CN117903940A - 培养装置、培养器的加工方法以及细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培养装置、培养器的加工方法和细胞培养方法。所述培养装置包括培养盒和培养器，所述培养盒具有容纳空间且顶部开口。所述培养器由聚二甲基硅氧烷制成且位于所述容纳空间内，所述培养器的底面紧贴所述培养盒的底壁，所述培养器的侧壁紧贴所述培养盒的内侧壁，所述培养器设有培养槽、输入孔和输出孔，所述培养槽由所述培养器的底面凹陷形成。所述输入孔由所述培养槽的顶壁凹陷至所述培养器的顶面形成。所述输出孔由所述培养槽的顶壁凹陷至所述培养器的顶面形成且与所述输入孔间隔设置。

Description

培养装置、培养器的加工方法以及细胞培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养装置技术领域，特别涉及一种培养装置、培养器的加工方法和细胞培养方法。

背景技术

随着组织工程和再生医学的快速发展，越来越多的研究需要进行原代细胞的分离培养和扩增。然而，传统的原代组织分离和干细胞培养方法存在多种问题，例如低细胞存活率、不稳定的固定组织方法和较低的克隆形成效率等，若是微量组织的原代培养，则成功率更低。常规方法需要大量的培养基和试剂，增加了实验成本，并限制了大规模实验的可行性。因此，研究人员需要寻求更高效、节约成本的培养方法，以提高实验效率并降低资源消耗。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种培养装置、培养器的加工方法和细胞培养方法，以解决上述问题。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种一种培养装置，所述培养装置包括：

培养盒，所述培养盒具有容纳空间且顶部开口；以及

培养器，所述培养器由聚二甲基硅氧烷制成且位于所述容纳空间内，所述培养器的底面紧贴所述培养盒的底壁，所述培养器的侧壁紧贴所述培养盒的内侧壁，所述培养器设有：

培养槽，所述培养槽由所述培养器的底面凹陷形成；

输入孔，所述输入孔由所述培养槽的顶壁凹陷至所述培养器的顶面形成；以及

输出孔，所述输出孔由所述培养槽的顶壁凹陷至所述培养器的顶面形成且与所述输入孔间隔设置。

本发明还涉及一种培养器的加工方法，包括步骤：

S1、将硅类聚合体和交联剂按比例混合后搅拌均匀，形成混合胶体；

S2、抽取所述混合胶体内的气泡；

S3、将片状的模具叠置于培养盒的底壁，再将抽取气泡后的所述混合胶体倒入所述培养盒内，加热干燥至所述混合胶体固化成型即可形成培养器；

S4、取出所述培养器后，将所述模具与所述培养器分离后，所述培养器的底面形成培养槽；用打孔器对所述培养槽的顶壁打出输入孔和输出孔，并使得所述输入孔和所述输出孔分别贯穿所述培养器。

在一个实施例中，所述培养盒为培养皿，所述模具为玻片。

在一个实施例中，步骤S2中，多个所述模具分别叠置于所述培养盒的底壁并间隔设置；

在步骤S4中，将多个所述模具与所述培养器分离后形成多个所述培养槽，用打孔器对多个所述培养槽的顶壁分别打出所述输入孔和所述输出孔。

在一个实施例中，至少两个所述模具沿竖直方向叠置。

在一个实施例中，至少两个所述模具的尺寸不同。

在一个实施例中，步骤S3，加热温度70°-80°，时间60min-70min。

本发明还涉及一种细胞培养方法，包括步骤：

a.对权利要求2所述的培养装置进行清洁处理，去除所述培养装置表面的杂质和残留物；

b.将所述培养器和所述培养盒进行灭菌处理；c.将所述培养器放置于所述培养盒内；

d.将培养基从所述输入口移入所述培养槽内。

根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养器由聚二甲基硅氧烷制成；步骤a中，将所述培养器放置于磷酸缓冲盐溶液中浸泡预设时间，去除所述培养器表面的杂质和残留物，然后再将所述培养器放置于去离子水中超声清洗，以确保所述培养皿表面的洁净度。

在一个实施例中，步骤b中，将所述培养器灭菌后，还需使用灭菌滤纸将所述培养器擦干。

本发明针对这些问题，开发了一种由弹性透明材质制成培养器，用于固定组织并进行原代细胞的培养。该装置采用小体积的培养槽和透气性的材料，能够降低污染风险，并减少培养基的消耗。使用该装置可以更好的固定微小组织，可以提高原代细胞的存活率和增殖率，同时为组织提供更接近原生状态的微环境条件。通过优化固定和培养方法，本发明有望改善组织固定与培养的效果，为细胞学和生物学研究提供更可靠的实验平台。此外，小型的培养槽还可以减少培养基和容器的使用，从而降低成本。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的培养器的示意图。

图2是图1所示实施例的培养器的剖视图。

图3是本发明的另一个实施例的培养器的示意图。

图3a是本发明的另一个实施例的培养器的示意图。

图4a是小鼠脑组织原代培养的培养基成分。

图4b是三种规格培养器和24孔板内的小鼠脑组织原代培养第四天时细胞生长图。

图5是三种规格培养器和24孔板内的小鼠脑组织原代培养收获细胞量的对比图。

图6a是在单位体面积中，三种规格培养器和24孔板内的细胞收获数与总细胞数对比图。

图6b是单位体积培养基下，三种规格培养器和24孔板内的细胞收获数与总细胞数对比图。

图7是三种规格培养器和24孔板内第八天的小鼠脑组织原代培养细胞的神经球培养效果图。

图8是牙髓组织在24孔板和0.17mm深度培养槽内的培养情况。

图9是牙髓组织在24孔板和0.17mm深度培养槽内的培养的阳性克隆率和单位体积以及单位面积的细胞数。

图10是牙髓组织在96孔板和0.2mm深度培养槽内的培养情况。

图11是牙髓组织在96孔板和0.2mm深度培养槽内的培养情况及细胞爬出比率。

图12是牙髓组织在96孔板和0.2mm深度培养槽内的细胞数。

图13是牙髓组织在96孔板和0.2mm深度培养槽内的细胞爬出比率。

图14是牙髓组织在96孔板和0.2mm深度培养槽内的细胞数。

图15是牙髓组织第六天在96孔板和0.2mm深度培养槽内的细胞。

附图标记：100、培养器；1、培养槽；2、输入孔；3、输出孔。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

除非语境有其它需要，在整个说明书和权利要求中，词语“包括”和其变型，诸如“包含”和“具有”应被理解为开放的、包含的含义，即应解释为“包括，但不限于”。

以下将结合附图对本发明的各实施例进行详细说明，以便更清楚理解本发明的目的、特点和优点。应理解的是，附图所示的实施例并不是对本发明范围的限制，而只是为了说明本发明技术方案的实质精神。

在整个说明书中对“一个实施例”或“一实施例”的提及表示结合实施例所描述的特定特点、结构或特征包括于至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个位置“在一个实施例中”或“在一实施例”中的出现无需全都指相同实施例。另外，特定特点、结构或特征可在一个或多个实施例中以任何方式组合。

如该说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一”和“所述”包括复数指代物，除非文中清楚地另外规定。应当指出的是术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用，除非文中清楚地另外规定。

在以下描述中，为了清楚展示本发明的结构及工作方式，将借助诸多方向性词语进行描述，但是应当将“前”、“后”、“左”、“右”、“外”、“内”、“向外”、“向内”、“上”、“下”等词语理解为方便用语，而不应当理解为限定性词语。

本发明涉及一种培养装置及其培养器100，该培养装置包括培养盒和培养器100，其中，培养盒具有容纳空间且顶部开口，培养盒可选包括但不限于24孔板、96孔板、12孔板、6孔板和培养皿等，本发明并不限制培养盒的具体实施方式。

该培养器100为弹性透明材质制成，弹性透明材质包括橡胶类，优选聚二甲基硅氧烷，聚二甲基硅氧烷无毒且具有超高分子量、低粘度和独特的流动性等特点，由聚二甲基硅氧烷制成的培养器100还具有一定的韧性，且相容性好、透明度高，非常适宜培养细胞。

培养器100可放置于培养皿内，或将六个培养器100分别放置于6孔板的六个孔内。以培养皿为例，培养器100的底面紧贴于培养皿的底壁，培养器100的侧壁紧贴于培养盒的内侧壁。

具体地，该培养器100可以柱体，例如圆柱体结构或四棱柱体结构，本发明不限制培养器100的具体结构，培养器100的结构需要和培养盒的容纳空间匹配即可。

在图1和图2所示的实施例中，培养器100为圆柱体结构，可以放置于培养皿内。可根据培养皿外径的尺寸设置培养器100的尺寸，即培养器100的外径需匹配培养皿的内径。培养器100的高度优选小于培养皿的深度，培养器100的高度范围优选0.5cm-1cm，包括但不限于0.5mm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm和1cm。在培养器100的制造过程中，适宜的厚度能方便地将培养器100从培养皿脱模，且可以使得培养器100严丝合缝放入培养皿，每个培养槽之间基本不会有培养基交流。培养器100设有培养槽1、输入孔2和输出孔3，其中，培养槽1由培养器100的底面凹陷形成，培养槽1的内壁形状可以为四棱柱体或其他柱体结构，培养槽1的深度也可以根据需要设置，本发明不限制培养槽1的具体形状。

在图1和图2的实施例中，培养槽1为圆柱体结构。该培养槽1的深度范围优选0.1mm-2mm，可选包括0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm和2mm。此外，在图1和图3所示的实施例中，培养器100的底面设置三个培养槽1，三个培养槽1均匀间隔设置且形状相同。应理解，也可以设置更多个培养槽1，且多个培养槽1的形状可以不相同，多个培养槽1的深度也可以根据需要设置，以适应不同的细胞培养需求。

作为优选实施例，如图3所示，三个培养槽1均为长条形的四棱柱体结构，且每个培养槽1的长度大于其高度。培养槽1的长度可以根据培养器100的径向尺寸设置，只要不大于培养器100的径向尺寸即可。培养槽1的宽度也可以根据培养槽1的数量设置，多个培养槽1间隔设置且不超出培养器100的外径即可。在图3a所示的实施例中，多个培养槽1中，部分培养槽1为长条形的四棱柱体结构，还有图1所示实施例中的圆柱体结构。当然，在其他实施例中，培养槽1的形状也可以设置成其他形状，本发明不限制培养槽1的具体形状。

输入孔2为沿竖直方向延伸的通孔，输入孔2可以看作培养槽1的顶壁凹陷至培养器100的顶面形成的通孔。输入孔2是培养基进入培养槽1的通道，可以通过移液枪将培养基从输入孔2加入培养槽1内。输入孔2的直径范围优选为0.5mm-1.5m，移液过程中，移液枪可将输入孔2撑开，移液后，输入孔2受到挤压后会变小，既可以方便将培养基轻松移入培养槽1内，又可以防止过多空气或杂质从输入孔2进入培养槽1内。

输出孔3和输入孔2的形成方式基本一致，都是从培养槽1的顶壁凹陷至培养器100的顶面形成。输出孔3与输入孔2间隔设置且直径大于输入孔2。细胞培养过程中，需要更换营养液，换液时，可通过移液枪将营养液从输入孔2加入培养槽1，将旧的营养液从输出孔3排出。所以为了方便液体从输出孔3顺利排出，输出孔3的直径需大于输入孔2的直径。作为优选方案，输出孔3的直径范围1.5mm-2.5mm，该范围内的输出孔3可以将液体顺利排出，也可以避免细胞培养过程中，防止培养基的过度蒸发，还可以避免杂质从输出孔3进入培养槽1内。

每个培养槽1均和一个输入孔2和一个输出孔3连通，每个输入孔2和输出孔3经常该对应的培养槽1的顶壁凹陷至培养器100的顶面形成，且每个培养槽1的输入孔2均和输出孔3间隔设置。也就是说，输入孔2、输出孔3和培养槽1的数量一一对应。

本发明还涉及一种培养器100的加工方法，具体包括步骤：

S1、将硅类聚合体和交联剂按比例混合后搅拌均匀，形成混合胶体，硅类聚合体和交联剂按比例一般为10:1；

S2、对混合胶体真空抽取，以去除混合胶体内的气泡，确保混合胶体无气泡；

S3、将片状的模具叠置于培养盒的底壁，再将抽取气泡后的混合胶体注入培养盒内，即混合胶体覆盖片状模具，在放置于金属热块加热，加热温度70°-80°，时间60min-70min。加热干燥至所述混合胶体固化成型即可形成培养器100；

混合胶体注入培养盒内的厚度主要影响培养器100的厚度，也就是培养器100的高度，培养器100的厚度决定其硬度，培养器100的厚度越小其越软，更易脱模打孔等后续操作。培养器100的厚度越大越硬，不方便脱模，但是能更好地分割每个孔，保证每个孔的独立性。所以培养器100的厚度优选0.5cm-1cm。

S4、取出所述培养器100后，将所述模具与所述培养器100分离后，固化后的培养器100与培养盒分离，小心地揭下培养器100，注意不要损坏培养盒，然后使用镊子将模具等小心取出。模具取出后，培养器100的底面形成培养槽1；用打孔器对所述培养槽1的顶壁打出输入孔2和输出孔3，并使得所述输入孔2和所述输出孔3分别贯穿所述培养器100。

在步骤S4中，将多个所述模具与所述培养器100分离后形成多个所述培养槽1，用打孔器对多个所述培养槽1的顶壁分别打出所述输入孔2和所述输出孔3。

在步骤S3中，培养盒可以为多孔板或培养皿。选择适当的外模具大小可以确保模具与细胞培养设备的兼容性，并提供足够的培养区域。

以培养皿为例，片状的模具可以选用玻片或其他的金属片，将多个玻片间隔放置于培养皿的底壁上，为了增加培养槽1的厚度，可以将两个、三个或更多个玻片沿竖直方向叠置。当然，也可以将部分玻片叠置，其他单个玻片叠置于培养皿的底壁，以形成不同深度的培养槽1。也可以选用不同尺寸的模具以形成不同尺寸的培养槽1。通过调整模具的大小和形状，可以根据组织的尺寸和形态来定制模具，以适应不同的细胞培养需求。

培养器100的厚度可以通过控制混合胶体的用量来调节。不同的厚度会对培养器100的性能和变形程度产生影响。较厚的培养器100操作起来更简单，并且在培养过程中减少了培养基的蒸发，同时也更不容易发生变形等问题。因此，在制作培养器100时，可以根据实验要求和操作的便利性来选择合适的培养器100厚度。通过根据不同组织的要求调整培养器100的参数，可以定制出适用于特定实验的培养器100。这些可变的参数可以根据实验需求进行灵活调整，以确保培养器100的性能和使用效果符合研究的目标和要求。

本发明还涉及一种细胞培养方法，包括步骤：

a.使用上述配置装置，先对培养器100和培养盒进行清洁处理，去除培养器100表面的杂质和残留物；对于聚二甲基硅氧烷制成的培养器100来说，可以用磷酸缓冲盐溶液清洁培养器100，可以将培养器100放置于磷酸缓冲盐溶液中浸泡预设时间，去除培养器100表面的杂质和残留物，然后再将所述培养器100放置于去离子水中超声清洗，以确保所述培养皿表面的洁净度。

b.将所述培养器100和所述培养盒进行高温灭菌处理，这样可以有效地杀灭残留在模具表面的微生物，减少污染的风险；将高温灭菌后的培养器100和培养盒取出，并使用无菌滤纸轻轻擦干，确保表面干燥，此操作可减少后续加液过程中培养槽产生的气泡；

有特殊培养表面需求的细胞，可将所述培养盒的内壁涂抹细胞粘附剂，该细胞粘附剂可以为胶原蛋白或其它细胞黏附物质，以增强细胞的附着和生长；

c.用无菌镊子将培养器100放置于所述培养盒内，该培养盒可以为培养皿或孔板内，确保确保培养器100与孔板或培养皿内壁完全贴合，并确保没有空隙或松动；

d.将培养基从所述输入口移入所述培养槽1内。具体地，用移液枪的枪头，准确地插入到输入口底部，确保尖端位于培养槽1内部。从输入孔2加入预先调节好密度的培养基，注意控制加入的体积，以确保培养基充满整个培养槽1。

在加入培养基的过程中，要注意排空气泡，以确保培养基填充培养槽1并与细胞接触良好。可以通过缓慢注入和轻轻振动培养器100来帮助排除气泡。确保所有的培养槽1都被培养基填满，并确保培养基的均匀分布。

通过严格遵循无菌操作流程，正确安装培养器100并加入含组织的培养基，可以确保细胞在培养槽1中得到良好的培养条件。这些步骤的实施将有助于减少污染和细胞的损伤，同时提高实验的可靠性和重复性。

在细胞培养的过程中，原代组织的贴壁能力通常是细胞成功培养和扩增的关键因素之一。许多原代组织，尤其是来源于成年动物或人体的组织，存在贴壁能力较差的问题。传统的贴壁培养方法无法有效分离和扩增组织中的干细胞，且传统的原代细胞锚定方法(如玻璃片压制)可能导致组织损伤和细胞失活。此外，常规的固定组织和原代细胞方法可能对组织结构和细胞完整性造成伤害，影响实验结果的准确性。为了改善实验的可重复性和可靠性，我们开发一种培养器100来减少组织和细胞的损伤，并开发出增强贴壁性的细胞培养方法，以更好地保留组织的原有特性，并提高细胞的存活率和增殖能力。

对于干细胞的原代培养，需要考虑到许多因素，如细胞外基质(ECM)成分、细胞-细胞相互作用、氧气、营养物质等，以确保干细胞能够保持其特性和功能。本发明的培养器100可以设置多个小型的培养槽1，小型的培养槽1能够提供更小体积、更接近原生状态的培养环境，有助于更准确地模拟体内条件。根据Bersini等人的研究，小体积培养装置可以更好地模拟细胞外基质成分、细胞-细胞相互作用、氧气水平和营养物质供应等因素，促进更真实的实验结果和研究发现。同时，对于一些原代组织，尤其是组织量少的人体组织，传统大体积贴壁培养在组织贴壁，培养基体积等方面仍然存在较多限制。

传统组织固定方式及常规体积培养存在许多缺点。例如，玻片贴壁培养需要将组织样本压在玻片下，这容易导致细胞的机械创伤和死亡，同时阻碍营养物质及气体的交换。此外，这种方法需要大量的培养基和有限的培养面积，增加了成本和操作麻烦。常规体积培养中，培养基相对组织量较多，导致组织细胞排列稀疏，影响了细胞之间的相互作用和通信，尤其是对于干细胞的增殖和干性维持。

本发明针对这些问题，开发了一种由弹性透明材质制成的培养器100，用于固定组织并进行原代细胞的培养。该装置采用小体积的培养槽1和透气性的材料，能够降低污染风险，并减少培养基的消耗。使用该装置可以降低细胞的机械创伤和死亡率，并提供更接近原生状态的微环境条件，可以提高原代细胞的存活率和增殖率，同时为组织提供更接近原生状态的微环境条件。通过优化固定和培养方法，本发明有望改善组织固定与培养的效果，为细胞学和生物学研究提供更可靠的实验平台。此外，小型的培养槽1还可以减少培养基和容器的使用，从而降低成本。

下面两个实验是为了验证本发明的培养器100的细胞培养的效果而设计。

实验一：培养小鼠脑组织。

在原代组织的培养中，组织量对原代培养的成功率非常重要。首先以容易获得较多的脑组织进行培养测试，观察在成功率高的情况下，培养器100对原代细胞的培养影响。我们采用出生24小时内的小鼠海马组织来分离神经祖细胞(简称NPC)，该细胞在海马组织中较为丰富，原代培养成功率高。

下面为小鼠取材和组织前处理及培养的过程：

1.准备小鼠NPC培养基，该培养基成分如图4a所示，P0新生小鼠准备：选用代号为C57BL/6J的孕鼠，待其生产后于24小时内对新生鼠海马组织进行取材。

2.使用75％(体积分数)酒精对新生健康小鼠消毒，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于含1％青霉素-链霉素混合液的杜氏磷酸盐缓冲液(简称DPBS缓冲液)的平皿中(下置冰盒)。

3.无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有2#培养基的平皿中。

4.用虹膜剪将组织剪切成小于1mm³的组织块，并用无菌的200目筛网对组织进行研磨过滤，对获得的组织进行体积定量，定量后用2#培养基重悬至工作浓度。

5.将准备好的无菌培养器100置于培养盒中，该培养盒选用6孔板，确保培养器100的培养槽内无液体，且培养器100下边缘与孔的底壁完全贴合无缝隙。将适量的组织分别加入培养槽1内，并分别设置培养器100内2倍、5倍稀释的少量组织培养组，及相应的24孔板内正常条件对照组进行对比测试。此外，本实验三种规格的培养器100以及24孔板作为对比实验，三种规格的培养器100的培养槽的深度分别为0.2mm、0.5mm和1mm。

培养过程中每三天对细胞进行一次换液，保证细胞生长所需营养充足。

NPC的传代培养及鉴定

图4b是经过对小鼠脑组织原代培养第四天时细胞生长观察后深度为0.2mm培养槽、0.5mm培养槽和1mm培养槽以及24孔板的细胞生长情况，如图4b所示，当脑组织接种量为2.5uL时，采用三种规格的培养器100及24孔板内都有大量的细胞长出，此浓度为最高组织量培养浓度。当脑组织接种量为0.5uL时，可见24孔板内细胞生长不均匀且有较多空隙，而培养器100的培养槽1内的细胞生长均匀，细胞汇合度达80％以上。当脑组织接种量为0.25uL时，24孔板内细胞生长状态不佳，且细胞多为散落分布，组织块周围少见细胞爬出。培养槽中细胞多于组织周围生长，汇合度高于24孔板，且形态较为均一，分布均匀。

图5是三次平行重复实验中各组P0细胞数目汇总对比，可以看到2.5ul组织量组，24孔板获得的细胞最多；而在组织量急剧减少的情况下，0.25ul组织量组，各个培养器100组收获的细胞却比24孔板组更多。

图6a和图6b是鼠脑组织原代培养单位面积及单位体积收获细胞量的对比，经过进一步对数据进行分析，可以看到，在单位体面积中，细胞收获数与总细胞收获数变化趋势相似，如图6a。而在单位体积培养基下，低体积培养的培养槽方案有更高的细胞量，0.25ul组织量组更是相差30倍以上，如图6b。

下面是小鼠NPC的成球培养，以验证细胞纯度。

将原代培养出来的细胞进行传代贴壁培养，连续传代三次对细胞进行纯化，得到较为单一的细胞。将收获的细胞培养在组织培养处理(简称TC处理)的24孔板中，图7为第八天时神经球的培养情况，由结果可知培养器100及24孔板培养出的细胞均可以经过悬浮培养成为神经球，证明了NPC的纯度在可接受的标准范围中，且培养器100不会对细胞的分化能力和特性产生显著影响。

在这部分实验中，我们对使用培养器100与传统的24孔培养板进行培养的细胞进行了比较，发现培养器100在低组织量下表现出明显的优势，能够获得更多的细胞。此外，培养器100的使用促进了细胞的均匀生长，提高了细胞汇合度，使细胞分布更均匀。这对于维持细胞状态、减少细胞损失以及确保实验的一致性非常重要。另一个显著的发现是，相同体积下，培养器100获得的细胞数量更多，这意味着在相同的实验条件下，培养器100需要的培养基更少，从而节约了实验成本。此外，我们推测培养器100的使用可能创造了更好的细胞微环境，促进了细胞增殖。

实验二：牙髓干细胞培养

牙髓间充质干细胞是存在于人体牙髓组织中的一种多能干细胞，具有较高的再生能力和多向分化潜能，因此被广泛用于组织工程和再生医学等领域，因此本发明还使用牙髓组织验证培养器100的效果。

培养前装置：

培养器100的制备：首先，按照小鼠牙髓组织的特性定制大小适合的培养器100，然后进行脱模和高压灭菌处理。高压灭菌可以有效杀灭模具表面的细菌和病毒，减少细胞培养的污染风险。

培养前处理：灭菌后的培养器100存放于纯水或者磷酸盐缓冲液(简称PBS)中，将培养器100提前拿出，用无菌的滤纸吸干表面水分，因为含有水滴会在后续加入培养基时引入气泡。

下面是小鼠牙髓取材、组织前处理及培养过程：

组织清洗和分离：脱颈处死小鼠，剪开头部并剖出小鼠下门牙(包含下颌骨)，仔细去除周围的组织，减少其他组织的污染。

将小鼠门牙置于含有稀释到工作浓度的抗生素的PBS中，进行多次清洗，以去除表面的血迹和污染。用外科刀沿着牙的形状，在牙根部小心翼翼地撬开骨质部分，暴露出其中的牙髓组织。谨慎地取出末端牙髓组织，保留根部干细胞较多的部分，约为1mm-2mm。

收集足够的组织，转移到1.5ml离心管盖上，滴加约10ul完全培养基(培养基+20％胎牛血清+1％青霉素-链霉素混合液)，用显微剪将组织尽可能剪碎，然后加入约200ul培养基，收集到离心管中，4°或冰上保存待用。

培养器100中的细胞培养：将提前晾干的培养器100放置于培养皿内，分离出的小鼠牙髓组织悬液按照30ul/孔分别加入培养器100(培养槽深度为0.17mm)以及对照的24孔中，添加培养基时应当小心加入，防止培养槽出现气泡。

在培养过程中，约每3天更换培养基，以提供足够的营养以支持细胞的增殖和分化，并对细胞进行观察和记录。若培养基蒸发较快，也可放置于湿盒中，再将湿盒放置于培养箱中。

将培养器100培养的细胞与传统贴壁培养的对照进行比较，以评估培养器100培养的效果。

细胞消化传代：当细胞生长至足够数量时，需要进行消化传代。消化时，可以使用稀释的胰蛋白酶或其他消化酶将细胞从培养皿或培养器100中分离出来，然后将其移植到新的培养皿中进行下一轮培养。在细胞传代的过程中，需要注意细胞密度和消化时间的控制，以确保细胞的健康生长和稳定性。

牙髓干细胞传代及培养鉴定。

原代培养的多组织以及细胞形态：将组织悬液加入培养器100的0.17mm深度的培养槽和24孔板中后，组织碎片会沉降在培养皿底部。相较于24孔板，培养器100能更好的使组织固定，进而促进贴壁的干细胞爬出组织。如图8所示，在培养的不同时间点，培养器100中的细胞爬出更快，克隆大小明显更大。在第二天时，已经能看到培养器100组的组织开始细胞爬出，而在第五天已经增殖出较多细胞。

在培养后第12天，计算总的阳性克隆数，对比发现培养槽内的组织都在40％左右的组织爬出了干细胞克隆，而24孔板的阳性克隆率只有8％-25％左右，如图9A。对当克隆增值到可以传代时(一般是10-13天)，将细胞消化下来进行计数，培养槽中可以达到6*10⁴/cm²左右，如图9B所示，而24孔板培养的组织总收获量在3*10⁴/cm²，差值可达2倍。而按照相对体积，如图9C所示，培养器100内的体积可达到1.08*10⁷/ml,而24孔板培养的则只有2.8*10⁵/ml，相差50倍左右。

为了进一步验证培养器100对原代组织的作用，加入了96孔和0.2mm厚度的培养槽的对比，每一个96孔和0.2mm厚度的培养槽中加入一块大鼠牙髓组织，对比原代细胞的爬出程度、比率、已经后续细胞的获得数。

从图10像中可以清晰观察到，相较与96孔常规贴壁培养，培养槽中细胞的生长速度更快，数量更多，克隆的面积也更大。

图11是牙髓组织在96孔板和培养器100的培养情况及细胞爬出比率。图12是牙髓组织在96孔板和培养器100的细胞数。图13和图14分别是孔板和培养器100的细胞爬出比率以及细胞收获数。图15是96孔板和培养器100的细胞培养情况。

在培养后第6天，计算总的阳性克隆数，对比发现培养器100组的大鼠组织都爬出了干细胞，而96孔板的阳性克隆率只有65.38％左右。

当克隆增值到可以传代时，将细胞消化下来进行计数并常规培养。第6天时，培养器100内可以达到4.16*10⁵/cm²左右，而96孔板培养的组织总收获量在2.44*10⁵/cm²，差值可达2倍。在培养过程中，两组的细胞形态也基本相似。

在近乎相同培养浓度(2.1*10⁴/cm2～2.2*10⁴/cm²)的常规培养后，培养器100组第15天时可以达到3.77*10⁷，而96孔板培养的组细胞总收获量在1.17*10⁷，差值可达3倍。

在牙髓这种量少，难培养的原代培养实验中，培养器100展示出优秀的性能，在克隆数、细胞数都明显优于24孔板/96孔板的传统贴壁对照。可以推测培养器100的培养槽1培养在固定组织，促进贴壁的能力是最重要的因素，其次，培养槽1的小体积培养也对原代细胞的增殖有较高的促进作用。

可见对于类似于牙髓这样的贴壁难，组织量少的原代培养，培养器100的培养槽1固定培养是一个非常优良的选择。尤其对于临床的穿刺样本或者其他数量限制的组织，本方案对原代培养的成功率将有非常大的提升。

以上已详细描述了本发明的较佳实施例，但应理解到，若需要，能修改实施例的方面来采用各种专利、申请和出版物的方面、特征和构思来提供另外的实施例。

考虑到上文的详细描述，能对实施例做出这些和其它变化。一般而言，在权利要求中，所用的术语不应被认为限制在说明书和权利要求中公开的具体实施例，而是应被理解为包括所有可能的实施例连同这些权利要求所享有的全部等同范围。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种培养装置，其特征在于，所述培养装置包括：

培养盒，所述培养盒具有容纳空间且顶部开口；以及

培养器，所述培养器由聚二甲基硅氧烷制成且位于所述容纳空间内，所述培养器的底面紧贴所述培养盒的底壁，所述培养器的侧壁紧贴所述培养盒的内侧壁，所述培养器设有：

培养槽，所述培养槽由所述培养器的底面凹陷形成；

输入孔，所述输入孔由所述培养槽的顶壁凹陷至所述培养器的顶面形成；以及

输出孔，所述输出孔由所述培养槽的顶壁凹陷至所述培养器的顶面形成且与所述输入孔间隔设置。

2.一种培养器的加工方法，其特征在于，包括步骤：

S1、将硅类聚合体和交联剂按比例混合后搅拌均匀，形成混合胶体；

S2、抽取所述混合胶体内的气泡；

S3、将片状的模具叠置于培养盒的底壁，再将抽取气泡后的所述混合胶体倒入所述培养盒内，加热干燥至所述混合胶体固化成型即可形成培养器；

S4、取出所述培养器后，将所述模具与所述培养器分离后，所述培养器的底面形成培养槽；用打孔器对所述培养槽的顶壁打出输入孔和输出孔，并使得所述输入孔和所述输出孔分别贯穿所述培养器。

3.根据权利要求2所述的培养器的加工方法，其特征在于，所述培养盒为培养皿，所述模具为玻片。

4.根据权利要求2所述的培养器的加工方法，其特征在于，步骤S2中，多个所述模具分别叠置于所述培养盒的底壁并间隔设置；

在步骤S4中，将多个所述模具与所述培养器分离后形成多个所述培养槽，用打孔器对多个所述培养槽的顶壁分别打出所述输入孔和所述输出孔。

5.根据权利要求2所述的培养器的加工方法，其特征在于，至少两个所述模具沿竖直方向叠置。

6.根据权利要求5所述的培养器的加工方法，其特征在于，至少两个所述模具的尺寸不同。

7.根据权利要求2所述的培养器的加工方法，其特征在于，步骤S3，加热温度70°-80°，时间60min-70min。

8.一种细胞培养方法，其特征在于，包括步骤：

a.对权利要求2所述的培养装置进行清洁处理，去除所述培养装置表面的杂质和残留物；

b.将所述培养器和所述培养盒进行灭菌处理；c.将所述培养器放置于所述培养盒内；

d.将培养基从所述输入口移入所述培养槽内。

9.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养器由聚二甲基硅氧烷制成；步骤a中，将所述培养器放置于磷酸缓冲盐溶液中浸泡预设时间，去除所述培养器表面的杂质和残留物，然后再将所述培养器放置于去离子水中超声清洗，以确保所述培养皿表面的洁净度。

10.根据权利要求9所述的细胞培养方法，其特征在于，步骤b中，将所述培养器灭菌后，还需使用灭菌滤纸将所述培养器擦干。