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CN117946165A - 一种新型结构化合物axl抑制剂及其应用 - Google Patents

一种新型结构化合物axl抑制剂及其应用 Download PDF

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CN117946165A
CN117946165A CN202410099479.2A CN202410099479A CN117946165A CN 117946165 A CN117946165 A CN 117946165A CN 202410099479 A CN202410099479 A CN 202410099479A CN 117946165 A CN117946165 A CN 117946165A
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CN
China
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compound
mmol
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ring
reduced pressure
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Application number
CN202410099479.2A
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何勇
秦绪荣
豆远尧
韩睿
刘弋辉
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Southwest University
Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Original Assignee
Southwest University
Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了新型结构化合物AXL抑制剂及其应用。本发明通过构建多种模拟过表达AXL的细胞模型，经过多轮筛选，从新合成的多种化合物中筛选到能有效抑制AXL蛋白的小分子化合物，经实验验证，其可显著抑制肿瘤(尤其是EGFR突变晚期非小细胞肺癌)中的AXL表达，是可用于临床的新型AXL抑制剂，对克服AXL高表达诱导的奥西替尼耐药具有重要的临床价值。

Description

一种新型结构化合物AXL抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种新型结构化合物AXL抑制剂及其应用。
背景技术
奥希替尼(Osimertinib，Osi)作为第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)被广泛用于EGFR突变晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一、二线治疗，疗效显著。然而，接受奥希替尼治疗的患者最终会产生耐药性，严重限制了其临床应用。奥希替尼耐药机制复杂，目前已明确的耐药机制如C797S位点突变或EGFR旁路c-MET扩增等只能解释一部分获得性耐药，仍有很大一部分患者耐药机制不明。
受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性的细胞内结构域。受体酪氨酸激酶(RTK)是许多多肽生长因子，细胞因子和激素的高亲和性细胞表面受体。在人类基因组中鉴定的90种独特的酪氨酸激酶基因中，有58种编码受体酪氨酸激酶蛋白，AXL蛋白是其中之一。
近年多项研究均证实AXL信号通路的激活介导了奥希替尼的耐药性。因此，克服AXL蛋白升高引起的奥希替尼获得性耐药，具有重要的临床意义。近年来，已有多种AXL抑制剂正在开展临床试验用于治疗NSCLC，如：Bemcentinib(R428)、CB469、ONO-7475和DS-1205c等，这为克服奥希替尼耐药提供了希望。Bemcentinib是一种选择性口服生物可利用的小分子AXL抑制剂，bemcentinib+docetaxel联合已被用于晚期NSCLC治疗的I期临床试验。另有DS-1205c抑制剂靶向AXL的临床试验已经在EGFR突变的奥希替尼获得性耐药的NSCLC患者中进行。然而，这些AXL抑制剂的效果不尽人意。尽管大多数AXL抑制剂都处于临床前阶段，离临床应用还很遥远。截至目前，在临床环境中还没有特别有效的治疗方法来抑制AXL。因此，进一步探索可用于临床的新型AXL抑制剂是有必要的，对克服AXL高表达诱导的奥西替尼耐药具有重要的临床价值。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种新型结构化合物AXL抑制剂。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种化合物，其为具有如通式(I)结构所示的化合物：
其中，通式(I)中Z1选自O、S、N、CH2，Z2选自O、S、N、CH2；
R1选自以下结构：
R2选自以下结构：
R3选自：卤素类：氟、氯、溴、碘，甲氧基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基，或者H、5-甲基、5-氯、5-溴、5-甲氧基、5-硫甲基、5-异丙基、5-叔丁基、5-甲氧酰基、5-氟、5-三氟甲基、5-氯、5-苯基。
优选地，R2选自(2-氨基苯基)二甲基氧化膦、卤素、三氟甲基或三氟甲氧基、硫甲基、异丙基、叔丁基、甲氧酰基、苯基、吡唑环、噁二唑环、咪唑环、异噁唑环、噁唑环、噻唑环、噻二唑环、噻吩环、吡啶环、嘧啶环、呋喃环、三唑环、吡咯环或四唑环；
其中R1和R2组合为4，5-二甲氧基、4，5-二硫甲基、4，5-二异丙基、4，5-二叔丁基、4，5-二甲氧酰基、4，5-二氟、4，5-二三氟甲基、4，5-二氯、4，5-二苯基、4-氟-5-甲氧基、4，5-二氯噻吩；
R3为烷基胺、链状及环状的醇。
优选地，所述化合物为BG-325、BG-381或者BG-272，结构式如下：
本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和作为活性成分的上述任一项所述的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、立体异构体或或其药学上可接受的盐。
本发明第三方面提供了上述任一项所述的化合物或上述的药物组合物在制备AXL抑制剂中的应用。
本发明第四方面提供了上述任一项所述的化合物或上述的药物组合物在制备治疗AXL高表达的肿瘤的药物中的应用。
优选地，所述AXL高表达的肿瘤包括肺癌、肝癌和黑色素瘤。
优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
优选地，所述肺癌为EGFR突变晚期非小细胞肺癌。
优选地，所述肺癌为EGFR-TKI耐药非小细胞肺癌，所述化合物为BG-267、BG-325或者BG-381。
本发明的有益效果是：为了筛选抑制肿瘤细胞AXL蛋白靶点的抑制剂，发明人前期准备了多种肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤以及肠癌等细胞系模型，并构建了多种模拟过表达AXL的细胞模型。利用上述多种细胞模型，通过多轮筛选，我们从自己创新合成的多种化合物中，筛选到两种能有效抑制AXL蛋白的小分子化合物，BG-325和BG-381，经实验验证，其可显著抑制肿瘤(尤其是EGFR突变晚期非小细胞肺癌)中的AXL表达，是可用于临床的新型AXL抑制剂，对克服AXL高表达诱导的奥西替尼耐药具有重要的临床价值。
附图说明
图1是AXL抑制剂新型结构化合物对奥希替尼耐药细胞PC-9OR的活性评价结果。
图2是AXL抑制剂新型结构化合物BG-325、BG-381对EGFR突变的NSCLC细胞的活性影响实验结果。
图3是AXL抑制剂新型结构化合物对EGFR TKI耐药细胞的AXL的抑制实验结果。
图4是筛选AXL高表达的肿瘤模型实验结果。
图5是化合物BG-272、BG-325、BG-381对肝癌和黑色素瘤细胞的活性结果。
图6是AXL抑制剂新型结构化合物对肝癌(A)和黑色素瘤细胞(B)的AXL的抑制实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂，如
无特殊说明，均为本领域常规试剂。
实施例1化合物的合成
一、(2-((5-氯-2-(4-(3-(3-氟吡咯烷-1-基)丙氧基)-2-甲氧基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-235)的合成
将化合物5-氟-2-硝基苯甲醚(446mg,2.6mmol)溶于二甲基亚砜(8mL)中，依次加入氢氧钠(1g，25mL)，水(8mL)，所得混合液在80℃下搅拌5h。体系呈黄色澄清溶液，向反应体系加水(50mL)稀释，水层用稀盐酸调至酸性，用乙酸乙酯(50mL×2)萃取两次，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得化合物A26的黄色固体(420mg,产率95％)。
向A26粗品(168mg,1mmol)的乙腈(8mL)溶液中，加入1,3-二溴丙烷(1mg,5mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)，将反应液加热到70℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩乙腈，真空加热蒸出体系中的1,3-二溴丙烷，向反应体系加水(30mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得粗品A27的黄色固体(290mg,产率100％)。
向25mL的三颈烧瓶中依次加入3-(R)-氟吡咯烷盐酸盐(126mg，1mmol),氢化钠(60mg,2.5mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后加入四氢呋喃(4mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌30分钟。将反应液自然冷却至室温，加入A27(347mg，1.2mmol)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，TLC检测反应完毕。减压浓缩四氢呋喃，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝60:1)纯化，得到化合物A28(160mg，产率47％)的黄色油状液体。
将化合物A28(80g，0.27mmol)溶于甲醇(2mL)和四氢呋喃(2mL)的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(14mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A29(72mg，产率100％)的黄色油状液体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A29(77mg,0.27mmol)、A3(71mg，0.22mmol)、乙二醇单甲醚(1mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(51μL,0.45mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯(10mL x3)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-235(122mg,产率37％)。
二、(2-((5-氯-2-((4-(3-(3,3-二氟吡咯烷-1基)丙氧基)-2-甲氧基苯基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-239)的合成
将化合物5-氟-2-硝基苯甲醚(446mg,2.6mmol)溶于二甲基亚砜(8mL)中，依次加入氢氧化钠(1g，25mL)，水(8mL)，所得混合液在80℃下搅拌5h。体系呈黄色澄清溶液，向反应体系加水(50mL)稀释，水层用稀盐酸调至酸性，用乙酸乙酯(50mL×2)萃取两次，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得化合物A26的黄色固体(420mg,产率95％)。
向A26粗品(168mg,1mmol)的乙腈(8mL)溶液中，加入1,3-二溴丙烷(1mg,5mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)，将反应液加热到70℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩乙腈,真空加热蒸出体系中的1,3-二溴丙烷，向反应体系加水(30mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得粗品A27的黄色固体(290mg,产率100％)。
向25mL的三颈烧瓶中依次加入3,3-二氟吡咯烷盐酸盐(247mg，1mmol),碳酸钾(415mg,3mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后加入四氢呋喃(3mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌30分钟。将反应液自然冷却至室温，加入A27(347mg，1.2mmol)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，TLC检测反应完毕。减压浓缩四氢呋喃，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/丙酮＝5:1)纯化，得到化合物A30(172mg，产率55％)的黄色油状液体。
将化合物A30(160mg，0.51mmol)溶于甲醇(2mL)和四氢呋喃(2mL)的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(27mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A31(146mg，产率100％)的黄色油状液体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A3(146mg,0.51mmol)、A3(133mg，0.42mmol)、乙二醇单甲醚(2mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(65μL,0.84mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中,搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯(10mL x3)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-239(239mg,产率50％)。
三、(2-((5-氯-2-((4-(3-(4,4-二氟哌啶-1基)丙氧基)-2-甲氧基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-247)的合成
将化合物5-氟-2-硝基苯甲醚(446mg,2.6mmol)溶于二甲基亚砜(8mL)中，依次加入氢氧化钠(1g，25mL)，水(8mL)，所得混合液在80℃下搅拌5h。体系呈黄色澄清溶液，向反应体系加水(50mL)稀释，水层用稀盐酸调至酸性，用乙酸乙酯(50mL×2)萃取两次，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得化合物A26的黄色固体(420mg,产率95％)。
向A26粗品(168mg,1mmol)的乙腈(8mL)溶液中，加入1,3-二溴丙烷(1mg,5mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)，将反应液加热到70℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩乙腈,真空加热蒸出体系中的1,3-二溴丙烷，向反应体系加水(30mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得粗品A27的黄色固体(290mg,产率100％)。
向25mL的三颈烧瓶中依次加入4,4-二氟哌啶(121mg，1mmol),碳酸钾(691mg,5mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后加入四氢呋喃(3mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌30分钟。将反应液自然冷却至室温，加入A27(347mg，1.2mmol)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，TLC检测反应完毕。减压浓缩四氢呋喃，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/丙酮＝5:1)纯化，得到化合物A32(285mg，产率86％)的黄色油状液体。
将化合物A32(142mg，0.4mmol)溶于甲醇(2mL)和四氢呋喃(2mL)的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(21mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A33(129mg，产率100％)的黄色油状液体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A33(129mg,0.44mmol)、A3(156mg，0.44mmol)、乙二醇单甲醚(2mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(67μL,0.87mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯(10mL x3)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-247(166mg,产率65％)。
四、(2-((5-氯-2-(4-(3-(3-氟哌啶-1-基)丙氧基)-2-甲氧基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-248)的合成
将化合物5-氟-2-硝基苯甲醚(446mg,2.6mmol)溶于二甲基亚砜(8mL)中，依次加入氢氧化钠(1g，25mL)，水(8mL)，所得混合液在80℃下搅拌5h。体系呈黄色澄清溶液，向反应体系加水(50mL)稀释，水层用稀盐酸调至酸性，用乙酸乙酯(50mL×2)萃取两次，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得化合物A26的黄色固体(420mg,产率95％)。
向A26粗品(168mg,1mmol)的乙腈(8mL)溶液中，加入1,3-二溴丙烷(1mg,5mmol)和碳酸钾(276mg,2mmol)，将反应液加热到70℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩乙腈，真空加热蒸出体系中的1,3-二溴丙烷，向反应体系加水(30mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，得粗品A27的黄色固体(290mg,产率100％)。
向25mL的三颈烧瓶中依次加入3-氟哌啶盐酸盐(140mg，1mmol),碳酸钾(691mg,5mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后加入四氢呋喃(3mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌30分钟。将反应液自然冷却至室温，加入A27(347mg，1.2mmol)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，TLC检测反应完毕。减压浓缩四氢呋喃，用二氯甲烷(20mL×3)萃取三次，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚/丙酮＝8:1)纯化，得到化合物A34(285mg，产率91％)的黄色油状液体。
将化合物A34(142mg，0.46mmol)溶于甲醇(2mL)和四氢呋喃(2mL)的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(24mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A35(130mg，产率100％)的黄色油状液体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A35(130mg,0.45mmol)、A3(142mg，0.45mmol)、乙二醇单甲醚(2mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(69μL,0.9mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯(10mL x3)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-248(164mg,产率65％)。
五、(2-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1基)苯基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-267)的合成
向N-甲基哌嗪(648μL,5.8mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(1g,5.8mmol)和碳酸钾(1.2g,8.8mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF,用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A1的黄色固体(973mg,产率66％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.89-7.87(d,J＝6.8Hz,1H),6.61-6.58(m,1H),6.53-6.52(m,1H),3.90(s,3H),3.45-3.42(t,J＝5.2Hz,4H),2.44-2.41(t,J＝5.2Hz,4H),2.22(s,3H)。
将化合物A1(500mg,2mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(43mg,20％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A2(443mg，产率100％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF,用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝11.53(s,1H),8.68-8.64(m,1H),8.21(s,1H),7.61-7.56(m,1H),7.31-7.25(m,1H),7.19-7.15(m,1H),1.85(s,3H),1.82(s,3H)。
取化合物A2(250mg,0.8mmol)、A3(210mg，0.95mmol)、乙二醇单甲醚(2.5mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(121μL,1.6mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水(0.8mmolA2，10mL)中,搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10,再次用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-267(308mg,产率78％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝11.16(s,3H),8.47(s,1H),8.073-8.07(m,2H),7.56-7.50(m,1H),7.42-7.40(d,J＝8.8Hz,1H),7.36-7.32(m,1H),7.12-7.08(m,1H),6.64-6.63(m,1H),6.48-6.45(m,1H),3.76(s,3H),3.19-3.17(m,4H),2.60-2.56(m,4H),2.30(m,3H),1.78-1.75(dd,J＝13.2Hz,6H)。
六、(2-((5-氯-2-((4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2甲氧基苯基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-272)的合成
向N-异丙基哌嗪(836μL,5.8mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(1g,5.8mmol)和碳酸钾(1.2g,8.8mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A4的黄色固体(1.5g,产率91％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.85-7.82(d,J＝9.2Hz,1H),6.55-6.52(m,1H),6.47-6.46(m,1H),3.86(s,3H),3.37-3.36(t,J＝5.0Hz,4H),2.68-2.61(m,1H),2.51-2.49(t,J＝5.2Hz,4H),0.96-0.95(d,J＝6.4Hz,6H)。
将化合物A4(1g，3.6mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(77mg,20％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A5(891mg，产率99％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF,用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝11.53(s,1H),8.68-8.64(m,1H),8.21(s,1H),7.61-7.56(m,1H),7.31-7.25(m,1H),7.19-7.15(m,1H),1.85(s,3H),1.82(s,3H).
取化合物A5(250mg,0.8mmol)、A3(210mg，0.95mmol)、乙二醇单甲醚(2.5mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(121μL,1.6mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水(0.8mmolA5，10mL)中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-272(308mg,产率74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝10.70(s,1H),8.60-8.57(m,1H),8.10-8.06(m,2H),7.49-7.45(m,1H),7.31-7.25(m,2H),7.13-7.09(m,1H),6.55-6.54(m,1H),6.50-6.46(m,1H),3.86(s,3H),3.23(s,3H),2.90-2.82(m,2H),1.84-1.81(d,J＝13.2Hz,6H),1.17-1.54(d,J＝6.4Hz,6H)。
七、(2-(5-氯-2-(4-(4-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)哌嗪-1-基)-2-甲氧基)氨基嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-296)的合成
向25mL的单口瓶中依次加入1-Boc-4-哌啶酮(200mg,1mmol)，1-异丙基哌嗪(286μL，2mmol)和甲醇(5mL)，少量多次加入氰基硼氢化钠(99mg,1.5mmol)，加毕，加入乙酸(100μL)，所得混合物在60℃下搅拌过夜，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液(5mL)猝灭反应，减压浓缩甲醇。向反应体系加水稀释，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取三次，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到化合物A6的白色固体(174mg，产率56％)。
将化合物A6(174mg,0.56mmol)溶于二氯甲烷(2.5mL)，加入三氟乙酸(0.2M)，室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩，得三氟乙酸盐形式的化合物A7粗品(182mg，产率100％，白色固体)。
向A7粗品(407mg,1.25mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(214mg,1.25mmol)和碳酸钾(433mg,3mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF,用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A8的黄色固体(128mg,产率30％)。
将化合物A8(128g，0.35mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(7.5mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A9(116mg，产率100％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A9(138mg,0.42mmol)、A3(111mg，0.35mmol)、乙二醇单甲醚(1mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(54μL,0.7mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水(0.42mmolA9，10mL)中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-296(117mg,产率55％)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ＝11.13(s,1H),8.49-8.46(m,1H),8.06(s,1H),8.02(s,1H),7.55-7.49(m,1H),7.40-7.32(m,2H),7.12-7.07(m,1H),6.62-6.61(m,1H),6.47-6.45(m,1H),4.12-4.08(m,2H),3.75(s,3H),3.74-3.68(m,2H),3.17-3.16(m,7H),2.69-2.62(m,3H),1.87-1.83(m,2H),1.78-1.74(d,J＝13.2Hz,6H),1.57-1.47(m,2H),0.99-0.97(d,J＝6.4Hz,6H)。
八、(2-((5-氯-2-(4-(3-氟-[1,4'-双哌嗪]-1'-基)-2甲氧基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-325)的合成
向25mL的三颈烧瓶中依次加入1-Boc-4-哌啶酮(200mg,1mmol)，3-氟哌啶盐酸盐(279mg，2mmol)，N,N-二异丙基乙胺(348μL,2mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后和加入甲醇(5mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌2小时。将反应液自然冷却至室温，加入乙酸(100μL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，少量多次加入氰基硼氢化钠(99mg,1.5mmol)，所得混合物在60℃下搅拌过夜，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液(5mL)猝灭反应，减压浓缩甲醇。向反应体系加水稀释，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取三次，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到化合物A10的白色固体(206mg，产率72％)。
将化合物A10(206mg,0.72mmol)溶于二氯甲烷(3mL)，加入三氟乙酸(0.2M)，室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩，得三氟乙酸盐形式的化合物A11粗品(216mg，产率100％，白色固体)。
向A11粗品(216mg,0.72mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(123mg,0.72mmol)和碳酸钾(249mg,1.8mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A12的黄色固体(197mg,产率81％)。
将化合物A12(197g，0.58mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(3.1mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A13(178mg，产率100％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF,用乙酸乙酯(30mL×3)。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A13(186mg,0.57mmol)、A3(152mg，0.48mmol)、乙二醇单甲醚(1mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(73.46μL,0.96mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中,搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯(10mL x3)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-325(169mg,产率60％)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ＝8.35-8.31(m,1H),8.02(s,1H),7.67-7.63(m,1H),7.62-7.56(m,1H),7.52-7.47(m,1H),7.26-7.22(m,1H),6.66-6.64(m,1H),6.46-6.42(m,1H),4.74-4.60(m,1H),3.83(s,3H),3.77-3.68(m,2H),3.51-3.47(m,1H),3.01-2.82(m,2H),2.71-2.52(m,5H),2.00-1.96(m,3H),1.84(s,3H),1.81(s,3H),1.77-1.59(m,4H)。
九、(2-((5-氯-2-((4-(4,4-二氟-[1,4'-双哌嗪]-1'-基)-2甲氧基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-328)的合成
向25mL的三颈烧瓶中依次加入1-Boc-4-哌啶酮(200mg,1mmol)，4,4-二氟哌啶(199mg，2mmol),N,N-二异丙基乙胺(348μL,2mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后和加入甲醇(5mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌2小时。将反应液自然冷却至室温，加入乙酸(100μL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，少量多次加入氰基硼氢化钠(99mg,1.5mmol)，所得混合物在60℃下搅拌过夜，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液(5mL)猝灭反应，减压浓缩甲醇。向反应体系加水稀释，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取三次，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到化合物A14的白色固体(189mg，产率62％)。
将化合物A14(189mg,0.62mmol)溶于二氯甲烷(3mL)，加入三氟乙酸(0.2M)，室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩，得三氟乙酸盐形式的化合物A15粗品(197mg，产率100％，白色固体)。
向A15粗品(197mg,0.62mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(106mg,0.62mmol)和碳酸钾(214mg,1.6mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A16的黄色固体(75mg,产率34％)。
将化合物A16(75g，0.2mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(1.1mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A17(75mg，产率92％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A17(75mg,0.23mmol)、A3(63mg，0.2mmol)、乙二醇单甲醚(1mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(31μL,0.4mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中,搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-328(71mg,产率58％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝10.81(s,1H),8.64-8.61(m,1H),8.11(s,1H),8.08(s,1H),7.52-7.47(m,1H),7.31-7.27(m,1H),7.14-7.10(m,1H),6.55-6.54(m,1H),6.50-6.48(m,1H),3.87(s,3H),3.67-3.64(m,2H),2.72-2.66(m,6H),2.53-2.54(m,1H),2.02-2.03(m,4H),1.93-1.90(m,2H),1.85-1.81(d,J＝13.2Hz,6H),1.76-1.73(m,2H)。
十、(R)-(2-((5-氯-2-((4-(4-(3-氟吡咯烷-1基)哌啶-1基)-2-甲氧基苯基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-380)的合成
向25mL的三颈烧瓶中依次加入1-Boc-4-哌啶酮(502mg,4mmol)，3-(R)-氟吡咯烷盐酸盐(400mg，2mmol),N,N-二异丙基乙胺(697μL,4mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后加入甲醇(10mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌2小时。将反应液自然冷却至室温，加入乙酸(200μL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，少量多次加入氰基硼氢化钠(189mg,3mmol)，所得混合物在60℃下搅拌过夜，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液(10mL)猝灭反应，减压浓缩甲醇。向反应体系加水稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取三次，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到化合物A18的白色固体(400mg，产率73％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝5.25-5.07(m,1H),4.02(s,2H),2.96-2.73(m,5H),2.54-2.48(m,1H),2.31-1.97(m,3H),1.90-1.79(m,3H),1.48-1.38(m,10H)。
将化合物A18(400mg,1.5mmol)溶于二氯甲烷(6mL)，加入三氟乙酸(0.2M)，室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩，得三氟乙酸盐形式的化合物A19粗品(421mg，产率100％，白色固体)。
向A19粗品(421mg,1.5mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(252mg,1.5mmol)和碳酸钾(509mg,3.7mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A20的黄色固体(360mg,产率76％)。
将化合物A20(360g，1.1mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(59mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A21(287mg，产率88％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g,产率70％)。
取化合物A21(287mg,1mmol)、A3(259mg，0.82mmol)、乙二醇单甲醚(2mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(126μL,1.64mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯((10mL x3))萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-380(226mg,产率48％)。
十一、(2-((5-氯-2-((4-(4-(3,3-二氟吡咯烷-1基)哌啶-1基)-2-甲氧基)氨基)嘧啶-4基)氨基)苯基)二甲基氧化膦(BG-381)的合成
向25mL的三颈烧瓶中依次加入1-Boc-4-哌啶酮(209mg,1.1mmol)，3,3-二氟吡咯烷盐酸盐(500mg，2mmol),N,N-二异丙基乙胺(366μL,2.1mmol)后，抽尽瓶中空气，换成氩气后和加入甲醇(5mL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌2小时。将反应液自然冷却至室温，加入乙酸(105μL)，所得混合物在氩气氛围60℃下搅拌过夜。将反应液自然冷却至室温，少量多次加入氰基硼氢化钠(101mg,1.6mmol)，所得混合物在60℃下搅拌过夜，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液(10mL)猝灭反应，减压浓缩甲醇。向反应体系加水稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取三次，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。合并有机相，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)纯化，得到化合物A22的白色固体(253mg，产率83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝3.99-3.97(m,2H),2.98-2.91(t,J＝13.6Hz,2H),2.84-2.75(m,4H),2.31-2.20(m,3H),1.79-1.75(m,2H),1.44(s,9H),1.41-1.34(m,2H).
将化合物A22(253mg,0.9mmol)溶于二氯甲烷(4mL)，加入三氟乙酸(0.2M)，室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩，得三氟乙酸盐形式的化合物A23粗品(265mg，产率100％，白色固体)。
向A23粗品(265mg,0.9mmol)的DMF溶液中，加入5-氟-2-硝基苯甲醚(149mg,0.9mmol)和碳酸钾(301mg,2.2mmol)，将反应液加热到80℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝97:3)，得化合物A24的黄色固体(240mg,产率81％)。
将化合物A24(240g，0.7mmol)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，向该混合体系中加入钯碳(37mg,5％)，将圆底烧瓶中的空气抽净，使圆底烧瓶中形成负压，向圆底烧瓶中通入氢气，该混合体系在室温下反应16小时。TLC检测反应完毕，用硅藻土抽滤除去钯碳，减压浓缩混合溶剂得到化合物A25(201mg，产率92％)的黄色固体。
向(2-氨基苯基)二甲基氧化膦(1g,5.9mmol)的DMF溶液中，加入2,4,5-三氯嘧啶(1g,8.9mmol)和磷酸氢二钾(3g,18mmol)，将反应液加热到60℃反应12小时，TLC检测反应完毕。将反应液自然冷却至室温，减压浓缩DMF，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得化合物A3的白色固体(1.3g，产率70％)。
取化合物A25(201mg,0.65mmol)、A3(171mg，0.54mmol)、乙二醇单甲醚(2mL)加入到25mL三颈瓶中，氩气保护，换气三次，冰浴条件下滴加三氟乙酸(83μL,1.1mmol),加料完毕后，升温至60℃，反应10小时。冷却至室温，倒入冰水中，搅拌30分钟，用乙酸乙酯((10mLx3))萃取，水层用饱和碳酸氢钠调PH＝10，再次用乙酸乙酯(10mL x3)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤并减压旋干，得到粗品。粗产品用少量二氯甲烷溶解，加入正己烷，有固体析出，抽滤，减压蒸除溶剂，旋干后的滤液再用乙酸乙酯和乙醇重结晶，得到白色或类白色的产物BG-381(255mg,产率80％)。
实施例2新型结构化合物对肺癌细胞杀伤和抑制AXL蛋白效果评价分析
本实施例使用的细胞材料为：以EGFR突变的细胞为模型：PC-9、H1975和HCC827及其奥希替尼耐药细胞PC-9OR、H1975OR和HCC827OR。使用的化合物为实施例1制备的BG-x系列化合物。
1AXL抑制剂新型结构化合物对奥希替尼耐药细胞PC-9OR的活性评价
将奥希替尼耐药细胞PC-9OR以3×103个/孔的密度接种于96孔板中，培养12h。再加入不同浓度的BG-x化合物(浓度100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.006、0.001、0μM)37℃孵育48h。细胞样品用PBS清洗3次，每孔加CCK-8溶液100μl。继续孵育2小时，终止培养。选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，计算化合物的IC50，结果如表1和图1所示。
表1
化合物编号 BG-235 BG-239 BG-247 BG-248 BG-267 BG-272
IC50(μM) 5.28 7.08 6.37 3.37 3.26 2.19
化合物编号 BG-296 BG-325 BG-328 BG-380 BG-381
IC50(μM) 1.71 1.49 4.7 5.28 0.91
BG-x化合物对耐药细胞的杀伤效果显示，BG-325、BG-381两种药物的效果较好。因此，优选BG-325、BG-381药物开展后续研究。
2BG-325、BG-381化合物对肺癌细胞的杀伤效果
将肺癌耐药细胞以3×103个/孔的密度接种于96孔板中，培养12h。再加入不同浓度的BG-325、BG-381化合物(浓度设置：100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.006、0.001、0μM)37℃孵育48h。细胞样品用PBS清洗3次5min，每孔加CCK-8溶液100μl。继续孵育2小时，终止培养。选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，计算BG-325、BG-381化合物的IC25和IC50。分析BG-325、BG-381化合物对奥希替尼细胞的杀伤效果。结果如表2-5和图2所示：BG-325、BG-381对大多数耐药株的杀伤效果较好，尤其是BG-381。
表2 BG-325的IC25
细胞 PC-9 PC-9OR1 PC-9OR2 H1975 H1975OR1 H1975OR2
IC25(μM) 0.10 1.36 0.83 0.15 0.97 0.77
细胞 HCC827 HCC827OR1 HCC827OR2 HCC827OR3 HCC827OR4 HCC827OR5
IC25(μM) 0.52 0.56 0.68 1.19 0.55 0.61
表3 BG-325的IC50
表4 BG-381的IC25
细胞 PC-9 PC-9OR1 PC-9OR2 H1975 H1975OR1 H1975OR2
IC25(μM) 0.22 0.68 0.22 0.17 0.75 0.43
细胞 HCC827 HCC827OR1 HCC827OR2 HCC827OR3 HCC827OR4 HCC827OR5
IC25(μM) 0.79 0.54 0.45 0.68 0.83 0.30
表5 BG-381的IC50
化合物编号 PC-9 PC-9OR1 PC-9OR2 H1975 H1975OR1 H1975OR2
IC50(μM) 0.79 1.81 0.62 0.69 4.03 1.92
化合物编号 HCC827 HCC827OR1 HCC827OR2 HCC827OR3 HCC827OR4 HCC827OR5
IC50(μM) 6.74 2.15 1.80 2.91 3.50 1.92
3化合物对肺癌耐药细胞AXL蛋白的抑制效果
将肺癌耐药细胞以3×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养12h。再加入BG-325、BG-381化合物上述获得的IC25浓度37℃孵育48h。收集细胞、裂解蛋白，采用Western Blot检测BG-325、BG-381化合物处理后的奥希替尼耐药细胞AXL蛋白的变化情况。
结果如图3所示：奥希替尼耐药PC-9OR#1-6；H1975OR#1、4、6、7；PC-9GROR#1、3、4、6、8；HCC827OR#1、3、4的AXL蛋白较其亲本细胞PC-9、H1975、PC-9GR和HCC827的显著升高。在加入化合物BG-325和BG-381处理后，观察到耐药细胞的AXL蛋白条带显著下调。表明BG-325和BG-381可显著抑制PC-9、H1975、PC-9GR和HCC827四种耐药细胞的AXL的表达。
实施例3化合物抑制其他肿瘤细胞AXL蛋白效果评价
1筛选AXL高表达的其他肿瘤模型
分析的肿瘤类型有：肺癌(PC-9GR)、肝癌(HepG2细胞)、结直肠癌(HCT-8细胞)、乳腺癌(MCF-7细胞)、胃癌(N87细胞)和黑色素瘤(WM-115)。
采用Western Blot分析上述肿瘤模型细胞的AXL表达情况。结果如图4所示：除了肺癌外，AXL在肝癌和黑色素瘤中表达较高，后续在肝癌和黑色素瘤中分析BG-X化合物对AXL的抑制效果。
2 AXL抑制剂新型结构化合物对肝癌和黑色素瘤细胞的AXL的抑制情况
参照实施例2中的方法，从化合物BG-272、BG-325、BG-381对肝癌和黑色素瘤细胞的活性(图5)计算得到IC25浓度，如表6所示：
表6化合物对肝癌和黑色素瘤细胞的IC25(μM)
化合物/细胞 HepG2细胞 WM-115
BG-272 0.77 1.17
BG-325 0.53 1.41
BG-381 0.22 0.95
采用Western Blot检测化合物处理后的其他肿瘤细胞的AXL蛋白的变化情况。
对HepG2细胞AXL的抑制效果如图6A所示：结果显示，化合物BG-272、BG-325、BG-381AXL的抑制效果较好，BG-272效果最佳。
对WM-115细胞AXL的抑制效果如图6B所示：结果显示，化合物BG-272、BG-325、BG-381这三种都可以可显著抑制黑色素瘤细胞的AXL的表达。
AXL蛋白氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.1)：
MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVGLEGLPYFLEEPEDRTVAANTPFNLSCQAQGPPEPVDLLWLQDAVPLATAPGHGPQRSLHVPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKEPSTPAFSWPWWYVLLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQPDPKDSCSCLTAAEVHPAGRYVLCPSTTPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA。

Claims (10)

1.一种化合物，其为具有如通式(I)结构所示的化合物：
其中，通式(I)中Z1选自O、S、N、CH2，Z2选自O、S、N、CH2；
R1选自以下结构：
R2选自以下结构：
R3选自：卤素类：氟、氯、溴、碘，甲氧基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基，或者H、5-甲基、5-氯、5-溴、5-甲氧基、5-硫甲基、5-异丙基、5-叔丁基、5-甲氧酰基、5-氟、5-三氟甲基、5-氯、5-苯基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：
R2选自(2-氨基苯基)二甲基氧化膦、卤素、三氟甲基或三氟甲氧基、硫甲基、异丙基、叔丁基、甲氧酰基、苯基、吡唑环、噁二唑环、咪唑环、异噁唑环、噁唑环、噻唑环、噻二唑环、噻吩环、吡啶环、嘧啶环、呋喃环、三唑环、吡咯环或四唑环；
其中R1和R2组合为4，5-二甲氧基、4，5-二硫甲基、4，5-二异丙基、4，5-二叔丁基、4，5-二甲氧酰基、4，5-二氟、4，5-二三氟甲基、4，5-二氯、4，5-二苯基、4-氟-5-甲氧基、4，5-二氯噻吩；
R3为烷基胺、链状及环状的醇。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物为BG-325、BG-381或者BG-272，结构式如下：
4.一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和作为活性成分的权利要求1至3任一项所述的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、立体异构体或或其药学上可接受的盐。
5.权利要求权利要求1至3任一项所述的化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备AXL抑制剂中的应用。
6.权利要求权利要求1至3任一项所述的化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备治疗AXL高表达的肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述AXL高表达的肿瘤包括肺癌、肝癌和黑色素瘤。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肺癌为非小细胞肺癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肺癌为EGFR突变晚期非小细胞肺癌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肺癌为EGFR-TKI耐药非小细胞肺癌，所述化合物为BG-267、BG-325或者BG-381。
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