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CN117903305B - 针对雌二醇的单克隆抗体、基于其的检测试剂及其应用 - Google Patents

针对雌二醇的单克隆抗体、基于其的检测试剂及其应用 Download PDF

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CN117903305B CN202311665026.3A CN202311665026A CN117903305B CN 117903305 B CN117903305 B CN 117903305B CN 202311665026 A CN202311665026 A CN 202311665026A CN 117903305 B CN117903305 B CN 117903305B
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Abstract

本发明涉及针对雌二醇(E2)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其相关核酸产品、细胞产品、检测试剂或试剂盒及其制备方法和应用。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能以高特异性、高亲和力结合E2，从而提高了E2的检测准确性和灵敏度；并且，本发明还开发了适用于双抗体夹心法免疫检测的高性能配对抗体，从而突破了传统竞争法检测试剂灵敏度低、临床相关性差的局限，实现了E2的双抗体夹心法免疫检测，对于卵巢疾病的早期诊断与治疗以及核心抗体原料的国产替代具有重要意义。

Description

针对雌二醇的单克隆抗体、基于其的检测试剂及其应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备及免疫学检测技术领域，具体涉及针对雌二醇(E2)的单克隆抗体、基于其的检测试剂及其应用。
背景技术
雌二醇(英文简称E2)是一种类固醇激素，主要由卵巢滤泡、黄体及妊娠时的胎盘分泌，其分子量约为272Da。雌酮(英文简称E1)，雌二醇(英文简称E2)和雌三醇(英文简称E3)都是体内雌激素的主要形式，E2是雌激素中含量最高、生物活性最强的激素，其主要作用是促进子宫内膜转变为增殖期以及促进女性第二性征的发育，在评价卵巢功能方面具有重要的临床意义。此外，E2对内分泌系统、心血管系统、人体的代谢、骨骼的生长等方面也均有明显影响。
E1与E2之间可以相互转化，E3为E2的代谢产物，三者在结构上极其相似，因此对抗体特异性要求较高。目前市面上的E2抗体大都存在交叉反应问题，尤其针对E1有较强的干扰。现有的E2免疫测定方法主要包括化学发光法、免疫层析法，而这些免疫检测方法主要采用竞争法的原理，试剂在特异性和灵敏度方面都有所欠缺，而且线性范围较窄，导致临床样本低值端和高值端区分度较小，从而对检测结果造成误判。
鉴于现有技术中存在的上述问题，目前急需开发针对E2的高特异性、高亲和力的单克隆抗体以满足免疫学检测的需求，特别是开发高性能的配对抗体，以突破传统竞争法的局限，实现双抗体夹心法检测E2尤为重要。
发明内容
发明目的
针对现有技术中存在的问题或需求，本发明的目的在于提供针对雌二醇(英文简称E2)的高特异性、高亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段，并开发适用于双抗体夹心法免疫学检测的高性能的配对抗体。
解决方案
为了实现上述目的，本发明经过大量的筛选获得了高特异性、高亲和力的针对雌二醇(英文简称E2)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其相关核酸及细胞产品，其制备方法和应用，以及基于其的免疫检测试剂，从而为E2的高特异性、高灵敏度免疫检测提供了基础。
具体地，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了针对雌二醇的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、AAS和SEQ ID NO:7所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(2)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15、GAT和SEQ ID NO:16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(3)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24、LAS和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(4)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:33、SAS和SEQ ID NO:34所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(5)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:39所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:42、SAS和SEQ ID NO:43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(6)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ IDNO:48所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:51、ATS和SEQ ID NO:52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(7)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:60、NAK和SEQ ID NO:61所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(8)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ IDNO:66所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:69、AAS和SEQ ID NO:70所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
(9)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ IDNO:75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:78、QMS和SEQ ID NO:79所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(10)重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQID NO:84所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ IDNO:87、AAS和SEQ ID NO:88所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或，
(2)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；或，
(3)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，
(4)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或，
(5)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；或，
(6)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列；或，
(7)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；或，
(8)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；或，
(9)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列；或，
(10)重链可变区，其具有如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
此外，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；优选地，所述恒定区为选自以下的任意一种：IgG、IgA或IgM抗体的恒定区。
进一步优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链，其具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；或，
(2)重链，其具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；或，
(3)重链，其具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列；或，
(4)重链，其具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:36所示的氨基酸序列；或，
(5)重链，其具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列；或，
(6)重链，其具有如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:54所示的氨基酸序列；或，
(7)重链，其具有如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:63所示的氨基酸序列；或，
(8)重链，其具有如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:72所示的氨基酸序列；或，
(9)重链，其具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:81所示的氨基酸序列；或，
(10)重链，其具有如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ IDNO:90所示的氨基酸序列。
上述第一方面中，以第(1)～(10)项所限定的单克隆抗体在下文中分别命名为抗体1～10。
在一些可行的实施方案中，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
第二方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。该多核苷酸不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
第三方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，以及，任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第四方面，本发明提供了一种重组载体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，或者如上述第三方面所述的核酸构建体。
本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，例如，可以是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在一些优选的实施方案中，所述重组载体为重组表达载体，优选为真核表达载体。
第五方面，本发明提供了一种转化的宿主细胞，其中转化有如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的重组载体；
所述宿主细胞包括但不限于：原核细胞，例如大肠杆菌细胞；真核细胞，例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。所述宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞系。
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，进一步优选为哺乳动物细胞。
第六方面，本发明提供了如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的重组载体和/或如上述第五方面所述的转化的宿主细胞在制备用于检测雌二醇的检测试剂或试剂盒中的应用。
在可行的实施方案中，所述样品为受试者的生物学样品，优选为受试者的血清或血浆样品。
第七方面，本发明提供了选自如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的任意两种单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测雌二醇的检测试剂或试剂盒中的应用。
优选地，所述两种单克隆抗体或其抗原结合片段选自：
(I)抗体1或其抗原结合片段，以及抗体2或其抗原结合片段；
(II)抗体3或其抗原结合片段，以及抗体4或其抗原结合片段；
其中，抗体1或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(1)项所定义，抗体2或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(2)项所定义，抗体3或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(3)项所定义，抗体4或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(4)项所定义。
第八方面，本发明提供了一种用于检测雌二醇的检测试剂，其包括如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的重组载体和/或如上述第五方面所述的转化的宿主细胞。
作为优选，所述检测试剂为双抗体夹心免疫检测试剂盒，其包含选自如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的任意两种单克隆抗体或其抗原结合片段，优选包含选自以下的两种单克隆抗体或其抗原结合片段：
(I)抗体1或其抗原结合片段，以及抗体2或其抗原结合片段；
(II)抗体3或其抗原结合片段，以及抗体4或其抗原结合片段；
其中，抗体1或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(1)项所定义，抗体2或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(2)项所定义，抗体3或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(3)项所定义，抗体4或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第(4)项所定义。
在可行的实施方案中，所述双抗体夹心免疫检测试剂盒包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条基于双抗体夹心法原理、以选自如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任意两种单克隆抗体或其抗原结合片段分别作为捕获抗体和检测抗体；
在一些优选实施方案中，所述免疫层析试纸条以(1)抗体1或其抗原结合片段和(2)抗体2或其抗原结合片段中的任意一种作为捕获抗体，并以另外一种作为检测抗体；进一步优选地，所述免疫层析试纸条以抗体1或其抗原结合片段作为检测抗体，以抗体2或其抗原结合片段作为捕获抗体；
在另一些优选实施方案中，所述免疫层析试纸条以(1)抗体3或其抗原结合片段和(2)抗体4或其抗原结合片段中的任意一种作为捕获抗体，并以另外一种作为检测抗体；进一步优选地，所述免疫层析试纸条以抗体3或其抗原结合片段作为检测抗体，以抗体4或其抗原结合片段作为捕获抗体；
优选地，作为检测抗体的所述单克隆抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物；此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在优选的具体实施方案中，所述可被检测的标记物为荧光微球、乳胶微球或胶体金颗粒，优选为胶体金颗粒。
第九方面，本发明提供了一种制备如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使如上述第五方面所述的转化的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
第十方面，本发明提供了一种检测雌二醇在样品中的存在或其水平的方法，所述方法包括使用如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的转化的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的检测试剂。
在可行的实施方案中，所述样品包括但不限于来自受试者的血清，血浆等。
该方法可用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
使用单克隆抗体或其抗原结合片段来检测目标抗原在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
有益效果
本发明的针对雌二醇的单克隆抗体可以高亲和力、高特异性与雌二醇结合(其结合活性EC50均达到ng/ml级别，KD均在10-10M～10-11M)，实现了雌二醇的高准确性、高灵敏度检测；并且，本发明还开发了适用于双抗体夹心法免疫学检测的高性能配对抗体，从而突破了传统竞争法检测试剂灵敏度低、临床相关性差的局限，实现了雌二醇的双抗体夹心法免疫检测，该检测方法具有更高的特异性和灵敏度，其临床符合率在0.95以上。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明实施例3所表达和纯化的10株抗E2单克隆抗体的SDS-PAGE检测的凝胶图；其中，M表示分子量Marker的电泳条带，泳道1显示还原条件下各单克隆抗体的电泳条带，泳道2显示非还原条件下各单克隆抗体的电泳条带。
图2为本发明实施例3所表达和纯化的10株抗E2单克隆抗体与E2偶联蛋白的结合活性检测结果图，如实施例4所检测的。
图3为本发明实施例5所制备的胶体金免疫层析试纸条的构造图；其中，1为PVC底板；2为样品垫；3为硝酸纤维素膜；4为金线；5为检测线；6为质控线；7为吸水垫。
图4为基于本发明两种配对抗体的两种胶体金免疫层析试纸条与罗氏检测试剂的临床样本相关性的结果图，如实施例6所检测的；其中，图4A为基于E2 mAb1+E2 mAb2配对抗体的胶体金免疫层析试纸条1的结果图，图4B为基于E2 mAb3+E2 mAb4配对抗体的胶体金免疫层析试纸条2的结果图。
具体实施方式
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，包括但不限于±5％、±2％、±1％和±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
如本文所用，术语“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包容性的，即，包括数量或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，额外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语下，例如“只有一个”或“的确一个”或者在权利要求中使用“由...组成”时，将指的是仅列出的一个数字或列表的一个元素。
术语“百分比(％)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。
术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scFv多肽在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域和另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10-9M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明本发明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1：针对E2的单克隆抗体的制备
(1)动物免疫：
以偶联蛋白E2-BSA(购自南京铭研生物科技有限公司，货号MY-E2-001)作为抗原，将其与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，经腹腔注射以免疫小鼠(品种：Balb/c，雌性，6-8周龄)，以两周时间间隔进行加强免疫，共免疫3次，末次加强免疫后5-8天，采微量尾血，用ELISA法检测血清效价，当血清效价达到＞128K的标准时，进行脾脏单细胞悬液的制备。
(2)脾脏单细胞悬液制备：
小鼠颈椎脱臼处死，在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。将脾脏置于细胞滤网上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液。另取15mL无菌试管，先加入细胞分离液Ficoll，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，分离液和细胞悬液的体积比为1：2。置于离心机中2000转/分钟，室温离心20分钟，离心后取出试管，可以看到不同的分层，吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外15mL无菌试管中，于离心机中1500转/分钟，室温离心10分钟，小心去除上清液后重悬细胞。
(3)获取单个B细胞：
利用制备好的脾脏单细胞悬液，通过对抗原标记，使用单细胞芯片筛选平台进行细胞筛选，以获得具有抗原特异性的B细胞。
通过上述步骤，共获得10株针对E2的单克隆抗体，经鉴定，其均为IgG抗体，分别称为E2 mAb1～E2 mAb10。以下实施例中，检测了其中10株单克隆抗体的轻、重链基因序列，并进行了表达、纯化和结合活性检测。
实施例2：针对E2的单克隆抗体的轻、重链基因序列的获得
cDNA制备：
将实施例1中分选获得的10株B细胞分别进行RNA提取，以RNA为模板进行反转录获得cDNA，并用PCR的方式扩增抗体的轻、重链的基因；
轻、重链基因的获取：
利用鼠源特异性的引物进行扩增，分别将扩增到的DNA序列克隆至载体中，然后进行转化涂板，挑取克隆、提取质粒进行测序，获得10株抗体的轻、重链基因序列；根据测得的各抗体的轻、重链基因序列，推导获得各抗体的轻、重链的氨基酸序列；具体地，抗体E2mAb1～E2 mAb10的重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、14、23、32、41、50、59、68、77、86所示，其轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、18、27、36、45、54、63、72、81、90所示；
轻、重链可变区基因序列的分析：
根据测序结果对VH及VL进行分析，最终获得轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区的氨基酸序列。
10株单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如下所示，其中，下划线为其CDR区。
E2 mAb1：
VH(SEQ ID NO:4)
QIQLIQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINT ETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGLGSYYFDYWGQ GSILTVSS；
VL(SEQ ID NO:8)
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASALDS GVPKRFSGSGSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPLTFGAGTKLELK；
E2 mAb2：
VH(SEQ ID NO:13)
EVLLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPN NDVTIYNQKFKGKATLTVDMSSSTSYMELRSLTSEDTAVYYCARRHYYGLYYFDYW GQGTTLTVSS；
VL(SEQ ID NO:17)
DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLE IGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK；
E2 mAb3：
VH(SEQ ID NO:22)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINT ETGEPTYEDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARSRGFLLPYYFDYW GQGTTLTVSS；
VL(SEQ ID NO:26)
DIVLTQSPASLDVSLGQRVTISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLA SNLESGVPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRGFPLTFGAGTALEVK；
E2 mAb4：
VH(SEQ ID NO:31)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAKETAYGSQSPWYFDVWGAGTTVTVSS；
VL(SEQ ID NO:35)
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRCSGVPDRFTGSGSGTDFTLTVTNVQSEDLAEYFCQQYNSYPFTFGSGTKLEIK；
E2 mAb5：
VH(SEQ ID NO:40)
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTSYWIQWVKQRPGQGLGWIGEIFPGTGTTYYNEKFKGKATLTIDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARGDYGSRSNYYAMDYWGQGTSVTVSS；
VL(SEQ ID NO:44)
DIVMTQSQKFVSTSVGDRVSVTCKASQNVGTTVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLTEYFCQQYSGYPYTFGGGTKLEIK；
E2 mAb6：
VH(SEQ ID NO:49)
QVQLQQSGADLVKPGASVKLSCGFTFSTYAIEWLKQRPGHGLEWIGQISGGASYTNYNAKFKDKATFTADTSSNTAYMQLLSLTSEDSGVYYCARHDYYGSNYDSFDYWGQGSTLTVSS；
VL(SEQ ID NO:53)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCSSLSYLAWYQQKQGKSPQLLVYATSTLADGVSSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQQWSSIPPTFGGGTKLEIK；
E2 mAb7：
VH(SEQ ID NO:58)
EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGVTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARRGYDGYYYFDYWGQGTTLTVSS；
VL(SEQ ID NO:62)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIQNYLAWYQQKQGKSPQLLLYNAKALTDGVPSRFSGSGSGTQYYLKINSLQPEDFGTYYCQHFWSTPWTFGGGTKVEIK；
E2 mAb8：
VH(SEQ ID NO:67)
QAQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTSSWMEWAKQRPGQGLEWIGEIHP NSGNTNYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARSGYDGSWFAYW GQGTLVTVSA；
VL(SEQ ID NO:71)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSLMQWYHQKPGQPPKLLIYAA SNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEGDDIAMYFCQQSRLVPWTFGGGTKLEIK；
E2 mAb9：
VH(SEQ ID NO:76)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFIFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATISDG GSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAIYYCARDRYNYDEGAFDY WGQGTTLTVSS；
VL(SEQ ID NO:80)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKNLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQ MSNLASGVPDRFSNSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIK；E2 mAb10：
VH(SEQ ID NO:85)
EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQTHGKSLEWIGDINPN SGITIYNQKFKGKATLTVDKSSGTAYMELRSLTSDDTAVYYCARGTTGTLYFDYWG QGTTLTVSS；
VL(SEQ ID NO:89)
DIQMIQSPSSLSASLGERVSLTCRTSQEISGFLSWLQQKPDGTIKRLIYAASALDSG VPKRFSGSGSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPPTFGGGTKLEIK。
实施例3：针对E2的单克隆抗体的表达和纯化
(1)培养N293悬浮细胞，当密度达到(1-3)×106个细胞/ml且成活率＞80-90％时，进行细胞转染；
(2)按照实施例2中测得的10株单克隆抗体E2 mAb1～E2 mAb10的轻、重链基因序列合成其轻、重链基因，并将合成的轻、重链基因分别构建入pcDNA3.4质粒；然后，将含抗体轻、重链基因的重组质粒转染N293细胞，转染条件为：PEI/质粒的质量比为3:1，按照2μg质粒/1mlN293细胞的比例转染；
(3)转染后5-7天，收集细胞上清，用Protein A树脂进行亲和纯化，获得高纯度的单克隆抗体，并通过透析将洗脱缓冲液置换成PBS，利用Nanodrop测定抗体浓度；
接下来，通过SDS-PAGE检测抗体的纯度，具体方法如下：
SDS-PAGE检测：
取2μg待测抗体，加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，使总体积为20μl；同时制备还原性SDS-PAGE样品及非还原性SDS-PAGE样品，然后进行上样；首先，在80V下电泳30min，然后在120V下电泳直至条带分隔清晰；将电泳后的PAGE胶取下，进行考马斯亮蓝染色，15min之后将染色液去掉，用清水冲洗干净，然后加入脱色液进行脱色，直至看到清晰的条带为止。
结果如图1所示，图1显示：在还原条件下，这10株单克隆抗体均具有两条电泳条带，并且这两条电泳条带的对应分子量与其各自的轻、重链大小一致；在非还原条件下，10株单克隆抗体都具有单一条带，并且该电泳条带的对应分子量与其各自的完整抗体的大小一致；这些结果说明，这10株单克隆抗体的表达准确。
此外，所有电泳条带均边缘清晰、无杂带，说明将上述表达和纯化步骤所得的单克隆抗体的纯度较高。
实施例4：针对E2的单克隆抗体的抗原结合活性和亲和力检测
本实施例中，分别对实施例3中表达和纯化的10株单克隆抗体E2 mAb1～E2mAb10进行抗原结合活性和亲和力检测。
抗原结合活性和亲和力检测程序：
①抗原包被：将抗原(即，前述偶联蛋白E2-BSA)稀释至合适的浓度，然后加入空的酶标板中，体积100μl/孔；将酶标板放置4℃冰箱，过夜孵育；
②封闭：用洗板机洗板5次，扣干，将封闭液加入酶标板，每孔150μl，置于37℃恒温箱中，封闭1h；用洗板机洗板5次，扣干；
③孵育一抗：用1×PBS将待测抗体稀释至合适的浓度梯度；将稀释后的待测抗体加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/1h；用洗板机洗板5次，扣干；
④孵育二抗：将酶标二抗按合适比例稀释，然后加入酶标板中，每孔100μl，反应时间：37℃/30min；用洗板机洗板5次，扣干；
⑤显色：将显色液加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37度/15min；
⑥终止、读数：添加终止液，体积100μl/孔；检测波长设置：检测波长450nm，参比波长620nm，将检测结果导出成Excel表格。
⑦数据分析：利用软件进行数据分析及作图，拟合EC50，并推导得出其KD。
这10株单克隆抗体与抗原的结合活性和亲和力检测结果如图2和以下表1所示。
表1
抗体编号 EC50(ng/ml) KD
E2 mAb1 34.69 2.31*10-10M
E2 mAb2 14.63 9.75*10-11M
E2 mAb3 19.47 1.30*10-10M
E2 mAb4 25.83 1.72*10-10M
E2 mAb5 27.88 1.86*10-10M
E2 mAb6 23.05 1.54*10-10M
E2 mAb7 14.23 9.49*10-11M
E2 mAb8 26.9 1.79*10-10M
E2 mAb9 28.72 1.91*10-10M
E2 mAb10 15.79 1.05*10-10M
图2和表1显示：这10株单克隆抗体与抗原结合的EC50均达到ng/ml级别，KD值均在10-10M～10-11M级别。
如前文所提到的，对于IgG抗体而言，本领域通常认为，当与抗原结合的KD值达到10-9M时即被认为具有高亲和性，而本发明的10株单克隆抗体与抗原结合的KD值均达到了10-10M-10-11M之多，为上述定义值的10-100倍，由此可以得出：本发明的单克隆抗体具有极强的抗原结合活性和亲和力。
实施例5：基于抗E2单克隆抗体的双抗体夹心法胶体金免疫层析试纸条的制备
本实施例中，分别以实施例3中表达和纯化的E2 mAb1和E2 mAb2、E2 mAb3和T4mAb4作为配对抗体，制备两种双抗体夹心法原理检测E2的胶体金免疫层析检测试纸条，试纸条的构造示意图如图3所示；试纸条的制备方法如下：
(1)Au-抗E2单克隆抗体复合物的制备
①取3ml胶体金颗粒(胶体金粒径：20nm，最大吸收峰波长为529nm，吸光度为2.0A)，加入12μl的0.1M K2CO3，混匀，加入8μg抗E2抗体(即，检测抗体)，常温反应1h；
②向步骤①体系中加入600μl 5％BSA封闭液，常温封闭30min；
③封闭完成后，以11000rpm在10℃下离心15min，弃上清，沉淀用50μl金标稀释液进行复溶(即浓缩60倍，60×)，获得Au-抗E2单克隆抗体复合物；所述金标稀释液含有pH7.5-8.5的100mM Tris缓冲液、5％蔗糖、1％海藻糖、5％ BSA；
(2)划金
①划封闭线：取5％BSA溶液，将仪器出水量设置为3μL/cm，将划好的底板置于37℃烘箱内干燥2小时；
②将Au-抗E2单克隆抗体复合物终浓度稀释至40×，出水量设置为2μL/cm，在封闭线位置进行划线，然后将底板置于37℃烘箱内干燥2小时，然后在不高于36％的湿度下将标记垫放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
(3)包被质控线C、检测线T
①质控线C、检测线T线包被液的制备：取羊抗鼠抗体，用pH7.4的10mM PBS缓冲液稀释成1.0mg/mL的抗体溶液；取另一种抗E2单克隆抗体(即，捕获抗体)，用pH7.4的10mMPBS缓冲液稀释成0.8mg/mL的抗体溶液；
②包被：将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔8mm，包被量均为为1μL/cm；将包被后的PVC底板置于37℃烘箱中，烘16小时，然后在不高于36％的湿度下将PVC底板放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
(4)样品垫的预处理
清洗烘网，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4小时，然后在不高于36％的湿度下将其放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
所述样品垫预处理液含有pH8.5的10mM Tris缓冲液、0.1％ PVP 10、0.1％PEG20000、0.1％ Tween20和0.5％酪蛋白钠；
(5)膜材的组装与切割
在不高于36％的湿度下，取出吸水垫、已处理的样品垫，按照10mm×300mm尺寸进行切割，取出包被的PVC底板，按以下流程进行组装：先在PVC底板上贴上样品垫，使样品垫部分压着硝酸纤维素膜2mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜2mm；将组装好的PVC底板切割成4mm，即为用于检测E2的胶体金免疫层析试纸条。
试纸条1的抗体配对方式为：E2 mAb1(用于制备Au-抗体复合物)+E2 mAb2(用于T线包被)；试纸条2的抗体配对方式为：E2 mAb3(用于制备Au-抗体复合物)+E2mAb4(用于T线包被)。
实施例6：基于抗E2单克隆抗体的双抗体夹心法胶体金免疫层析试纸条的检测性能
本实施例中，测试了实施例5所制备的两种胶体金免疫层析试纸条对于临床血清样本中的E2的检测性能，并将其与传统的罗氏检测试剂的检测性能进行比较。
具体地，对于实施例5所制备的两种胶体金免疫层析试纸条，用样本稀释液(其组成为：10mM Tris+1％BSA+0.2％Tween-20+0.1％proclin300，pH7.0)稀释临床血清样本，室温反应10min，然后加样75μl，15分钟后用胶体金免疫分析仪进行检测，读取检测值，并处理数据，获得各稀释度的样本中的E2浓度；对于罗氏检测试剂盒，则按照其说明书流程进行操作，对血清样本进行稀释，然后检测，获得E2浓度数据。然后，将两种试纸条所检测的E2浓度数据与罗氏试剂所检测的E2浓度数据(作为标准)相比较，制作临床相关性(即，与罗氏检测结果的符合率)曲线。
结果如图4所示；其中，图4A和4B分别为胶体金免疫层析试纸条1和试纸条2的临床相关性(即，与罗氏检测结果的符合率)结果图，其显示：两种试纸条的临床相关性(R2值)均＞0.97。
上述结果显示，基于本发明配对抗体所制备的E2胶体金免疫层析试纸条与罗氏检测结果具有很高的符合率(R2在0.97以上)，因此具有很好的临床相关性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.针对雌二醇的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47和SEQ ID NO:48所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 51、ATS和SEQ ID NO: 52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其具有如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQID NO:53所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其具有如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；和轻链，其具有如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段为嵌合抗体。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段为双特异抗体。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段为多特异抗体。
8.多核苷酸，其编码如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.核酸构建体，其包含如权利要求8所述的多核苷酸，以及与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
10.一种重组载体，其包含如权利要求8所述的多核苷酸，或者如权利要求9所述的核酸构建体。
11.一种转化的宿主细胞，其包含如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体或如权利要求10所述的重组载体。
12.如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的重组载体和/或如权利要求11所述的转化的宿主细胞在制备用于检测雌二醇的检测试剂或试剂盒中的应用。
13.一种用于检测雌二醇的检测试剂，其包含如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
14.一种制备如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使权利要求11所述的转化的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
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