsGreen片段，使hM4Di与T2A-ZsGreen片段由T2A序列连接，即所述抑制性受体hM4Di的供体质粒；和/或，
所述兴奋性受体hM3Dq的供体质粒的构建方法包括：将AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry质粒的mcherry切割，并且在hM3Dq的下游插入T2A-ZsGreen片段，使hM3Dq与T2A-ZsGreen片段由T2A序列连接，即所述兴奋性受体hM3Dq的供体质粒。
6.一种受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，通过权利要求1-5中任一项所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法制备得到。
7.如权利要求6所述的受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述受调控的多巴胺能神经细胞为多巴胺能前体细胞、多巴胺能神经元中的至少一种。
8.如权利要求7所述的受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述多巴胺能神经元为A9区多巴胺能神经元。
9.如权利要求6所述的受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述受调控的多巴胺能神经细胞包括第一阶段细胞和第二阶段细胞；
所述第一阶段细胞通过以下方法制备得到：对所述编辑后的诱导神经干细胞进行第一阶段培养；所述第一阶段培养包括应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有SAG1和FGF8；所述第一阶段培养的时间为10天；
所述第二阶段细胞通过以下方法制备得到：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
第一阶段培养，在分化培养的前10天，应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有SAG1和FGF8；
第二阶段培养，在第一阶段培养之后，应用第二阶段培养基培养3天；所述第二阶段培养基含有cAMP、DAPT、ascorbic acid、BDNF、GDNF、TGF-b3；
所述第一阶段细胞和第二阶段细胞的比例为1-2:7。
10.权利要求6-9中任一项所述的受调控的多巴胺能神经细胞在制备治疗帕金森病药物方面的应用。
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