CN117866789A

CN117866789A - 一种合成二糖的酵母基因工程菌

Info

Publication number: CN117866789A
Application number: CN202310009900.1A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 李凤仪; 韩丽娟
Original assignee: Shandong Henglu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hengrui Qingdao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-01-05
Filing date: 2023-01-05
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2043-01-05
Also published as: CN117866789B; WO2024146465A1

Abstract

本发明属于生物工程、基因工程技术及寡糖（稀有糖）合成技术领域，具体涉及一种利用基因修饰后的重组酵母菌生产乳糖‑N‑二糖的方法。本发明的技术方案是：一种重组酵母细胞，导入包含(1)异源的乳‑N‑二糖磷酸化酶（LNBP）基因，和（2）果糖‑1‑磷酸磷酸化酶（YQAB）基因，进一步优选的，还包括（3）对标志物基因的破坏或修饰。所述重组酵母细胞具有从乳糖合成乳糖‑N‑二糖（Lacto‑N‑biose，LNB）的性能，并且通过分子开关大幅度提高LNB的产率。

Description

一种合成二糖的酵母基因工程菌

技术领域

本发明属于生物工程、基因工程技术及寡糖（稀有糖）合成技术领域，具体涉及一种利用基因修饰后的酵母基因工程菌生产乳糖-N-二糖的方法。

背景技术

母乳是婴儿最理想的天然“功能性食品”，是婴儿营养的“金标准”。与母乳喂养的婴儿相比，奶瓶喂养的婴儿存活率要低，感染几率更高，这一现象引起了科学家对母乳成分的研究兴趣。21世纪以来，研究者发现人类初乳中总HMOs（酸性和中性低聚糖）浓度高达24g/L，但是随泌乳期延长而下降；还发现HMOs对婴儿的生长发育以及后期的健康非常重要，其可促进婴儿肠道微生态平衡，促进肠道内有益菌的增殖、抑制有害菌的生长、抵御病原菌感染、调节免疫系统和促进婴儿的认知发育等，母乳的许多有益作用都归功于人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）。

随着用于结构表征的分析工具和技术的不断进步，科学家们正致力于识别母乳中的成分，特别是丰富多样的HMOs，如今已鉴定出200多种。其中，2-岩藻糖基乳糖（2’-FL）、乳糖-N-三糖 (Lacto-N-tetriaose II，LNTII)、乳糖-N-四糖（Lacto-N-tetraose，LNT）和乳糖-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose，LNnT）被发现是HMOs中的主要成分，发挥双歧因子的作用。研究证明，以牛乳或羊乳作为主要原料的婴幼儿配方奶粉中添加HMOs，并且喂养婴幼儿，可以在婴幼儿的营养、免疫等方面接近母乳哺育的效果。因此，向婴幼儿奶粉、一些人造奶、乳制品、婴儿食品以及功能保健品或特殊人群食品中添加具有生理功能的HMOs，将大大提高相应人群的身体素质，提高其生活质量，具有明显的社会和经济价值。HMOs添加的婴幼儿配方奶粉以及膳食补充剂等，已经在美国、欧盟、澳大利亚和新西兰等国家市场上销售。目前，欧盟EFSA、美国FDA均批准了乳糖-N-四糖（LNT）和乳糖-N-新四糖（LNnT）的上市。

乳糖-N-二糖（Lacto-N-biose，LNB，Galβ1-3GlcNAc，化学结构式见式1）是HMOs的一种，也是中性HMO的核心结构，是合成其他中性HMOs的重要前体物质，但因其来源途径有限，亟需建立简洁、高效、经济地大量获得核心结构乳-N-二糖（LNB）的合成途径。LNB是半乳糖-1-磷酸和乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）通过1,3-β键连接的二糖，近几年，研究人员一直在优化LNB生产制备方法。现有的制备方法中，从人类母乳中提取，存在生产成本较高、产量低、价格昂贵。化学合成法虽然可获得结构确定的寡糖，但是需要重金属的参与，环境不友好且有食品安全问题，限制了化学法合成LNB的商业化进展。相对于化学法，生物法具有工艺简捷、反应条件温和、产物处理工艺简单等优点，因此，研究人员一直在尝试利用生物法合成乳糖-N-二糖（LNB），以期突破瓶颈，实现低成本、可规模化地生产LNB。

。

Nishimoto等人（Biosci. Biotech. Bioch. 2007, 71 (8), 2101-2104.）通过体外酶催化法合成了乳糖-N-二糖（LNB），设计了以蔗糖和乙酰氨基葡萄糖为底物，多酶催化一锅法合成LNB途径，利用蔗糖磷酸酶催化得到葡萄糖-1-磷酸，经过UDP-Gal/UDP-Glc循环得到半乳糖-1-磷酸后，和乙酰氨基葡萄糖被酶催化生成LNB。CN201911055516.5利用生物安全性好且应用广泛的多酶催化体系，以半乳糖和乙酰氨基葡萄糖通过在多酶反应体系中引入ATP再生循环系统等三个模块，和前一种方法比，将酶合成速率提高了13倍以上，提高乳糖-N-二糖合成及底物利用率。但是，以上方法都必须以乙酰氨基葡萄糖为底物，大大提高了合成LNB的原料成本。

微生物发酵法合成HMOs，则多集中在利用大肠杆菌发酵生产HMOs的生物合成技术。已有多项专利（申请号CN201611147477.8、CN201680052611.8、CN201611147478.2和CN201510751641.5）均是以大肠杆菌作为宿主，异源生产HMOs。和大肠杆菌相比较，酵母发酵生产具有食品安全，鲁棒性高，不存在噬菌体的问题，是规模工业化生产HMOs的理想宿主之一。CN202010187632.9公开了一株酿酒酵母工程菌株，其中所述酵母细胞经遗传修饰后可生产2'-岩藻糖基乳糖，为酵母工业化生产HMOs提供了重要的参考。但是，至今为止，利用大肠杆菌或者酵母合成LNB均未见到相关报道。

发明内容

发明目的：提供一种能够生产乳糖-N-二糖的酵母基因工程菌，以及所述酵母基因工程菌在合成乳糖-N-二糖（Lacto-N-biose，LNB）方面的应用。

本发明提供了一种新的乳糖-N-二糖合成途径，不需要以乙酰氨基葡萄糖为底物，为乳糖-N-二糖的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。同时本发明合成方法高效温和、简便易行，成本低、适合产业化生产，具有良好的实际应用之价值。

本发明的技术方案是：

一种酵母基因工程菌，具有以乳糖为原料合成乳糖-N-二糖（Lacto-N-biose，LNB）的性能。

优选的，所述以乳糖为原料，可以选择以含有乳糖或半乳糖的培养基为原料合成LNB。

所述酵母基因工程菌，优选的，包含(1)异源的乳-N-二糖磷酸化酶（Lnbp）基因，和（2）果糖-1-磷酸磷酸化酶（YqaB）基因。所述酵母基因工程菌无需要导入特殊的转运蛋白，具有利用乳糖合成乳糖-N-二糖（Lacto-N-biose，LNB）的性能。

所述乳糖-N-二糖磷酸化酶（Lacto-N-biose phosphorylase，Lnbp），也称为1,3-β-半乳糖苷-N-乙酰己糖胺磷酸化酶（1,3-beta-galactosyl-N-acetylhexosaminephosphorylase），EC 2.4.1.21。其包含氨基酸序列与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2具有至少67%、至少68%、至少69%、70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的序列一致性的酶，且具有产生乳糖-N-二糖LNB的活性。

所述乳糖-N-二糖磷酸化酶Lnbp，优选的，为来源于长双歧杆菌Biﬁdobacteirum longum的LNBP1（Genbank No. BAD80751.1，PDB：2ZUS），其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述乳糖-N-二糖磷酸化酶Lnbp，优选的，为来源于芽孢杆菌Bacillus cereus的LNBP2（Genbank No. WP_078422288.1）；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

如附图1所示，SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2的氨基酸序列一致性为52.88%。

所述果糖-1-磷酸磷酸化酶（YqaB），包含氨基酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%序列一致性的酶。

所述果糖-1-磷酸磷酸化酶（YqaB），优选的，为来源于大肠埃希氏菌Escherichia coli（Genbank No. APQ20426.1）的EcYQAB, 其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述果糖-1-磷酸磷酸化酶（YqaB），优选的，为来源于细菌性甘薯茎腐病菌Dickeyadadantii（Genbank No. WP_013319095.1）的DdYQAB, 其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

如附图2所示，SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4的氨基酸序列一致性为67%。

在一些实施例中，描述了以酵母细胞为宿主，导入异源的乳糖-N-二糖磷酸化酶基因（LNBP）和果糖-1-磷酸磷酸化酶基因（YQAB），提高了原始酵母细胞合成LNB的能力。

在一些实施例中，所述酵母基因工程菌可以是萨酵母属（Issatchenkia sp.）、假丝酵母属（Candida sp.）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces sp.）、毕赤酵母属（Pichia sp.）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces sp.）、汉逊酵母属（Hansenula sp.）、有孢圆酵母属（Torulasporasp.）、耶氏酵母属（Yeastsp.）、接合酵母属（Zygosaccharomyces sp.）或酵母属（Saccharomyces sp.）酵母细胞。

进一步优选的，所述酵母基因工程菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxinus）、解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）、禾本红酵母（Rhodotorulagraminis）、巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）等细胞；其中，乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）为通过美国食品药物管理局GRAS食品安全认证的酵母细胞，在食品或食品添加剂管理方面，更容易被接受。

所述酵母菌株，在优选的实施方案中，酵母菌属细胞可以选自：乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）。乳酸克鲁维酵母在ATCC菌种保藏中心保藏号为ATCC 8585。马克斯克鲁维酵母在ATCC菌种保藏中心保藏号为ATCC 46537。

以上物种的菌株，也可以容易地在国内许多培养物保藏中心为公众所获得，如中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）、中国典型培养物中心（CCTCC）、广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）等。

在一个方面，所述酵母基因工程菌，包含(1) 包括乳-N-二糖磷酸化酶基因（LNBP）的导入，（2）果糖-1-磷酸磷酸化酶基因（YQAB）的导入，和（3）对酵母标志物基因的破坏或修饰。

所述酵母标志物基因，为半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶基因（GALT）。酵母标志物基因（GALT）的破坏或修饰是实现高产LNB的必要条件。

术语“ 破坏”或“修饰”意指参考基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰(例如通过缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸)，从而使得编码的多肽的表达不存在(失活)或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本领域已知的技术测量破坏效果，如使用来自在此参考的无细胞提取物测量值检测半乳糖消耗量的不存在或降低。

在某些实施例中，所述酵母基因工程菌包含一个或多个酵母标志物基因的破坏或修饰。

所述酵母标志物基因，包含半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶（GalT）的部分氨基酸序列，与SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:6至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的氨基酸序列一致性。

所述酵母基因工程菌，优选的，为乳酸克鲁维酵母基因工程菌，进一步优选的，包含至少一个酵母标志物基因被破坏或修饰，并且含有所述酵母标志物的氨基酸序列，以及编码所述酵母标志物的核酸序列。所述酵母标志物基因的核酸序列Genebank编号X07039.1；其氨基酸序列Genebank编号CAA30091.1，如SEQ IDNO:5所示。

所述马克斯克鲁维酵母基因工程菌，进一步优选的，至少一个酵母标志物基因被破坏或修饰，并且包括所述酵母标志物的氨基酸序列，以及编码所述酵母标志物的核酸序列。所述酵母标志物基因的核酸序列Genebank编号NC_036026.1；其氨基酸序列Genebank编号XP_022674659.1，如SEQ IDNO:6所示。

在一个方面，是具有主动合成LNB途径的基因工程宿主菌，其中该细胞包含对酵母标志物基因GALT（例如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6）的破坏或修饰。在一些实施例中，当在相同的条件下培养时，基因工程宿主菌株与亲本菌株相比，LNB的产量得到了较大程度的提高。

如附图3所示，SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6的氨基酸序列一致性为79.84%。

所述乳酸克鲁维酵母基因工程菌或马克斯克鲁维酵母基因工程菌的重组构建技术，包括如下步骤：

（1）构建表达盒，在乳酸克鲁维酵母细胞或马克斯克鲁维酵母细胞中导入乳糖-N-二糖磷酸化酶基因（LNBP）；和/或

（2）构建表达盒，在乳酸克鲁维酵母细胞或马克斯克鲁维酵母细胞中导入果糖-1-磷酸磷酸化酶基因（YQAB）；和/或

（3）构建敲除盒或者利用点突变试剂盒，敲除或修饰乳酸克鲁维酵母细胞或马克斯克鲁维酵母细胞中的酵母标志物基因（GALT）。

在一些实施例中，所述酵母基因工程菌，通过导入人工转录因子CamR调控CAMO启动子。

优选的，所述酵母基因工程菌，通过调控GlcNAc-6-P流向GlcNAc-1-P的路径，从而提高LNB的产量。

本发明的另一个实施方案，是所述酵母基因工程菌在合成乳糖-N-二糖（LNB）中的应用。

所述酵母基因工程菌在合成乳糖-N-二糖（LNB）中的应用，以乳糖或葡萄糖和半乳糖为底物。

所述应用，优选的，包括生成LNB的步骤。

优选的，所述酵母基因工程菌的发酵产物，还可经过离心、过滤、脱色、纳滤、色谱纯化和结晶、重结晶等方式进行纯化。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述技术方案合成的乳糖-N-二糖。另外，基于本发明的合成方法，合成所有含有以乳糖-N-二糖为骨骼构造的寡糖或多糖亦在本发明的保护范围之内。

定义

术语“宿主细胞”意指对用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在此将术语“基因工程菌”定义为包括一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸的非天然存在的宿主细胞。宿主细胞可以是在此描述的突变菌株，或被进一步破坏以提供在此描述的突变菌株。

异源多核苷酸：在此将术语“异源多核苷酸”定义为以下多核苷酸：对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出结构修饰的天然多核苷酸；由于通过重组DNA技术例如，一种不同的(外源的)启动子对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸；或具有该多核苷酸的一个或多个额外的拷贝以定量改变表达的宿主细胞中的天然多核苷酸。“异源基因”是包括异源多核苷酸的基因。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于在此所述的目的，两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，J .Mol .Biol .[分子生物学杂志]，1970，48:443-453)确定，如在EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件包]，Rice等人，Trends Genet .[遗传学趋势]，2000，16:276-277)，优选地3.0.0版或更高版本中所实施。

有益效果

本发明首次利用克鲁维酵母基因工程菌，在没有ATP等辅酶因子和乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的添加下，仅利用乳糖等廉价碳源，实现了LNB的高效合成。在食品安全、能量利用和生产成本上都优于体外酶催化法。这也是首次通过微生物发酵实现LNB的合成。产物的催化效率和转化率高的同时，而废物排放低，有利于产品的下游纯化效果，更易获得高纯度LNB产品。

本发明技术对于人乳寡糖LNB的工业化生产有积极的意义，该方法获得的LNB绿色安全、且能够高效、可持续地大规模被生产，具有重要的实用价值，发展前景广阔。

附图说明

图1. SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的比对结果图。

图2. SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的比对结果图。

图3.SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的比对结果图。

图4.为StrainKL-LNB-4发酵产物的HPLC图谱。

图5.LNB标准品的LC-MS图。

图6. HPLC图中rt=10.5 min的产物的LC-MS图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下对本技术方案的细节和形式进行修改或替换均落入本发明的保护范围内。

需要注意的是，所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如 Sambrook 等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释；所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

如下实施例中，所述乳酸克鲁维酵母在ATCC菌种保藏中心保藏号为ATCC 8585；马克斯克鲁维酵母在ATCC菌种保藏中心保藏号为ATCC 46537。

如下实施例中，PCR扩增过程中所用的所有高保真酶均购买于诺唯赞生物有限公司。2* MultiF Seamless Assembly Mix购买于ABclonalTechnology生物有限公司。

如下实施例中，PCR扩增体系为Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase1 μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs (10 mM)1 μL，引物F和R各2μL，模板DNA1μL，加超纯水至总体积50 μL。PCR扩增程序为95℃预变性3 min，95℃变性15 s，54℃退火30 s，72℃延伸2-3 min，2-4步循环30次，72℃终延伸5 min，最后4℃保存。

如下实施例中，经琼脂糖凝胶电泳回收后的目的基因条带，利用2*MultiFSeamless Assembly Mix进行连接，连接体系为DNA片段 (0.5-1 pmol)XμL，2*MultiFSeamless Assembly Mix5μL，加超纯水至总体积10μL。

优选的，所述克鲁维酵母基因工程菌，可以将乳糖转入细胞内，并且在细胞内被降解为半乳糖和葡萄糖，葡萄糖除了进入糖酵解，用于酵母的生长和能量代谢之外，还被多步反应催化生成为乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸，乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸被果糖-1-磷酸磷酸化酶（YqaB）催化为乙酰氨基葡萄糖；而半乳糖被催化成半乳糖-1-磷酸，最后半乳糖-1-磷酸和乙酰氨基葡萄糖被乳糖-N-二糖磷酸化酶(Lnbp)合成为LNB。

以下实施例中，酵母转化方法具体如下：

（1）先制备酵母感受态细胞：取少量酵母菌株冻存物在平板固体培养基上划线，30℃倒置培养2天。挑取酵母单菌落于50 mL液体培养基中，30℃，220 rpm 培养至OD₆₀₀在0.8-1.5之间。收集菌体用25 mL无菌水洗涤，室温1500 ×g离心10 min，弃上清。加入 1 mL 100mM的氯化锂缓冲液，重悬沉淀，12000 rpm 离心30s，弃上清。再次加入 400 μL 100 mM的氯化锂缓冲液，重悬沉淀，得酵母细胞感受态，按50 μL/管分装，待转化用。同时，煮沸1 mL鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴以制备单链DNA。

（2）转化：将上述制备的感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的氯化锂溶液。对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350（240 μL）；1M LiCl（36 μL）；2 mg/mL 单链Salmon sperm DNA（25 μL）；5～10 μg/50 μL H₂O 质粒DNA（50 μL），剧烈旋涡混匀，直至沉淀菌体完全分布均匀；30 ℃水浴孵育30 min；42 ℃水浴热休克20～25 min；8000 rpm离心10 min后，收集酵母菌体；然后，重悬酵母于500 μL液体培养基，30℃摇床孵育；1～4 h后，取25～100 μL菌液涂布于选择性培养基平板，于30℃倒置培养。

以下实施例中，酵母基因组提取方法如下：将克鲁维酵母单菌落挑取至1 mL YPD（10 mL离心管）培养基中，30℃，200 rpm过夜培养；取600 μL菌液于1.5毫升EP管中，10000rpm离心1 min，去上清，然后加入600~800 μL的基因组抽提buffer，100 μL石英砂，充分震荡5 min。65℃水浴30 min，每10 min颠倒一次。取上清于新的1.5mL EP管中，加入等体积的DNA提取液，吹打混匀，13000 rpm离心10 min。取400 μL上清于新的1.5mL EP管中，加入0.6倍体积的异丙醇和40μL 3M醋酸钠，混匀，-20℃静置30 min。13000 rpm离心10 min，弃上清，得到酵母基因组。用70%的乙醇洗涤两次，待乙醇挥发后溶于ddH₂O中，-20℃保存。

如下实施例中，利用高效液相色谱（HPLC）分析酵母基因工程菌发酵反应产物，条件如下：色谱柱型号：AminexHPX-87H（300×7.8 mm），流动相为5mMH₂SO₄水溶液，柱温45℃，进样体积10 μL，紫外检测器（日立Chromaster），波长210 nm，流速0.5 mL/min。

本发明所述酵母基因工程菌的发酵产物，可通过离心、过滤、脱色、纳滤、色谱纯化和结晶等方式进行提纯，获得纯度较高的反应溶液或固体；也可通过喷雾干燥或冻干技术制成粉末。

实施例1. 乳酸克鲁维酵母基因工程菌的制备

1.酵母标志物基因KL-ΔGALT::loxp-Kan-loxp敲除盒的构建

根据GALT的上下游序列，PUG6质粒以及筛选抗性KAN的序列信息，设计扩增引物，如表1所示。以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，设计引物

galt up-s：5’-cactatagaacgcaaataccattgacatgacagat-3’；

galt up-a：5’-gttgtcgacctgccttgatgaaataaattgggcac-3’；

galt down-s：5’-tccactagtgTGAgcaggcaaagcagaaaata-3’；

galt down-a：5’-cactatagggagagaatttgaattccatttgagaactg-3’，

上述引物PCR扩增后得到GALT的上下游序列。

以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，KanMX4-galt-s：5’-atttcatcaaggcaggtcgacaacccttaat-3’、KanMX4-galt-a：5’-tgctttgcctgcTCAcactagtggatctgatatcacc-3’为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板，PUG6-galt-s：5’-tggaattcaaattctctccctatagtgagtcgtatt-3’、PUG6-galt-a：5’-caatggtatttgcgttctatagtgtcacctaaatcg-3’为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。

扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳，将大小符合预期的目的条带回收后利用2*MultiF Seamless Assembly Mix进行连接，各片段按等摩尔数添加。50℃连接30min后进行大肠杆菌转化。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-GALT。以该质粒为模板，galt up-s、galt down-a为引物，序列同上进行PCR扩增即可得到KL-ΔGALT:: loxp-Kan-loxp敲除盒。

2. KL-ΔGALT::lnbp1-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据LNBP1序列、LNBP1的启动子和终止子序列信息以及PUG6-GALT质粒信息设计扩增引物，如下所示：

Lnbp1-s(Lac4Pro)：5’-actgaaagatATGACTAGCACCGGCCGCT-3’；

Lnbp1-a：5’-tggttacaacaTCAGGCTTCACGCCAGGCGA-3’；

Lac4Pro-s(lnbp1/2)：5’-catcaagcatatgtatcacgttgacttgg-3’；

Lac4Pro-a(lnbp1)：5’-CGGTGCTAGTCATatctttcagttctcgatgag-3’；

Ter-lnbp1-s：5’-CGTGAAGCCTGAtgttgtaaccagtgtgcgc-3’；

Ter-lnbp/2-a：5’-cgacctggaaaattattggaatattacgaggat-3’；

PUG6-galt-lnbp1/2-s：5’-attccaataattttccaggtcgacaacccttaata-3’；

PUG6-galt-lnbp1/2-a：5’-gtcaacgtgatacatatgcttgatgaaataaattgggcac-3’。

分别以人工合成并经过密码子优化的LNBP1编码序列为模板，Lnbp1-s（Lac4Pro）、Lnbp1-a为引物，PCR扩增得到LNBP1序列。以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，Lac4Pro-s（lnbp1/2）、Lac4Pro-a（lnbp1）为引物，PCR扩增得到LNBP1的启动子。以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，Ter-lnbp1-s、Ter-lnbp/2-a为引物，PCR扩增得到LNBP1的终止序列。以PUG6-GALT质粒为模板，PUG6-galt-lnbp1/2-s、PUG6-galt-lnbp1/2-a为引物，PCR扩增得到PUG6-GALT质粒骨架。同上进行琼脂糖凝胶电泳，回收LNBP1的启动子、终止序列和PUG6-GALT质粒骨架条带后，将等摩尔数的各片段利用2* MultiF Seamless Assembly Mix进行连接。50℃连接30min后进行大肠杆菌转化。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-GALT- LNBP1\。以PUG6-GALT-lnbp1为模板，galt up-s、galt down-a为引物进行PCR扩增即可得到KL-ΔGALT::lnbp1-loxp-Kan-loxp表达盒。

3. KL-ΔGALT::lnbp2-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据LNBP2序列、LNBP2的启动子和终止子序列信息以及PUG6-GALT质粒信息设计扩增引物为：

Lnbp2-s(Lac4Pro)：5’-ctgaaagatATGAAGAAGAAGAAGGGTAGAGT-3’；

Lnbp2-a：5’- ActggttacaacaTTAACCTTCATTAGAAACATCTTCCCA-3’；

Lac4Pro-a(lnbp2)：5’-ACCCTTCTTCTTCTTCATatctttcagttctcgatgagt-3’；

Ter-lnbp2-s：5’-CTAATGAAGGTTAAtgttgtaaccagtgtgcgc-3’。

分别以人工合成并经过密码子优化的LNBP2编码序列为模板，Lnbp2-s（Lac4Pro）、Lnbp2-a为引物，PCR扩增得到LNBP2序列。以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，Lac4Pro-s（lnbp1/2）、Lac4Pro-a（lnbp2）为引物，PCR扩增得到LNBP2的启动子。以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，Ter-lnbp/2-a、Ter-lnbp2-s为引物，PCR扩增得到lnbp2的终止序列。以PUG6-GALT质粒为模板，PUG6-galt-lnbp1/2-s、PUG6-galt-lnbp1/2-a为引物，PCR扩增得到PUG6-GALT质粒骨架。同上的方法进行琼脂糖凝胶电泳，将LNBP2的启动子、终止序列和PUG6-GALT质粒骨架条带回收后连接。转化入大肠杆菌。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-GALT-LNBP2。以PUG6-GALT-LNBP2为模板，galt up-s、galt down-a为引物进行PCR扩增即可得到KL-ΔGALT:LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒。

4. KL-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据XYL1的上下游序列，PUG6质粒、筛选抗性Kan以及LNBP1表达盒的序列信息，设计扩增引物为：

xyl1 up-s：5’-gtgacactatagactcgagcttgaaacttcga-3’；

xyl1 up-a：5’-gttgtcgacctgctcaccattattgcggaagag-3’；

xyl1 down-s：5’-gatccactagtgAACTTTTCAGGTGCGTTGAT-3’；

xyl1 down-a：5’-ctatagggagaaggtgagtggcatcaattatg-3’；

KanMX4-xyl1-s ：5’-caataatggtgagcaggtcgacaacccttaat-3’；

KanMX4-xyl1-a ：5’-acCTGAAAAGTTcactagtggatctgatatcacc-3’；

PUG6-xyl1-s：5’-tgccactcaccttctccctatagtgagtcgta-3’；

PUG6-xyl1-a：5’-caagctcgagtctatagtgtcacctaaatcgtat-3’；

PUG6-xyl1-lnbp*2-s：5’-ttcaagcgggaacagcaggtcgacaacccttaat-3’；

PUG6-xyl1-lnbp*2-a：5’-cgtgatacatatgtcaccattattgcggaagag-3’；

Ter-lnbp*2-s：5’-CGTGAAGCCTGAaaatagtttccatgtagaatttcg-3’；

Ter-lnbp*2-a：5’-acctgctgttcccgcttgaagttagc-3’；

Lnbp*2-s：5’-cgcaataatggtgacatatgtatcacgttgacttgg-3’；

Lnbp*2-a：5’-TGgaaactatttTCAGGCTTCACGCCAGGCGATA-3’。

以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，xyl1 up-s、xyl1 up-a；xyl1 down-s、xyl1down-a为引物，PCR扩增得到XYL1的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，KanMX4-xyl1-s、KanMX4-xyl1-a为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板，PUG6-xyl1-s、PUG6-xyl1-a）为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。琼脂糖凝胶电泳所得目的条带用2* MultiF Seamless Assembly Mix于50℃连接30min后，进行大肠杆菌转化，从阳性大肠杆菌转化子提取质粒，将该质粒命名为PUG6-XYL1。以PUG6-XYL1质粒为模板，PUG6-xyl1-lnbp*2-s、PUG6-xyl1-lnbp*2-a为引物，PCR扩增得到PUG6-XYL1质粒骨架。随后以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，Ter-lnbp*2-s、Ter-lnbp*2-a为引物，PCR扩增得到终止序列；以PUG6-GALT-LNBP1质粒为模板，Lnbp*2-s、Lnbp*2-a为引物，PCR扩增得到lnbp1及其启动子。将PUG6-XYL1质粒骨架、LNBP1及其启动子、终止序列条带回收、连接、大肠杆菌转化、提取质粒，将该质粒命名为PUG6-XYL1-LNBP1。以PUG6-XYL1-LNBP1质粒为模板，xyl1 up-s、xyl1 down-a为引物进行PCR扩增即可得到KL-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒。

5. KL-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据相关的质粒信息，设计相应的引物如下：

lnbp2-KL-XYL1-F：5’-gagaactgaaagatATGAAGAAGAAGAAGGGTAGAG-3’；

lnbp2-KL-XYL1-R：5’-atggaaactatttTTAACCTTCATTAGAAACATCTTCCCA-3’；

PUG-lnbp2-XYL1-F：5’-AATGAAGGTTAAaaatagtttccatgtagaatttcg-3’；

PUG6-lnbp2-XYL1- R：5’-CTTCTTCTTCATatctttcagttctcgatgagt-3’。

以质粒PUG6-GALT-LNBP2为模板，以lnbp2-KL-XYL1-F和lnbp2-KL-XYL1-R为引物，合成LNBP2的序列。以质粒PUG6-XYL1-LNBP1为模板，以PUG-lnbp2-XYL1-F和PUG-lnbp2-XYL1-R为引物，合成质粒骨架部分。之后进行琼脂糖凝胶电泳，将大小符合预期的目的条带回收，利用2* MultiF Seamless Assembly Mix连接各片段。大肠杆菌转化后挑取阳性转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-XYL1-LNBP2，以其为模板，xyl1 up-s、xyl1 down-a为引物进行PCR扩增即可得到KL-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒。

6. KL-ΔXYL3::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据XYL3的上下游序列，PUG6质粒、筛选抗性Kan以及GALK2基因的序列信息，设计扩增引物，如下所示：

xyl3 up-s：5’-gacactatagaacgcgtatttgttttggggctaatagt-3’；

xyl3 up-a：5’-gtcgacctgcaccaattctaatctataatttggttca-3’；

xyl3 down-s：5’-tccactagtggGTCGTATTGACAAATGTCAATATG-3’；

xyl3 down-a：5’-cgactcactataggTTAGTGTGATGACGCTTCTCT-3’；

KanMX4-xyl3-s：5’-gattagaattggtgcaggtcgacaacccttaata-3’；

KanMX4-xyl3-a：5’-GTCAATACGACccactagtggatctgatatcac-3’；

PUG6-xyl3-s：5’-CATCACACTAAcctatagtgagtcgtattaatttcg-3’；

PUG6-xyl3-a：5’-acaaatacgcgttctatagtgtcacctaaat-3’；

PUG6-xyl3-galk-s：5’-gaacgtcggtgcaggtcgacaacccttaata-3’；

PUG6-xyl3-galk-a：5’-gtaattcgattgagccaattctaatctataatttggttca-3’；

TefPro-s(galk)：5’-agattagaattggctcaatcgaattacacagaaca-3’；

TefPro-a(galk)：5’-AGGAACGGACATttttaatgttacttctcttgcagt-3’；

galk-s(TefPro)：5’-gaagtaacattaaaaATGTCCGTTCCTATTGTGCCA-3’；

galk-a：5’-gtcgacctgcaccgacgttcattaagaatact-3’。

以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，xyl3 up-s、xyl3 up-a；xyl3 down-s、xyl3down-a为引物，PCR扩增得到XYL3的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，KanMX4-xyl3-s、KanMX4-xyl3-a为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板，PUG6-xyl3-s、PUG6-xyl3-a为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。将所有目的条带连接后转化，挑取阳性转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-XYL3。再以PUG6-XYL3质粒为模板，PUG6-xyl3-galk-s、PUG6-xyl3-galk-a为引物，PCR扩增得到PUG6-Xyl3质粒骨架。随后以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，TefPro-s（galk）、TefPro-a（galk）为引物，PCR扩增得到启动子序列；以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，galk-s（TefPro）、galk-a为引物，PCR扩增得到GALK2及其终止序列。将PUG6-XYL3质粒骨架、启动子、GALK及其终止序列条带连接后进行大肠杆菌转化。从阳性转化子中提取质粒，将该质粒命名为PUG6-Xyl3-GALk。以PUG6-XYL3-GALK质粒为模板，xyl3 up-s、xyl3 down-a为引物进行PCR扩增即可得到KL-ΔXYL3:: GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒。

7. KL-ΔXYL2::YQAB-loxp-kan-loxp表达盒构建

根据XYL2的上下游序列，PUG6质粒、筛选抗性Kan以及YQAB基因的序列信息，设计扩增引物为：

xyl2 up-s：5’-cactatagaacgcTCTTcccgtttctccatctgaat-3’；

xyl2 up-a：5’-gacctgcaTGTCTGAACCGCAGATACCG-3’；

xyl2 down-s：5’-cactagtggGATCGGTGCCAAAGAATTAC-3’；

xyl2 down-a：5’-actatagggttacctcttctcgcttcttc-3’；

KanMX4-xyl2-s：5’-CGGTTCAGACAtgcaggtcgacaacccttaat-3’；

KanMX4-xyl2-a：5’-TGGCACCGATCccactagtggatctgatatcac-3’；

PUG6-xyl2-s：5’-gcgagaagaggtaaccctatagtgagtcgtattaatttcg-3’；

PUG6-xyl2-a：5’-acgggAAGAgcgttctatagtgtcaccta-3’；

PUG6-xyl2-yqab-s：5’-attccaataattttctgcaggtcgacaaccct-3’；

PUG6-xyl2-yqab-a：5’-cgattgagGTCTGAACCGCAGATACCG-3’；

TefPro-s(yqab)：5’-CTGCGGTTCAGACctcaatcgaattacacagaacac-3’；

TefPro-a(yqab)：5’-CGTATCTTTCGTACATttttaatgttacttctcttgcag-3’；

Ter-yqab-s：5’-GTTGCTCGAGtgttgtaaccagtgtgcgct-3’；

Ter-yqab-a：5’-gtcgacctgcagaaaattattggaatattacgaggat-3’；

以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，xyl2 up-s、xyl2 up-a；xyl2 down-s、xyl2down-a为引物，PCR扩增得到XYL2的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，KanMX4-xyl2-s、KanMX4-xyl2-a为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板，PUG6-xyl2-s、PUG6-xyl2-a为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。将各目的条带连接、转化、提取质粒，将该质粒命名为PUG6-XYL2，以它为模板，PUG6-xyl2-yqab-s、PUG6-xyl2-yqab-a为引物，PCR扩增得到PUG6-XYL2质粒骨架。随后以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，TefPro-s（yqab）、TefPro-a（yqab）为引物，PCR扩增得到启动子序列；以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，Ter-yqab-s、Ter-yqab-a为引物，PCR扩增得到终止序列。以人工合成并经过密码子优化的YQAB编码序列为模板，PCR扩增得到EcYQAB或者DdYQAB序列。将PUG6-XYL2质粒骨架、启动子、终止序列及YQAB条带回收后利用2* MultiF Seamless Assembly Mix连接30min后进行大肠杆菌转化。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-XYL2-YQAB。以PUG6-XYL2-YQAB质粒为模板，xyl2 up-s、xyl2 down-a为引物进行PCR扩增即可得到KL- ΔXYL::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒或者KL-ΔXYL2::DdYQAB-loxp-kan-loxp表达盒。

8. GALT突变体的构建

利用点突变试剂盒，分别对KL-GalT进行催化活性位点的突变，构建了KL-GALT ^M1，KL-GALT ^M2和KL-GALT ^M3三个菌株，分别在SEQ ID NO:5的基础上突变了C54A/N166A/H179A/H294A/Q338A，C51A/H121A/195EA/H313A/E332A或H177A/H311A/K326A/F327A/V329A的氨基酸残基。

9. 乳酸克鲁维基因工程菌株构建与验证

分别将KL-ΔGALT::loxp-Kan-loxp、KL-ΔGALT::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒转化入乳酸克鲁维酵母并删除G418抗性，分别得菌株KL-LNB-0、StrainKL-LNB-1。将KL-Δ XYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKL-LNB-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-2。将KL-ΔXYL3::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKL-LNB-2并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-3。分别将KL-ΔXYL2::EcYAQB-loxp-kan-loxp表达盒和KL-ΔXYL2::DdYQAB-loxp-kan-loxp表达盒转化入StrainKL-LNB-3并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-4和StrainKL-LNB-5。将KL-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒，KL-ΔXYL3::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒和KL-ΔXYL2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒依次导入出发乳酸克鲁维酵母，并分别导入KL-GALT ^M1，KL-GALT ^M2，KL-GALT ^M3，得到菌株StrainKL-LNB-6，StrainKL-LNB-7，StrainKL-LNB-8。将KL-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒和KL-ΔXYL2::EcYQAB-loxp-kan-loxp依次导入乳酸克鲁维酵母并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-9。将KL-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒和KL-ΔXYL2:: DdYQAB-loxp-kan-loxp依次导入乳酸克鲁维酵母并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-10。

将KL-ΔGALT::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒转化入乳酸克鲁维酵母并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-1-1。将KL-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKL-LNB-1-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-2-1。将KL-ΔXYL3::GALK2- loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKL-LNB-2并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-3-1。将KL-ΔXYL2::EcYQAB-loxp-kan-loxp导入乳酸克鲁维酵母StrainKL-LNB-3-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-4-1。将KL-ΔXYL2::DdYQAB-loxp-kan-loxp导入乳酸克鲁维酵母StrainKL-LNB-3-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-5-1。将KL-ΔXYL2:: EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒和KL-ΔXYL2::DdYQAB-loxp-kan-loxp分别转化入乳酸克鲁维出发菌株并删除G418抗性，分别得菌株StrainKL-LNB-6-1和StrainKL-LNB-7-1。将KL-Δ XYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒，KL-ΔXYL3::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒和KL-Δ XYL2::EcYAQB-loxp-kan-loxp表达盒依次导入出发乳酸克鲁维酵母，并分别导入KL-GalT^M1，KL-GalT^M2，KL-GalT^M3，得到菌株StrainKL-LNB-8-1，StrainKL-LNB-9-1，StrainKL-LNB-10-1。将KL-ΔXYL2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒和KL-ΔXYL2::DdYQAB-loxp-kan- loxp分别导入乳酸克鲁维酵母StrainKL-LNB-0并删除G418抗性，得到菌株StrainKL-LNB-11和StrainKL-LNB-12。

基因工程菌株与其基因型的对应关系如表1所示。为验证以上菌株的正确性，我们提取以上转化子和原始菌株的基因组，用对应敲除盒或表达盒扩增引物对基因组进行PCR扩增。PCR扩增后有且得到唯一条带的大小与敲除盒或表达盒一致则判定菌株正确，否则则判定菌株为假阳性错误。

表1. 乳酸克鲁维基因工程菌株与其基因型

。

实施例2.马克斯克鲁维酵母基因工程菌的制备

1. 酵母标志物基因KM-ΔGALT::loxp-Kan-loxp敲除盒的构建

以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，km-galt-upF：5’-aggtgacactataCAGTGTTCCGATCCTTGGTC-3’；

km-galt-upR: 5’-gtcgacctgGGCTATACTATGCTATGCAATG-3’；km-galt-doF:5’-tccactagtgCCAGCTTTCTAAAGATGCCA-3’；km-galt-doR:5’-ctatagggagaCTTTATCATCATGCAGGTGAT-3’为引物，PCR扩增得到GALT的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，km-galt-loxp-F:5’-CATAGTATAGCCcaggtcgacaacccttaata-3’、km-galt-loxp-R:5’-AGAAAGCTGGcactagtggatctgatatcacc-3’为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板，PUG6-km-galt-F:5’-GCATGATGATAAAGtctccctatagtgagtcgtatt-3’、PUG6-km-galt-R:5’-TCGGAACACTGtatagtgtcacctaaatcgtat-3’为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。PCR扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳，将大小符合预期的目的条带回收后利用2* MultiF SeamlessAssembly Mix在50℃下连接30min后进行大肠杆菌转化。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-km-GALT。以该质粒为模板，km-galt-upF、km-galt-doR为引物进行PCR扩增即可得到KM-ΔGALT::loxp-Kan-loxp敲除盒。

2.KM-ΔGALT::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据PUG6-km-GALT，PUG6-GALT-LNBP1质粒信息设计扩增引物为：

km-galt-lnbp1-F ：5’-TAGCCAAGAACcatatgtatcacgttgacttg-3’；

km-galt-lnbp1-R ：5’-gtcgacctgggaatattacgaggatatgatgc-3’；

km-galt-lnbp1-PUG-F：5’-cgtaatattcccaggtcgacaacccttaata-3’；

km-galt-lnbp1-PUG6-R：5’-gtgatacatatgGTTCTTGGCTATACTATGCTAT-3’。

以PUG6-GALT-LNBP1质粒序列为模板，km-galt-lnbp1-F、km-galt-lnbp1-R为引物，PCR扩增得到lnbp1表达盒序列。以PUG6-km-GALT质粒序列为模板，km-galt-lnbp1-PUG-F、km-galt-lnbp1-PUG6-R为引物，PCR扩增得到GALT上下游同源臂，Kan抗性序列以及PUG6骨架序列。琼脂糖凝胶电泳回收LNBP1表达盒序列和GALT上下游同源臂-Kan抗性序列-PUG6骨架序列条带后进行连接，再转化入大肠杆菌。挑取阳性转化子提质粒，将其命名为PUG6-km-GALT-LNBP1。以PUG6-km-GALT-LNBP1为模板，km-galt-upF、km-galt-doR为引物进行PCR扩增即可得到KM-ΔGALT::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒。

3. KM-ΔGALT::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据PUG6-km-GALT-LNBP1，PUG6-XYL1-LNBP2质粒信息设计扩增引物如下：

km-galt-lnbp2-F ：5’-ctgaaagatATGAAGAAGAAGAAGGGTAGAGT-3’；

km-galt-lnbp2-R：5’-ActggttacaacaTTAACCTTCATTAGAAACATCTTCCCA-3’；

km-galt-lnbp2-PUG-F：5’-CTAATGAAGGTTAAtgttgtaaccagtgtgcgc-3’；

km-galt-lnbp2-PUG6-R：5’-ACCCTTCTTCTTCTTCATatctttcagttctcgatgagt-3’。

以PUG6-XYL1-LNBP2质粒序列为模板，km-galt-lnbp2-F、km-galt-lnbp2-R为引物，PCR扩增得到lnbp2表达盒序列。以PUG6-km-GALT-LNBP1质粒序列为模板，km-galt-lnbp2-PUG-F、km-galt-lnbp2-PUG6-R为引物，PCR扩增得到GALT上下游同源臂，Kan抗性序列, LNBP2启动子和终止子序列以及PUG6骨架序列。通过琼脂糖凝胶电泳回收各目的条带。连接后转化大肠杆菌中。取阳性转化子提质粒，命名为PUG6-km-GALT-LNBP2。以其为模板，km-galt-upF、km-galt-doR为引物进行PCR扩增即可得到KM-ΔGALT::LNBP2-loxp-Kan- loxp表达盒。

4. KM-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据km-XYL1的上下游序列，PUG6-km-GALT-LNBP1质粒、筛选抗性Kan以及LNBP1表达盒的序列信息，设计引物：

km-xyl1-upF：5’-taggtgacactataATATGGGCAGTGTGATCTGT-3’；

km-xyl1-upR：5’-cgtgatacatatgGGTGGAGATAATTGACACT-3’；

km-xyl1-doF：5’-ccactagtgCATGTCAAATGATGAAACGA-3’；

km-xyl1-doR：5’-actatagggagaGAACCAATAATTGTTACCTTGT-3’；

km-xyl1-lnbp1-kan-F：5’-ATCTCCACCcatatgtatcacgttgacttgg-3’；

km-xyl1-lnbp1-kan-R：5’-ATTTGACATGcactagtggatctgatatcac-3’；

km-xyl1-lnbp1-PUG-F：5’-TTATTGGTTCtctccctatagtgagtcgt-3’；

km-xyl1-lnbp1-PUG6-R：5’-CTGCCCATATtatagtgtcacctaaatcgtatg-3’。

以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，km-xyl1-upF、km-xyl1-upR；km-xyl1-doF、km-xyl1-doR为引物，PCR扩增得到km-XYL1的上下游序列。以含有LNBP1表达盒和Kan抗性的PUG6-km-GALT-LNBP1质粒为模板，km-xyl1-lnbp1-kan-F、km-xyl1-lnbp1-kan-R为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan和LNBP1。以PUG6-km-GALT-LNBP1质粒为模板，km-xyl1-lnbp1-PUG-F、km-xyl1-lnbp1-PUG6-R为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。利用琼脂糖凝胶电泳切胶回收，连接，转化，质粒提取，将该质粒命名为PUG6-km-XYL1-LNBP1。以PUG6- km-XYL1-LNBP1质粒为模板，km-xyl1-upF、km-xyl1-doR为引物，PCR扩增得到KM-ΔXYL1::LNBP1- loxp-Kan-loxp表达盒。

5. KM-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒构建

以PUG6-XYL1-LNBP2为模板，以km-xyl1-lnbp2-F，km-xyl1-lnbp2-R为引物，合成lnbp2的表达盒序列；以PUG6- km-XYL1-LNBP1质粒为模板，以pug6-km-lnbp2-F，pug6-km-lnbp2-R为引物，扩增PUG6的骨架-上下游同源臂km-xyl1序列。琼脂糖凝胶电泳回收目的条带后进行连接和大肠杆菌转化。提取质粒命名为PUG6-km-XYL1-LNBP2。以其为模板，km-xyl1-upF、km-xyl1-doR为引物，PCR扩增即得KM-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒。引物序列为：

km-xyl1-lnbp2-F：5’-taggtgacactataATATGGGCAGTGTGATCTGT-3’；

km-xyl1-lnbp2-R：5’-cgtgatacatatgGGTGGAGATAATTGACACT-3’；

pug6-km-lnbp2-F：5’-ccactagtgCATGTCAAATGATGAAACGA-3’；

pug6-km-lnbp2-R：5’-actatagggagaGAACCAATAATTGTTACCTTGT-3’。

6. KM-ΔXKS1::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒构建

根据XKS1的上下游序列，PUG6-XYL3-GALK2质粒的序列信息，设计引物：

km-xks1-upF：5’-gacactataATATACCGAGAGAATCTCGA-3’；

km-xks1-upR：5’-aattcgattgagTGCTGAAATATTATGAGAGCG-3’；

km-xks1-doF：5’-ccactagtggCAACCAGAAGCTGTTGAC-3’；

km-xks1-doR：5’-ctcactataggTTGAGCCTCAACATCAATCG-3’；

km-galk-F：5’-TATTTCAGCActcaatcgaattacacagaaca-3’；

km-galk-R：5’-TTCTGGTTGccactagtggatctgatatcac-3’；

km-xks1-PUG6-F：5’-GAGGCTCAAcctatagtgagtcgtattaatttcg-3’；

km-galk-PUG6-R：5’-TTCTCTCGGTATATtatagtgtcacctaaatcgtatg-3’。

以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，km-xks1-upF、km-xks1-upR；km-xks1-doF、km-xks1-doR为引物，PCR扩增得到XKS1的上下游序列。以PUG6-XYL3-GALK2质粒为模板，km-galk-F、km-galk-R为引物，PCR扩增得到抗性序列Galk-Kan的序列。以PUG6-XYL3-GALK2质粒为模板，km-xks1-PUG6-F、km-galk-PUG6-R为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。同上的方法获得阳性转化子中的质粒，命名为PUG6-km-XKS1-GALK2。以该质粒为模板，km-xks1-upF、km-xks1-doR为引物，扩增得到KM-ΔXKS1::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒。

7. KM-ΔPHA2::YQAB-loxp-kan-loxp表达盒构建

根据Pha2的上下游序列，PUG6-Xyl2-Yqab质粒的序列信息，设计扩增引物：

km-pha2-upF：5’-ggtgacactataATTCCATTTGGATTTGGCAG-3’；

km-pha2-upR：5’-gtaattcgattgagAGCTACTTTTAGTTGGAGATT-3’；

km-pha2-doF：5’-ccactagtggTTGTTGTTACTTACCATTCCG-3’；

km-pha2-doR：5’-cactataggCAATATGGCTACAGATATAGACC-3’；

km-yqab-kan-F：5’-AAAGTAGCTctcaatcgaattacacagaacac-3’；

km-yqab-kan-R：5’-GTAACAACAAccactagtggatctgatatcac-3’；

km-yqab-PUG6-F：5’-GTAGCCATATTGcctatagtgagtcgtattaatttcg-3’；

km-pha2-yqab-PUG6-R：5’-CCAAATGGAATtatagtgtcacctaaatcgtatg-3’。

以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，km-pha2-upF、km-pha2-upR；km-pha2-doF）、km-pha2-doR为引物，PCR扩增得到PHA2的上下游序列。以含有Kan抗性的PUG6-XYL2-YQAB质粒为模板，以km-yqab-kan-F、km-yqab-kan-R为引物，PCR扩增得到抗性序列Kan-Yqab共同序列。以PUG6-XYL2-YQAB质粒为模板，km-yqab-PUG6-F、km-pha2-yqab-PUG6-R为引物，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。然后，进行琼脂糖凝胶电泳，大肠杆菌转化，质粒提取，将该质粒命名为PUG6-km-PHA2-YQAB。以PUG6-km-PHA2-YQAB质粒为模板，km-pha2-upF、km-pha2-doR）为引物进行PCR扩增即可得到KM-ΔPHA2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒或者KM-ΔPHA2:: DdYQAB-loxp-kan-loxp表达盒。

8. GALT突变体的构建

利用点突变试剂盒，分别对KM-GALT进行催化活性位点的突变，构建了KL-GALT^M1，KL-GALT^M2和KL-GALT^M3三个菌株，分别在SEQ ID NO:6的基础上突变了C54A/N166A/H179A/H294A/Q338A，C51A/H121A/195EA/H313A/E332A或H177A/H311A/K326A/F327A/V329A的氨基酸残基。

9. LNB合成菌株构建与验证

分别将KM-ΔGALT::loxp-Kan-loxp敲除盒、KM-ΔGALT::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒转化入马克斯克鲁维酵母并删除G418抗性，分别得菌株StrainKM-LNB-0、StrainKM-LNB-1。将KM-LNB-1菌株中的G418抗性删除，将KM-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKM-LNB-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-2。将KM-ΔXKS1::GALK2- loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKM-LNB-2并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-3。分别将KM-ΔPHA2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒和KM--ΔPHA2::DdYQAB-loxp-kan-loxp表达盒转化入StrainKM-LNB-3并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-4和StrainKM-LNB-5。将KM-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒，KM-ΔXKS1::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒依次导入出发马克斯克鲁维酵母，并分别导入KM-GALT ^M1，KM-GALT ^M2，KM-GALT ^M3，得到菌株StrainKM-LNB-6，StrainKM-LNB-7，StrainKM-LNB-8。将KM-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::EcYQAB- loxp-kan-loxp依次导入马克斯克鲁维酵母并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-9。将KM-ΔXYL1::LNBP1-loxp-Kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::DdYQAB-loxp-kan-loxp依次导入马克斯克鲁维酵母并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-10。

将KM-ΔGALT::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒转化入马克斯克鲁维酵母并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-1-1。将KM-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒转化入StrainKM-LNB-1-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-2-1。将KM-ΔXKS1::GALK2- loxp-Kan-loxp表达盒转化StrainKM-LNB-2并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-3-1。

将KM-ΔPHA2::EcYQAB-loxp-kan-loxp导入马克斯克鲁维酵母StrainKM-LNB-3-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-4-1。将KM-ΔPHA2::DdYQAB-loxp-kan-loxp导入马克斯克鲁维酵母StrainKM-LNB-3-1并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-5-1。将KM- ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒导入马克斯克鲁维酵母出发菌株并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-6-1；将KM-ΔXYL1:: LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::DdYQAB-loxp-kan-loxp表达盒导入马克斯克鲁维酵母出发菌株中，得到菌株StrainKM-LNB-7-1；将KM-ΔXYL1::LNBP2-loxp-Kan-loxp表达盒，KM-ΔXKS1::GALK2-loxp-Kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::EcYQAB-loxp-kan-loxp表达盒依次导入出发马克斯克鲁维酵母，并分别导入KM-GALT ^M1，KM-GALT ^M2，KM-GALT ^M3，得到菌株StrainKM-LNB-8-1，StrainKM-LNB-9-1，StrainKM-LNB-10-1。将KM-ΔPHA2::EcYQAB- loxp-kan-loxp表达盒和KM-ΔPHA2::DdYQAB-loxp-kan-loxp分别导入马克斯克鲁维酵母StrainKM-LNB-0并删除G418抗性，得到菌株StrainKM-LNB-11和StrainKM-LNB-12。

基因工程菌株与菌株基因型详见表2。为验证以上菌株的正确性，我们提取以上转化子和原始菌株的基因组，用对应敲除盒或表达盒扩增引物对基因组进行PCR扩增。PCR扩增后有且得到唯一条带的大小与敲除盒或表达盒一致则判定菌株正确，否则判定菌株为假阳性错误。

表2. 马克斯克鲁维重组菌株与其基因型

。

实施例3. 乳酸克鲁维酵母基因工程菌、马克斯克鲁维酵母基因工程菌发酵合成LNB

以乳糖或葡萄糖和半乳糖为底物，分别利用乳酸克鲁维酵母细胞、马克斯克鲁维酵母细胞、实施例1所得乳酸克鲁维酵母基因工程菌、实施例2所得马克斯酵母基因工程菌，采用两段式培养进行LNB的合成验证实验。

1. 发酵实验：

第一阶段：菌体生长期：以葡萄糖为碳源培养酵母，让酵母迅速生长，酵母生长进入对数末期或稳定期。将菌株划线培养于YDP等固体培养基中，30℃培养2-3天后挑取单菌落接种于1.5mLYPD液体培养基，30℃、200 rpm震荡培养过夜。随后按2%的接种量接种于50mL液体培养基摇瓶中，30℃、200 rpm培养至OD₆₀₀=1，按2%的接种量接种于5L的YPD培养基（酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L）中（10L体积发酵罐），30℃、200 rpm震荡培养进行菌体量积累。

第二阶段：产物合成期：30℃，200 rpm下震荡培养至40 h时，开始流加20g/L的乳糖或者用10 g/L葡萄糖和10 g/L半乳糖代替20g/L乳糖，总发酵时长72 h。发酵72 h结束后，离心发酵液，分别收集上清和沉淀，沉淀使用高压匀浆破碎仪进行菌体破碎，煮沸离心除去蛋白，合并上清液得到酵母最终的发酵产物。

2.产物的鉴定

（1）按前述HPLC分析方法检测标准品和发酵液。HPLC分析结果显示：LNB标准品出峰时间rt为10.5 min。

实施例1所得乳酸克鲁维酵母基因工程菌，实施例2所得马克斯克鲁维酵母酵母基因工程菌发酵液均在10.5 min附近出现了强吸收峰，与LNB标准品的出峰时间一致，初步说明酵母基因工程菌发酵生成了乳糖-N-二糖（LNB）。

（2）LC-MS分析

将HPLC图谱中rt=10.5 min的产物进行LC-MS分析。其中，进行LC-MS分析的条件具体是：AminexHPX-87H（Bio-Rad, Inc., Hercules.），检测器：紫外检测器（日立Chromaster），检测波长：210nm，进样量：10μL，流速：0.5ml/min，柱温：45℃，流动相为5 mM硫酸水溶液；H-ESI模式，分子量扫描范围400~900。

LC-MS图谱显示，LNB标准品分子量384.1459应为LNB+H；分子量406.1315应为LNB+Na。质谱结果检索可以得到结果如下：Compound CID: 440994，Chemcial Formula：C₁₄H₂₅NO₁₁，Extract Mass: 383.1。

发酵产物的HPLC图谱中rt=10.5 min物质的LC-MS图谱与LNB标准品的LC-MS图谱一致。说明发酵液中rt=10.5 min的物质为LNB。

综上所述，本发明酵母基因工程菌菌发酵获得的产物的分子量为383左右，而且出峰时间和LNB标准品的出峰时间一致，即，本发明所得发酵溶液中含有乳糖-N-二糖（LNB，分子量383.1）。

按上述HPLC分析方法检测发酵液中LNB产量，结果分别记录与表3、表4中。

经分析测定：

（1）乳酸克鲁维出发菌株，StrainKL-LNB-0、StrainKL-LNB-1、StrainKL-LNB-2、StrainKL-LNB-3、StrainKL-LNB-1-1、StrainKL-LNB-2-1、StrainKL-LNB-3-1、StrainKL-LNB-11、StrainKL-LNB-12基因工程菌株不产生LNB。

（2）马克斯克鲁维出发菌株，StrainKM-LNB-0、StrainKM-LNB-1、StrainKM-LNB-2、StrainKM-LNB-3、StrainKM-LNB-1-1、StrainKM-LNB-2-1、StrainKM-LNB-3-1、StrainKM-LNB-11、StrainKM-LNB-12基因工程菌株不产生LNB。

(3)其他基因工程菌株产LNB的结果分别记录于表3、表4中。

表3. 乳酸克鲁维酵母基因工程菌合成产LNB研究

。

表4. 马克斯克鲁维酵母基因工程菌产LNB研究

。

表3-4数据说明在乳酸克鲁维或马克斯克鲁维菌株中：

（1）同时导入乳糖-N-二糖磷酸化酶（LNBP）和果糖-1-磷酸磷酸化酶（YQAB）后，能够合成LNB，即使导入不同来源的乳-N-二糖磷酸化酶（LNBP）和不同来源的果糖-1-磷酸磷酸化酶（YQAB），依然能合成LNB；

（2）在（1）的基础上，通过破坏酵母的标志物GALT基因或者修饰GalT氨基酸序列，大幅度提高了LNB的产量。

（3）单独导入乳糖-N-二糖磷酸化酶（LNBP）或果糖-1-磷酸磷酸化酶（YQAB）或破坏酵母标志物GALT基因或修饰酵母标志物GALT基因，所得基因工程菌株没有合成LNB的能力。

（4）无论碳源是采用乳糖还是半乳糖和葡萄糖的混合糖，LNB的产量差异不大。

实施例4.在乳酸克鲁维酵母中构建分子开关调控LNB的生成

1. KL-ΔGALE::P _tef -CAMR-Tuap-PcamO-AGM1-Tagm-loxp-Kan-loxp表达盒的构建：

以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到GalE的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板，PCR扩增得到PUG6质粒骨架。PCR扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带回收后利用2* MultiF SeamlessAssembly Mix进行连接，各片段按等摩尔数添加，50℃连接30min后进行大肠杆菌转化。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-GALE。以PUG6-GALE质粒为模板，PCR扩增得到PUG6-GalE质粒骨架。随后以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，扩增得到启动子tef；以基因合成的转录因子CAMR为模板，PCR扩增得到转录因子CAMR序列，如SEQ IDNO.7所示；以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到UAP终止序列；以基因合成的CamR响应型启动子序列为模板，PCR扩增得到启动子CamO，如SEQ ID NO.8所示；以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到AGM1的CDS序列及其终止序列，如SEQ ID NO.9所示。将PUG6-GALE质粒骨架、启动子tef、转录因子CAMR、UAP的终止序列、启动子CamO序列、AGM1的CDS序列及其终止序列条带回收后连接，进行大肠杆菌转化。挑取阳性转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-ΔGALE-CAMR-AGM1。以PUG6-ΔGALE-CAMR-AGM1质粒为模板，GalE up-s、GalE down-a为引物进行PCR扩增即可得KL-ΔGALE::P _tef -CAMR-Tuap-PcamO-AGM1-Tagm- loxp-Kan-loxp表达盒。引物设计如下：

GalE up-s： 5’-ctatagaacgcATGTCTGAAGATAAATACTGTTTGGT-3’；

GalE up-a： 5’-gttgtcgacctgcaCAGATGGATGAGCACCAATAG-3’。

2. KL-ΔAGM1::loxp-Kan-loxp敲除盒的构建

根据AGM1的上下游序列，以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到AGM1的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，PCR扩增得到抗性序列Kan。PCR扩增得到PUG6质粒骨架。琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，连接后进行大肠杆菌转化，提取质粒，将该质粒命名为PUG6-AGM1。以PUG6-AGM1质粒为模板，AGM1 up-s、AGM1down-a为引物进行PCR扩增，即可得到KL-ΔAGM1::loxp-Kan-loxp敲除盒。引物设计如下：

AGM1 up-s：5’-cactatagaacgcgttgcgaagtctcatctgtt-3’；

AGM1 up-a：5’-tgtcgacctgcagtcacggaaagacattggtg-3’。

3.分子开关调控LNB生成的菌株构建与验证

StrainKL-LNB-13菌株的构建：将KL-ΔAGM1::loxp-Kan-loxp敲除盒和KL-Δ GalE::P _tef -CAMR-Tuap-PcamO-AGM1-Tagm-loxp-Kan-loxp表达盒转化入乳酸克鲁维酵母StrainKL-LNB-4菌株，删除G418抗性后获得StrainKL-LNB-13菌株。

为验证以上菌株的正确性，我们提取以上转化子和野生型菌株的基因组，用对应敲除盒或表达盒扩增引物对基因组进行PCR扩增。PCR扩增后有且得到唯一条带的大小与敲除盒或表达盒一致则判定菌株正确，否则判定菌株为假阳性错误。

实施例5. 在马克斯克鲁维酵母中构建分子开关调控LNB的生成

1.KM-ΔGALE::P _tef -CAMR-Tuap-PcamO-AGM1-Tagm-loxp-Kan-loxp表达盒的构建

以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到GALE的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，PCR扩增得到抗性序列Kan。以PUG6质粒为模板， PCR扩增得到PUG6质粒骨架。琼脂糖凝胶电泳回收目的条带后连接、转化。挑取阳性大肠杆菌转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-GALE。以PUG6-GalE质粒为模板，PCR扩增得到PUG6-GALE质粒骨架。随后以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，扩增得到启动子tef；以基因合成的转录因子CAMR为模板，PCR扩增得到转录因子CAMR序列；以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到UAP终止序列；以基因合成的CAMR响应型启动子序列为模板，PCR扩增得到启动子CamO；以马克斯克鲁维酵母基因组为模板，PCR扩增得到AGM1的CDS序列及其终止序列。将PUG6-GALE质粒骨架、启动子tef、转录因子CAMR、UAP的终止序列、启动子CamO序列、AGM1的CDS序列及其终止序列条带回收后利用2* MultiF Seamless Assembly Mix进行连接，转化入大肠杆菌。挑取阳性转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-ΔGALE-CAMR-AGM1。以PUG6-ΔGALE-CAMR-AGM1质粒为模板，GalE up-s、GalE down-a为引物进行PCR扩增即可得KM-Δ GALE::P _tef -CAMR-Tuap-PcamO-AGM1-Tagm-loxp-Kan-loxp表达盒。引物设计如下：

GalE up-s：5’-ctatagaacgcATGTCTGAAGATAAATACTGTTTGGT-3’；

GalE up-a：5’-gttgtcgacctgcaCAGATGGATGAGCACCAATAG-3’。

2. KM-ΔAGM1::loxp-Kan-loxp敲除盒的构建：

根据AGM1的上下游序列，以马克斯克鲁维酵母基因组为模板， PCR扩增得到AGM1的上下游序列。以含有Kan抗性的pUG6质粒为模板，PCR扩增得到抗性序列Kan。PCR扩增得到PUG6质粒骨架。上述各片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带后连接，进行大肠杆菌转化。挑取阳性转化子进行质粒提取，将该质粒命名为PUG6-AGM1。以PUG6-AGM1质粒为模板，AGM1 up-s、AGM1down-a为引物进行PCR扩增，即可得到KM-ΔAGM1::loxp-Kan-loxp敲除盒。引物设计如下：

AGM1 up-s：5’-cactatagaacgcgttgcgaagtctcatctgtt-3’；

AGM1 up-a：5’-tgtcgacctgcagtcacggaaagacattggtg-3’。

3. 分子开关调控LNB生成的菌株构建与验证

StrainKM-LNB-13菌株的构建：将KM-ΔAGM1::loxp-Kan-loxp敲除盒和KM-Δ GALE::P _tef -CAMR-Tuap-PcamO-AGM1-Tagm-loxp-Kan-loxp表达盒转化入马克斯克鲁维酵母LNB-4菌株，删除G418抗性后获得StrainKM-LNB-13菌株。

实施例6.实施例4-5所得乳酸克鲁维酵母基因工程菌、马克斯克鲁维酵母基因工程菌发酵实验

以20g/L乳糖或者10 g/L葡萄糖和10 g/L半乳糖代替乳糖为碳源，樟脑为分子开关调控小分子，采用两段式培养进行LNB的合成验证实验。

1. 发酵实验

第一阶段为菌体生长期：同实施例3发酵实验第一阶段。

第二阶段为产物合成期：30℃，200 rpm下震荡培养至40 h时，开始流加20 g/L乳糖或者10 g/L葡萄糖和10 g/L半乳糖，同时添加200 µM的樟脑进行发酵，总发酵时长72h。发酵72h结束后，离心发酵液，分别收集上清和沉淀，沉淀使用高压匀浆破碎仪进行菌体破碎，煮沸离心除去蛋白，合并上清液得到酵母最终的发酵产物。

2.产物的鉴定与含量分析方法同实施例3，酵母基因工程菌株产LNB的量分别记录与表5。

表5.乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母基因工程菌株合成LNB

。

表5数据说明：乳酸克鲁维酵母基因工程菌株和马克斯克鲁维酵母基因工程菌株在导入分子开关之后前，在生长之后的稳定期，通过添加具有分子开关调控功能的小分子物质，改变了酵母内部的代谢流，从而大幅度提高了LNB的产量近十倍。

虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明以及实例的方式相当详细描述了本发明，本领域普通技术人员将清楚的是，可以实施任何等效方面或修饰。因此，本说明书和实施例不应当解释为限制本发明的范围。

Claims

1.一种酵母基因工程菌，其特征在于，以含有乳糖或半乳糖的培养基为原料合成乳糖-N-二糖（Lacto-N-biose，LNB）。

2.如权利要求1所述酵母基因工程菌，其特征在于，包含(1)异源的乳-N-二糖磷酸化酶（Lacto-N-biose phosphorylase，LNBP）基因，和（2）果糖-1-磷酸磷酸化酶（fructose-1-phosphate/6-phosphogluconate phosphatase，YQAB）基因。

3.如权利要求1-2所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述乳糖-N-二糖磷酸化酶（Lnbp），包含氨基酸序列与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2具有至少67%、至少68%、至少69%、70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的序列一致性。

4.如权利要求1-2所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述乳糖-N-二糖磷酸化酶（Lnbp），来源于长双歧杆菌Biﬁdobacteirum longum，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.如权利要求1-2所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述乳糖-N-二糖磷酸化酶（Lnbp），来源于芽孢杆菌Bacillus cereus，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.如权利要求1-5所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述果糖-1-磷酸磷酸化酶（Yqab），包含氨基酸序列与SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4具有至少67%、至少68%、至少69%、70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的序列一致性。

7.如权利要求1-6所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述果糖-1-磷酸磷酸化酶（Yqab），来源于大肠埃希氏菌Escherichia coli，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

8.如权利要求1-6所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述果糖-1-磷酸磷酸化酶（Yqab），来源于细菌性甘薯茎腐病菌Dickeya dadantii，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

9.如权利要求1-8所述酵母基因工程菌，其特征在于，所述酵母细胞可以是萨酵母属（Issatchenkia sp.）、假丝酵母属（Candida sp.）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces sp.）、毕赤酵母属（Pichia sp.）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces sp.）、汉逊酵母属（Hansenulasp.）、有孢圆酵母属（Torulaspora sp.）、耶氏酵母属（Yarrowia sp.）、接合酵母属（Zygosaccharomyces sp.）或酵母属（Saccharomyces sp.）酵母细胞；

优选的，为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxinus）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、禾本红酵母（Rhodotorula graminis）、巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）。

10.如权利要求1-9所述酵母基因工程菌，其特征在于，还包含对酵母标志物基因的破坏或者修饰；

所述酵母标志物基因，优选的，为半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶（galactose-1-phosphate uridyltransferase，GALT）基因，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:5或者SEQ IDNO:6具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的序列一致性；

所述酵母标志物基因，优选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示。