CN117866038A - 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法，所述方法包括将含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白溶液在亲和层析柱上进行上样，用平衡溶液漂洗所述亲和层析柱；用PEI溶液漂洗所述亲和层析柱，洗脱下来的蛋白置换到低盐体系后，用阳离子层析柱进行纯化或者用阴离子层析柱进纯化。本发明在原有的亲和层析步骤中增加一步PEI漂洗，通过优化PEI漂洗浓度与体积有效解决HCD残留问题，本发明方法简单，蛋白损失小、HCD残留低且无PEI残留，同时该方法也适用于多种类型蛋白，具备可大量纯化制备，纯化效率高、成本低特点。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体而言，涉及纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法。
背景技术
重组蛋白制品已广泛应用于科学研究、生化分析或医疗领域，重组蛋白在提取与纯化过程中会伴随大量宿主核酸(Host Cell DNA, HCD)残留，特别在分子实验中宿主核酸会干扰我们对实验结果的分析与判断，生物药用制品中残留HCD也会带来致癌与感染风险，所以纯化出低HCD残留的重组蛋白具有重要意义。
想要拿到高纯度、低残留的带亲和标签蛋白，通常第一步纯化是进行亲和层析来富集蛋白；第二步进行离子层析提高纯度和降低杂质残留。但对于HCD残留要求很高的酸性蛋白（本专利描述的酸性蛋白指在纯化溶液中表面总净电荷为负的蛋白）在经过亲和-离子层析后很难有效将HCD含量降低至100pg/mg以下，因为酸性蛋白和HCD表面都带负电荷，离子层析方法无法有效将酸性蛋白与HCD分离，这极大增加了酸性蛋白纯化难度和工艺成本。
PEI（聚乙烯亚胺，Polyethylenimine）是一种水溶性较高的分子聚合物也是目前已知的电荷密度最大的阳离子有机高分子材料，且具有高附着性、高吸附性、高阳离子性、高反应性、细胞毒性小等优点。行业中是一般采用PEI沉淀法去除HCD，但该方法对酸性蛋白存在蛋白损失大、核酸去除不彻底和PEI残留问题。因此亟需新的技术来解决蛋白的HCD残留问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：将含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白溶液在亲和层析柱上进行上样，所述酸性蛋白与所述亲和层析柱上配基进行特异性结合；步骤2：上样完成后，用平衡溶液漂洗所述亲和层析柱；步骤3：步骤2之后，用PEI溶液漂洗所述亲和层析柱，在漂洗过程中，PEI带着核酸冲洗下来，所述酸性蛋白依然结合在所述亲和层析柱上；步骤4：步骤3之后，用平衡溶液再漂洗所述亲和层析柱，漂洗完成后用洗脱液将所述酸性蛋白从所述亲和层析柱上洗脱下来；和，步骤5：洗脱下来的蛋白置换到低盐体系后，用阳离子层析柱进行纯化，低盐洗脱所述酸性蛋白，或者用阴离子层析柱进纯化，低盐去除可能残留的PEI，再用高盐洗脱所述酸性蛋白，从而根据PEI与所述酸性蛋白在离子柱上的挂柱差异分离酸性蛋白和PEI，得到纯化的所述酸性蛋白。
在一种实施方式中，步骤2中PEI漂洗体积不小于5个柱体积和PEI体积浓度不小于0.003%。
在一种实施方式中，步骤2中PEI漂洗体积不大于9个柱体积、PEI体积浓度不大于0.004%。
在一种实施方式中，步骤2中PEI漂洗体积为8个柱体积、PEI体积浓度为0.004%。
在一种实施方式中，所述酸性蛋白是分子酶。
在本发明中，蛋白溶液在亲和柱上后，此时蛋白与在层析柱上与亲和配基进行特异性结合形成配基-蛋白复合体；对于某些特殊蛋白如分子酶（本申请中分子酶是指其底物是核酸的酶，可以与核酸结合）则会形成配基-分子酶-核酸复合体，常规纯化手段很难将核酸从配基-分子酶-核酸复合体上分离，但本发明的方法可以完美解决分离问题。PEI漂洗亲和柱时，由于PEI带高密度的正电荷，核酸带负电荷，PEI会包裹亲和柱里面的核酸，强行将核酸从蛋白上剥离，形成PEI-核酸复合体，又由于分子间的离子作用力一般比亲和力要小，所以在漂洗过程中，蛋白依然结合在层析柱上，核酸被PEI包裹洗脱下来。
PEI漂洗亲和柱时，由于PEI带阳离子，核酸带阴离子，PEI会包裹亲和柱里面的核酸形成PEI-核酸复合体，由于分子间的离子作用力一般比亲和力要小，所以在漂洗过程中，PEI带着核酸冲洗下来，蛋白依然结合在层析柱上。
从亲和柱上洗脱下来的酸性蛋白溶液中可能会有PEI残留，低盐条件下酸性蛋白会流穿阳离子层析柱或挂阴离子层析柱，但在低盐条件下PEI会流穿阴离子柱或挂阳离子柱，根据PEI与酸性蛋白在离子柱上的挂柱差异可分离酸性蛋白和PEI。
本发明的方案工艺简单，获得的酸性蛋白中HCD去除彻底，HCD去除率大于99%，HCD最低含量可降低至10pg/mg，蛋白损失小于10%。本发明方法克服了现有带亲和标签的酸性蛋白在去除HCD技术工艺相对复杂、蛋白损失过大且核酸残留偏高问题。
本发明在原有的亲和层析步骤中增加一步PEI漂洗，通过优化PEI漂洗浓度与体积有效解决HCD残留问题，本发明方法简单，蛋白损失小、HCD残留低且无PEI残留，同时该方法也适用于多种类型蛋白，具备可大量纯化制备，纯化效率高、成本低特点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明中HCD残留与PEI浓度、漂洗体积的等值线图；
图2是本发明中蛋白相对损失率与 PEI浓度、漂洗体积的等值线图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
一. 实验方案
1. 破菌，获取澄清蛋白溶液；
2. 亲和层析上样与漂洗：16支亲和柱分别上样蛋白溶液，上样完成后用平衡液漂洗掉残余上清；
3. PEI漂洗亲和层析柱：将16支亲和柱进行排序，见表1，用对应的PEI漂洗液分别漂洗亲和柱；再次用亲和层析平衡液漂洗掉残余PEI；
4. 从亲和柱上洗脱目的蛋白：用亲和层析洗脱液将16支亲和层析柱上的蛋白洗脱下来；
5. 离子柱上样与漂洗：用离子层析平衡液分别稀释洗脱下来的蛋白；稀释后的蛋白分别上样16支离子柱，上样完成后用平衡液漂洗离子柱；
6. 从离子柱上洗脱目的蛋白：用离子层析洗脱液分别将目的蛋白从离子柱上洗脱下来，对洗脱下来的蛋白检测蛋白浓度和宿主核酸残留。
二. 材料
材料：16支相同规格亲和层析高通量纯化枪头、16支相同规格离子层析高通量纯化枪头；
菌体：带His亲和标签的酸性蛋白BESN0024在大肠杆菌(BL21(DE3))表达后的菌体；
PEI：聚乙烯亚胺，沃凯，[9002-98-6]，M.W.70000。
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷，沪试，Lot: 20230726
NaCl：氯化钠，沪试，Lot: 20230915
咪唑：麦考林，Lot: C14739942
逗点生物DNA合成用筛板Φ4.1mm 厚度2.5mm 孔径20μm。
不带滤芯1mL移液枪头。
亲和填料：NW Rose NiFF，纳微，Lot: L04D0701
离子层析填料：SP Sepharose High Performance，思拓凡cytiva，Lot:10333816。
三．纯化具体步骤
1. 试剂准备：亲和层析阶段用到试剂：亲和层析平衡液A液: 20mM Tris，500mMNaCl，25mM咪唑，pH8.0；PEI漂洗液A1液: 20mM Tris，500mM NaCl，25mM咪唑，pH8.0+0.001%PEI；PEI漂洗液A2液: 20mM Tris，500mM NaCl，25mM咪唑，pH8.0+0.005%PEI；PEI漂洗液A3液: 20mM Tris，500mM NaCl，25mM咪唑，pH8.0+0.01%PEI；PEI漂洗液A4液: 20mM Tris，500mM NaCl，25mM咪唑，pH8.0+0.02%PEI；亲和层析洗脱液B液: 20mM Tris，500mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0。离子层析用到试剂：离子层析平衡液SPA液：20mM Tris， pH8.0；离子层析洗脱液SPB液：20mM Tris，100mM NaCl，pH8.0。
高通量纯化枪头制备：取1mL枪头，加入一片DNA合成用筛板作为下堵头，压实堵头后加入500μL Ni层析填料溶液，分装16支亲和层析枪头标记0/a1/b1/c1/a2/b2/c2/a3/b3/c3/a4/b4/c4/a5/b5/c5；相同方法组装16支离子层析枪头，分别标记SP1~16。
2. 取5g BESN0024菌体，加入50mL亲和柱A液，重悬后进行超声破碎20min。破菌液12000rpm离心30min后，上清用0.22μm滤膜过滤。
3. 从标记为0/a1/b1/c1/a2/b2/c2/a3/b3/c4/a4/b4/c4/a5/b5/c5的16支枪头上端分别用平衡液亲和柱A液平衡5mL，平衡后上样2mL破菌上清，上样完成用亲和柱A液漂洗2.5mL。
4. a1/b1/c1枪头分别用A液漂洗2.5mL、5mL、7.5mL。a2/b2/c2枪头分别用A1液漂洗2.5mL、5mL、7.5mL。a3/b3/c3枪头分别用A2液漂洗2.5mL、5mL、7.5mL。a4/b4/c4枪头分别用A3液漂洗2.5mL、5mL、7.5mL。a5/b5/c5枪头分别用A4液漂洗2.5mL、5mL、7.5mL。再分别加入2.5mL亲和柱A液到a1/b1/c1/a2/b2/c2/a3/b3/c3/a4/b4/c4/a5/b5/c5枪头中进行漂洗。
5.漂洗结束后加入1mL洗脱液到0/a1/b1/c1/a2/b2/c2/a3/b3/c3/a4/b4/c4/a5/b5/c5枪头中，对目的蛋白进行洗脱，分别收集洗脱组分标记为Ni-1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16。
6. 将Ni-1~16分别用9mL离子层析平衡液SPA液稀释。稀释后的Ni-1~16蛋白分别上样对应SP1~16离子层析柱，上样完成后用平衡液SPA液漂洗2.5mL。
7. 离子柱漂洗结束后分别加入1mL离子层析洗脱液SPB液到SP1~16离子层析柱中，将目的蛋白洗脱下来，分别收集洗脱组分标记为1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16。检测1-16组分蛋白浓度以及宿主核酸残留，检测结果如下表1。
表1 不同PEI体积浓度和漂洗体积对蛋白损失和宿主核酸残留结果
。
表1数据进行处理，以PEI浓度与漂洗体积作为因子，宿主核酸残留作为响应值，获得了图1，HCD残留与PEI浓度、漂洗体积的等值线图。由图1可知，当PEI漂洗体积不小于5个柱体积、PEI体积浓度不小于0.003%时HCD残留低于100pg/mg。
以PEI浓度与漂洗体积作为因子，蛋白相对损失率作为响应获得了图2，蛋白相对损失率与 PEI浓度、 漂洗体积 的等值线图。由图2可知，当PEI漂洗体积不大于9个柱体积、PEI体积浓度不大于0.004%时蛋白相对损失率低于10%。
结论：经过第一步Ni富集后，由图1和图2可知，当PEI漂洗体积应介于5-9个柱体积、PEI体积浓度介于0.003%-0.004%时去除HCD的效果最好，综合可选择最优PEI体积浓度为0.004%，漂洗体积为8个柱体积。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (5)
1.纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：将含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白溶液在亲和层析柱上进行上样，所述酸性蛋白与所述亲和层析柱上配基进行特异性结合；
步骤2：上样完成后，用平衡溶液漂洗所述亲和层析柱；
步骤3：步骤2之后，用PEI溶液漂洗所述亲和层析柱，在漂洗过程中，PEI带着核酸冲洗下来，所述酸性蛋白依然结合在所述亲和层析柱上；
步骤4：步骤3之后，用平衡溶液再漂洗所述亲和层析柱，漂洗完成后用洗脱液将所述酸性蛋白从所述亲和层析柱上洗脱下来；
步骤5：洗脱下来的蛋白置换到低盐体系后，用阳离子层析柱进行纯化，低盐洗脱所述酸性蛋白，或者用阴离子层析柱进纯化，低盐去除可能残留的PEI，再用高盐洗脱所述酸性蛋白，从而根据PEI与所述酸性蛋白在离子柱上的挂柱差异分离酸性蛋白和PEI，得到纯化的所述酸性蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中PEI漂洗体积不小于5个柱体积和PEI体积浓度不小于0.003%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中PEI漂洗体积不大于9个柱体积、PEI体积浓度不大于0.004%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中PEI漂洗体积为8个柱体积、PEI体积浓度为0.004%。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述酸性蛋白是分子酶。
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