CN117959316A - 一种包含恩格列净的药物组合物及其制备方法与制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)和/或甘草酸盐在制备眼用药物中的新用途；以及一种药物组合物和制备方法。本发明的多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)及其组合物，用于制备治疗和/或缓解眼部化学伤的药物，能够加快角膜损伤愈合、抑制蛋白/促炎性细胞因子的表达等，具有良好的疗效。试验结果还进一步表明，多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)和甘草酸盐组合，安全性高，稳定性好，且易于溶解、释放和/或吸收，提高了活性药物的生物利用度，二者具有协同增效作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种包含恩格列净的药物组合物及其制备方法与制药用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种包含恩格列净的药物组合物及其制备方法与制药用途。

背景技术

角膜是眼睛抵抗外界微生物细菌的重要屏障。由于角膜直接暴露于外界，容易受到机械、感染、化学制品、烧伤等多种因素的损害。角膜的健康影响着眼球的健康状态，及时、有效修复受损角膜，可以阻止病情的深入。

眼部化学伤作为一种常见的非机械性损伤的眼科急症，多发生在化工厂、施工地和实验室等。根据化学物质的不同，可以分为碱烧伤、酸烧伤等，其中，碱烧伤往往又比酸烧伤更严重。

眼睛遭受化学损伤后，眼组织受损并引发炎症，炎症反应不能及时抑制就会进一步导致眼组织坏死，进而产生恶性循环。高迁移率族蛋白B1(High Mobility GroupProtein，HMGB1)是机体坏死细胞发出的一种内源性危险信号，也是一种促新生血管和促炎性分子。已有研究表明，HMGB1与碱烧伤及其并发症密切相关，HMGBl可以通过其下游受体之一的Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)促进角膜新生血管的产生。

现阶段，这类眼部疾病的治疗手段十分有限，除了药物治疗之外，严重的患者往往需要进行角膜移植，具有失明的风险。

恩格列净(Empagliflozin)由德国勃林格殷格翰公司和美国礼来公司合作研发，是一种新型的口服降糖药，它以不依赖胰岛素分泌和胰岛素作用的机制有效地降低血糖，改善胰岛素敏感性(IS)及胰岛β细胞的功能(参见：中国专利申请CN 111214450A、CN112618495A、CN 110655511A等)。

甘草酸二钾(DG)为白色或类白色粉末，具有抗炎、抗过敏、保湿等功效，在医药行业主要用于镇咳祛痰、胃溃疡、急慢性胃炎、湿疹、皮肤瘙痒，以及用于治疗癌症和防治艾滋病等。

截止到目前为止，未检索到有将恩格列净或其与甘草酸二钾组合用于预防、治疗和/或缓解眼部化学伤(例如，碱烧伤)的相关文献报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术存在的问题和/或不足，本发明的目的之一在于提供多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)和/或甘草酸盐在制备眼用药物中的新用途。本发明的多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)及其组合物，用于制备治疗和/或缓解眼部化学伤的药物，能够加快角膜损伤愈合、抑制蛋白/促炎性细胞因子的表达等，具有良好的疗效。

本发明提供了一种新用途：

多羟基化合物和/或甘草酸盐在制备眼用药物中的用途(具体包括以下三种情况：1、多羟基化合物在制备眼用药物中的用途；2、甘草酸盐在制备眼用药物中的用途；3、多羟基化合物和甘草酸盐的组合在制备眼用药物中的用途)，其中，所述多羟基化合物为恩格列净或其药学上可接受的盐。

在上述任一技术方案(所述的用途)中，所述眼用药物为治疗和/或缓解眼部化学伤的眼用药物；

优选地，所述眼部化学伤为眼部碱烧伤；

更优选地，所述眼部化学伤为角膜碱烧伤。

在上述任一技术方案(所述的用途)中，所述眼用药物为蛋白抑制剂，例如，所述蛋白抑制剂为HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的用途)中，所述眼用药物为促炎性细胞因子抑制剂，例如，IL-6抑制剂、NF-κB抑制剂或TNF-α抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的用途)中，所述眼用药物为受体抑制剂，例如，TLR2抑制剂、TLR4抑制剂或TLR9抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的用途)中，所述眼用药物为细胞生长因子抑制剂，例如，VEGF抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的用途)中，所述甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；

优选地，所述甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含多羟基化合物和药学上可接受的辅料；其中，所述多羟基化合物为恩格列净或其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的辅料包含甘草酸盐；

优选地，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:2～50(例如，质量比为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50等)；

更优选地，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:5～25；

进一步优选地，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:12～18；例如，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:15。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述多羟基化合物为恩格列净；和/或，所述甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；

优选地，所述甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药学上可接受的辅料包覆所述多羟基化合物；优选地，所述药学上可接受的辅料包覆所述多羟基化合物形成纳米颗粒；更优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为1～300nm，优选为1～60nm，更优选为1～15nm。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物可以是微球、纳米粒、脂质体等载体包裹后的药物；优选为纳米粒包裹后的药物。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物可以是载体纳米颗粒、载体脂质体等；优选为载体纳米颗粒。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述多羟基化合物以非晶态形式存在。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述多羟基化合物的包封率至少为80％(例如，包封率至少为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)；优选地，所述多羟基化合物的包封率≥90％或≥95％。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为液体制剂、半固体制剂或固体制剂；和/或，所述药物组合物中的多羟基化合物为治疗有效量的。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为液体制剂，所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、羧甲基纤维素钠水溶液或PBS缓冲液。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述液体制剂为纳米胶束制剂；和/或，所述液体制剂中的所述多羟基化合物含量为1～10mg/ml，例如为3～6mg/ml；和/或，所述液体制剂的pH值为6.8～7.4；和/或，所述液体制剂的渗透压为280～320mOsm/kg。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，当所述液体制剂中的多羟基化合物含量为1mg/ml时，所述液体制剂满足下述条件①～③中的一项或两项以上：

①、所述液体制剂的平均胶束粒径为1～300nm(例如，1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、100nm、150nm、200nm等)，优选为1～60nm，更优选为1～15nm；

②、所述液体制剂的多分散系数为≤0.6，优选为≤0.5；

③、所述液体制剂的Zeta电位为-20～0mV(例如，-20mV、-19mV、-18mV、-17mV、-16mV、-15mV、-14mV、-13mV、-12mV、-11mV、-10mV、-9mV、-8mV、-7mV、-6mV、-5mV、-2mV、-1mV等)，优选为-10～0mV；

优选地，当所述液体制剂中的多羟基化合物含量为1mg/ml时，所述的液体制剂同时满足所述条件①～③。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物由包括以下步骤的方法制成：将所述多羟基化合物和所述药学上可接受的辅料溶解或分散于有机溶剂中，然后除去所述有机溶剂，即得；

优选地，所述有机溶剂为醇类溶剂；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.1～20mL(例如，0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml等)；

更优选地，所述有机溶剂为乙醇；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.4～10mL。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为眼用药物组合物。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为治疗和/或缓解眼部化学伤的药物组合物；优选地，所述眼部化学伤为眼部碱烧伤；更优选地，所述眼部化学伤为角膜碱烧伤。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为蛋白抑制剂，例如，所述蛋白抑制剂为HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为促炎性细胞因子抑制剂，例如，IL-6抑制剂、NF-κB抑制剂或TNF-α抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为受体抑制剂，例如，TLR2抑制剂、TLR4抑制剂或TLR9抑制剂。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述药物组合物为细胞生长因子抑制剂，例如，VEGF抑制剂。

本发明还提供了前面任一项所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述多羟基化合物和所述药学上可接受的辅料溶解或分散于有机溶剂中，然后除去所述有机溶剂，即得；

优选地，所述有机溶剂为醇类溶剂；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.1～20mL(例如，0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml等)；

更优选地，所述有机溶剂为乙醇；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.4～10mL。

关于使用术语的定义，除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于全文中的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容和/或上下文以及本领域的常识，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

术语“药学上可接受的”，是指通常在化学或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“辅料”，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

术语“治疗有效量”，是指给予患者的、足以有效治疗疾病的药物化合物的量。治疗有效量将根据药物化合物、疾病种类、疾病的严重度、患者的年龄等变化，可由本领域技术人员视情况进行常规调整。

术语“眼用药物”，是指供洗眼、滴眼用以治疗或诊断眼部疾病的药物。眼用药物可分为眼用液体制剂(包括但不限于滴眼剂、洗眼剂、眼内注射溶液等)、眼用半固体制剂(包括但不限于眼膏剂、眼用乳膏剂、眼用凝胶剂等)、眼用固体制剂(包括但不限于眼膜剂、眼丸剂、眼内插入剂等)等。根据不同的需求和/或给药形式，眼用药物中可包含本领域中常规采用的pH调节剂(例如，缓冲液)、渗透压调节剂、防腐剂、抗菌剂、粘度调节剂、增溶剂、分散剂、助溶剂、抗氧剂等。

本发明的有益效果，主要包括以下方面：

(1)本发明提供了多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)和/或甘草酸盐的一种新用途：眼用药物；

(2)体外和/或体内的试验结果显示，本发明的多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)及其组合物，对于治疗和/或缓解眼部化学伤(特别是角膜碱烧伤)具有出色的疗效，能够加快角膜损伤愈合，抑制蛋白/促炎性细胞因子的表达等；

(2)体外和/或体内的试验结果还进一步表明，多羟基化合物(恩格列净或其药学上可接受的盐)和甘草酸盐组合，安全性高，稳定性好，且易于溶解、释放和/或吸收，提高了活性药物的生物利用度，二者具有协同增效作用，取得了比任意单一组分更优越的治疗效果。

附图说明

图1为实施例1中EMP、DG、EMP&DG、EMP-DG的FT-IR对比图谱。

图2为实施例1中EMP、DG、EMP&DG、EMP-DG的XRD对比图谱。

图3为实施例2中EMP-DG在不同的EMP和DG质量比下的包封率图表。

图4为实施例2中EMP-DG在不同的EMP和DG质量比下的胶束尺寸图表。

图5为实施例2中EMP-DG在不同的EMP和DG质量比下的多分散指数图表。

图6为实施例2中EMP-DG在不同的EMP和DG质量比下的Zeta电位图表。

图7为实施例2中EMP-DG的外观对比图。

图8为实施例2中EMP、EMP&DG、EMP-DG在不同溶液中的溶解度图表。

图9为实施例2中EMP-DG储存12周的EMP保留率图表。

图10为实施例2中EMP-DG储存12周的胶束尺寸变化图表。

图11为实施例2中EMP-DG储存12周的多分散指数变化图表。

图12为实施例2中EMP-DG储存12周的Zeta电位变化图表。

图13-图17分别为实施例3中EMP-DG在不同浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml)下FRAP测定值随时间的变化图表。

图18-图22分别为实施例3中EMP-DG在不同培养时间(5min、15min、30min、60min、120min)下FRAP测定值随时间的变化图表。

图23为实施例4中EMP-DG和EMP的体外释放曲线对比图表。

图24为实施例5中的兔角膜和结膜的刺激性观察图像。

图25为实施例5中的兔角膜和结膜的病理学观察图像。

图26为实施例6中不同给药组的角膜荧光强度图像。

图27为实施例6中不同给药组的角膜和视网膜的病理学观察图像。

图28为实施例7中不同给药组的角膜荧光素钠染色对比图像。

图29为实施例7中不同给药组的角膜上皮面积缺损率对比图表。

图30为实施例7中不同给药组的角膜敏感度对比图表。

图31为实施例7中不同给药组的角膜混浊评分对比图表。

图32为实施例7中不同给药组的眼部新生血管观察对比图像。

图33为实施例7中不同给药组的眼部新生血管评分对比图表。

图34为实施例7中不同给药组的组织病理学检查结果对比图像。

图35-图43分别为实施例7中不同给药组的角膜中的HMGB1、IL-6、NF-κB、RAGE、TLR2、TLR4、TLR9、TNF-α、VEGF测定结果图表(PCR分析)，其中，纵坐标表示相对于正常健康小鼠的比值。

图44-图48分别为实施例7中不同给药组的角膜中的HMGB1、IL-6、NF-κB、TNF-α、VEGF测定结果图表(ELISA分析)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

本发明的实施例中，未注明具体条件的试验，按照本领域常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

恩格列净(Empagliflozin，缩写为“EMP”)：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甘草酸二钾(Dipotassium Glycyrrhizinate，缩写为“DG”)：纯度≥98％，购自陕西富捷药业有限公司。

磷酸盐缓冲液(PBS)：购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

雄性新西兰兔：购自青岛康大生物有限公司。

C57BL/6J雄性小鼠：8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

本发明的实施例中，采用SPSS Statistics 24软件进行数据分析，P<0.05表示具有显著性。

本发明的实施例中，所使用的百分数如无特别说明均为质量百分数。

实施例1EMP-DG的制备

分别将50mg恩格列净(EMP)与不同质量的甘草酸二钾(DG)(EMP与DG的质量比分别为1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)置于茄型瓶中，加入乙醇(25ml)使其完全溶解，然后使用旋转蒸发仪在40℃下减压蒸发除去乙醇，在瓶壁上形成一层薄膜(EMP-DG)。之后用磷酸盐缓冲液(PBS)进行溶解，氢氧化钠和/或盐酸调节pH值至6.8～7.4并定容(10ml)，渗透压调节至280～320mOsm/kg(采用氯化钠调节渗透压)，0.22μm滤膜过滤，得到恩格列净-甘草酸二钾眼用制剂(EMP-DG眼用制剂)，其中的EMP浓度为5mg/ml(参考文献：Q.Li,X.Wu,M.Xin,Strengthened rebamipide ocular nanoformulation to effectively treat cornealalkali burns in mice through the HMGB1 signaling pathway,Exp Eye Res 213(2021)108824)。

其中，EMP与DG质量比＝1:15所得的EMP-DG，其FT-IR(美国Nicolet iS10)和XRD(D/max-2400，日本Rigaku)图谱分别如图1和图2所示，恩格列净(EMP)、甘草酸二钾(DG)、恩格列净和甘草酸二钾的物理混合物(缩写为“EMP&DG”，EMP和DG的质量比为1:15，直接将两者混合得到)作为对比。结果显示，EMP-DG中的EMP表现为非晶态形式。

实施例2 EMP-DG的性能测试

2.1包封率

将实施例1所得的EMP-DG用水溶解，过0.22μm滤膜，过滤分离未包封的EMP，分别用乙腈稀释EMP-DG过滤前和过滤后的溶液，破坏胶束。通过下述HPLC法测定溶液中的EMP浓度并计算包封率，包封率为过滤后检测到的EMP浓度与过滤前检测到的EMP浓度的比值(％)。

高效液相色谱法(HPLC)：

安捷伦1100色谱系统，安捷伦ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温25℃；流动相为乙腈-水(体积比＝45:55)，流速1.0mL/min，紫外检测器(检测波长：225nm)。

不同配比(实施例1所制得，质量比EMP:DG＝1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)所得EMP-DG的包封率如图3所示。结果显示，EMP与DG质量比＝1:15所测定的包封率为97.91±0.50％。

2.2胶束尺寸、多分散指数和Zeta电位

将实施例1所得的EMP-DG眼用制剂用PBS稀释至EMP浓度为1.0mg/ml，使用MalvernZetasizer Nano ZS90(动态光散射法，DLS)在25℃下测定其胶束尺寸、多分散指数(Polydispersity Index，缩写为PDI)和Zeta电位。

不同配比(实施例1所得，质量比EMP:DG＝1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)所得EMP-DG测定的胶束尺寸、多分散指数(PDI)和Zeta电位，分别如图4～图6所示。

结果显示，EMP与DG质量比＝1:15所得的EMP-DG，在溶液中表现为纳米尺寸的胶束，粒径分布均匀，所测定的胶束尺寸为6.659±0.196nm、多分散指数(PDI)＝0.226±0.059以及Zeta电位为-[4.103±0.157]mV。

2.3溶解性

EMP-DG的溶解性：易溶于水(EMP浓度为1-5mg/ml时均易溶于水)，呈淡黄色透明溶液，如图7所示(EMP-DG(EMP与DG质量比＝1:15)居中，左侧为EMP，右侧为DG)。

分别将过量的EMP、EMP&DG(EMP和DG的质量比为1:15)、实施例1所得EMP-DG(EMP与DG质量比＝1:15)加入到不同的溶剂中：水、PBS或模拟泪液，置于摇床上摇晃4小时，过滤，并利用前述HPLC法测定EMP浓度并计算溶解度。

溶解度的测定结果如图8所示。结果显示，EMP在水、PBS和模拟泪液中的溶解度分别为36.3±3.8、53.3±6.2和51.4±6.5μg/ml，EMP&DG在水、PBS和模拟泪液中的溶解度分别为118.8±6.9、158.9±7.8和94.2±28.3μg/ml，EMP-DG在水、PBS和模拟泪液中的溶解度分别为18.484±0.678、22.403±0.713和18.862±0.770mg/ml。

2.4稳定性

将实施例1所得EMP-DG眼用制剂(EMP与DG质量比＝1:15)置于25℃下避光储存12周，按照前述方法检测包封率、胶束尺寸、多分散指数(PDI)和Zeta电位，并按照下式计算EMP保留率：EMP的保留率＝每周的包封率检测数据/初始的包封率数据，初始的包封率为97.91±0.50％。

检测结果分别如图9～图12所示。结果表明，本发明的EMP-DG眼用制剂在25℃下储存12周，包封率、胶束尺寸、多分散指数(PDI)和Zeta电位的变化波动都不大，表现出良好的储存稳定性。

实施例3体外抗氧化活性试验

通过铁离子还原/抗氧化能力法(FRAP法)检测EMP、DG、EMP-DG(实施例1所制得，EMP与DG质量比＝1:15)的抗氧化活性。不同EMP浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml)下随着培养时间的FRAP测定值变化图分别如图13～图17所示，不同培养时间(5min、15min、30min、60min、120min)下随着浓度的FRAP测定值变化图分别如图18～图22所示。

结果显示，在不同的浓度和不同的培养时间下，EMP-DG均表现出了比EMP、DG更强的抗氧化活性。

实施例4体外释放试验

测试溶液：(1)EMP-DG(实施例1所得，EMP与DG质量比＝1:15)水溶液，EMP的浓度为1mg/mL；(2)EMP悬浮液：EMP分散在水中，EMP的浓度为1mg/mL。

将1ml测试溶液置于透析膜袋中(截留分子量[MWCO]＝3500Da)，再浸入100ml PBS(pH＝7.4，含0.5％吐温80)中，在37℃下以100rpm摇床培养，在设定的时间点分别取1ml透析液(同时补充1ml PBS)，采用前述HPLC法检测EMP的浓度，进而计算出EMP的累计释放量，体外释放曲线如图23所示。

结果显示，EMP-DG相比EMP表现出了更快的体外释放速率。

实施例5眼刺激性实验

对雄性新西兰兔随机进行如下分组，每隔半小时进行一次点眼，持续6h，最后一次点眼后24h用裂隙灯对兔眼角膜、结膜等眼组织进行观察和记录。然后将眼角膜、结膜进行组织切片，并在显微镜下观察。

1)PBS组；

2)EMP组：PBS为溶剂，每毫升中含5mg的EMP；

3)DG组：PBS为溶剂，每毫升中含75mg的DG；

4)EMP-DG组：实施例1所得眼用制剂(EMP与DG质量比＝1:15)，其中EMP浓度为5mg/ml，DG浓度为75mg/ml。

观察结果如图24和图25所示。结果显示，点眼使用EMP、DG以及EMP-DG后，所有兔子均能够正常睁眼，未观察到角膜水肿或炎性细胞浸润，也未观察到结膜发红或充血等症状，这表明EMP、DG和EMP-DG均不会引起眼部刺激，安全性良好。

实施例6小鼠角膜吸收实验

用香豆素6(Cou-6)分别对EMP-DG(实施例1所得，EMP与DG质量比＝1:15)、EMP进行标记(香豆素6的浓度为5μg/ml)。将C57BL/6J雄性小鼠随机分为三组，一组眼表滴香豆素6标记的EMP-DG眼用制剂(EMP的浓度为5mg/ml)，一组滴香豆素6标记的EMP悬液(PBS作为溶剂，EMP的浓度为5mg/ml)，每10分钟一次，共三次，另设不给药的空白对照小鼠。最后1次点眼结束后30、60和90分钟处死小鼠，摘取眼角膜，将小鼠角膜剪瓣平铺玻片上，使用荧光显微镜观察，曝光时间设定为348毫秒。将眼角膜、视网膜进行组织切片，并在显微镜下观察。结果如图26和图27所示。

结果显示，EMP悬液组只能看到微弱的绿色荧光，EMP-DG滴眼液组的绿色荧光强度明显强于EMP悬液组，这表明EMP-DG中的EMP与EMP相比具有更好的角膜渗透能力，更有利于角膜对其吸收和利用。

实施例7

参考文献：1、Q.Li,X.Wu,M.Xin,Strengthened rebamipide ocularnanoformulation to effectively treat corneal alkali burns in mice through theHMGB1 signaling pathway,Exp Eye Res 213(2021)108824；2、Song K,Xin M,Zhang F,etal.Novel ultrasmall nanomicelles based on rebaudioside A:A potentialnanoplatform for the ocular delivery of pterostilbene.[J].Internationaljournal of pharmaceutics,2020,577:119035。

1.建立小鼠角膜碱烧伤模型及分组给药

全身和眼部局部麻醉后，剪掉C57BL/6J小鼠的眼睫毛等，将一块NaOH(浓度为1M)浸湿的滤纸片放在小鼠角膜中央，持续时间60秒，诱导小鼠眼角膜的急性碱烧伤，取下滤纸，用生理盐水冲洗眼睛，以洗去眼部残留的NaOH溶液。每只小鼠右眼进行碱烧伤，左眼作为对照。

诱导角膜损伤后，将小鼠随机分为六组，每组26～28只小鼠，分别将下述各溶液(每次5μl)滴到小鼠角膜上。每天重复给药3次，持续7天。

①PBS组(阴性对照组)；

②HA组(阳性治疗组)：0.1％透明质酸钠溶液；

③EMP组：0.5％羧甲基纤维素钠溶液为分散溶剂，EMP的浓度为5mg/ml；

④DG组：PBS为溶剂，DG的浓度为75mg/ml；

⑤EMP&DG组：0.5％羧甲基纤维素钠溶液为分散溶剂，每毫升中含5mg的EMP和75mg的DG；

⑥EMP-DG组：实施例1所得眼用制剂(EMP与DG质量比＝1:15)，其中，EMP的浓度为5mg/mL。

2.小鼠角膜荧光素钠染色

在1、3、5、7天随机选取每个分组的小鼠，在小鼠眼部给予浓度为0.25％的荧光素钠溶液覆盖眼球，在眼表停留10s后，冲去多余荧光素钠溶液，暴露眼球，在裂隙灯前观察，拍照记录小鼠角膜上皮荧光素钠着色情况。用图像分析软件Image J测量角膜上皮着色面积，计算角膜上皮修复面积。

荧光素钠染色观察结果如图28所示。结果显示，小鼠经碱烧伤后，氢氧化钠侵蚀掉整个角膜上皮，钴蓝光下经荧光素钠染色后所有组的小鼠角膜上皮全部为荧光绿色(0天)，经给药后，EMP-DG眼用制剂对于治疗小鼠角膜碱烧伤最为有效，具有促进上皮损伤愈合的治疗效果，且优于EMP&DG组、EMP组、DG组等。

根据荧光素钠染色统计的角膜上皮面积缺损率结果如图29所示(“*”：表示与PBS组相比，P＜0.05；“#”：表示与HA组相比，P＜0.05；“&”：表示与EMP组相比，P＜0.05；“$”：表示与DG组相比，P＜0.05；“@”：表示与EMP&DG组相比，P＜0.05)。

结果显示，在给药的第5天，EMP-DG组的角膜损伤已经基本上完全修复，而其他五组均还存在不同程度的角膜缺损，尤其是，PBS组(阴性对照)的角膜愈合缓慢，仍有面积约40％左右的角膜缺损。这表明EMP-DG能够加快角膜损伤的愈合。

3.角膜敏感度测试

使用Cochet-Bonnet角膜知觉仪检测，重复三次，取三次平均值进行记录，结果如图30所示(“*”：表示与PBS组相比，P＜0.05；“#”：表示与HA组相比，P＜0.05；“&”：表示与EMP组相比，P＜0.05；“$”：表示与DG组相比，P＜0.05；“@”：表示与EMP&DG组相比，P＜0.05)。

结果显示，碱烧伤严重损害了角膜的敏感性，PBS组的角膜敏感度恢复缓慢。与PBS组相比，EMP-DG组的角膜敏感度明显得到了改善，且改善效果优于HA组、EMP组、DG组、EMP&DG组等其他组。

4.角膜混浊评价

利用裂隙灯显微镜观察，对角膜混浊情况进行评估，得分结果如图31所示(“*”：表示与PBS组相比，P＜0.05；“#”：表示与HA组相比，P＜0.05；“&”：表示与EMP组相比，P＜0.05；“$”：表示与DG组相比，P＜0.05；“@”：表示与EMP&DG组相比，P＜0.05)。

5.角膜新生血管观察

利用裂隙灯显微镜观察，角膜新生血管呈现出有代表性的照片，并进行评分，结果如图32和图33所示(“*”：表示与PBS组相比，P＜0.05；“#”：表示与HA组相比，P＜0.05；“&”：表示与EMP组相比，P＜0.05；“$”：表示与DG组相比，P＜0.05；“@”：表示与EMP&DG组相比，P＜0.05)。

结果显示，与PBS组相比，EMP-DG眼用制剂组对角膜碱烧伤所引起的新生血管具有明显的抑制作用，特别是，在第7天EMP-DG组的抑制效果明显优于HA组、EMP组、DG组、EMP&DG组等其他组。

6.组织病理学检查

第7天每组随机选取小鼠脱颈处死，摘取眼球，进行组织病理学检查，结果如图34所示。

结果显示，PBS组的角膜显示出严重的炎症反应，整个角膜观察到大量浸润性炎性细胞，角膜上皮缺失，组织损伤严重，无法区分，同时也观察到新生血管等。EMP-DG眼用制剂组与正常健康小鼠(正常健康组)相接近，这表明EMP-DG对角膜损伤具有良好的疗效。

7.定量实时PCR分析

第7天每组随机处死6只小鼠，分离角膜，将两个角膜合并为一个样本，提取总RNA，进行PCR分析(参考文献：Wang H,He Y,Hou Y,et al.Novel self-nanomicellizingformulation based on Rebaudioside A:A potential nanoplatform for oraldelivery of naringenin[J].Materials Science and Engineering C,2020,112(Suppl.1):110926.)，测试细胞因子的相对表达水平，包括HMGB1、IL-6、NF-κB、RAGE、TLR2、TLR4、TLR9、TNF-α和VEGF。

HMGB1(High Mobility Group Protein)：有研究表明，HMGB1是重要炎症介质，在脓毒症、肿瘤、关节炎等多种疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用；

IL-6：一种重要的炎症细胞因子，主要表达于炎症反应等；

NF-κB：一种重要的转录激活因子，涉及到炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程；

RAGE(Receptor for Advanced Glycation Endproducts)：糖基化终产物受体，是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族；

TNF-α：一种促炎细胞因子，其功能失调被认为与许多疾病相关，有报道称，TNF-α抑制剂是自身免疫疾病(类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及银屑病性关节炎等)的首选治疗药物；

VEGF(vascular endothelial growth factor)：血管内皮生长因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

结果分别如图35～图43所示(“*”：表示与PBS组相比，P＜0.05)。

PCR分析结果显示，EMP-DG眼用制剂能够有效地抑制HMGB1、IL-6、NF-κB、RAGE、TLR2、TLR4、TLR9、TNF-α和VEGF等蛋白或因子的过度表达，可以作为它们潜在的抑制剂，从而为临床用药提供更多的选择。

8.酶联免疫吸附试验

将6个小鼠角膜合并为1个样品，每组用3个样品进行检测，采用市售的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)，检测HMGB1、IL-6、NF-κB、TNF-α和VEGF的结果，结果分别如图44～图48所示(“*”：表示与PBS组相比，P＜0.05)。

与PCR分析结果类似，ELISA检测结果也显示，EMP-DG眼用制剂能够有效地抑制HMGB1、IL-6、NF-κB、TNF-α和VEGF等蛋白或因子的过度表达，可以作为它们潜在的抑制剂，从而为临床用药提供更多的选择。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明并不局限于上述实施方式。

Claims (11)

1.多羟基化合物和/或甘草酸盐在制备眼用药物中的用途，其特征在于，所述多羟基化合物为恩格列净或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述眼用药物为治疗和/或缓解眼部化学伤的眼用药物；

优选地，所述眼部化学伤为眼部碱烧伤；

更优选地，所述眼部化学伤为角膜碱烧伤。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；

优选地，所述甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

4.一种药物组合物，其包含多羟基化合物和药学上可接受的辅料；其特征在于，所述多羟基化合物为恩格列净或其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的辅料包含甘草酸盐；

优选地，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:2～50；

更优选地，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:5～25；

进一步优选地，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:12～18；例如，所述多羟基化合物和所述甘草酸盐的质量比为1:15。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述多羟基化合物为恩格列净，和/或，所述甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；

优选地，所述甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，所述药学上可接受的辅料包覆所述多羟基化合物；优选地，所述药学上可接受的辅料包覆所述多羟基化合物形成纳米颗粒；更优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为1～300nm，优选为1～60nm，更优选为1～15nm；

和/或，所述多羟基化合物以非晶态形式存在；

和/或，所述多羟基化合物的包封率至少为80％；优选地，所述多羟基化合物的包封率≥90％或≥95％。

7.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液体制剂、半固体制剂或固体制剂；和/或，所述药物组合物中的多羟基化合物为治疗有效量的；

优选地，所述药物组合物为液体制剂，所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、羧甲基纤维素钠水溶液或PBS缓冲液；

更优选地，所述液体制剂为纳米胶束制剂；和/或，所述液体制剂中的所述多羟基化合物含量为1～10mg/ml，例如为3～6mg/ml；和/或，所述液体制剂的pH值为6.8～7.4；和/或，所述液体制剂的渗透压为280～320mOsm/kg。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，当所述液体制剂中的所述多羟基化合物含量为1mg/ml时，所述液体制剂满足下述条件①～③中的一项或两项以上：

①、所述液体制剂的平均胶束粒径为1～300nm，优选为1～60nm，更优选为1～15nm；

②、所述液体制剂的多分散系数为≤0.6，优选为≤0.5；

③、所述液体制剂的Zeta电位为-20～0mV，优选为-10～0mV；

优选地，当所述液体制剂中的所述多羟基化合物含量为1mg/ml时，所述液体制剂同时满足所述条件①～③。

9.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由包括以下步骤的方法制成：将所述多羟基化合物和所述药学上可接受的辅料溶解或分散于有机溶剂中，然后除去所述有机溶剂，即得；

优选地，所述有机溶剂为醇类溶剂；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.1～20mL；

更优选地，所述有机溶剂为乙醇；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.4～10mL。

10.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，

所述药物组合物为眼用药物组合物；

和/或，所述药物组合物为治疗和/或缓解眼部化学伤的药物组合物；优选地，所述眼部化学伤为眼部碱烧伤；更优选地，所述眼部化学伤为角膜碱烧伤；

和/或，所述药物组合物为蛋白抑制剂，例如，所述蛋白抑制剂为HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂；

和/或，所述药物组合物为促炎性细胞因子抑制剂，例如，IL-6抑制剂、NF-κB抑制剂或TNF-α抑制剂；

和/或，所述药物组合物为受体抑制剂，例如，TLR2抑制剂、TLR4抑制剂或TLR9抑制剂；

和/或，所述药物组合物为细胞生长因子抑制剂，例如，VEGF抑制剂。

11.权利要求4～10任一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述多羟基化合物和所述药学上可接受的辅料溶解或分散于有机溶剂中，然后除去所述有机溶剂，即得；

优选地，所述有机溶剂为醇类溶剂；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.1～20mL；

更优选地，所述有机溶剂为乙醇；和/或，每毫克所述多羟基化合物对应的所述有机溶剂用量为0.4～10mL。