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CN117925511A - 提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法 - Google Patents

提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法 Download PDF

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CN117925511A
CN117925511A CN202410121188.9A CN202410121188A CN117925511A CN 117925511 A CN117925511 A CN 117925511A CN 202410121188 A CN202410121188 A CN 202410121188A CN 117925511 A CN117925511 A CN 117925511A
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somatic
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李东律
朴卿顺
李娥菻
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Industry Academic Cooperation Foundation of College of Medicine Pochon CHA University
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Abstract

本发明一方面提供一种提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法。可以通过使用增加Rad51活性的物质及减少H3K9me3甲基化的制剂来提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率。

Description

提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的 方法
本发明是2019年01月23日所提出的申请号为201980009895.6、发明名称为《一种包括Rad51激活剂的用于胚胎发育的组合物以及用其提高胚胎发育率的方法》的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法。
背景技术
为了制备患者免疫相容性干细胞，通过体细胞核置换来制备胚胎干细胞可以是最有利的方法。然而，体细胞核置换技术的制备效率非常低，并且失败原因还没有被很好地查明。因此，查明制备效率低的原因并提高制备效率仍然是体细胞核置换干细胞的商业化要解决的问题。
为了实现基因组的稳态，必须保存DNA而不得损坏，其中最致命的DNA损坏是DNA双螺旋的断裂，而Rad51是参与修复所断裂的DNA双螺旋的蛋白质之一。当发生DNA双螺旋断裂时，首先核酸外切酶(exonuclease)在断裂位点形成单螺旋DNA，并通过用复制蛋白A(replication protein A，RPA)包覆来保护该单螺旋。随后，重组蛋白Rad51再次取代RPA以形成丝状复合体，并搜索同源染色体等以找到同源碱基序列，然后交换DNA链以完成同源重组修复。
另外，RS-1为增加Rad51的酶活性的化学物质，已知通过增加Rad51的DNA结合活性(binding activity)来提高同源重组效率。
发明内容
技术问题
本发明一方面提供一种提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法。
本发明一方面提供一种包括增加Rad51活性的物质的用于提高胚胎发育的组合物。
本发明另一方面提供一种增加胚胎发育效率的方法，其包括：在含有增加Rad51活性的物质的培养基中培养卵子。
技术方案
本发明一方面提供一种提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法，其包括：在包括增加Rad51活性的物质及减少H3K9me3甲基化的制剂的培养基中培养分离后的卵子,其中所述物质减少2细胞期发育停止的胚胎数量。
本发明一方面提供一种包括增加Rad51活性的物质的用于增加受精卵的胚胎形成或发育效率的组合物。本发明另一方面提供一种包括Rad51激活剂的用于增加胚胎形成或发育效率的组合物。
如本文所用，术语“胚胎形成”是指合子(zygote)通过细胞分裂变成多个细胞，并这些细胞经历细胞分裂和分化以形成胚胎(embryo)或作为胚胎出现。
如本文所用，术语“效率的增加”是指经体细胞复制的卵子的胚泡发育或胚泡发育的增加。所述胚泡是指在受精卵反复卵裂而生长的过程中处于可分为在致密化的桑椹胚之后形成胚泡腔而将分化成胎儿的内细胞团(inner cell mass)和将分化成胎盘的滋养外胚层(trophectoderm)的发育状态的受精卵。因此所述效率的增加是指与在不存在减少H3K9me3甲基化作用的制剂的情况下进行的体细胞核移植相比，体细胞核移植的效率增加，具体而言，经体细胞复制的卵子的胚胎发育效率增加、进入胚泡阶段的体细胞核移植胚胎的发育增加、进入胚泡阶段的发生增加、胚泡的生产效率增加、获得胚泡的效率增加或胚泡的发育形成率增加。
如本文所用，术语“Rad51”是指在真核生物中表达的基因，其参与DNA双螺链断裂的修复，即作为DNA修复剂的一种Rad51蛋白家族。所述基因的序列和位置等在本领域已知(NCBI Gene ID：5888等)。
所述增加Rad51活性的物质例如可以商品名RS-1(RAD51-stimulatory compound-1)购得，或者可以包括根据如高通量筛选(high throughput screening，HTS)等的本领域已知的方法选择与Rad51结合的材料、3-[(苄氨基)磺酰基]-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲酰胺(3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide)、4-溴-N-(4-溴苯基)-3-[[(苯甲基)氨基]磺酰基]-苯甲酰胺(4-Bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide)或以下化学式1的化合物或其衍生物：
【化学式1】
所述增加Rad51活性的物质通过维持具有修复受损DNA功能的Rad51蛋白与ssRNA(single strand DNA)或dsDNA(double strand DNA)的结合稳定性来增加Rad51蛋白的活性，从而可以具有维持DNA修复效果的功能。
在一具体实施例中，所述培养基组合物可以在基本培养基中以0.1μM至50μM的浓度包括增加Rad51活性的物质。具体而言，所述基本培养基可以为用于培养哺乳动物卵子的基本培养基。所述基本培养基根据哺乳动物的种类而不同，但包括选自无机盐类、碳源、氨基酸、牛血清白蛋白和辅因子中的至少任何一个，并可以包括本领域技术人员已知的所有常用培养基。氯化钠、氯化钾和碳酸氢钠等可以用作所述无机盐类，葡萄糖、钠、丙酮酸和乳酸钙等可以用作所述碳源，包括谷氨酰胺在内的必需氨基酸和非必需氨基酸用作所述氨基酸，微量元素和缓冲液可以用作所述辅因子。所述培养基例如可以选自最小必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium，DMEM)、罗斯威尔帕克纪念研究所培养基(Roswell Park MemorialInstitute Medium，RPMI)、角质细胞无血清培养基(Keratinocyte Serum Free Medium，K-SFM)、伊思考夫改良杜尔贝科培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)、F12和DMEM/F12。另外，培养基在等渗溶液中可以含有中性缓冲液(例如磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)和蛋白质营养素(例如血清，例如胎牛血清(fetal bovine serum:FBS)、胎牛血清(fetal calf serum:FCS)、马血清、血清替代物、白蛋白或必需氨基酸和非必需氨基酸，例如谷氨酰胺、L-谷氨酰胺)。进一步地，可以含有脂质(脂肪酸、胆固醇、血清的HDL或LDL提取物)和在大多数此类保存液培养基中发现的其他成分(例如转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸、作为任何离子化形式或盐的糖原，例如葡萄糖、糖皮质激素，例如氢化可的松和/或还原剂，例如β-巯基乙醇)。此外，所述基本培养基可以进一步包括抗生素。所述增加Rad51活性的物质可以0.1μM至50μM、0.1μM至40μM、0.1μM至30μM、1μM至50μM、1μM至30μM，5μM至30μM或5μM25μM的浓度包括在所述基本培养基中。此时，当所述基本培养基中所含的增加Rad51活性的物质的浓度小于所述范围时，由于不能有效地去除活性氧，因此卵子的胚泡发育效率受到阻碍，从而存在不能获得优质卵子的问题；当其超过所述范围时，由于增加Rad51活性的物质长时间作用于卵子，因此存在阻碍卵子成熟的问题。
在一具体实施例中，所述组合物可以进一步包括减少H3K9me3甲基化的制剂。所述减少甲基化的制剂可以为增加组蛋白去甲基化酶的KDM4家族成员表达的制剂。例如，所述制剂可以增加KDM4A(JMJD2A)、KDM4B(JMJD2B)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4D(JMJD2D)或其组合的表达或活性。
本发明另一方面提供一种增加卵子的胚胎发育效率的方法，其包括：在包括增加Rad51活性的物质的培养基中培养卵子。所述包括增加Rad51活性的物质的培养基的具体内容如上所述。
在一具体实施例中，其可以进一步包括：使卵子与减少H3K9me3甲基化(methylation)的制剂接触。所述减少H3K9me3甲基化(methylation)的制剂的细节如上所述。另外，所述卵子可以为冷冻后融化的。
所述方法可以包括：在包括增加Rad51活性的物质的培养基中培养卵子1天至10天。具体而言，可以培养1天至10天、1天至8天、1天至7天、2天至8天、2天至6天或3天至6天。此时，当培养期间小于所述范围时，存在胚胎不足以发育成胚泡的问题；当其超过所述范围时，存在由于卵子过度成熟而难以获得在质量上改善的胚泡的问题。
另外，所述方法可以进一步包括：将在所述培养步骤中获得的胚胎发育成个体。所述个体可以为桑椹胚(morula)、囊胚(blastula)和/或原肠胚(gastrula)。
本发明另一方面提供一种通过所述方法制备的胚胎、胚泡和/或胚胎干细胞。本发明另一方面提供一种包括通过所述方法制备的胚胎和/或胚泡作为有效成分的用于移植的组合物。
本发明另一方面提供一种通过使用增加Rad51活性的物质来增加体细胞核移植的效率的方法。所述效率可以为体细胞核移植的成功率、由所述体细胞核移植产生的细胞的胚胎发育率。所述胚胎发育率可以是指胚胎通过2细胞期、4细胞期和8细胞期发育为胚泡。
本发明人确认了，在通过体细胞核移植制备的细胞的复制过程中，与体外受精过程相比，Rad51的表达非常低，并确认增加Rad51活性的物质显着提高该体细胞复制效率。因此Rad51激活剂可有效地用于通过体细胞核移植的细胞制备，通过筛选增加Rad51活性的物质可显着提高体细胞核移植的效率。
所述方法可以包括：准备体细胞的核和已去除核的卵子；将所述体细胞的核和已去除核的卵子与增加Rad51活性的物质一起培养；以及获得体细胞核置换(somatic-cellnuclear transfer，SCNT)细胞。
所述方法包括可以进一步包括：去除卵母细胞的核；移植一个或更多体细胞的核(供体核)；激活重建的核移植卵母细胞(胚胎)；以及进一步培养成胚泡。这些用于体细胞核移植(somatic-cell nuclear transfer，SCNT)的步骤可以由本领域技术人员根据文献(Nature 419，583-587，2002年10月10日)等中公开的方法通过适当的修改来执行。
所述方法可以包括添加一个或多个体细胞,即供体细胞的一个或多个核,其包括通过将供体核直接注入到卵母细胞中或通过电刺激来使核与细胞融合。
“体细胞核置换”或“体细胞核移植”是指将从供体细胞收集的核移植到已去除核的受体细胞中,即产生与供体细胞在遗传上相同的细胞的技术。
所述已去除核的卵子可以为从个体的卵泡收集的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexs)，并可以商购获得。所述个体可以为包括人在内的哺乳动物。例如，所述哺乳动物可以包括鼠、猪、羊、狗、牛、马、山羊等。另外，所述已去除核的卵子可以被冻结和/或冷冻保存。作为所述冻结方法，可以使用缓慢冻结(sloe-freezing)或作为超快速冻结方法的玻璃化冻结(vitrification)。
根据一具体实施例的方法可以包括：通过体外培养体细胞的核和已去除核的卵子来形成胚泡。
可以将所述增加Rad51活性的物质添加到培养体细胞的核和已去除核的卵子的培养基中，例如在SCNT细胞的产生之前、产生之后、2细胞期、4细胞期、8细胞期或胚泡形成时存在于培养基。所述增加Rad51活性的物质的浓度可以由本领域技术人员根据所述物质的Rad51活化程度或细胞毒性进行适当调节，例如可以0.1μM至50μM、0.1μM至40μM、0.1μM至30μM、1μM至50μM、1μM至30μM、5μM至30μM或5μM至25μM的浓度存在于所述培养基。
根据一具体实施例的方法可以进一步包括：与减少H3K9me3甲基化(methylation)的制剂接触。所述减少H3K9me3甲基化的制剂可以为增加组蛋白去甲基化酶的KDM4家族成员表达的制剂。例如，所述制剂可以增加KDM4A(JMJD2A)、KDM4B(JMJD2B)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4D(JMJD2D)或其组合的表达或活性。所述接触可以在体细胞的核与已去除核的卵子融合后，在经过核移植的胚胎上进行。具体而言，所述胚胎可以为在体细胞核移植卵母细胞基因开始激活之前的胚胎。例如，在激活所述胚胎后5小时(5hours post activation,5hpa)或10hpa至12hpa之间(即，1细胞期)，或在约20hpa(即，初始2细胞期)或20hpa至28hpa之间(即，2细胞期)，可以与一个或多个组蛋白去甲基化酶KDM4家族接触。
另外，所述接触或注入可以是指在将供体细胞的核注入到已去除核的卵母细胞之前将供体细胞，例如最终分化的体细胞核或细胞质接触或注入到至少一个组蛋白去甲基化酶KDM4家族。所述接触或注入可以是指与供体体细胞接触1小时以上、或2小时以上，并所述接触也可以在从供体体细胞到已去除核的卵母细胞的核去除之前执行1天(24小时)以上、2天以上、3天以上或超过3天。
因此通过将所述体细胞的核和已去除核的卵子与减少H3K9me3甲基化的制剂接触来降低抑制了体细胞核移植胚胎中的复制的组蛋白甲基酶的活性，并增强与胚胎发生有关的基因的表达，从而可以提高胚泡的发生和发育效率。例如，所述发育效率可以为增加发育成2细胞、4细胞和8细胞或胚泡阶段的体细胞核移植胚胎的发育百分比。即，在移植到8细胞或胚泡阶段之前，可以增加体细胞核移植胚胎的发育效率。在一实施例中，根据是否存在在体细胞核移植过程中增加Rad51活性的物质来确认了胚胎的状态和胚泡数量的变化。结果，确认了通过处理增加Rad51活性的物质来减少了2细胞期发育停止(block)的胚胎数量，并胚胎发育率显着增加了(图3A)。因此，所述增加Rad51活性的物质可以通过克服2细胞期发育停止现象并维持连续的胚胎发育来提高胚泡发育的效率。
在一具体实施例中，与在不存在增加Rad51活性的物质的情况下进行的体细胞核移植相比，所述方法的核移植效率增加约5％以上、约10％以上、约13％以上、约15％以上、约30％以上、约50％以上、50％至80％或超过80％。即，增加体细胞核移植胚胎的移植前的发育效率，或增加胚胎向胚泡阶段的发育、或将胚胎向扩张胚泡阶段的发育以约5％、约7％、约10％、约12％以上或超过12％发育到扩张胚泡阶段。在另一具体实施例中，与在不存在增加Rad51活性的物质的情况下进行的体细胞核移植相比，所述方法使向胚泡阶段的成功发育增加3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上或超过8倍。所述体细胞核移植效率的增加意味着胚泡的产生或产量的增加。与在不存在增加Rad51活性的物质的情况下进行的体细胞核移植相比，所述胚泡的产生或产量的增加可以为胚泡的产生或产量增加约110％以上、约120％以上、约130％以上、约140％以上、约150％以上或超过约150％。
如上所述，根据本发明一方面的方法，通过在包括增加Rad51活性的物质的培养基中培养体细胞核移植卵子来防止体细胞核移植卵子的细胞损伤，从而可以提高卵子的质量。另外，通过Rad51激活剂冻结和融化的体细胞核移植卵子的凋亡减少，所以可以提高胚泡形成和生产效率。另外，随着体细胞核移植卵子的着床率提高，可以通过体外受精来生产濒临灭绝的动物，并随着胚胎干细胞的诱导增强，可以有效地生产胚胎干细胞系。
本发明另一方面提供一种根据所述方法制备的体细胞核移植胚胎、胚泡、胚胎干细胞或复制生殖细胞。所述胚胎为经过基因修饰的，例如，可以为在体细胞核移植步骤之前(即，在收集供体核并与受体卵母细胞的细胞质融合之前)，供体核的遗传材料中的至少一个移植基因被修饰的。在一具体实施例中，所述胚胎可以包括供体体细胞来源核DNA、受体卵母细胞来源细胞质以及第3供体个体来源线粒体DNA。所述胚胎干细胞可以通过将细胞与根据所述方法制备的胚泡中的内部细胞团分离并将未分化的所述内部细胞团来源细胞培养来形成。另外，所述胚胎干细胞可以为多能性干细胞或全能性干细胞。
本发明另一方面提供一种通过增加Rad51的活性来提高体细胞复制效率的物质的筛选方法，其包括：准备细胞的核和已去除核的卵子；将所述体细胞的核和已去除核的卵子与候选物质一起培养；以及评价所述培养后产生的体细胞核置换细胞的Rad51活性。
从所述体细胞核移植胚胎或胚泡诱导的细胞，例如胚胎干细胞等可以用于测试以决定制剂是否影响分化或细胞增殖。例如，从所述制剂的存在或不存在评估所述细胞的分化或增殖的能力，所以可以用于筛选以选择影响从体细胞核移植胚胎或胚泡诱导的细胞的制剂。测试化合物可以为任何感兴趣的化合物，其包括化学化合物、小分子、多肽或其他生物制剂(例如，抗体或细胞因子等)。
在根据一具体实施例的方法中，所述Rad51活性的评估是为了确认Rad51的表达水平，可以使用例如逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-PCR:
RT-PCR)或免疫染色法等本领域已知的技术来执行。另外，所述Rad51活性的评估可以与所述体细胞复制效率的评估一起执行。如果与添加所述候选物质之前相比，添加后的培养物中SCNT卵母细胞、2细胞期细胞、4细胞期细胞或胚泡阶段的细胞数量发生变化，则可以确定所述候选物质为增加所述Rad51的活性并进一步提高通过体细胞核移植的体细胞复制效率的物质。
本发明另一方面提供一种体细胞移植受精卵的制备方法，其包括：准备体细胞的核和已去除核的卵子；在包括增加Rad51活性的物质的培养基中培养所述体细胞核和去除核的卵子，以获得体细胞核移植(somatic-cell nuclear transfer，SCNT)细胞；以及将体细胞核移植细胞与液态精液在体外受精。在包括Rad51激活剂的培养基中培养所述体细胞的核和已去除核的卵子的方法的具体内容如上所述。所述体细胞核移植细胞可以为体细胞核移植卵子，具体为2细胞期、4细胞期和8细胞期的胚胎，也可以为通过所述胚胎发育而达到胚泡阶段的细胞。
根据一具体实施例的方法包括：将所述体细胞核移植细胞与液态精液在体外受精。所述精液可以是从个体的输精管收集的精液。所述个体可以为包括人在内的哺乳动物。例如，所述哺乳动物可以包括鼠、猪、羊、狗、牛、马、山羊等。可以将所述体细胞核移植细胞和液态精液在体外受精用培养基组合物中体外受精1天至7天。此时，当体外受精期间小于所述范围时，存在无法受精的问题；当期超过所述范围时，存在胚胎退化的问题。另外，所述步骤可以进一步包括：接触或注入增加Rad51活性的物质。关于所述增加Rad51活性的物质的具体内容如上所述。将所述增加Rad51活性的物质在向体细胞核移植细胞注入精液之后，在形成原核(pronuleus)之前(在注入精液后18小时内)，具体地在注入精液之后，在2细胞期之前接触或注入到体细胞移植受精卵。因此所述体细胞移植受精卵可以提高生产的效率性，因为体细胞核移植细胞(胚胎)有效地前进而没有发育停止，并经过2、4和8细胞期阶成功发育成胚泡而没有发育缺陷或生存力的丧失。
有益效果
本发明涉及一种包括Rad51激活剂的用于胚胎发育的组合物以及用其提高胚胎发育率的方法，由于所述细胞有效地发育为胚泡而没有细胞损伤和/或发育停止，因此可以使用体外受精程序来生产体细胞复制受精卵。
附图说明
图1A示出了体外受精(in vitro fertilization,IVF)、使用新鲜卵子的体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)和将Kdm4a mRNA注入卵子的SCNT过程中Rad51表达水平的RT-PCR分析结果。
图1B示出了IVF、使用冷冻卵子的SCNT和使用新鲜卵子的SCNT过程中Rad51表达水平的RT-PCR分析结果。
图2示出了IVF、使用冷冻卵子的SCNT和使用新鲜卵子的SCNT过程中Rad51表达水平的免疫染色法分析结果。
图3A示出了根据Rad51激活剂存在与否在SCNT过程中处于2细胞期发生停止状态的胚胎和胚泡的数量变化的照片。
图3B为确认IVF卵子、SCNT卵子和SCNT+RS-1卵子中细胞自噬和线粒体之间的相关关系的照片。
图4为确认IVF卵子、SCNT卵子和SCNT+Kdm4a卵子中线粒体活性的照片。
图5A为确认IVF卵子、SCNT卵子和SCNT+RS-1卵子中细胞损伤的照片。
图5B为确认IVF卵子、SCNT卵子和SCNT+RS-1卵子中DNA损伤生物标志物的表达的照片。
图5C为确认IVF卵子、SCNT卵子和SCNT+RS-1卵子中细胞周期DNA损伤的照片。
图6为确认IVF卵子、SCNT卵子和SCNT+RS-1卵子中DNA的断裂与否的图表。
图7为通过基因表达的增减来确认RS-1处理对SCNT卵子的影响的图表。
图8为通过H3K9me3染色来确认根据RS-1处理和Kdm4a mRNA处理的SCNT的机制模式的照片。
图9A为确认根据RS-1处理与否的SCNT卵子的复制产生率的表。
图9B为确认根据RS-1处理与否的SCNT卵子的胚胎干细胞诱导率的表。
具体实施方式
本发明将参考实施例以详细描述下文。然而，这些实施例是为了描述本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1、体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)
给8周龄至10周龄的雌性BDF/1小鼠施用5IU PMSG和5IU hCG激素。在施用hCG后14小时后，在过度排卵的小鼠中使用透明质酸酶(hyaluronidase)以分离卵丘细胞，并收集卵子。将分离后的卵丘细胞冷藏保存以用作体细胞复制供体细胞，并将分离后的卵子保存在37℃培养箱KSOM培养液中直至实验开始。然后，为了进行体细胞复制实验，从成熟卵子中去除细胞核，并将预先分离的卵丘细胞直接注入供体细胞中。在包括RS-1(Rad51-stimulatimulatory compound 1)的培养液中将注入供体细胞的卵丘细胞人工激活6小时。随后，在所述添加有RS-1试剂的培养液中培养22小时，并22小时后在KSOM培养液中培养72至96小时。
实施例2、准备Kdm4a mRNA并将Kdm4a mRNA注入体细胞复制卵子
2-1、准备Kdm4a mRNA
使用In-Fusion试剂盒(Clonetech#638909)，将全长(full-length)小鼠Kdm4a/Jhdm3A cDNA克隆到克隆位点3'末端中含有poly(A)83的pcDNA3.1质粒。使用mMESSAGEmMACHINE T7超试剂盒(Life Technologies#AM1345)从通过体外(in vitro)转录线性化的模板质粒合成mRNA。将经合成的mRNA溶解在无核酸酶水(nuclease-free water)中。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)测量mRNA的浓度。将mRNA的分取量保存于-80℃下直至使用。
2-2、将Kdm4a mRNA注入体细胞复制卵子
使用压电驱动微操作器(piezo-driven micromanipulator)，将所述实施例2-1中准备的Kdm4a mRNA 2μg/μl分别注入在活化培养液中与对照组～10pl一起进行RS-1处理6小时的复制卵母细胞和未经RS-1处理的复制卵母细胞。注射后，在添加RS-1的KSOM培养液和未添加RS-1的培养液中分别培养22小时，然后在未添加RS-1的培养液中培养72小时至96小时以观察胚泡效率。
实施例3、与体外受精(In vitro fertilization)卵子相比，比较分析体细胞核移 植卵子中Rad51的表达水平
通过qRT-PCR比较和分析在体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子、所述实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)和所述实施例2的体细胞核移植过程中注入Kdm4a mRNA的复制卵子(SCNT+Kdm4a)中的调节同源重组机制的Rad51的表达水平。具体而言，使用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒(Dynal Asa，挪威奥斯陆)分离了胚胎的mRNA。在裂解/结合缓冲液中洗涤原核期(Pronuclear stage，PN)、2细胞期和4细胞期的约20个胚胎后，将其与Dynabeads oligo dT25混合并在室温下结合。在将mRNA与珠子结合后，将其用缓冲液-A洗涤两次，再用缓冲液-B洗涤。然后，添加Tris-HCl溶液以在73℃下从珠子分离mRNA。使用寡聚dT引物从分离的mRNA合成cDNA。以经合成的cDNA作为模板(template)，通过qRT-PCR分析小鼠Rad51的表达。此时，所使用的引物碱基序列如下：
正向引物：5'-AGCTTTCAGCCAGGCAAAT-3'
反向引物：5'-GCTTCAGCTTCAGGAAGACA-3'
根据Rad51在原核期、2细胞期和4细胞期胚胎中表达的比较分析结果，Rad51在IVF的1细胞期非常丰富地表达，但在2细胞期显示出显着减少的趋势，并在4细胞期中，Rad51的表达显示出与1细胞期相似地增加的趋势。另一方面，在SCNT中，1细胞期和2细胞期显示出与IVF相似的表达模式，但与IVF相比，在4细胞期中未观察到类似于SCNT的1细胞期的表达增加。然而，在SCNT+Kdm4a中，可以确认类似于IVF的表达模式(图1A)。
与由IVF形成的4细胞期相比，确认了在使用新鲜卵子和冷冻卵子的SCNT形成的4细胞期中Rad51的表达显着低(图1B)。
接下来，通过免疫染色法重新分析了Rad51的RNA表达与通过IVF形成的4细胞期相比在通过体细胞核置换(SCNT)形成的4细胞期中显着减少的结果。具体而言，在激活体细胞复制卵子30小时后，在2细胞期用添加有0.1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin:BSA)的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline:PBS)洗涤，并在室温下用4％多聚甲醛处理30分钟。在添加有0.1％Triton X的PBS/0.1％BSA中处理24小时后，将Rad51、γH2AX、线粒体示踪剂(Mitotracker)和LC3B抗体在室温下处理2小时。然后，用添加有0.1％BSA的PBS每次10分钟洗涤3次，并分别处理于山羊抗小鼠(goat anti-mouse)和驴抗兔(donkey anti-rabbit)抗体1小时。随后，在PBS/0.1％BSA中进行3次洗涤10分钟，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对核进行染色。将染色后的卵子固定在载玻片上，并用共聚焦荧光显微镜观察和分析。
结果确认，直到2细胞期，IVF、SCNT和使用冷冻卵子的SCNT中Rad51蛋白的量没有差异，但在通过体细胞核置换形成的4细胞期中Rad51蛋白的量显着减少(图2)。
实施例4、通过用Rad51活性增加化合物处理来确认体细胞复制效率的改善和生物 标志物
4-1、确认体细胞复制效率的改善
根据所述实施例3的结果，在体细胞复制过程中处理作为增加Rad51活性的物质的RS-1后，分析了体细胞复制效率是否改善。首先，为了确认RS-1是否对卵子发育产生毒性，将RS-1 0μM、1μM、5μM、10μM处理于所述体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子和实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)，以选择合适的浓度。
结果确认，在10μM的浓度下胚胎(embryo)的发育率显着增加(表1)(对照组：31％，RS-1：76％)。另外，如所预期，确认了通过RS-1处理处于2细胞期发育停止(block)状态的胚胎数量减少(对照组：39％，RS-1 5％)，并胚胎发育率也显着增加(对照组：17％，RS-159％)(图3A)。
【表1】
对照组：基于对照组卵母细胞+重建卵母细胞(reconstructed oocyte)的数量。
#基于2细胞胚胎的数量。
4-2、确认生物标志物的表达和相关关系
在体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子、所述实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)和所述实施例4-1中经RS-1处理的体细胞核移植卵子(SCNT+RS-1)各自的1细胞期、2细胞期和4细胞期中，通过作为细胞自噬(autophage)标记的LC3B与作为线粒体标记的线粒体示踪剂(mitotracker)染色来确认了细胞自噬与线粒体的相关关系。具体而言，为了评估线粒体分布，使用橙色线粒体示踪剂CMTMRos(分子探针)对SCNT来源的1细胞期、2细胞期和4细胞期的体细胞复制卵子进行染色。在添加有0.3％BSA的M16培养液中，线粒体示踪剂在黑暗条件下以300nM的浓度于37℃下使用30分钟。洗涤后，固定卵母细胞，用LC3B抗体进行免疫荧光染色，并用DAPI染色核。
结果，发现了在1细胞期中仅在SCNT组细胞质中的细胞自噬和线粒体的分布被凝聚而表达为小点(dot)的特异性，并且在经RS-1处理的SCNT组中，可以确认类似于IVF组的表达模式。此外，在2细胞期中，可以确认IVF组中的细胞自噬和线粒体的表达均匀分布于核和细胞质，但SCNT组和SCNT+RS-1组的细胞自噬和线粒体集中表达于核。尤其，在2细胞期停止发育的SCNT组中，可以确认仅在细胞质表达而在核不表达的特异性。在4细胞期中，所有组中的表达均显示出相似的模式(图3B)。
实施例5、与体外受精(In vitro fertilization)卵子相比，分析体细胞核移植卵 子中线粒体的活性
为了分析在体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子、所述实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)和所述实施例2的体细胞核移植过程中注入Kdm4a mRNA的复制卵子(SCNT+Kdm4a)中的线粒体活性和潜在力，每个卵子用JC-1染色。具体而言，为了测量线粒体活性，使用JC-1(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)将SCNT来源的1细胞期、2细胞期和4细胞期的体细胞复制卵子以1μg/ml的浓度添加于培养液，并在黑暗条件下培养20分钟。随后，用Hoechst(Sigma)染色核。
结果，在IVF组的2细胞期中，可以确认线粒体在细胞质和核周围丰富地表达。另一方面，在SCNT组和SCNT+Kdm4a组中，可以确认线粒体在细胞质中部分地凝聚而表达不稳定。另外，在SCNT组和SCNT+Kdm4a组的4细胞期中，可以确认仅在细胞质表面上相对表达。因此，可见IVF组和SCNT组中的线粒体表达模式完全不同(图4)。
实施例6、确认根据RS-1处理与否的细胞损伤和DNA损伤
6-1、确认细胞损伤
为了确定是否根据RS-1处理对体细胞复制卵子的细胞造成损伤，确认了体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子、所述实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)和所述实施例4-1中经RS-1处理的体细胞核移植卵子(SCNT+RS-1)在2细胞期是否产生活性氧。具体而言，将IVF组、2细胞期的SCNT+RS-1组和SCNT组在添加有CellROX氧化应激制剂(oxidative stress reagenent)5μM的培养液中在37℃的黑暗条件下培养30分钟。然后，用添加有0.1％PVA的D-PBS洗涤，并用Hoechst(Sigma)染色核。
结果，可以确认IVF组总体上显示出活性氧减少的趋势。与此相反，可以确认在SCNT+RS-1组和SCNT组的核中活性氧增加。(图5A)。
6-2、确认DNA损伤
为了确定是否根据RS-1处理对体细胞复制卵子的DNA造成损伤，确认了体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子、所述实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)和所述实施例4-1中经RS-1处理的体细胞核移植卵子(SCNT+RS-1)是否表达DNA损伤生物标志物(rH2AX)。具体而言，在将固定于4％多聚甲醛的IVF组、SCNT组和SCNT+RS-1组固定于1细胞期、2细胞期和4细胞期后，用rH2AX(Abcam，ab22551)和Rad51(Abcam，ab63801)培养2小时，并用稀释至与以1：200PBS/0.1％BSA稀释的山羊抗小鼠(goat anti-mouse)相同浓度的山羊抗兔(goat anti-rabbit)抗体培养1小时。然后，用DAPI染色核。
结果，在IVF组的1细胞期中，可以确认rH2AX和Rad51的表达非常不足。与此相反,可以确认，在SCNT组中Rad51和rH2AX强烈表达于核，并在SCNT+RS-1组中DNA损伤显着减少。另外，可以确认在SCNT+RS-1的2细胞期发育停止组中，与其他组相比，DNA损伤在核中强烈表达。具体而言，Rad51和rH2AX在IVF组的4细胞期核中强烈表达，Rad51和rH2AXIVF也在SCNT+RS-1组的4细胞期核中与此相似地表达。另一方面，可以确认在SCNT组的4细胞期核中Rad51和rH2AX非常不足。即，当在体细胞核移植过程中处理RS-1时，可以看出在从2细胞期到4细胞期的复制过程中DNA损伤显着增加(图5B和图5C)。
实施例7、确认DNA断裂(break)
为了确认体外受精(in vitro fertilization，IVF)卵子、所述实施例1的体细胞核移植卵子(SCNT、F/T SCNT)和经RS-1处理的SCNT卵子中的DNA裂解，执行了单细胞凝胶电泳试验(彗星电泳)。具体而言，为了确认DNA损伤，将每个样品置于从培养液中取出的1ml试管中并悬浮于37℃的1％琼脂糖，然后将其固定在预涂布的载玻片(Trevigen)上。将载玻片于4℃下培养4小时，然后浸入4℃的Trevigen溶液中4小时。将载玻片从裂解溶液中移出，并浸入4℃1X TAE缓冲液中30分钟，然后进行电泳30分钟至40分钟。在室温下将载玻片浸入1M乙酸铵中30分钟，然后固定于75℃。在室温下固定30分钟后，于42℃下培养20分钟直到琼脂糖完全干燥。然后，用1X SYBR green I染色溶液进行染色5分钟。
结果，与IVF组相比，可以确认SCNT组3'末端的显着延长导致大量DNA裂解。然而，在经RS-1处理的SCNT+RS-1组中，可以确认随着3'末端显着减少而DNA裂解减少。另外，可以确认在SCNT组中产生异常的3'末端，但在SCNT+RS-1组中，可以确认异常3'末端的产生显着减少(图6)。
实施例8、确认RS-1处理对体细胞核移植卵子的影响
为了确认RS-1处理对体细胞核移植卵子的影响，在所述实施例1的体细胞复制过程中，通过用RS-1处理2细胞期阶段的复制卵子来进行RNA测序。此时，将体外受精(invitro fertilization，IVF)卵子用作阴性对照组。具体而言，根据制造商的说明，使用SMARTer超低输入RNA cDNA准备试剂盒(Takara，634890)扩增互补DNA(cDNA)。使用M220Sony Caterpillar(Covaris)将cDNA片段化为约200bp片段。将片段化的cDNA末端修复并与衔接子连接。根据制造商的说明，使用ScriptSeq v2试剂盒(Illumina)准备测序文库。在HiSeq2500(Illumina)中进行单端测序，并使用STAR(v2.5.2b，https://github.com/alexdobin/STAR)映射到mm9小鼠基因组。随后，使用基本选项通过Cufflinks(v2.2.1)计算FPKM(每百万读数每千碱基的片段数)。
结果，可以确认与翻译、免疫应答、代谢过程和线粒体翻译相关的基因表达增加，从而SCNT+RS-1组显示类似于IVF组的表达模式。另外，可以确认细胞增殖相关基因增加而细胞分化相关基因减少(图7)。
实施例9、确认根据RS-1处理和mRNA mRNA注入的体细胞核移植效率
为了确认所述实施例3中经RS-1处理的体细胞核移植卵子(SCNT+RS-1)和所述实施例2的体细胞核移植过程中注入Kdm4a mRNA的复制卵子(SCNT+Kdm4a)的复制机制，以与所述实施例8相同的方法确认每个卵子中表达的基因。
结果，可以确认在SCNT+RS-1组中190个基因显着增加，而在SCNT+Kdm4a组中45个基因(在1314个中)显着增加。另外，可以确认在SCNT+RS-1组中414个基因显着减少，而在SCNT+Kdm4a组中3个基因(在478个中)显着增加。
此外，通过H3K9me3染色已经证明，经RS-1处理和经Kdm4a mRNA处理的体细胞核移植通过单独的机制实现。具体而言，在将固定于多聚甲醛的IVF组、SCNT组和SCNT+RS-1组固定于1细胞期后，用H3K9me3抗体(Millipore，07-442)培养2小时，并用以1：200PBS/0.1％BSA稀释的山羊抗兔(goat anti-rabbit)抗体培养1小时。然后，用DAPI染色核。
即，可见经RS-1处理和经Kdm4a mRNA处理的体细胞核移植通过完全单独的机制执行(图8)。
实施例10、确认根据RS-1处理与否的复制产生率和干细胞诱导率
10-1、通过复制小鼠的生产来确认复制生产率
已报道，通常复制小鼠的生产率在正常体细胞复制后为1％左右。因此，确认了体细胞核移植卵子的根据RS-1处理与否的小鼠中的植入和复制生产率。具体而言，将SCNT和SCNT+RS-1卵母细胞的2细胞期的胚胎植入在假孕后经过0.5天的代孕母雌性ICR小鼠的子宫中。在移植后的第19.5天，将体细胞复制小鼠从代孕母的子宫取出，并与饲养复制小鼠的ICR小鼠同一天出生的正常ICR小鼠一起将代孕母的气味沾上以饲养。
结果，可以确认经RS-1处理的SCNT+RS-1组中的复制小鼠生产率提高至5％。另外，在发生过程中并没有毒性问题。因此，在生产体细胞核移植卵子时，RS-1处理具有有效生产无毒性的复制小鼠的优势(图9A)。
10-2、确认干细胞建立效率
为了确认根据RS-1处理与否的干细胞建立效率，从所述实施例1中制备的体细胞核移植卵子(SCNT)和所述实施例3中经RS-1处理的体细胞核移植卵子(SCNT+RS-1)的胚泡诱导了胚胎干细胞。具体而言，将每组胚泡培养在含有小鼠胚胎干细胞培养基的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)饲养细胞上。将20％KSR、0.1mMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、1％非必需氨基酸、100units/Ml青霉素、100μg/mL链霉素(所有产品均为GIBCO)1.5X103units/Ml重组mLif(Chemicon)用作培养液。使用胰蛋白酶-EDTA来传代，并将建立后的体细胞复制小鼠胚胎干细胞用碱性磷酸酶处理，以通过组织化学染色来评估所建立的干细胞。
结果，可以确认与未经RS-1处理组(SCNT)相比，经RS-1处理组(SCNT+RS-1)的胚胎干细胞诱导率显着更高(17％vs.45％)(图9B)。

Claims (8)

1.一种提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法，其包括：在包括增加Rad51活性的物质及减少H3K9me3甲基化的制剂的培养基中培养分离后的卵子,其中所述物质减少2细胞期发育停止的胚胎数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述增加Rad51活性的物质为下述化学式1的化合物：
【化学式1】
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述减少H3K9me3甲基化的制剂为增加组蛋白去甲基化酶的KDM4家族成员表达的制剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述卵子冷冻后融化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过所述培养而获得的胚胎在DNA复制过程中受损伤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述损伤在2细胞期之后和4细胞期之前引起。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述增加Rad51活性的物质减少通过所述培养而获得的胚胎的2细胞期发育停止。
8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：将在所述培养中获得的胚胎发育成个体。
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