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CN117979975A - 用于预防和治疗动脉瘤、高血压、ards和其他与内皮功能障碍相关联的疾病的mirna抑制剂 - Google Patents

用于预防和治疗动脉瘤、高血压、ards和其他与内皮功能障碍相关联的疾病的mirna抑制剂 Download PDF

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CN117979975A
CN117979975A CN202280048010.5A CN202280048010A CN117979975A CN 117979975 A CN117979975 A CN 117979975A CN 202280048010 A CN202280048010 A CN 202280048010A CN 117979975 A CN117979975 A CN 117979975A
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Abstract

本公开涉及包含miRNA抑制剂的药物组合物，以及用于使用此类药物组合物的方法。

Description

用于预防和治疗动脉瘤、高血压、ARDS和其他与内皮功能障碍 相关联的疾病的MIRNA抑制剂
相关申请
本申请要求2021年5月7日提交的美国临时专利申请序列号63/185,788的优先权权益，该美国临时专利申请的内容据此全文以引用方式并入本文。
政府支持
本发明是根据美国国立卫生研究院授予的授权号HL077440下的政府支持产生的。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
腹主动脉瘤(AAA)被定义为直径超过3cm的腹主动脉扩张，最常影响肾下段。它与动脉瘤破裂事件中的高死亡风险相关联，导致每年全球约150,000-200,000人死亡。大于65岁的总人群中AAA的发病率高达9％。虽然最公认的AAA风险因素包括男性性别和吸烟，但其他风险因素也已与AAA形成有关，诸如年龄较大、家族史、高血压和高脂血症。AAA形成机制很复杂，主要涉及炎症和氧化应激介导的基质降解和血管重塑，这会导致腹主动脉扩张。目前预防大于5.5cm的大AAA破裂的临床干预仅限于扩张动脉的手术修复或支架安装，死亡率风险相当大，高达5％。目前尚无口服药物可用于治疗较小且不断生长的动脉瘤，以预防不可预测的突然破裂和死亡。
高血压是一种普遍且严重的心血管疾患，影响全球大于30％的成年人群。尽管有现有治疗，但是许多高血压患者响应于四类药物的可用治疗选项耐药。高血压是动脉粥样硬化性冠状动脉疾病的主要原因，与极高的死亡率相关联。耐药性高血压迫切需要新的治疗选项。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是另一种与内皮功能障碍相关联的破坏性、致死性临床病症，是动脉瘤、高血压、ARDS或与内皮功能障碍相关联的其他疾病发展的常见介体。ARDS迫切需要新的治疗选项。
发明内容
在某些方面中，本文提供了包含miRNA抑制剂的药物组合物。此类抑制剂及其组合物可用于医学治疗，诸如预防、抑制、减少和治疗动脉瘤、高血压、ARDS和与内皮功能障碍相关联的其他疾病。
本文所述的组合物和方法可用于预防、抑制、治疗或减少受试者的动脉瘤、高血压、ARDS和与内皮功能障碍相关联的其他疾病，包括向所述受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分或表1至表4中列出的那些miRNA结合的核酸序列。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含编码miRNA抑制剂的载体。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p或表1至表4中列出的那些miRNA的功能。
本发明还提供了预防、抑制、治疗或减少受试者的动脉瘤、高血压、ARDS和与内皮功能障碍相关联的其他疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用(例如，皮下、肠胃外施用)包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
在某些实施方案中，动脉瘤是腹主动脉瘤、脑动脉瘤或胸主动脉瘤。
在某些实施方案中，高血压是原发性高血压或继发性高血压。
在某些实施方案中，ARDS由创伤、细菌或病毒感染(例如SARS或COVID-19)引起。
在某些实施方案中，与内皮功能障碍相关联的其他疾病是指冠状动脉疾病、糖尿病血管并发症、脑血管疾病、外周血管疾病、血栓栓塞性疾病、心脏/心肌梗塞的缺血再灌注损伤、或下文中稍后列出的描述所有相关病理状态的那些。
本文所述的方法可还包括向受试者联合施用附加治疗剂(例如，叶酸化合物、钙通道阻断剂、活性氧物质/ROS清除剂)。
还提供了用于逆转血管重塑的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分或表1至表4中列出的那些miRNA结合的核酸序列，其中血管重塑的特征在于炎症、基质降解、外膜肥大、内侧弹性蛋白降解和扁平化和/或腔内血栓的形成。
在某些方面中，本文提供了减少活性氧物质产量的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分或表1至表4中列出的那些miRNA结合的核酸序列，并且其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p或表1至表4中列出的那些miRNA的功能。
在某些方面中，本文提供了减少活性氧物质产量的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
在某些方面中，本文提供了恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分或表1至表4中列出的那些miRNA结合的核酸序列，并且其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p或表1至表4中列出的那些miRNA的功能。
在某些方面中，本文提供了恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
在某些方面中，本文提供了保持一氧化氮(NO)生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分或表1至表4中列出的那些miRNA结合的核酸序列，并且其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p或表1至表4中列出的那些miRNA的功能。
在某些方面中，本文提供了保持一氧化氮(NO)生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
还提供了用于治疗或预防受试者的动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和与内皮功能障碍相关联的其他疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用miRNA抑制剂，所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少50-100％同一的核酸。
进一步，本文所述的方法可用于治疗或预防受试者的动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和与内皮功能障碍相关联的其他疾病，包括向所述受试者施用miRNA抑制剂，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分或表1至表4中列出的那些miRNA结合的核酸序列。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂与miR-192-5p序列的一部分或表1至表4中列出的那些miRNA具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少99％、或至少100％的互补性。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p或表1至表4中列出的那些miRNA的功能。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少90％、至少95％、或至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含作为SEQ ID NO:1至SEQID NO:19中的任一者的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸包含任何可能的化学修饰(例如，2'-O-甲基化核苷(2'OMe)、2'-氟代寡核苷酸(2'F)、2'-O-甲氧基乙基寡核苷酸(2'MOE)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯键(PS)、锁核酸(LNA)、非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)、疏水部分、萘基改性剂或胆固醇部分)。核酸可以通过HEN1甲基转移酶修饰。
在某些实施方案中，核酸与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者互补。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂与包含与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一的核酸的miRNA结合。在一些实施方案中，miRNA抑制剂与包含作为SEQID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者的核酸的miRNA结合。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂的长度为至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂的长度不大于32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个或20个核苷酸。
附图说明
图1A示出了人AAA中miR-192-5p的上调。RNA是从人AAA患者和对照受试者(每组n＝15)的主动脉样品中分离出的。与对照相比，人AAA患者的主动脉样品中miR-192-5p上调。数据表示为平均值±SEM(n＝15)，**与对照相比p<0.01。
图1B示出了在H2O2刺激的HAEC中Hsa-miR-192-5p表达上调。将人主动脉内皮细胞(HAEC)用过氧化氢(H2O2，100μM，24h)处理，并且分离RNA以检测miR-192-5p表达水平。H2O2刺激的HAEC中Hsa-miR-192-5p表达上调。数据表示为平均值±SEM(每组n＝4-6)，*与对照相比p<0.05
图2A示出Hsa-miR-192-5p特异性抑制剂减弱H2O2刺激的HAEC中的miR-192-5p表达。在存在或不存在阴性对照miR抑制剂或Hsa-miR0192-5p抑制剂的情况下，将人主动脉内皮细胞(HAEC)用过氧化氢(H2O2，100μM，24h)处理，并且分离RNA以检测miR-192-5p表达水平。Hsa-miR-192-5p特异性抑制剂减弱H2O2刺激的HAEC中的miR-192-5p表达。数据表示为平均值±SEM(n＝6)，*p<0.05。
图2B示出Hsa-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复H2O2刺激的HAEC中的DHFR mRNA表达。在存在或不存在阴性对照miR抑制剂或Hsa-miR-192-5p抑制剂的情况下，将人主动脉内皮细胞(HAEC)用过氧化氢(H2O2，100μM，24h)处理，并且分离RNA以检测DHFR mRNA表达水平。Hsa-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复H2O2刺激的HAEC中的DHFR mRNA表达。数据表示为平均值±SEM(n＝4-6)，**p<0.01，***p<0.001。
图2C示出了以β-肌动蛋白作为内部对照的内皮DHFR蛋白表达的代表性蛋白质印迹。在存在或不存在阴性对照miR抑制剂或Hsa-miR-192-5p抑制剂的情况下，将人主动脉内皮细胞(HAEC)用过氧化氢(H2O2，100μM，24h)处理，并且分离蛋白质以检测DHFR蛋白质表达水平。
图2D示出Hsa-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复H2O2刺激的HAEC中的DHFR蛋白质表达。在存在或不存在阴性对照miR抑制剂或Hsa-miR-192-5p抑制剂的情况下，将人主动脉内皮细胞(HAEC)用过氧化氢(H2O2，100μM，24h)处理，并且分离蛋白质以检测DHFR蛋白质表达水平。Hsa-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复H2O2刺激的HAEC中的DHFR蛋白质表达。数据表示为平均值±SEM(n＝4)，*p<0.05。
图3A示出了输注Ang II的hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变小鼠的每个实验组中的AAA百分比。在进行AAA表型分析之前，将Ang II输注到hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物体内。每组n＝26-53，***p<0.001。
图3B示出了在有和没有Ang II输注的情况下hph-1和hph-1-NO X1小鼠中的mmu-miR-192-5p表达水平。在对AAA进行表型分析和分离主动脉内皮细胞以检测miR-192-5p表达水平之前，将Ang II输注到hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物体内。数据表示为平均值±SEM(n＝5)，*p<0.05，**p<0.01。
图3C示出了在有和没有Ang II输注的情况下hph-1和hph-1-NOX2小鼠中mmu-miR-192-5p的表达水平。在对AAA进行表型分析和分离主动脉内皮细胞以检测miR-192-5p表达水平之前，将Ang II输注到hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物体内。数据表示为平均值±SEM(n＝6-7)，*p<0.05。
图3D示出了在有和没有Ang II输注的情况下hph-1和hph-1-p47phox小鼠中mmu-miR-192-5p的表达水平。在对AAA进行表型分析和分离主动脉内皮细胞以检测miR-192-5p表达水平之前，将Ang II输注到hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物体内。数据表示为平均值±SEM(n＝4)，***p<0.001。
图3E示出了在有和没有Ang II输注的情况下hph-1和hph-1-NOX4小鼠中mmu-miR-192-5p的表达水平。在对AAA进行表型分析和分离主动脉内皮细胞以检测miR-192-5p表达水平之前，将Ang II输注到hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物体内。数据表示为平均值±SEM(n＝6)，**p<0.01，***p<0.001。
图4A示出mmu-miR-192-5p特异性抑制剂减弱输注Ang II的hph-1小鼠中的mmu-miR-192-5p表达。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并收获主动脉内皮细胞以检测miR-192-5p表达水平。数据表示为平均值±SEM(n＝6)，**p<0.01，***p<0.001。
图4B示出mmu-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复输注Ang II的hph-1小鼠中的DHFR mRNA。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并收获主动脉内皮细胞以检测DHFR mRNA表达水平。数据表示为平均值±SEM(n＝4-6)，**p<0.01，***p<0.001。
图4C示出了以β-肌动蛋白作为内部对照的内皮DHFR蛋白表达的代表性蛋白质印迹。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并收获主动脉内皮细胞以检测DHFR蛋白表达水平。
图4D示出mmu-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复输注Ang II的hph-1小鼠中的DHFR蛋白表达。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并收获主动脉内皮细胞以检测DHFR蛋白表达水平。数据表示为平均值±SEM(n＝4)，*p<0.05。
图5A示出通过DHE成像检测到的主动脉超氧化物产量在输注Ang II的hph-1小鼠中显著增加，这通过用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂进行体内治疗而显著减弱。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并新鲜收获主动脉以进行对超氧化物产量的二氢乙锭(DHE)成像分析。
图5B示出了DHE图像的荧光强度的定量分析，指示了与图5A中相同的结果。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并新鲜收获主动脉以进行对超氧化物产量的二氢乙锭(DHE)成像分析。数据表示为平均值±SEM(n＝4-5)。**p<0.01，***p<0.001。
图5C示出了在存在或不存在L-NAME(NOS抑制剂)的情况下通过ESR测定的总超氧化物产量。如先前公开的，hph-1小鼠中存在非常适度的基线eNOS解偶联(L-NAME可抑制的超氧化物产量)活性。输注Ang II的hph-1小鼠中的eNOS解偶联活性的显著增加通过用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理而完全减弱。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并新鲜收获主动脉以进行对超氧化物产量的电子自旋共振(ESR)分析。数据表示为平均值±SEM(n＝6-7)。*对于所有对应组，与L-NAME(-)相比p<0.05；#与没有Ang II输注的假手术组相比p<0.05；&与没有L-NAME的Ang II和AngII+阴性对照组相比p<0.05。
图5D示出在输注Ang II的hph-1小鼠中通过ESR测定的NO生物利用度显著降低，这通过用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理而显著恢复。将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中，并新鲜收获主动脉以进行对NO生物利用度的电子自旋共振(ESR)测定。数据表示为平均值±SEM(n＝7-9)。*p<0.05，**p<0.01。
图6A示出了用阴性对照和mmu-miR-192-5p特异性抑制剂处理的输注Ang II的hph-1小鼠中AAA的百分比。在对小鼠进行AAA形成表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。n＝10-20，***p<0.001。
图6B示出了在输注Ang II的hph-1小鼠和用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂处理的那些小鼠中通过超声心动描记术定义的腹主动脉扩张和抑制的代表性图像。在对小鼠进行AAA形成表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。
图6C示出了在输注Ang II的hph-1小鼠中通过用miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理减弱了通过超声心动描记术定义的腹主动脉的时间依赖性扩张。在通过超声心动描记术对小鼠进行AAA形成表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。数据表示为平均值±SEM(n＝7)**p<0.01，***与假手术相比p<0.001；#与Ang II相比p<0.05；&与Ang II+阴性对照相比p<0.05。
图6D示出死后检视指示通过在输注Ang II的hph-1小鼠中通过mmu-miR-192-5p特异性抑制剂体内处理减弱了AAA形成。在对小鼠进行AAA形成的死后检视表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。
图6E示出了将Ang II输注到hph-1小鼠中诱导显著的外膜肥大和壁内血栓形成，这通过用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理而减弱。在通过H&E成像分析对小鼠进行AAA形成表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注AngII的hph-1小鼠中。
图6F示出将Ang II输注到hph-1小鼠中诱导腹主动脉外径增大，这通过用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理而减弱。在测量分离的腹主动脉的外径之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。数据表示为平均值±SEM(n＝10-11)，*p<0.05，***p<0.001。
图6G示出了VVG染色，表明输注Ang II的hph-1小鼠的主动脉内层中弹性纤维的显著退化和扁平化，这通过用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理而恢复。在对小鼠进行内层基质降解表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。
图7示出了miR-192-5p在NOX下游的AAA形成中的中间体作用的示意图。在通过AngII输注激活NADPH氧化酶(NOX)后，通过H2O2上调miR-192-5p，导致二氢叶酸还原酶(DHFR)下调、伴随着ROS产量增加和NO生物利用度降低的eNOS解偶联，从而导致持续氧化应激、血管重塑和AAA形成。
具体实施方式
概述
氧化应激在AAA、高血压、ARDS和与内皮功能障碍相关联的疾病的发展中起着重要作用。先前表明内皮细胞特异性二氢叶酸还原酶(DHFR)缺乏是输注Ang II的高苯丙氨酸血症(hph)-1小鼠和apoE缺陷型小鼠中血管紧张素II(Ang II)诱导的eNOS解偶联和eNOS解偶联依赖性AAA形成的基础，以及野生型(WT)小鼠和DHFR敲除小鼠中高血压发展的基础(GaoL等人，Hypertension 2012；Li Q等人，Redox Biology 2019)。在hph-1和apoE缺陷型小鼠中，Ang II输注经由下调DHFR来增强eNOS解偶联。叶酸经由恢复DHFR功能来防止eNOS进行性解偶联和血管重塑，从而使WT小鼠的血压完全正常化并消除输注Ang II的hph-1小鼠和apoE缺陷型小鼠中的AAA形成。利用双敲除策略，进一步表明在输注Ang II的hph-1小鼠中DHFR缺陷位于NOX同种型1、2或4的下游，这与我们先前的发现NOX产生的过氧化氢(H2O2)诱导DHFR缺乏一致。敲除DHFR的小鼠表现出更严重的血管重塑表型，并经由线粒体功能障碍加剧AAA和高血压。叶酸恢复DHFR功能以导致WT小鼠中eNOS重新偶联，也显著减轻了高血压的发展(Gao L等人，Hypertension 2012)。
microRNA(miR)是小的、内源性、单链非编码RNA分子，通常具有18-22个核苷酸。它们与特异性信使RNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合，以经由动物细胞中的不完美补体或植物细胞中的完美补体诱导其降解或翻译阻遏。miR-192-5p被报道为经由翻译抑制来降低DHFR蛋白表达。Yang等人Oncotarget.2015；6:43712-30报道了成神经管细胞瘤中的miR-192-5p水平降低。
如本文所述研究了miR-192-5p在NOX依赖性DHFR下调和随后的AAA形成中的中间体作用。miR-192-5p表达水平在人AAA患者的主动脉瘤组织(对于AAA患者和对照，n＝15)、经H2O2处理的人主动脉内皮细胞(HAEC)和经Ang II处理的hph-1小鼠中显著上调，而在hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4小鼠的双重突变体中降低。用miR-192-5p特异性抑制剂进行体内处理显著恢复DHFR mRNA和蛋白质水平，减少超氧化物产率，重新偶联eNOS，恢复NO生物利用度，并减弱AAA形成。这些结果表明，靶向miR-192-5p用作治疗和/或预防AAA的新颖治疗方法。鉴于miR-192-5p抑制剂对DHFR功能的保护效应，miR-192-5p可以作为高血压、以及ARDS和与内皮功能障碍相关联的疾病的新颖治疗选项来靶向。值得注意的是，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是另一种与肺内皮功能障碍密切关联的危急情况，该危急情况可能是由内皮DHFR缺乏引起的，通过抑制miR-192-5p来靶向内皮DHFR缺乏可证明是非常有益的。
在一个方面中，本文提供了包含miRNA抑制剂(例如，miR-192-5p抑制剂)的药物组合物，所述药物组合物可用于治疗动脉瘤、高血压、ARDS和与内皮功能障碍相关联的疾病。
定义
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，在本文中描述的与以下结合使用的命名法和以下的技术是本领域中众所周知的和常用的那些：化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学。
除非另外指明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法以及如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的那样执行。
本申请中所引用的所有上述和任何其他出版物、专利和公布的专利申请以引用方式明确并入本文。在冲突的情况下，以本说明书，包括其具体定义为准。
如本文所用的冠词“一个/种”是指一个/种或多于一个/种(例如，至少一个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“一要素”意指一个要素或多于一个要素。
术语“试剂”在本文中用于表示化合物(诸如有机或无机化合物、化合物的混合物)、生物大分子(诸如核酸、抗体，包括其部分，以及人源化、嵌合和人抗体和单克隆抗体、蛋白质或其部分，例如肽、脂质、碳水化合物)，或由生物材料(诸如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。药剂包括例如结构已知的药剂和结构未知的药剂。
术语“结合”或“相互作用”是指例如由于例如生理条件下的静电、疏水性、离子性和/或氢键相互作用而导致的两个分子之间，例如miRNA抑制剂与靶miRNA之间的缔合，该缔合可以是稳定的缔合。
如本文所用，如果两个核酸序列在每个位置彼此碱基配对，则它们是彼此的“补体”或者彼此“互补”。
如本文所用，如果两个核酸序列都与相同的核酸序列互补，则它们彼此“对应”。
“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用，并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、灵长类动物、牲畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
“miRNA”是指18-22个核苷酸的小、内源性、单链非编码RNA分子，其经由效应核酸-蛋白质复合物(例如，微核糖核蛋白(RNP)或miRNA诱导的沉默复合物(RISC))调节基因表达。miRNA与特异性信使RNA的3非翻译区(3-UTR)结合以诱导其降解或翻译阻遏。在一些实施方案中，miRNA不完美地与特异性信使RNA的3-UTR互补。在一些实施方案中，miRNA完美地与特异性信使RNA的3-UTR互补。微小RNA分子(“miRNA”)的长度通常是21个至22个核苷酸，但已报道了17个至25个核苷酸的长度。所述miRNA均从较长的前体RNA分子(“前体miRNA”)加工而成。前体miRNA由非蛋白质编码基因转录而来。所述前体miRNA具有两个互补区域，使得它们能够形成茎环或折回样结构，该结构在动物体内由称为Dicer的酶切割。Dicer是核糖核酸酶III样核酸酶。经加工的miRNA通常是茎的一部分。经加工的miRNA(也称为“成熟miRNA”)变成为大型复合物的一部分以下调靶基因。
“miRNA抑制剂”是指作为成熟miRNA(靶位点)的反向互补序列的核苷酸序列。所述miRNA抑制剂与靶位点结合(例如，miR-192-5p或表1至表4中列出的那些位点)并抑制成熟miRNA的功能。在一些实施方案中，miRNA抑制剂是化学合成的。在一些实施方案中，miRNA抑制剂经化学修饰以防止核酸-蛋白质复合物诱导的miRNA切割(例如，RISC诱导的诱导)、增强与靶位点的结合亲和力，和/或提供对miRNA抑制剂的溶核降解的抗性。在一些实施方案中，使用递送运载体(诸如脂质体或阳离子聚合物)将本文所述的miRNA抑制剂递送至细胞。在一些实施方案中，本文所述的miRNA抑制剂经化学修饰，以便不需要使用此类递送运载体来介导对细胞中的miRNA的靶向(例如，对miR-192-5p或表1至表4中列出的那些的靶向)。如本文所用，miRNA抑制剂包括隔离miRNA并降低或消除其效应的任何天然或人工RNA转录物。本文包括与竞争性内源RNA(ceRNA)相同的miRNA抑制剂。ceRNA是天然的细胞内miRNA抑制剂，其竞争结合共享的miRNA识别元件(MRE)以降低microRNA可用性并缓解对靶RNA的阻遏。
如本文所用，术语“干扰核酸”、“抑制核酸”可互换使用。干扰核酸通常包括通过亚基间键连接的环状亚基的序列，每个环状亚基均带有碱基配对部分，所述亚基间键允许碱基配对部分通过沃森-克里克碱基配对与核酸(通常是RNA)中的靶序列杂交，以在靶序列内形成核酸:寡聚体异源双链体。干扰RNA分子包括但不限于反义分子、siRNA分子、asiRNA分子、lasiRNA分子、单链siRNA分子、miRNA分子和shRNA分子。此类干扰核酸可被设计为阻断或抑制mRNA的翻译或抑制天然前mRNA剪接加工，或诱导靶向mRNA的降解，并且可以说是“针对”或“靶向”与其杂交的靶序列。干扰核酸可包括例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2'-O-甲基寡核苷酸和RNA干扰剂(siRNA剂)。RNAi分子通常通过与靶分子形成异源双链体来发挥作用，所述异源双链体被选择性降解或“敲低”，从而使靶RNA失活。在一些条件下，干扰RNA分子还可以通过抑制转录物翻译和/或抑制转录物的转录来使靶转录物失活。当干扰核酸以上述方式靶向靶标的核酸时，所述干扰核酸被更一般地称为“靶向”生物学相关靶标，诸如蛋白质。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何组合和任何长度的核苷酸聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸还是它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的(多个)基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰的话，则可以在聚合物装配之前或之后对核苷酸结构进行修饰。多核苷酸可经进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。在本文所提供的所有核酸序列中，U核苷酸可与T核苷酸互换。
“治疗”病症或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。如本文所用，并且如在本领域中很好理解的，“治疗(treatment)”是用于获得患有益或所需结果(包括临床结果)的途径。有益的或期望的临床结果可包括但不限于，一种或多种症状或病症的减轻或改善、疾病范围的减小、稳定化的(即，不恶化)疾病状态、防止疾病传播、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解、以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指相比于如果不接受治疗时的预期生存，延长存活期。
术语“预防”是本领域中公认的，并且当关于与诸如局部复发(例如，疼痛)的病症、诸如动脉瘤、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的疾病、诸如心衰的证候或任何其他医学病症使用时，是本领域中熟知的，并且包括施用组合物，相对于未接受所述组合物的受试者，所述组合物降低了受试者中的医学病症的症状的频率或延迟了其发作。因此，癌症的预防包括例如减少相对于未治疗的对照群体，接受预防性治疗的患者群体中可检测到的癌性生长的数量；和/或延迟相对于未治疗的对照群体，经治疗的群体中可检测到的癌性生长的出现，例如达统计上和/或临床上显著的量。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种方法将物质、化合物或药剂“施用(Administering/administration of)”给受试者。例如，化合物或药剂可以静脉内地、动脉内地、皮内地、肌内地、腹膜内地、皮下地、经眼地、舌下地、口服地(通过摄取)、鼻内地(通过吸入)、脊柱内地、脑内地和透皮地(通过吸收，例如，通过皮肤导管)施用。化合物或药剂也可以适当地通过可再装填或可生物降解的聚合物装置或其他装置(例如，贴片和泵)或制剂引入，所述装置或制剂提供化合物或药剂的延时释放、缓释或控释。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时段内执行施用。
向受试者施用物质、化合物或药剂的适当方法也将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或药剂的化学和生物学性质(例如，溶解度、消化率、生物利用度、稳定性和毒性)。在一些实施方案中，化合物或药剂例如通过摄取被口服施用至受试者。在一些实施方案中，口服施用的化合物或药剂在延时释放或缓释制剂中，或使用用于此类缓释或延时释放的装置施用。
如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何施用形式，使得第二药剂在先前施用的治疗剂在体内仍然有效时施用(例如，两种药剂在患者中同时有效，这可包括两种药剂的协同效应)。例如，不同的治疗化合物可以在相同的制剂中或在分开的制剂中同时或顺序地施用。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同治疗剂的联合效应。
药物或药剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当施用于受试者时将具有预期治疗效应的药物或药剂的量。完全治疗效应不一定通过施用一次剂量发生，并且可以在仅施用一系列剂量之后发生。因此，治疗有效量可以按一次或多次施用形式施用。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的体型、健康和年龄，以及所治疗的病症(诸如癌症或MDS)的性质和程度。技术人员可以通过常规实验容易地确定给定情况下的有效量。
在两个或更多个核酸的上下文中，术语“同一”或“同一性百分比”是指这样的两个或更多个序列或子序列，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的核苷酸为相同的(例如，当比较和比对在比较窗口或指定区域内的最大对应时，在该指定区域内约50％同一性，优选55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检视(参见例如，NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)测量的。
术语“调节(modulation/modulate)”当关于功能特性或生物活性或过程(例如，酶活性或受体结合)使用时，是指上调(例如，激活或刺激)、下调(例如，抑制或遏制)或以其他方式改变此类特性、活性或过程的品质的能力。在某些情况下，此类调节可能取决于特定事件的发生，诸如信号转导途径的激活，和/或可能仅在特定细胞类型中显现。
如本文所用，“特异性结合”是指miRNA抑制剂结合预定miRNA靶标的能力。通常，miRNA抑制剂以与约10-7M或更低、约10-8M或更低、或约10-9M或更低的KD对应的亲和力与其靶标特异性结合，并且以与其对与非特异性和不相关的靶标(例如，BSA、酪蛋白或不相关细胞，诸如HEK 293细胞或大肠杆菌(E.coli)细胞)结合的亲和力相比显著更低(例如，至少2倍小、至少5倍小、至少10倍小、至少50倍小、至少100倍小、至少500倍小、或至少1000倍小)的KD与靶标结合。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用。它们是指作为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物的任何长度的核苷酸聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的(多个)基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、合成多核苷酸、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰的话，则可以在聚合物装配之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可经进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。
术语“药学上可接受的”是本领域中公认的。在某些实施方案中，所述术语包括在合理医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的组合物、赋形剂、佐剂、聚合物和其他材料和/或剂型。
“药学上可接受的盐”或“盐”在本文中用于指适用于或与患者的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如可用于配制用于药物或治疗用途的药物的液体或固体滤光剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。
药物组合物
本发明的组合物和方法可用于治疗有需要的个体。在某些实施方案中，所述个体是哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物。当施用于动物(诸如人)时，所述组合物或化合物优选作为包含例如本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物施用。药学上可接受的载体是本领域中众所周知的并且包括例如水溶液(诸如水或生理缓冲盐水)或其他溶剂或媒介物(诸如二醇类、甘油、油诸如橄榄油、或可注射的有机酯)。在优选实施方案中，当此类药物组合物用于人施用，特别是用于侵入性施用途径(即，避免通过上皮屏障的运输或扩散的途径，诸如注射或植入)时，水溶液是无热原的，或基本上无热原的。赋形剂可经选择例如以影响药剂的延迟释放或选择性地靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是诸如片剂、胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊剂)、颗粒剂、用于重构的冻干剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、栓剂、注射剂等剂量单位形式。所述组合物也可以存在于经皮递送系统，例如皮肤贴剂中。
药学上可接受的载体可包含生理学上可接受的试剂，所述生理学上可接受的试剂例如作用以稳定化、增加溶解度或以增加化合物(诸如本发明化合物)的吸收。此类生理学上可接受的试剂包括例如糖类物质(诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。包括生理学上可接受的试剂在内的药学上可接受的载体的选择取决于例如组合物的施用途径。所述制备物或药物组合物可以是自乳化药物递送系统或自微乳化药物递送系统。药物组合物(制备物)也可以是其中可掺入例如本发明的化合物的脂质体或其他聚合物基质。例如包含磷脂或其他脂质的脂质体是无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体，所述载体的制备和施用相对简单。
术语“药学上可接受的”在本文中用于指代在合理医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体滤光剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些示例包括(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄芪粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂用蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。
药物组合物(制备物)可以通过多种施用途径中的任何一种施用途径施用至受试者，所述施用途径包括例如口服(例如，在水性或非水性溶液或悬浮液中的灌服剂、片剂、胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于施加至舌头的糊剂)；通过口腔粘膜吸收(例如，舌下)；皮下；透皮(例如施加至皮肤的贴剂)；和局部(例如，作为施加至皮肤的乳膏剂、软膏剂或喷雾剂)。该化合物也可以配制用于吸入。在某些实施方案中，化合物可简单地溶解或悬浮于无菌水中。合适的施用途径和适用于所述施用途径的组合物的详细信息可以在例如美国专利号6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896，以及所述美国专利中所引用的专利中找到。
制剂可方便地以单位剂型存在，并且可通过药学领域中众所周知的任何方法来制备。可与载体物质组合以产生单剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、具体施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效应的化合物的量。通常，在百分之一百中，这种量的范围为约1％至约99％，优选地约5％至约70％，最优选约10％至约30％的活性成分。
制备这些制剂或组合物的方法包括将活性化合物(诸如本发明的化合物)与载体和任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，制剂是通过以下方式制备的：使本发明的化合物与液体载体或细碎固体载体或两者均匀并紧密地缔合，然后使产物成形(如果需要的话)。
如本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适用于胃肠外施用的药物组合物包含一种或多种活性化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水性溶液、分散体、混悬剂或乳剂、或恰好在使用之前可重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末剂的组合，所述无菌可注射溶液或分散体可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。
本发明的药物组合物中可采用的合适水性和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及它们的合适混合物、植物油(诸如橄榄油)、以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的预防可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂(单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
在一些情况下，为了延长药物的效应，需要使来自皮下或肌内注射的药物的吸收减缓。这可通过使用水溶性不良的结晶或非晶材料的液体混悬剂来达成。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，所述溶解速率继而可取决于晶体大小和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收是通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来完成的。
可注射贮库形式是通过在生物可降解聚合物(聚丙交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊化基质来制备的。取决于药物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的示例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微型乳剂中来制备贮库型可注射制剂。
为了在本发明的方法中使用，活性化合物可以本身或作为药物组合物给予，所述药物组合物含有例如0.1％至99.5％(更优选地，0.5％至90％)的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
引入方法也可通过可再装填装置或生物可降解装置提供。近年来，已经开发了各种缓释聚合物装置并在体内进行了测试以用于药物(包括蛋白质生物药物)的受控递送。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括可生物降解的聚合物和不可降解的聚合物两者，可用于形成植入物以在特定靶部位处持续释放化合物。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得活性成分的某一量，该量有效实现对特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应，而对患者没有毒性。
所选剂量水平将取决于各种因素，包括所采用的特定化合物或化合物组合或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康和既往病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定所需药物组合物的治疗有效量并开具其处方。例如，医师或兽医可以比实现所需治疗效应所需要的水平更低的水平开始所述药物组合物或化合物的剂量，并逐步增加所述剂量直至实现期望的效应。“治疗有效量”意指足以引发所需治疗效应的化合物浓度。通常理解的是化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其他因素可包括但不限于患者病症的严重程度、所治疗的疾患、化合物的稳定性，以及如果需要的话，与本发明的化合物一起施用的另一种类型的治疗剂。可以通过多次施用所述药剂来递送更大的总剂量。用于确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的(Isselbacher等人(1996)Harrison's Principlesof Internal Medicine第13版，1814-1882，该参考文献以引用方式并入本文)。
通常，在本发明的组合物和方法中使用的活性化合物的合适日剂量将是有效产生治疗效应的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。
如果需要的话，则活性化合物的有效日剂量可以任选地以单位剂型，作为在一天中以适当的间隔单独施用的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。在本发明的某些实施方案中，活性化合物可以每天施用两次或三次。在优选的实施方案中，活性化合物将每天施用一次。
接受这种治疗的患者是任何有需要的动物，包括灵长类动物，尤其是人；和其他哺乳动物，诸如马、牛、猪、绵羊、猫和狗；家禽；以及一般的宠物。
在某些实施方案中，本发明的化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合施用。
药学上可接受的酸加成盐还可以作为各种溶剂化物，诸如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等的溶剂化物存在。也可以制备此类溶剂化物的混合物。此类溶剂化物的来源可以来自结晶溶剂、是制备或结晶溶剂中固有的、或是这种溶剂的外来物。
润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的示例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
miRNA抑制剂
在某些方面中，本文提供了选择性结合miRNA(例如，miR-192-5p)的miRNA抑制剂(例如，miR-192-5p抑制剂)。在一些方面中，本文提供了包含此类miRNA抑制剂的药物组合物，使用此类miRNA抑制剂来预防、抑制、治疗或减少动脉瘤、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和/或与内皮功能障碍相关联的其他疾病的方法，以及制备此类miRNA抑制剂的方法。
表1中提供了示例性miRNA抑制剂序列。
表1：示例性miRNA抑制剂序列
表2中提供了示例性miRNA序列。
表2：示例性miRNA序列
通过TargetScan预测DHFR是miR-192-5p的推定靶点，如下所示：
miR-192-5p在不同物种之间是保守的(表3)。miR-192-5p在不同物种之间高度保守，尤其是在靶向二氢叶酸还原酶(DHFR)的种子区域(粗体)中。来自不同物种的miR-192-5p的所有序列均从miRBase获取(http://www.mirbase.org/)。
表3
表2中miRNA的基因ID和NCBI参考序列如下表4中所示。
表4
在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者的核酸序列具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、或至少99.9％序列同一性)的核酸。在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含作为SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:19中的任一者的核酸。
在一些实施方案中，核酸与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者互补。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂与包含与SEQ ID NO.20至SEQ ID NO.38中的任一者的核酸序列具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或至少100％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性、或至少100％序列同一性)的核酸的miRNA结合。在一些实施方案中，miRNA抑制剂与包含作为SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者的核酸的miRNA结合。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂的长度为是例如至少5个、10个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、或120个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA抑制剂的长度不大于120个、115个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、10个、或5个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA抑制剂的长度是至少18个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA抑制剂的长度不大于22个核苷酸。本文所公开的miRNA抑制剂可包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个取代。与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者相比，本文所公开的miRNA抑制剂可以具有不大于40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个取代。
在本发明的其他实施方案中，存在作为miRNA抑制剂的合成核酸。miRNA抑制剂的长度在约7个至35个核苷酸之间(例如，17个至25个核苷酸)并且包含与成熟miRNA的5'至3'序列至少90％互补的5'至3'序列。在某些实施方案中，miRNA抑制剂分子的长度是17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸，或其中可推导的任何范围。此外，miRNA抑制剂具有的序列(从5'至3')是成熟miRNA，特别是成熟的天然存在的miRNA的5'至3'序列，或与所述成熟miRNA，特别是成熟的天然存在的miRNA的5'至3'序列至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％互补，或其中可推导的任何范围。本领域技术人员可以使用较长探针序列的与成熟miRNA的序列的至少一部分具有至少部分互补性的部分作为miRNA抑制剂的序列。表2指示了miRNA的成熟序列。此外，可以改变探针序列的该部分，使其例如与成熟miRNA的序列90％互补。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂与如本文所述的miRNA抑制剂(例如，内源性miRNA抑制剂)竞争与包含作为SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者的核酸的miRNA结合。
在某些实施方案中，载体包含如本文所述的miRNA抑制剂。
在某些实施方案中，本文所提供的miRNA抑制剂包含一种或多种化学修饰，其中所述修饰在不存在递送载体的情况下促进细胞膜的穿透。维持相同功能结构的miRNA抑制剂的任何化学修饰都将会与其预期靶标结合。
在某些实施方案中，所述化学修饰中的任何化学修饰的示例包括2'-O-甲基化核苷(2'OMe)、2'-氟代寡核苷酸(2'F)、2'-O-甲氧基乙基寡核苷酸(2'MOE)、N6-甲基腺苷酸(m6A)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯键(PS)、锁核酸(LNA)、非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)、疏水部分、萘基改性剂或胆固醇部分。
N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)是这样的化合物，所述化合物当放置在寡核苷酸两端处或附近时增加与靶标寡核苷酸的结合亲和力并阻止核酸外切酶降解。
在某些实施方案中，miRNA的化学修饰是通过甲基化产生的。在一些实施方案中，miRNA抑制剂的甲基化由HEN1甲基转移酶介导的。HEN1甲基转移酶将短双链RNA中的末端核糖(例如，miRNA抑制剂的3'端标记)甲基化。在一些实施方案中，HEN1甲基转移酶对miRNA抑制剂的甲基化产生2'-O-甲基化核苷(2'OMe)化学修饰。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂没有细胞毒性。本文所述的miRNA抑制剂可以采用多种寡核苷酸化学物质。寡核苷酸化学物质的示例包括但不限于肽核酸(PNA)、连接核酸(LNA)、硫代磷酸酯、2'O-Me-修饰的寡核苷酸和吗啉代化学物质，包括前述物质中的任何物质的组合。一般来说，PNA和LNA化学物质可以利用较短的靶向序列，因为它们相对于2'O-Me寡核苷酸具有相对较高的靶结合强度。硫代磷酸酯和2'O-Me修饰的化学物质往往组合以生成具有硫代磷酸酯主链的2'OMe修饰的寡核苷酸。参见例如PCT公开号WO/2013/112053和WO/2009/008725，这些专利中的每一者据此全文以引用方式并入。肽核酸(PNA)是DNA类似物，其中主链与脱氧核糖主链在结构上同态，由附接有嘧啶或嘌呤碱基的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA与遵循沃森-克里克碱基配对规则的互补寡核苷酸杂交，并在碱基对识别方面模仿DNA。PNA的主链由肽键而不是磷酸二酯键形成，从而使它们非常适合反义应用(参见下面的结构)。主链不带电，从而导致表现出高于正常的热稳定性的PNA/DNA或PNA/RNA双链体。PNA不被核酸酶或蛋白酶识别。尽管天然结构发生了根本性的结构变化，但是PNA仍然能够以螺旋形式与DNA或RNA进行序列特异性结合。PNA的特性包括与互补DNA或RNA的高结合亲和力、单碱基错配引起的去稳定化效应、对核酸酶和蛋白酶的抗性、与盐浓度无关的与DNA或RNA的杂交、以及与高嘌呤DNA形成三链体。PANAGENE.TM.已经开发了其专有的Bts PNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基基团)和专有的寡聚化工艺。使用Bts PNA单体的PNA寡聚化由脱保护、偶联和封端的重复循环构成。PNA可以使用本领域已知的任何技术合成生产。参见例如美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。关于PNA的制备，还参见美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等人，Science,254:1497-1500,1991中找到。前述中的每一者的全部内容以引用方式并入。干扰核酸还可能含有“锁核酸”亚基(LNA)。“LNA”是一类称为桥接核酸(BNA)的修饰的成员。BNA的特征为共价键将核糖环的构象锁定在C3-内切(北)糖皱褶中。对于LNA，桥由2'-O与4'-C位置之间的亚甲基构成。LNA增强主链预组织和碱基堆积，以提高杂交和热稳定性。
LNA的结构可以在例如Wengel等人,Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54:3607,and Accounts of Chem.Research(1999)32:301)；Obika等人，Tetrahedron Letters(1997)38:8735；(1998)39:5401,and Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16:9230中找到。本文所提供的化合物可以并入一种或多种LNA；在一些情况下，化合物可能完全由LNA构成。用于合成单独的LNA核苷亚基以及将它们掺入寡核苷酸的方法描述于例如美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461中，所述专利中的每篇专利均全文以引用方式并入。典型的亚基间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；或者，可以采用不含磷的接头。一个实施方案是含有LNA的化合物，其中每个LNA亚基由DNA亚基分开。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基构成，其中亚基间接头是硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂与胆固醇部分连接。在一些实施方案中，胆固醇部分附接至有义链的3'末端。在一些实施方案中，胆固醇部分附接至反义链的3'末端。在一些实施方案中，胆固醇部分附接至有义链的5'末端。在一些实施方案中，胆固醇部分附接至反义链的5'末端。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含2'-O-甲基化核苷。2'-O-甲基化核苷在核糖分子的2'-OH残基上带有甲基基团。2'-O-Me-RNA显示出与RNA相同(或相似)的行为，但可以被保护防止核酸酶降解。2'-O-Me-RNA还可以与硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)组合以进一步稳定化。2'-O-Me-RNA(磷酸二酯或硫代磷酸酯)可以根据本领域的常规技术合成(参见例如，Yoo等人，Nucleic Acids Res.32:2008-16,2004，该文献据此以引用方式并入)。在一些实施方案中，2'-O-甲基核苷位于有义链的3'末端。在一些实施方案中，有义链的3'末端区域包含多个2'-O-甲基化核苷(例如，3'末端的6个核苷内的2个、3个、4个、5个或6个2'-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中，2'-O-甲基核苷位于反义链的3'末端。在一些实施方案中，反义链的3'末端区域包含多个2'-O-甲基化核苷(例如，3'末端的6个核苷内的2个、3个、4个、5个或6个2'-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中，有义链的3'末端区域和反义链的3'末端区域均包含多个2'-O-甲基化核苷。在一些实施方案中，有义链包含与未修饰核苷交替的2'-O-甲基化核苷。在一些实施方案中，有义链包含与未修饰核苷交替的2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个2'-O-甲基化核苷的连续序列。在一些实施方案中，反义链包含与未修饰的核苷交替的2'-O-甲基化核苷。在一些实施方案中，反义链包含与未修饰的核苷交替的2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个2'-O-甲基化核苷的连续序列。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含硫代磷酸酯键。非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)，“硫代磷酸酯”(或S-寡聚物)是正常DNA的一种变体，其中非桥接氧中的一个非桥接氧被硫代替。核苷酸间键的硫化降低了核酸内切酶和核酸外切酶的作用，所述核酸内切酶和核酸外切酶包括5'至3'和3'至5'DNA POL 1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯通过两种主要途径制备：通过元素硫的二硫化碳溶液与磷酸氢盐的作用，或通过用二硫化四乙基秋兰姆(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯的方法(参见例如，Iyer等人，J.Org.Chem.55,20 4693-4699,1990)。后一种方法避免了元素硫不溶于大多数有机溶剂和二硫化碳毒性的问题。TETD和BDTD方法还产生更高纯度的硫代磷酸酯。在一些实施方案中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的在miRNA抑制剂的有义链中的核糖核苷酸之间的键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，miRNA抑制剂的有义链中的核糖核苷酸之间的所有键都是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的在miRNA抑制剂的反义链中的核糖核苷酸之间的键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，miRNA抑制剂的反义链中的核糖核苷酸之间的所有键都是硫代磷酸酯键。
miRNA抑制剂可以与细胞接触或施用于生物体(例如，人)。或者，编码miRNA抑制剂的构建体和/或载体可以与细胞或生物体接触或引入细胞或生物体中。在某些实施方案中，使用病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。本文所述的miRNA抑制剂可以通过本领域已知的任何合适的方法来制备。例如，在一些实施方案中，本文所述的miRNA抑制剂通过化学合成或体外转录制备。
在一些实施方案中，在递送运载体(例如，脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导结构域(PTD)、抗体和/或适体)存在下使细胞与miRNA抑制剂接触。
在本发明方法中，本文所述的miRNA抑制剂可以例如作为没有递送运载体的核酸、与递送试剂组合的核酸和/或作为包含表达本文所述的miRNA抑制剂的序列的核酸施用于受试者。在一些实施方案中，本领域中已知的任何核酸递送方法均可用于本文所述的方法中。合适的递送试剂包括但不限于例如Mirus Transit TKO亲脂性试剂；脂质转染；脂质转染胺；cellfectin；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、去端肽胶原蛋白、纳米复合物和脂质体。Minakuchi等人Nucleic Acids Res.,32(13):e109(2004)；Hanai等人Ann NY Acad Sci.,1082:9-17(2006)；和Kawata等人Mol Cancer Ther.,7(9):2904-12(2008)中描述了使用去端肽胶原作为核酸分子的递送运载体，这些文献中的每篇文献都全文并入本文。示例性的干扰核酸递送系统在美国专利号8,283,461、8,313,772、8,501,930、8,426,554、8,268,798和8,324,366中提供，所述美国专利中的每篇美国专利都5据此全文以引用方式并入。
在本文所述的方法的一些实施方案中，脂质体用于将本文所述的miRNA抑制剂递送至受试者。适用于本文所述的方法的脂质体可由标准囊泡形成脂质形成，所述标准囊泡形成脂质通常包括中性或带负电的磷脂和甾醇，诸如10胆固醇。脂质的选择通常是通过考虑诸如所需的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期的因素来指导的。已知有多种用于制备脂质体的方法，例如如在Szoka等人(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述，所述文献的全部公开内容以引用方式并入本文。还可以修饰用于本发明方法的脂质体以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。这种修饰的脂质体具有在表面上或掺入脂质体结构中的调理作用抑制部分。20用于制备本文所述的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大亲水聚合物。如本文所用，调理作用抑制部分在化学或物理附接至膜时“结合”至脂质体膜，例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身，或通过直接结合至25膜脂质的活性基团。这些抑制调理作用的亲水性聚合物形成保护性表面层，所述保护性表面层显著降低MMS和RES对脂质体的摄取；例如，如在美国专利号4,920,016中所述，所述美国专利的全部公开内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，适合修饰30脂质体的调理作用抑制部分是数均分子量为约500道尔顿至约40,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约20,000道尔顿的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，诸如OPH-00301-23-聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链、支链或树枝状聚酰胺基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如羧基或氨基化学连接至的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物5的共聚物也是合适的。另外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺基胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸10、角叉菜胶；胺化多糖或寡糖(直链或支链)；或羧基化多糖或寡糖，例如与碳酸衍生物反应，从而产生羧基连接。在一些实施方案中，调理作用抑制部分是PEG、PPG或它们的衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时被称为“聚乙二醇化脂质体”。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂包含末端修饰。在一些实施方案中，将miRNA抑制剂用聚乙二醇(PEG)(例如0.5-40kDa)进行化学修饰(例如附接至miRNA抑制剂的5'端)。在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含5'端帽(例如，反向胸腺嘧啶、生物素、白蛋白、几丁质、壳聚糖、纤维素、末端胺、炔、叠氮化物、硫醇、马来酰亚胺、NHS)。在某些实施方案中，miRNA抑制剂包含3'端帽(例如，反向胸腺嘧啶、生物素、白蛋白、几丁质、壳聚糖、纤维素、末端胺、炔、叠氮化物、硫醇、马来酰亚胺、NHS)。
在某些实施方案中，本文提供的miRNA抑制剂包含一种或多种(例如，至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、或54种)经修饰的糖。在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含一个或多个2'糖取代(例如，2'-氟、2'-氨基或2'-O-甲基取代)。在某些实施方案中，miRNA抑制剂在其主链中包含锁核酸(LNA)、非锁核酸(UNA)和/或2'脱氧-2'氟-D-阿拉伯核酸(2'-FANA)糖。
在某些实施方案中，miRNA抑制剂包含一种或多种(例如，至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、或54种)甲基膦酸酯核苷酸间键、硫代磷酸酯核苷酸间键和/或二硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，miRNA抑制剂包含一种或多种(例如，至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、或54种)三唑核苷酸间键。在某些实施方案中，miRNA抑制剂用胆固醇或二烷基脂质(例如，在其5'端)修饰。
在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含一种或多种经修饰的含氮碱基(例如，(苄基羧酰胺)-脱氧尿苷(BzdU)、5-甲基胞嘧啶)或包含官能团(例如，萘基、色氨基(triptamino)、异丁基、或炔烃(二苯并环辛炔、叠氮化物、马来酰亚胺)的含氮碱基。
在一些实施方案中，本文所述的miRNA抑制剂用可检测标记标记和/或包含可检测标记。在一些实施方案中，可以使用任何可检测标记。可检测标记的示例包括但不限于荧光部分、放射性部分、顺磁性部分、发光部分和/或比色部分。在一些实施方案中，本文所述的miRNA抑制剂与荧光部分连接、包含荧光部分和/或被荧光部分结合。荧光部分的示例包括但不限于别藻蓝蛋白(APC)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、Cy3染料、Cy5染料、多甲藻素-叶绿素蛋白复合物、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor750、Alexa Fluor 790、EGFP、mPlum、mCherry、mOrange、mKO、EYFP、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、Cerulean和CyPet。
miRNA抑制剂可以通过技术人员熟知的方法合成。例如，miRNA抑制剂可以化学合成，例如在固体载体上化学合成。固相合成可以使用亚磷酰胺化学。简而言之，将固体支持的核苷酸脱三苯甲基化，然后与适当活化的核苷亚磷酰胺偶联以形成亚磷酸三酯键。然后可以发生封端，随后用氧化剂(例如碘)氧化亚磷酸三酯。然后可以重复该循环以装配miRNA抑制剂。
在某些方面中，本文提供了制备miRNA抑制剂的方法，所述方法包括合成核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者的核酸序列具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或至少100％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性、或至少100％序列同一性)的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括合成SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中任一者的核酸分子。
在某些方面中，本文提供的方法包括预防、抑制、治疗或减少动脉瘤，包括向有需要的受试者施用如本文所述的miRNA抑制剂。
在某些方面中，本文提供的方法包括预防、抑制、治疗或减少动脉瘤，包括向有需要的受试者施用如本文所述的载体。
在某些方面中，本文提供的方法包括预防、抑制、治疗或动脉瘤，包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，皮下施用药物组合物。在一些实施方案中，肠胃外地施用药物组合物。
在一些实施方案中，动脉瘤是腹主动脉瘤、脑动脉瘤或胸主动脉瘤。在一些实施方案中，疾病病症是高血压、ARDS或与内皮功能障碍相关联的任何其他病理疾患。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者联合施用附加治疗剂。在一些实施方案中，所述附加治疗剂是叶酸化合物和/或钙通道阻断剂。
在某些方面中，本文所提供的方法包括逆转血管重塑，包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物，其中血管重塑的特征在于炎症、基质降解、外膜肥大、内侧弹性蛋白降解和扁平化，和/或腔内血栓形成。
在某些方面中，本文提供的方法包括调节二氢叶酸还原酶(DHFR)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA4)、基质金属肽酶9(MMP-9)和/或SMAD家族2(SMAD2)mRNA表达和蛋白质水平，包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。
在某些方面中，本文提供的方法包括减少活性氧物质产生，包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。活性氧物质(ROS)是不稳定的分子，含有氧作为氧代谢的副产品，有时还含有氮，同时也被称为反应性氮物质(RNS)(例如一氧化氮、过氧亚硝酸盐)。ROS包括超氧化物、过氧化氢、一氧化氮、过氧亚硝酸盐、次氯酸(HOCl)和羟基自由基。在一些实施方案中，通过用荧光探针(例如，二氢乙锭或2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA))对活性氧物质(例如，超氧化物、过氧化氢、一氧化氮、过氧亚硝酸盐、氢氯酸或羟自由基)进行染色，通过流式细胞术或荧光显微术测量活性氧物质产量。例如，可以通过用于超氧化物检测的二氢乙锭(DHE)染色来测量活性氧物质产量。
在某些方面中，本文提供的方法包括恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性，包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。如本文所用，“恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性”是指相对于先前的测量结果或参考对照样品增加eNOS偶联活性。在某些实施方案中，在存在或不存在L-NAME(NOS抑制剂)的情况下通过电子自旋共振(ESR)光谱法测量eNOS偶联/解偶联活性。ESR光谱术测量超氧化物水平。如果在L-NAME存在下恢复了eNOS偶联活性，则超氧化物水平的度量将会增加。如果在L-NAME存在下没有恢复eNOS偶联活性，则超氧化物水平的度量将保持降低，指示来自eNOS/eNOS衍生的超氧化物产生的超氧化物产生。
在某些方面中，本文提供的方法包括保持一氧化氮(NO)生物利用度，包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。一氧化氮(NO)是一种参与维持心血管稳态的多功能信号传导分子。NO生物利用度表明实际上内皮NO分子可用于器官或细胞系统的功能，并且其减少是氧化应激导致内皮功能障碍的结果。如本文所用，“保持NO生物利用度”是指相对于先前的测量结果或参考对照样品维持或增加NO水平。在某些实施方案中，NO利用度是通过电子自旋共振(ESR)光谱术来测量的。如果NO生物利用度得到保留/恢复，则NO水平的度量将会增大。如果NO生物利用度未得到保留，则NO水平的度量将保持下降。
在某些方面中，本文提供的方法包括降低miRNA表达的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物，其中miRNA包含作为SEQ ID NO:20至SEQ IDNO:38中任一者的核酸。
在某些方面中，本文提供的方法包括制备如本文所述的miRNA抑制剂的方法，所述方法包括合成核酸分子。
治疗疾病的方法
在某些方面中，本文提供的组合物和方法可用于治疗或预防本文所述的疾病、疾患或病症。
心血管疾病
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及治疗或预防心脏病、血管疾病和/或心血管疾病或心血管系统疾病，例如动脉瘤(例如，腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、冠状动脉疾病、卒中、外周动脉疾病、脑血管疾病、糖尿病衍生的心血管疾病/并发症、充血性心力衰竭，急性和慢性心力衰竭、动脉高血压、原发性和继发性高血压、冠心病、稳定型和不稳定型心绞痛、心肌缺血、心肌缺血再灌注损伤、心肌梗塞、冠状动脉微血管功能障碍、微血管阻塞、无复流现象、休克、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周动脉疾病(peripheral artery disease)、外周动脉疾病(peripheral arterialdisease)、间歇性跛行、严重间歇性跛行、肢体缺血、严重肢体缺血、心脏肥大、任何病因的心肌病(诸如扩张性心肌病、限制型心肌病、肥厚型心肌病、缺血性心肌病)，心脏纤维化、房性和室性心律失常、短暂性和/或缺血性发作、中风、缺血性和/或出血性卒中、先兆子痫、炎性心血管疾病、代谢性疾病、肥胖、糖尿病(diabetes)、I型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病(diabetes mellitus)、外周和自主神经病变、糖尿病神经病变、糖尿病微血管病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病四肢溃疡、坏疽、CREST综合征、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、脂肪代谢紊乱、代谢综合征、纤维蛋白原和低密度脂蛋白水平升高(即LDL)、纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)浓度增加、以及外周血管和心血管疾病、外周循环障碍、原发性和继发性雷诺综合征、微循环障碍、动脉性肺动脉高压、原发性和继发性肺动脉高压、冠状动脉和外周动脉痉挛、血栓形成、血栓栓塞性疾病、水肿形成(诸如肺水肿、脑水肿、肾水肿、心肌水肿、与心力衰竭相关联的心肌水肿)、即溶栓疗法后的再狭窄、经皮腔内血管成形术(PTA)、腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)、心脏移植、肺移植、肾移植、搭桥手术以及微血管和大血管损伤(例如，血管炎)、再灌注损伤、动脉和静脉血栓形成、微量白蛋白尿、心功能不全、内皮功能障碍。根据本公开，心力衰竭包括更具体或相关种类的疾病，诸如急性失代偿性心力衰竭、右心力衰竭、左心力衰竭、整体机能不全、缺血性心肌病、扩张性心肌病、先天性心脏缺陷、瓣膜疾病、与瓣膜疾病相关的心力衰竭、二尖瓣狭窄、二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣闭锁不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁不全、联合瓣膜缺陷、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、细菌性心肌炎、糖尿病性心力衰竭、酒精中毒性心肌病、心脏贮积病、射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、舒张性心力衰竭、射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、收缩性心力衰竭。在本公开的上下文中，术语房性心律失常和室性心律失常还包括更具体和相关的疾病实体，诸如：房颤、阵发性房颤、间歇性房颤、持续性房颤、永久性房颤、心房扑动、窦性心律不齐、窦性心动过速、被动性异位、主动性异位、替代性收缩、期外收缩、冲动传导障碍、病态窦房结综合征、过敏性颈动脉窦、心动过速、房室(AV)结折返性心动过速、房室折返性心动过速、WPW综合征(沃尔夫-帕金森-怀特综合征)、Mahaim心动过速、隐藏旁路/束、永久性交界折返性心动过速、局灶性房性心动过速、交界性异位心动过速、房性折返性心动过速、室性心动过速、心室扑动、室颤、心源性猝死。在本公开的上下文中，术语冠心病还包括更具体或相关的疾病实体，诸如：缺血性心脏病、稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、不稳定型心绞痛、NSTEMI(非ST段抬高型心肌梗死)、STEMI(ST段抬高型心肌梗死)、心脏缺血性损伤、心律失常、和心肌梗塞。
内皮功能障碍
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及内皮功能障碍或与内皮功能障碍相关的疾病或病症的治疗或预防。内皮功能障碍是指这样的疾病，所述疾病的特征在于内衬于血管腔的内皮细胞中一氧化氮(NO)生物利用度缺乏，导致一系列功能障碍事件，从而导致心血管疾病和其他人疾病的发病机理。功能障碍事件包括但不限于由于NO介导的血管舒张作用丧失而导致的血管收缩、血小板活化和嗜中性粒细胞粘附增加、由于炎症蛋白表达上调而导致的炎症反应增加、以及内皮细胞凋亡。内皮功能障碍已参与多种人疾病，诸如但不限于高血压、动脉瘤、糖尿病血管疾病/并发症、肥胖/代谢综合征、肺动脉高压、ARDS、和心脏/心肌梗塞的缺血再灌注损伤。
炎症性疾病和病症
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于治疗或预防炎症。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于预防或治疗身体的任何组织和器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、心脏炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症和生殖系统炎症。
本文所述的组合物和方法可用于治疗或预防与病理性免疫反应相关联的疾病或病症，诸如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)或全身炎症反应综合征(SIRS)。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种会导致低血氧和致死呼吸衰竭的严重肺部病症。发展出ARDS的个体通常是由于另一种疾病或严重受伤而患病。ARDS通常在创伤、吸入有害物质或由细菌和/或病毒感染(诸如SARS或SARS-CoV-2)诱发的脓毒症后发展出。在ARDS中，由于内皮功能障碍的主要病理特征，流体在肺部的微小的气囊内积聚，从而导致血管渗漏，并且表面活性剂分解。表面活性剂是一种泡沫状物质，其使肺部保持充分扩张，以便人可以呼吸。这些变化阻止肺部正确充满空气和将足够的氧气输送到血液和全身。肺组织可能会结疤并变硬。
SIRS是一种与全身炎症、器官功能障碍和器官衰竭相关的严重病症。它是细胞因子风暴的子集，其中存在多种细胞因子的异常调节。SIRS还与败血症密切相关，并且满足SIRS标准的受试者也可能患有疑似或已证实的感染。SIRS通常可表现为生命体征异常的组合，包括发热或体温过低、心动过速、呼吸急促以及白细胞增多或白细胞减少。SIRS是非特异性的，并且可由缺血、炎症、创伤、烧伤、感染、胰腺炎、应激、器官损伤、大手术、骨折或多种损伤的组合引起。
自身免疫性疾病
本文所述的组合物和方法可用于例如预防或治疗自身免疫性疾病，诸如慢性炎性肠病、系统性红斑狼疮、牛皮癣、穆克勒-韦尔斯综合征、类风湿性关节炎、多发性硬化症或桥本氏病；过敏性疾病，诸如食物过敏、花粉病或哮喘。本文所述的组合物和方法可用作例如用于预防或治疗炎性疾病(诸如胃肠道炎性疾病(诸如结肠袋炎)、心血管炎性病症(诸如动脉粥样硬化)、或炎性肺病(诸如慢性阻塞性肺病、纤维化疾病或囊性纤维化))的药物组合物。
本文所述的组合物和方法可用于治疗或预防具有炎症组分的自身免疫病症。此类病症包括但不限于急性播散性普秃、白塞病、恰加斯病、慢性疲劳综合征、自主神经机能障碍、脑脊髓炎、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、化脓性汗腺炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、乳糜泻、克罗恩氏病、1型糖尿病、巨细胞动脉炎、古德帕斯丘综合征、格拉夫病、格林-巴利综合征、桥本氏病、亨诺赫-舍恩莱因紫癜、川崎病、红斑狼疮、显微镜下结肠炎、显微镜下多动脉炎、混合性结缔组织疾病、穆克勒-韦尔斯综合征、多发性硬化症、重症肌无力、眼阵挛性肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、天疱疮、结节性多发性动脉炎、多肌痛、类风湿性关节炎、莱特尔氏综合征、干燥综合征、颞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、温性自身免疫性溶血性贫血、间质性膀胱炎、莱姆病、硬斑病、牛皮癣、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎和白癜风。
癌症
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及癌症的治疗或预防，因为许多类型的癌症与内皮功能障碍、炎症和/或氧化应激有关。在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法治疗任何癌症。可以通过本文所述的组合物和方法治疗的癌症的示例包括但不限于膀胱癌细胞、血液癌细胞、骨癌细胞、骨髓癌细胞、脑癌细胞、乳腺癌癌细胞、结肠癌细胞、食道癌细胞、胃肠癌细胞、牙龈癌细胞、头癌细胞、肾癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、鼻咽癌细胞、颈癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、舌癌细胞或子宫癌细胞。此外，癌症可以具体地是以下组织学类型之一，但不限于这些：恶性赘瘤；恶性肿瘤；未分化的恶性肿瘤；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；和恶性母细胞瘤；塞尔托利氏细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维性组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；或毛细胞白血病。
在一些实施方案中，癌症包括乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)。在一些实施方案中，癌症包括结直肠癌(例如，微卫星稳定(MSS)结直肠癌)。在一些实施方案中，癌症包括肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症包括肺癌(例如，非小细胞肺癌)。在一些实施方案中，癌症包括膀胱癌。在一些实施方案中，癌症包括胃食管癌。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法涉及白血病的治疗。术语“白血病”包括造血器官/系统的广泛进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中白细胞及其前体的增殖和发育扭曲。白血病疾病的非限制性示例包括急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球性白血病、嗜碱性粒细胞白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞白血病、血母细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、微成髓细胞性白血病、单核细胞白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓性粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病、内格利型白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病和早幼粒细胞白血病。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法涉及恶性肿瘤的治疗。术语“恶性肿瘤”是指由倾向于浸润周围组织和/或抵抗生理和非生理细胞死亡信号并引起转移的上皮细胞构成的恶性生长。恶性肿瘤的非限制性示例性类型包括腺泡癌、腺泡状癌、腺样囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、基底样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬癌、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外生性癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌、鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamouscell carcinoma)、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、毛基底细胞癌、多血癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、透明质癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔癌、库尔奇茨基细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤性癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑素癌、软癌、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、克鲁肯伯格瘤(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、胶样癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾细胞癌、贮备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌和阴囊癌。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法涉及肉瘤的治疗。术语“肉瘤”通常是指由类似于胚胎性结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由包埋在纤维状、异质或同质物质中的紧密堆积的细胞构成。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、纤维母细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、阿伯内西肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞性肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞性肉瘤、詹森氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网织红细胞性肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。
可以使用本文所述的组合物和方法治疗的另外的示例性肿瘤形成包括霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛瘤、恶性类癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、结直肠癌、直肠癌和肾上腺皮质癌。
在一些实施方案中，所治疗的癌症是黑素瘤。术语“黑素瘤”意指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。黑素瘤的非限制性示例是哈-帕二氏黑素瘤、青少年性黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、肢端雀斑性黑素瘤、无黑素性黑素瘤、良性青少年性黑素瘤、克劳德曼氏黑素瘤、S91黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。
可以使用本文所述的组合物和方法治疗的肿瘤的具体类别包括淋巴组织增生性疾患、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、骨癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、中枢神经系统癌症、周围神经系统癌症、皮肤癌、肾癌以及上述所有癌症的转移。具体类型的肿瘤包括肝细胞癌、肝癌、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食道癌、甲状腺癌、神经节母细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹上皮内肉瘤(rhabdotheliosarcoma)、浸润性导管癌、乳头状腺癌、黑素瘤、肺鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(高分化、中度分化、低分化或未分化的)、细支气管肺泡癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肾上腺样癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、睾丸肿瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和大细胞肺癌)、膀胱癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、直肠癌、造血系统恶性肿瘤，包括所有类型的白血病和淋巴瘤，包括：急性骨髓性白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、浆细胞瘤、结直肠癌、和直肠癌。
在某些实施方案中治疗的癌症还包括癌前病变，例如光化性角化病(日光性角化病)、痣(发育不良性痣)、光化性唇炎(农夫唇)、皮角、巴雷特食管、萎缩性胃炎、先天性角化不良、铁缺乏性吞咽困难、扁平苔藓、口腔粘膜下纤维化、光化性(日光)弹性组织变性和宫颈非典型增生。
在一些实施方案中，所治疗的肿瘤包括非癌性或良性肿瘤，例如内胚层、外胚层或间充质来源的非癌性或良性肿瘤，包括但不限于胆管瘤、结肠息肉、腺瘤、乳头瘤、囊腺瘤、肝细胞腺瘤、葡萄胎、肾管腺瘤、鳞状细胞乳头瘤、胃息肉、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、脂肪瘤、纤维瘤、淋巴管瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、星形细胞瘤、痣、脑膜瘤和神经节瘤。
示例性实施方案
实施方案1.一种miRNA抑制剂，所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:19中的任一者至少80％同一的核酸。
实施方案2.如实施方案1所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少50％(例如，50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少90％)同一的核酸。
实施方案3.如实施方案1所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少95％同一的核酸。
实施方案4.如实施方案1所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少98％同一的核酸。
实施方案5.如实施方案1所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂包含作为SEQID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者的核酸。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述核酸包含化学修饰。
实施方案7.如实施方案6所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是2'-O-甲基化核苷(2'OMe)、2'-氟代寡核苷酸(2'F)、2'-O-甲氧基乙基寡核苷酸(2'MOE)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯键(PS)、锁核酸(LNA)、疏水部分、萘基改性剂、非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)、或胆固醇部分。
实施方案8.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是2'-O-甲基化核苷(2'OMe)。
实施方案9.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是2'-氟代寡核苷酸(2'F)。
实施方案10.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是2'-O-甲氧基乙基寡核苷酸(2'MOE)。
实施方案11.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。
实施方案12.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是肽核酸(PNA)。
实施方案13.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是硫代磷酸酯键(PS)。
实施方案14.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是锁核酸(LNA)。
实施方案15.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是疏水部分。
实施方案16.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是萘基修饰剂。
实施方案17.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是胆固醇部分。
实施方案18.如实施方案1-17中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述核酸与SEQID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者互补。
实施方案19.如实施方案1-18中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少50％(例如，50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少90％)同一的核酸的miRNA结合。
实施方案20.如实施方案1-18中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少90％同一的核酸的miRNA结合。
实施方案21.如实施方案1-18中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少95％同一的核酸的miRNA结合。
实施方案22.如实施方案1-18中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少98％同一的核酸的miRNA结合。
实施方案23.如实施方案1-18中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂与包含作为SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中的任一者的核酸的miRNA结合。
实施方案24.如实施方案1-23中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂的长度为至少10个核苷酸。
实施方案25.如实施方案1-23中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂的长度为至少18个核苷酸。
实施方案26.如实施方案1-25中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂的长度不大于30个核苷酸。
实施方案27.如实施方案1-25中任一项所述的miRNA抑制剂，其中所述miRNA抑制剂的长度不大于22个核苷酸。
实施方案28.一种miRNA抑制剂，所述miRNA抑制剂与如实施方案1-27中任一项所述的miRNA抑制剂竞争结合包含作为SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:38中任一项的核酸的miRNA。
实施方案29.一种载体，所述载体包含如实施方案1-28中任一项所述的miRNA抑制剂。
实施方案30.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案1-28中任一项所述的miRNA抑制剂或如实施方案29所述的载体。
实施方案31.如实施方案30所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案32.如实施方案30或31所述的药物组合物，所述药物组合物用于预防、抑制、治疗或减少动脉瘤。
实施方案33.如实施方案32所述的药物组合物，其中所述动脉瘤是腹主动脉瘤、脑动脉瘤或胸主动脉瘤。
实施方案34.一种预防、抑制、治疗或减少受试者的动脉瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列。
实施方案35.如实施方案34所述的方法，其中所述药物组合物包含载体。
实施方案36.如实施方案34或35所述的方法，其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p的功能。
实施方案37.一种预防、抑制、治疗或减少受试者的动脉瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
实施方案38.如实施方案37所述的方法，其中皮下施用所述药物组合物。
实施方案39.如实施方案37所述的方法，其中肠胃外施用所述药物组合物。
实施方案40.如实施方案37-39中任一项所述的方法，其中所述动脉瘤是腹主动脉瘤、脑动脉瘤或胸主动脉瘤。
实施方案41.如实施方案37-40中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者联合施用附加治疗剂。
实施方案42.如实施方案41所述的方法，其中所述附加治疗剂是叶酸化合物和/或钙通道阻断剂。
实施方案43.一种逆转血管重塑的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列，其中所述血管重塑的特征在于炎症、基质降解、外膜肥大、内侧弹性蛋白降解和扁平化和/或腔内血栓的形成。
实施方案44.一种减少活性氧物质产量的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列。
实施方案45.一种减少活性氧物质产量的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
实施方案46.一种恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列。
实施方案47.一种恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
实施方案48.一种保持一氧化氮(NO)生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列。
实施方案49.一种保持一氧化氮(NO)生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
实施方案50.一种治疗或预防受试者的动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或与内皮功能障碍相关联的任何其他疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少50％(例如，50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少90％)同一的核酸的miRNA抑制剂。
实施方案51.一种治疗或预防受试者的动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或与内皮功能障碍相关联的任何其他疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列的miRNA抑制剂。
实施方案52.如实施方案51所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p的一部分具有至少50％(例如，50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少90％)的互补性。
实施方案53.如实施方案51所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p的一部分具有至少95％的互补性。
实施方案54.如实施方案51所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p的一部分具有至少99％的互补性。
实施方案55.如实施方案51所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p的一部分具有100％的互补性。
实施方案56.如实施方案51-55中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p的功能。
实施方案57.如实施方案7所述的miRNA抑制剂，其中所述化学修饰是非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)。
实施例
现已一般性地描述本发明，通过参考以下实施例将使本发明得到更清楚的理解，包括所述实施例仅用于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，而不旨在限制本发明。
申请人在此已表明，内皮特异性二氢叶酸还原酶(DHFR)缺乏是eNOS解偶联和腹主动脉瘤(AAA)形成的基础。在此，研究了miR-192-5p在介导NOX依赖性DHFR缺乏和AAA形成中的新颖作用。miR-192-5p预计会靶向DHFR。有趣的是，在人AAA患者中，hsa-miR-192-5pmRNA表达显著上调。在暴露于过氧化氢(H2O2)的人主动脉内皮细胞(HAEC)中，hsa-miR-192-5p表达显著上调。这伴随着DHFR mRNA和蛋白表达的显著下调，这通过hsa-miR-192-5p特异性抑制剂得以恢复。miR-192-5p表达在输注Ang II的hph-1小鼠中显著上调，这在hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变小鼠中减弱，其中AAA发生率也被消除，表明了miR-192-5p在NOX活化后的下游效应物作用。用mmu-miR-192-5p作为抑制剂进行体内治疗减弱了输注Ang II的hph-1小鼠的腹主动脉扩张，如超声心动描记术和死后检视所定义的。它还逆转了血管重塑的特征，包括基质降解、外膜肥大和管腔内血栓的形成。这些动物已经恢复了DHFR mRNA和蛋白质表达，减少了超氧化物产量，重新偶联了eNOS，并保留了NO生物利用度。总之，我们的数据证明了miR-192-5p在介导NOX依赖性DHFR缺乏和AAA形成中的关键作用，抑制miR-192-5p对于减弱AAA的发展非常有效。由于小鼠和人miR-192-5p序列相同，因此miR-192-5p抑制剂很容易转化为用于治疗AAA的新颖疗法。
实施例1.材料和方法
在实施例2至实施例7中使用了以下材料和方法。
试剂：
除非另有说明，否则所有化学品均以最高纯度购自Millipore-Sigma(Burlington,MA,USA)。异氟醚获自Piramal Healthcare(Bethlehem,PA,USA)。
人AAA样品：
以批准的IRB(机构审查委员会(Institutional Review Board))方案从NIH NDRI(国家疾病研究交换(National Disease Research Interchange))计划获得人AAA的主动脉瘤组织样品，并且对照受试者是那些由于突然原因死亡但没有动脉瘤的供体(年龄：对照为73.1±11.4岁，相比之下AAA为72.5±10.8岁；对照为11名男性和4名女性，相比之下AAA为为10名男性和5名女性)。
细胞培养和miRNA抑制剂转染
将从2名男性(49岁和50岁；Lonza；Walkersville,MD)捐赠的第3代至第7代人主动脉内皮细胞(HAEC)在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和补充物(氢化可的松、hFGF-B、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸、hEGF、GA-1000和肝素，所有试剂均来自Lonza,USA)的EGM2培养基中培养。使细胞在5％ CO2和37℃的潮湿气氛中生长。根据制造商的使用说明，使用脂质转染胺RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific)执行将miRNA抑制剂和阴性对照(50μmol/L；六孔板中100pmol/孔，Life Technologies Corporation,Grand Island,NY 14072,USA)转染至HAEC中。在HAEC中用100μmol/L的H2O2刺激24h之前执行转染48h。然后收获细胞用于后续的has-miR-192表达、DHFR mRNA和蛋白表达分析。
RNA提取、microRNA特异性cDNA合成、和microRNA的qRT-PCR
根据制造商的使用说明，使用(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)从HAEC中提取总RNA。根据制造商的使用说明，使用Mir-X miRNA第一链合成试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.,A Takara Bio Company,Mountain View,CA,USA)从RNA样品中合成第一链cDNA。引物是基于miRBase序列(hsa-miR-192-5p、MIMAT0000222、miRBase)设计的。相对于扩增后U6的丰度(由Clontech Laboratories,Inc.供应)对cDNA的初始量的变异性进行归一化，并将数据表示为倍数变化。根据制造商的说明，使用SYBR qRT-PCR试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.,A Takara Bio Company,Mountain View,CA,USA)进行微小RNA的qRT-PCR。
mRNA表达的实时RT-PCR测定
如前所述执行DHFR mRNA的实时RT-PCR扩增。每个PCR反应均一式三份进行，并使用管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内源对照，用经效率校正的2-ΔΔCt方法执行定量。用于人DFHR的引物是：有义：5'-CTTTCCAGAAGTCTAGATGC-3'；反义：5'-GGTATCTGATAGAGACAAGAG-3'。用于GAPDH的引物是：有义：5'-AACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAA-3'；反义：5'-GCATCAGCAGAGGGGGCAGAG-3'。数据显示为对照组的倍数变化。用于实时PCR的所有引物均由Integrated DNA Technologies(San Diego,CA)合成。
蛋白质印迹法
对20微克蛋白质进行SDS-PAGE(10％凝胶)并转移至硝酸纤维素膜(AmershamInc,Marlborough,MA,USA)。在含有0.1％ Tween-20和5％(w/v)脱脂奶粉的PBS中封闭1h后，将膜分别与针对DHFR(1:300，Novus Biologicals,Littleton,CO,USA)和肌动蛋白(1:10,000，Sigma-Millipore,address)的一抗一起孵育。
渗透泵将Ang II输注到hph-1小鼠和hph-1-NOX同种型/亚基双重突变小鼠中
所有动物和实验工序均得到了加州大学洛杉矶分校的机构动物护理和使用委员会的批准。如前所述维护自制生成的纯合子hph-1以及双重突变体hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4小鼠。将动物在异氟烷室中用异氟烷麻醉，然后移至供应1.5-2％异氟烷的鼻锥以维持麻醉状态。将小鼠背部中的肩胛骨之间的一小块区域去除毛发，然后用碘溶液消毒。在该部位切开一个小切口，然后在左胁腹的皮肤下插入渗透泵(Alzet，型号2002，Cupertino,CA,USA)，容纳有在递送溶液(3.8mL H2O，120μl的5MNaCl，40μl的乙酸)中的Ang II(0.7mg/kg/天)。使用手术钉来闭合伤口。将动物放入加热室中进行恢复。锁核酸(LNA)-mmu-miR-192-5p抑制剂由Exiqon(现在是QIAGEN公司，Germantown,MD,USA)合成并用于在植入Ang II泵后的第一天和第三天皮下注射(30mg/kg)到hph-1小鼠中。将LNA阴性对照注射到动物体内作为对照组。
组织收集
在Ang II输注后2周，用CO2对动物实施安乐死。迅速从体内取出主动脉，用冰冷的改良Krebs/HEPES缓冲液(KHB：99mmol/L的NaCl；4.7mmol/L的KCl；1.2mmol/L的MgSO4；1.0mmol/L的KH2PO4；2.5mmol/L的CaCl2；25mmol/L的NaHCO3；5.6mmol/L的D-葡萄糖；20mmol/L的NaHEPES)冲洗，并在冰上清除结缔组织和脂肪。通过主动脉大小的超声分析和死后检视来确定AAA发生率。还用尺子测量分离的主动脉的外径。收集肾上腺主动脉的一小部分(约2mm)以进行随后组织学分析。
从主动脉分离内皮细胞
如前所述从主动脉中分离内皮细胞(EC)。简而言之，将新鲜分离的主动脉切成小切片(约2mm)并在含有胶原酶(0.6mg/mL)的PBS中在37℃下消化20min。然后在消化缓冲液中轻轻振荡主动脉环以去除EC。通过在4℃下以1,000g离心3min收集EC，并用裂解缓冲液裂解以通过蛋白质印迹分析DHFR蛋白表达，或用裂解以通过RT-PCR分析DHFR mRNA和miR-192-5p表达。
用mmu-miR-192-5p抑制剂对hph-1小鼠进行体内治疗
锁核酸(LNA)-mmu-miR-192-5p抑制剂由Exiqon(现在是QIAGEN公司，Germantown,MD,USA)合成并用于在植入Ang II泵后的第一天和第三天皮下注射(每次30mg/kg)到hph-1小鼠中。将LNA阴性对照注射到动物体内作为对照组。用于体内实验的mmu-miR-192-5pmiRNA抑制剂和阴性对照由ThermoFisher(Grand Island,NY,USA)合成。在植入Ang II泵后，将mmu-miR-192-5pmiRNA抑制剂或阴性对照在第一天和第三天通过尾静脉静脉注射到hph-1小鼠体内(每次2.5mg/kg)。
组织学分析
在切片后，由UCLA的转化病理学核心实验室(Translational Pathology CoreLaboratory,TPCL)核心设施使用标准方案执行H&E染色。为了进行VVG染色以可视化弹性蛋白纤维，将石蜡包埋的组织切片通过在二甲苯(2x)中连续洗涤(酒精从100％降到50％)来脱蜡，然后放入蒸馏水中。然后将切片在Verhoeff溶液中染色70min，然后在2％三氯化铁中分化90s。然后将切片与5％硫代硫酸钠一起孵育60s，接着用范吉逊氏溶液复染并用95％和100％酒精脱水，最后用二甲苯洗涤。干燥后，将组织用Permount(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,USA)封片，并使用Nikon TE2000-U荧光显微镜捕获图像。
主动脉ROS产量的DHE检测。
如前所述，使用二氢乙锭(DHE)染色来检查miR-192-5p抑制剂对总原位血管ROS产量的功效。DHE是一种可渗透细胞的染料，所述染料被超氧化物氧化为溴化乙锭，所述溴化乙锭随后与DNA相互作用并被捕获在细胞核内。新鲜收获主动脉，并将主动脉环嵌入OCT化合物中，立即在-20℃下冷冻并切片。在改良的Krebs/HEPES缓冲液(KHB，内容物如上所述)中短暂冲洗7微米厚的冷冻切片以去除OCT化合物，然后覆盖在DHE(2μmol/L)溶液中以在避光润湿容器中于37℃孵育30min。然后将载玻片用KHB清洗3次，用ProLong Gold Antifade试剂(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)封片，并在激发和分别为488nm和610nm的发射波长下用Nikon TE2000-U荧光显微镜成像。
超氧化物水平的电子自旋共振(ESR)测定
如前所述，将新鲜分离的主动脉在补充有蛋白酶抑制剂混合物(1:100)的裂解缓冲液中在冰上均质化，并在12,000g下离心15min。使用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad,Irvine,CA,USA)测定上清液的蛋白质含量。将5μg蛋白质与含有二乙基二硫代氨基甲酸(5μmol/L)、去铁胺(25μmol/L)和新鲜制备的超氧化物特异性自旋捕获甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷(CMH，500μmoL/L,Axxora,San Diego,CA,USA)的冰冷且氮气鼓泡的KHB混合。然后将混合物装载入玻璃毛细管(Kimble,Dover,OH,USA)中，并使用电子自旋共振(ESR)光谱仪(eScan,Bruker,Billerica,MA,USA)测定超氧化物产量。添加PEG-SOD(100U/mL)进行第二次测量。为了评定eNOS解偶联活性，添加L-NAME(100μmoL/L)进行第三次测量。所使用的ESR设置是：中心场，3480；扫描宽度，9G；微波频率，9.78GHz；微波功率，21.02mW；调制幅度，2.47G；512点分辨率；接收器增益，1000。
一氧化氮(NO)生物利用度的电子自旋共振(ESR)测定
通过ESR测定主动脉NO生物利用度。将新鲜分离的主动脉切成2mm环，然后在钙离子载体A23187(10μmol/L)存在下在新鲜制备的NO特异性自旋捕获Fe2+(DETC)2(0.5mmol/L)胶体中在氮气鼓泡、改良的Krebs/HEPES缓冲液中于37℃孵育60min。将主动脉环在液氮中速冻并装载到手指杜瓦瓶中，以用ESR分光光度计(eScan,Bruker,Billerica,MA,USA)进行测量。所使用的仪器设置如下：中心场，3440；扫掠宽度，100G；微波频率，9.796GHz；微波功率13.26mW；调制幅度，9.82G；512点分辨率；和接收器增益356。
腹主动脉的超声成像
执行腹主动脉大小的超声测定。将动物用异氟烷麻醉并放置在温控台上。使用脱毛膏从腹部去除毛发，并将预热的超声波传输凝胶涂在腹部区域上。将超声探头(Velvo2100,echocardiograph,MS-400)放置在凝胶上以横向可视化主动脉。使用多普勒测量来鉴定主动脉中是否存在脉动流。通过可视化所有动物中紧邻左肾动脉分支的主动脉，来确保用于图像采集的定位一致。
统计分析
使用Prism软件进行所有统计分析。使用学生t检验执行两组之间的比较。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)之后是纽曼-科伊尔斯事后检验进行多组之间的比较。使用卡方检验执行不同动物组间AAA发生率的比较。统计显著性设定为p<0.05。所有分组数据均以平均值±SEM表示。
实施例2.过氧化氢下调DHFR表达，同时上调miR-192-5p表达
本研究检查了miR-192-5p在NOX依赖性DHFR调节影响AAA形成中的中间作用。首先，研究检查了人AAA的主动脉瘤组织中miR-192-5p的表达。有趣的是，与供体对照相比，人AAA患者的主动脉瘤组织中hsa-miR-192-5p的表达显著上调(图1A)。以批准的IRB方案从NIH NDRI计划获得人AAA和对照非AAA受试者的主动脉瘤组织样品，并且对照受试者是那些由于突然原因死亡但没有动脉瘤的供体(年龄：对照为73.1±11.4岁，相比之下AAA为72.5±10.8岁；对照为11名男性和4名女性，相比之下AAA为为10名男性和5名女性)。在经H2O2(100μM,24h)处理的HAEC中，hsa-miR-192-5p表达也显著上调(图1B)。有趣的是，DHFR是通过TargetScan(http://www.targetscan.org/)获得的推定miR-192-5p靶标。值得注意的是，miR-192-5p显示为降低人结肠癌细胞系中的DHFR蛋白丰度，并通过与DHFR 3-UTR结合来抑制成神经管细胞瘤细胞增殖。因此假设在人AAA患者的主动脉瘤组织和经H2O2处理的HAEC中表达增加的miR-192-5p可能介导体内DHFR的H2O2下调以诱导AAA形成。
实施例3.用特异性抑制剂沉默miR-192-5p恢复了内皮细胞中的DHFR表达
为了检查miR-192-5p是否下调EC中的DHFR，在转染miR-192-5p抑制剂48h后，将HAEC暴露于H2O2。如图2A所示，经miR-192-5p特异性抑制剂处理的HAEC中miR-192-5p表达水平降低。此外，hsa-miR-192-5p特异性抑制剂显著恢复了DHFR mRNA(图2B)和蛋白质表达(图2C和图2D)，表明了miR-192-5p在H2O2诱导的DHFR缺乏中的中间作用。
实施例4.输注Ang II的hph-1小鼠中的miR-192-5p表达：NOX依赖性上调
值得注意的是，miR-192-5p在物种间高度保守。因此，本研究探索了miR-192-5p在输注Ang II的hph-1小鼠中的AAA形成中经由预测的体内DHFR下调的潜在作用。先前已表明，在输注Ang II的hph-1小鼠中，DHFR缺陷位于NOX同种型1、2或4激活的下游，导致eNOS解偶联以诱导AAA形成。AAA的发生率显著降低，通过卡方检验有显著差异，从输注AngII的hph-1动物中的79.2％分别降至hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物中的11.8％、15.2％、7.7％和0％(图3A和表4)(来自本研究和先前工作的组合数据)。与WT小鼠相比，输注Ang II的hph-1小鼠中miR-192-5p表达显著上调，这在hph-1-NOX1(图3B)、hph-1-NOX2(图3C)、hph-1-p47phox(图3D)和hph-1-NOX4(图3E)双重突变小鼠中则被消除，表明了在NOX激活后miR-192-5p的下游作用。
表4显示miR-192-5p在介导AAA形成中充当NOX的下游效应物。在对AAA进行表型分析和分离主动脉内皮细胞以检测miR-192-5p表达水平之前，将Ang II输注到hph-1、hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物体内。数据显示了每个实验组中有和没有AAA的实际动物数量，与我们在Siu KL等人Redox Biol.2017；11:118-125中报告的原始数据的组合。AAA的发生率从输注Ang II的hph-1小鼠中的79.3％分别大大降低至hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变动物中的11.8％、15.2％、7.7％和0％。
表5
AAA(n) 无AAA(n) 发生率(％)
hph-1+Ang II 42 11 79.2
hph-1-NOX1+Ang II 4 30 11.8
hph-1-NOX2+Ang II 7 39 15.2
hph-1-p47phox+Ang II 2 24 7.7
hph-1-NOX4+Ang II 0 39 0.0
实施例5.miR-192-5p抑制剂恢复输注Ang II的hph-1小鼠中的DHFR表达
值得注意的是，mmu-miR-192-5p特异性抑制剂用于检查miR-192-5p的抑制是否恢复输注Ang II的hph-1小鼠中的DHFR表达。如图4A所示，miR表达的qRT-PCR分析表明，mmu-miR-192-5p特异性抑制剂降低了从输注Ang II的hph-1小鼠的主动脉分离的EC中的mmu-miR-192-5p表达。与hph-1小鼠相比，输注Ang II的hph-1小鼠具有显著降低的DHFR mRNA(图4B)和蛋白表达(图4C和图4D)，而与输注Ang II的hph-1小鼠相比，mmu-miR-192-5p抑制剂基本上恢复了从主动脉分离的EC中的DHFR mRNA(图4B)和蛋白质表达(图4C和图4D)。
实施例6.在输注Ang II的hph-1小鼠中miR-192-5p抑制剂减少内皮超氧化物产量、重新偶联eNOS并恢复NO生物利用度
先前表明，内皮DHFR缺乏会导致H4B生物利用度降低并且随后内皮一氧化氮合酶(eNOS)解偶联以导致AAA的发展。与未处理的hph-1小鼠相比，在输注Ang II的hph-1小鼠中通过DHE染色检测到的主动脉总ROS产量显著增加，这在输注Ang II的hph-1小鼠中用mmu-miR-192-5p抑制剂显著减弱(图5A和图5B)。此外，收获主动脉，并在存在或不存在NOS抑制剂L-NAME的情况下，对所述主动脉进行超氧化物产量的电子自旋共振(ESR)测定。如果eNOS是功能性和偶联的，则L-NAME对其抑制以去除NO的缓冲效应将增加所测量的超氧化物。然而，如果eNOS是功能障碍和未偶联的，它就会产生超氧化物。因此，用L-NAME进行抑制将减少所测量的超氧化物。输注Ang II的hph-1小鼠中的超氧化物产量增加，并且这种增加由L-NAME抑制，表明未偶联的eNOS是超氧化物产生的酶促来源(图5C)，如其先前所示。L-NAME敏感的超氧化物产生(反映eNOS解偶联活性)被miR-192-5p抑制剂完全减弱(图5C)。值得注意的是，在输注Ang II的hph-1小鼠中NO生物利用度降低，这也通过miR-192-5p抑制剂显著恢复(图5D)。这些结果表明miR-192-5p抑制剂可以在输注Ang II的hph-1小鼠中经由恢复DHFR表达来改善eNOS的偶联状态、减少ROS产量并恢复NO生物利用度。
实施例7.miR-192-5p抑制剂减弱输注Ang II的hph-1小鼠中的AAA形成
由于在输注Ang II的hph-1小鼠中miR-192-5p表达增加，因此本研究探索了miR-192-5p在AAA发展中经由下调DHFR的潜在中间作用。在Ang II输注后，AAA的发生率从经阴性对照处理的hph-1动物中的80.0％大大降低至经miR-192-5p特异性抑制剂处理的hph-1动物的25.0％(图6A和表5)。在第0天、第7天和第14天，执行腹部超声以评估腹主动脉(AA)尺寸。与对照组的通过超声心动描记术测量的AA大小相比，用mmu-miR-192-5p抑制剂处理的hph-1小鼠中通过超声心动描记术测量的AA大小显著更小(图6B和图6C)。死后检视表明，在用mmu-miR-192-5p抑制剂进行体内处理的输注Ang II的hph-1小鼠中，AAA形成被阻止(图6D)。H&E染色的代表性图像如图6E所示，这证实了mmu-miR-192-5p抑制剂减弱输注AngII的hph-1小鼠中的AAA形成。此外，在经阴性对照处理的hph-1动物中，AAA的外径增加，这在Ang II输注后在经miR-192-5p特异性抑制剂处理的hph-1小鼠中减弱(图6F)。值得注意的是，Ang II输注诱导显著的外膜肥大以及壁内血栓形成，这通过mmu-miR-192-5p抑制剂显著减弱。VVG染色表明，输注Ang II的hph-1小鼠中的弹性纤维发生显著降解和扁平化，这通过用miR-192-5p抑制剂进行体内处理而显著消除(图6G)。值得注意的是，miR-192-5p的序列在人与小鼠之间是相同的。因此，这些结果表明miR-192-5p抑制剂可能很容易地用作人AAA的潜在治疗方法。
表5显示mmu-miR-192-5p特异性抑制剂减弱输注Ang II的hph-1小鼠中的AAA发育。在对小鼠进行AAA形成表型分析之前，将Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂和阴性对照注射到输注Ang II的hph-1小鼠中。有和没有AAA的每个实验组中的动物的实际数量。AAA发生率从用阴性对照处理的hph-1动物中的80.00％大大降低到用mmu-miR-192-5p特异性抑制剂处理的hph-1小鼠中的25.00％。
表5
AAA(n) 无AAA(n) 发生率(％)
假手术 0 10 0.0
Ang II 8 3 72.7
Ang II+阴性对照 16 4 80.0
Ang II+miR-192-5p抑制剂 5 15 25.0
讨论
本研究中最重大的发现是首次证明miR-192-5p在介导AAA形成中的NOX依赖性DHFR缺乏中发挥关键作用，并且用特异性抑制剂体内沉默miR-192-5p表达经由保留EC中的内皮DHFR表达、eNOS的偶联活性和NO生物利用度而显著有效地预防AAA形成。数据表明从NOX产生的H2O2激活miR-192-5p表达以降低DHFR蛋白丰度，从而导致eNOS解偶联依赖性AAA形成。用特异性抑制剂抑制体内miR-192-5p恢复了内皮DHFR表达和eNOS偶联活性以导致减少的氧化应激、恢复的NO生物利用度并预防基质降解和外膜肥大(AAA形成的标志)(图7)。因此，miR-192-5p可能作为用于治疗AAA的新颖靶点。
AAA是一种进行性血管疾病，并且多种miRNA已经与AAA的发病机制有关。人AAA的中心区的miR-33a-5p表达高于边缘区，并且miR-33缺失经由下调巨噬细胞中的MMP9和VSMC中的单核细胞趋化蛋白-1的下调来减弱小鼠中的AAA形成。发现AAA活检中的miR-155表达显著增加，而与对照相比，AAA患者中的循环miR-155水平也升高，上调了2.67倍，达到了临界意义。发现与AAA颈部相比，两种免疫学上重要的miR-155靶基因CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关联的蛋白)和SMAD2(与果蝇中的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)SMA和MAD基因家族同源)在AAA体内显著下调，这通过增强T细胞发育和减少细胞核中TGF-β依赖性基因的表达，在促进慢性炎症中发挥着重要作用。然而，miRNA在人AAA中的详细分子机制需要进一步探索，更不用说内皮miRNA的特异性作用和调控。在此，数据首次证明内皮miR-192-5p在人AAA的主动脉瘤组织中上调，并且其经由下调DHFR和随后的eNOS解偶联在输注AngII的hph-1小鼠中在介导AAA形成中发挥着关键作用。抑制体外和体内miR-192-5p恢复了eNOS偶联活性以导致消除AAA形成。
DHFR缺乏会使eNOS解偶联以诱导高血压和AAA形成。相对适度的DHFR缺乏会导致输注Ang II的WT小鼠中eNOS解偶联活性和高血压发展增加两倍，而输注Ang II的hph-1小鼠中更严重的DHFR缺乏会诱导三倍的eNOS解偶联活性以导致AAA形成。先前已证实，内皮DHFR表达和活性的增强对于预防AAA发展非常有效。在此，已首次证明miR-192-5p能够诱导体外人内皮细胞中和输注Ang II的hph-1小鼠体内的DHFR缺乏。此外，miR-192-5p抑制剂恢复了H2O2刺激的内皮细胞和输注Ang II的hph-1小鼠中的DHFR mRNA和蛋白表达，以减弱eNOS解偶联活性。有趣的是，在输注Ang II的hph-1小鼠中，miR-192-5p抑制剂将AAA的发病率从80％降低至25％，并在分子和组织学水平上显著减弱了AAA的形成。miR-192-5p抑制剂消除了血管重塑，包括内侧弹性蛋白降解和扁平化，以及外膜肥大，这些是我们之前的研究显示的表征输注Ang II的hph-1小鼠中的AAA形成的特征。内皮细胞中miR-192-5p的调节是否在其他血管疾病中的外膜肥大中发挥作用仍有待进一步研究。总体而言，数据证实miR-192-5p在输注Ang II的hph-1小鼠的稳健模型中的AAA形成中发挥重要作用。值得注意的是，miR-192-5p的序列在人与小鼠之间是相同的。因此，miR-192-5p抑制剂可能很容易用作用于人AAA的潜在强大疗法。
NOX同种型1、2或4位于DHFR缺陷的上游以诱导AAA形成。Ang II对NOX的激活产生ROS以促进心血管发病机理。NOX在内皮细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)中响应于Ang II产生ROS。内皮NOX衍生的H2O2响应于Ang II下调DHFR表达。hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4双重突变小鼠在内皮细胞中响应于Ang II输注保留了DHFR表达和活性。值得注意的是，miR-192-5p表达在输注Ang II的hph-1小鼠中显著增加，这在输注AngII的hph-1-NOX1、hph-1-NOX2、hph-1-p47phox和hph-1-NOX4小鼠中被显著消除，表明了miR-192-5p在介导NOX依赖性DHFR缺乏中的下游作用。Mmu-miR-192-5p特异性抑制剂恢复了输注Ang II的hph-1小鼠中的DHFR mRNA和蛋白表达。值得注意的是，动物和初步人数据已表明，miRNA模拟物和抑制剂具有发展成为用于治疗心血管疾病的全新类别疗法的巨大潜力。miRNA是具有已知序列的小RNA分子，其在物种之间通常非常保守，诸如本研究中的miR-192-5p。这些特性使miRNA成为极好的药物靶标，所述药物靶标可以用大多数在靶效应进行操纵，所述在靶效应已经促进调节miRNA的化合物进入临床前功效和安全性研究以及临床试验。抗miR可以基于反义技术生成，并可以以优异的亲和力和特异性与其同源miRNA靶标有效结合；本研究中使用的mmu-miR-192-5p抑制剂确实已被证明在体内高效且有效地减弱AAA形成。
总之，这项工作表示首次证明在响应于Ang II的NOX同种型的激活下游的miR-192-5p介导H2O2诱导的内皮DHFR缺乏、eNOS解偶联以及随后的AAA形成。然而，在输注Ang II的hph-1小鼠中特异性抑制miR-192-5p经由保留内皮DHFR表达和eNOS偶联活性以及消除持续的氧化应激、基质降解和血管重塑来强烈有效地减弱AAA形成。由于人和小鼠miR-192-5p序列相同，所以这些数据表明miR-192-5p抑制剂可以很容易地用作动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、ARDS或可能由miR-192-5p激活导致的DHFR缺乏引起的与内皮功能障碍相关的任何其他疾病的新颖治疗选项。
以引用方式并入
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等同物
虽然已经讨论了本发明的具体实施方案，但以上说明是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求书后，本发明的许多变化对本领域技术人员来说将变得显而易见。本发明的全部范围应参照权利要求及其等同物的全部范围、说明书以及此类变型来确定。

Claims (51)

1.一种预防、抑制、治疗或减少受试者的动脉瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物包含编码所述miRNA抑制剂的载体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p的功能。
4.一种预防、抑制、治疗或减少受试者的动脉瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
5.如权利要求4所述的方法，其中皮下施用所述药物组合物。
6.如权利要求4所述的方法，其中肠胃外施用所述药物组合物。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述动脉瘤是腹主动脉瘤、脑动脉瘤或胸主动脉瘤。
8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者联合施用附加治疗剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述附加治疗剂是叶酸化合物、钙通道阻滞剂和/或活性氧物质(ROS)清除剂。
10.一种逆转血管重塑的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列，其中所述血管重塑的特征在于炎症、基质降解、外膜肥大、内侧弹性蛋白降解和扁平化和/或腔内血栓的形成。
11.一种减少活性氧物质产量的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列，并且其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p的功能。
12.一种减少活性氧物质产量的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
13.一种恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列，并且其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p的功能。
14.一种恢复内皮一氧化氮合酶(eNOS)偶联活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
15.一种保持一氧化氮(NO)生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列，并且其中所述miRNA抑制剂抑制成熟miR-192-5p的功能。
16.一种保持一氧化氮(NO)生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用包含miRNA抑制剂的药物组合物，所述miRNA抑制剂包含表1至表4中列出的核酸序列。
17.一种治疗或预防受试者的动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或与内皮功能障碍相关联的任何其他疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用miRNA抑制剂，所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少50-100％同一的核酸。
18.一种治疗或预防受试者的动脉瘤(腹主动脉瘤(AAA)、胸主动脉瘤(TAA)或脑动脉瘤)、高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或与内皮功能障碍相关联的任何其他疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含与miR-192-5p序列的至少一部分结合的核酸序列的miRNA抑制剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p序列的一部分具有至少50％的互补性。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p序列的一部分具有至少95％的互补性。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p序列的一部分具有至少99％的互补性。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与miR-192-5p序列的一部分具有100％的互补性。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂抑制所述成熟miR-192-5p的功能。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少50％同一的核酸序列。
25.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少90％同一的核酸序列。
26.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少95％同一的核酸序列。
27.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者至少98％同一的核酸序列。
28.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂包含作为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19中的任一者的核酸序列。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述核酸包含化学修饰。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述化学修饰是2'-O-甲基化核苷(2'OMe)、2'-氟代寡核苷酸(2'F)、2'-O-甲氧基乙基寡核苷酸(2'MOE)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯键(PS)、锁核酸(LNA)、非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)、疏水部分、萘基改性剂或胆固醇部分。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是2'-O-甲基化核苷(2'OMe)。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是2'-氟代寡核苷酸(2'F)。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是2'-O-甲氧基乙基寡核苷酸(2'MOE)。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是肽核酸(PNA)。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是硫代磷酸酯键(PS)。
37.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是锁核酸(LNA)。
38.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是疏水部分。
39.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是萘基改性剂。
40.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是胆固醇部分。
41.如权利要求30所述的方法，其中所述化学修饰是非核苷酸N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基偶氮基)-苯胺(ZEN)。
42.如权利要求24-41中任一项所述的方法，其中所述核酸与SEQ ID NO:20至SEQ IDNO:38中的任一者互补。
43.如权利要求24-42中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ IDNO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少50％同一的核酸的miRNA结合。
44.如权利要求24-42中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ IDNO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少90％同一的核酸的miRNA结合。
45.如权利要求24-42中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ IDNO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少95％同一的核酸的miRNA结合。
46.如权利要求24-42中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与包含与SEQ IDNO:20至SEQ ID NO:38中的任一者至少98％同一的核酸的miRNA结合。
47.如权利要求24-42中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂与包含作为SEQ IDNO:20至SEQ ID NO:38中的任一者的核酸的miRNA结合。
48.如权利要求24-47中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂的长度为至少5个核苷酸。
49.如权利要求24-47中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂的长度为至少18个核苷酸。
50.如权利要求24-49中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂的长度不大于35个核苷酸。
51.如权利要求24-49中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂的长度不大于22个核苷酸。
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