CN117865335B - 一种利用混合藻膜处理高氨氮废水的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于高氨氮废水处理技术领域。本发明公开了一株能与绿藻形成混合藻膜的集胞藻S1及其应用。本发明还公开一种利用集胞藻S1与绿藻形成混合藻膜处理高氨氮废水的方法，所述方法为将集胞藻与绿藻的混合种子液加入旋转生物膜反应器中进行覆膜培养形成混合藻膜，然后运行旋转生物膜反应器进行高氨氮废水处理。本发明的方法能处理1000mg/L浓度的高氨氮废水，并且生物质产量高，氨氮的去除效果好，通过刮取就可以回收藻细胞，克服了传统悬浮培养方式中光照利用率低、采收难度大、无法连续处理运行等缺点，可在收获高价值微藻生物质的同时连续高效生物转化废水中的氨氮。

Description

一种利用混合藻膜处理高氨氮废水的方法

技术领域

本发明属于高氨氮废水处理技术领域。更具体地，涉及一种利用混合藻膜处理高氨氮废水的方法。

背景技术

高氨氮废水是指水体中氨氮浓度超过200mg/L的污染水体，其来源广泛、成分复杂且排放量大，普遍见于工业及养殖废水，来源包括金属冶炼业、食品加工业、畜禽养殖业、垃圾渗滤液和半导体行业等，排放到水体中会导致水体富营养化和引起生物毒害作用，还会造成土壤退化、地下水污染等一系列严重环境问题。现今一些传统的处理方法(如物理吹脱法、化学沉淀法和生物硝化/反硝化工艺脱氮)普遍存在处理成本高、有污泥产生、工艺复杂且流程长、易造成二次污染等诸多不足。

微藻是指个体微小、需在显微镜下才能辨别其形态结构的藻类。一方面，微藻具有微生物的结构简单、生长繁殖快的特点，易于大规模培养；另一方面，微藻能利用太阳能(其光合效率比植物更高)和水体中的氮、磷等作为养分，进行自养生长并在细胞内积累大量蛋白质、油脂、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等高价值生物活性物质。相较于传统的高氨氮废水资源化利用方式，利用微藻处理高氨氮废水，其处理过程不会产生或释放有毒物质，还能同时获得大量微藻生物质；这些生物质可进一步加工成肥料、生物燃料、动物饲料及化工产品等高附加值产品，实现废水资源化循环利用，降低其处理成本，符合循环经济的发展需求。基于微藻的处理技术逐渐成为废水处理研究的热点。

然而，虽然氨氮是易被大多数微藻利用的氮源形式，但大多数微藻对高浓度氨氮的耐受性不高，很难直接应用于高氨氮废水处理。目前报道过的关于利用混合藻膜技术进行高氨氮废水处理的方案最高只能耐受600mg/L(CN106396112A)。现有实际应用中的做法是需对氨氮废水进行预处理降低氨氮浓度，如“一种处理高浓度氨氮养猪沼液的方法”(CN104445816A)利用沸石对高氨氮沼液进行预处理；“一种利用吸附处理氨氮废水培养微藻的方法”(CN109912136A)采用活性炭、离子交换树脂等吸附剂对高氨氮废水进行预处理等。

最近，魏东等人公开了一种利用蛋白核小球藻进行发酵培养直接处理高氨氮废水的方法(CN110627213B)，虽然该技术能直接处理高浓度氨氮废水、无需预处理降低氨氮浓度，但其发酵过程需要进行补料(如碳源、磷源)，光发酵装置设计复杂，处理方法繁琐，且为批式培养，无法连续处理运行。更重要的是，在这些微藻处理方法中，微藻都是在水体中悬浮生长，光的衰减会导致藻类产率下降，从而导致废水处理效率降低；另外，在进行藻细胞的回收时，离心、过滤等方法能耗高，重力驱动沉降法效率低而絮凝技术存在引入铝、铁等金属离子的风险，包埋、共价结合等固定化技术大大增加了处理难度和运行成本。藻细胞的采收问题严重限制了微藻废水处理方法的发展和应用。

因此，针对现有利用微藻对高氨氮废水处理技术的不足，急需研发出绿色、高效、能耗成本低、操作简单的处理方法。

发明内容

为了克服现有利用微藻处理废水中耐高氨氮能力的不足与无法连续处理运行的缺陷，本发明提供一种利用混合藻膜处理高氨氮废水的方法，具体是利用旋转生物膜反应器培养一种蓝藻和一种绿藻形成混合藻膜生物转化水体高氨氮的方法。

本发明的第一个目的是提供一株能与绿藻形成混合藻膜而用于处理高氨氮废水的集胞藻。

本发明的第二个目的是提供上述集胞藻在处理氨氮废水中的应用。

本发明的第三个目的是提供上述集胞藻在与绿藻协同处理氨氮废水或与绿藻形成藻膜中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种利用混合藻膜处理高氨氮废水的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一株能与绿藻形成混合藻膜而用于处理高氨氮废水的集胞藻S1，该菌株已于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M20231999。

利用该集胞藻与绿藻形成混合藻膜进而运用旋转生物膜反应器可以直接对极高浓度的氨氮废水进行处理，效率高，能耗成本低，操作简单。因此本发明提供以下应用：

本发明提供上述集胞藻S1在处理氨氮废水中的应用。

本发明还提供上述集胞藻S1在与绿藻协同处理氨氮废水或与绿藻形成藻膜中的应用。

本发明提供一种利用混合藻膜处理高氨氮废水的方法，所述方法为将上述集胞藻S1与绿藻的混合种子液加入旋转生物膜反应器中进行覆膜培养形成混合藻膜，然后运行旋转生物膜反应器进行高氨氮废水处理。

优选地，集胞藻S1与绿藻的混合种子液的藻液密度不低于0.5g/L。

优选地，集胞藻S1与绿藻的混合种子液的藻液密度0.5～100g/L。

优选地，混合种子液由集胞藻S1的藻液与绿藻的藻液按体积比(1～9)：(1～9)混合培养得到。

更优选地，混合种子液由集胞藻S1的藻液与绿藻的藻液按体积比(1～3)：(1～3)混合培养得到(更优选地按体积比为1:1混合培养得到)。

优选地，所述绿藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。

具体地，上述氨氮废水为氨氮浓度超过200mg/L的高浓度氨氮废水。如200～1000mg/L的高氨氮废水。

优选地，废水处理的水力体停留时间为1～5天。更优选地，废水处理的水力体停留时间为1～3天。

优选地，所述混合种子液加入旋转生物膜反应器前，旋转生物膜反应器需在水中运行12～48小时。

更优选地，所述混合种子液加入旋转生物膜反应器前，旋转生物膜反应器需在水中运行24小时。

优选地，所述混合种子液的培养条件为在20～30℃、100～200rpm转速和2500-2700lux光强下培养。

更优选地，所述混合种子液的培养条件为在25℃、150rpm和2600lux光强下培养。

优选地，所述覆膜培养的条件为在20～30℃、100～200rpm转速和2500-2700lux光强下培养5～10天。

作为可选择的实施方式，所述利用集胞藻S1与蛋白核小球藻的混合藻膜处理高氨氮废水的方法包括如下步骤：

S1.混合种子液制备：

S11.分别将斜面保藏集胞藻S1与蛋白核小球藻接种到BG11培养基中进行活化，在20～30℃、100～200rpm和2500-2700lux光强下培养，得到集胞藻S1藻液与蛋白核小球藻藻液两种藻液；

S12.将集胞藻S1藻液与蛋白核小球藻藻液以比例为(1～9)：(1～9)混合后培养，所得混合藻液即为混合种子液；

S2.覆膜：将步骤S1的混合种子液加入旋转生物膜反应器中进行覆膜培养5～10天形成混合藻膜，藻膜形成后刮取膜上多余的微藻；

S3.废水处理：将氨氮废水作为反应器进水，通入完成覆膜的旋转生物膜反应器中进行处理，设置不同水力体停留时间，进行混合藻膜的氨氮废水连续处理，在5～10d时刮取收集膜上的微藻。

优选地，步骤S11所述培养至藻液密度不低于0.5g/L。

实践中用量大时，可采用多级扩大培养的方式制备大量藻液。

优选地，步骤S12所述培养的条件20～30℃、100～200rpm和2500-2700lux光强下培养至藻液密度不低于0.5g/L。

优选地，步骤S2所述的旋转生物膜反应器框架采用铝合金材质。

优选地，步骤S2所述旋转生物膜反应器为半浸式旋转生物膜反应器。

优选地，步骤S2所述旋转生物膜反应器的转速为2～6cm/s。

优选地，步骤S2所述旋转生物膜反应器在加入混合种子液前，需在旋转生物膜反应器的水槽中加入纯水，让膜在纯水中运行24h形成潮湿环境，之后排干水槽中的纯水，再加入混合种子液。

优选地，步骤S3设置水力体停留时间为1～5天。

更优选地，步骤S3设置水力体停留时间为3天。

本发明具有以下有益效果：

本发明利用旋转生物膜反应器培养一种蓝藻和一种绿藻形成混合藻膜连续处理高氨氮废水，可直接处理高氨氮废水、不需预处理，并且在处理过程中无需进行补料，可以连续进行废水处理。该技术通过覆膜生长形成的混合藻膜对高氨氮耐受力强，能耐受1000mg/L的氨氮浓度，生物质产量高，氨氮的去除效果好，且通过刮取就可以回收藻细胞，无需补料(即无需额外添加碳源、磷源等)，可连续运行处理，克服了传统悬浮培养方式中光照利用率低、采收难度大、无法连续处理运行等缺点，可在收获高价值微藻生物质的同时连续高效生物转化废水中的氨氮。

附图说明

图1为100mg/L(a)、250mg/L(b)、500mg/L(c)和1000mg/L(d)NH₄ ⁺-N浓度下混合藻膜的生长状态。

图2为不同NH₄ ⁺-N浓度下旋转生物膜反应器(RAB)和鼓泡式柱式悬浮培养反应器(BC)中微藻的生物质产率结果(RAB-1代表RAB设置HRT为1d；RAB-3代表RAB设置HRT为3d；BC-3代表BC设置HRT为3d)。

图3为处理250mg/L(a)、500mg/L(b)和1000mg/L(c)氨氮废水过程中反应器进水和出水的NH₄ ⁺-N浓度测定结果。

图4为不同藻膜处理不同浓度高氨氮废水时的氨氮去除率结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)购于中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology,FACHB)，编号FACHB-27。颤藻(Oscillatoria lutea var.contorta)购买于中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-278。

BG11培养基配方为NaNO₃ 1500mg/L、MgSO₄·7H₂O 75mg/L、K₂HPO₄·3H₂O52mg/L、CaCl₂·2H₂O 36mg/L、Na₂CO₃ 20mg/L、Ctric acid·H₂O 6.6mg/L、Ferric ammoniumcitrate 6mg/L、EDTANa₂·2H₂O 1.1mg/L、A5(Trace metal solution)1mL/L；A5(Tracemetal solution)的配方为H₃BO₃ 2.86g/L、MnCl₄·4H₂O 1.86g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L、CuSO₄·5H₂O 0.08g/L、Co(NOз)₂·6H₂O 0.05g/L。

以下实施例中，生物质产率测定方法为干重法，具体操作如下：收获的微藻生物质经纯水洗涤3次后，使用滤膜过滤(滤膜已在105℃烘箱中烘干至恒重并记录重量)，过滤后将带有藻细胞沉淀的滤膜再次在105℃下烘干6h以上，直至滤膜重量不再变化，待滤膜在干燥器中冷却至室温后再进行称重。滤膜前后重量的差值即为收获的微藻生物质的重量。以1.2L的工作体积进行换算，可以得到总的生物量，除以对应的工作周期后，即可得到生物质产率。

实施例中使用的旋转生物膜反应器具体为发明人在先申请的美国专利US11691902B2中的旋转藻类生物膜光生物反应器。旋转生物膜反应器包括框架、电机、转筒、膜、水槽(1.2L)等组件。

实施例1集胞藻S1的分离与鉴定

1、菌株分离

在广州市番禺区海鸥岛虾塘进行表层水样采集，用GF/C滤膜(1.2μm)抽滤200mL水样收集藻细胞；将过滤后的滤膜放入含适量无菌BG11培养液的取样管，低温保活运输到实验室。将取样管中滤膜上的藻细胞清洗并转移到BG11培养基进行培养，待藻液呈现蓝绿色时，取少量藻液进行梯度稀释。取10μL稀释好的样品，将样品挤在盖玻片上进行显微镜观察(稀释倍数以最终显微镜每个视野中只存在一个细胞为准)。根据稀释好的浓度，取100μL稀释好的样品在BG11固体培养基进行涂布，每个样品涂3个平板，涂好后用封口膜封好，倒立放在1000-3000lux光照下进行培养观察。待长出菌落后继续挑单菌落划线，持续2-3轮纯化后获得微藻纯种，记录为菌株S1。

2、菌株S1的鉴定

形态鉴定：菌株S1在BG11固体培养基下的单菌落为近圆形，颜色为蓝绿色。

分子生物学鉴定：菌株S1经分子生物学16S rDNA测序并比对鉴定属于集胞藻属(Synechocystis)。

综上，菌株S1鉴定属于集胞藻(Synechocystis sp.)，并于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20231999。

实施例2微藻混合种子液的制备

微藻混合种子液的制备方法为：

S11.将斜面保藏的集胞藻和蛋白核小球藻分别接种到BG11培养基中进行活化，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养约10天，至藻液颜色发生明显变化、藻细胞密度较高时(藻液密度不低于0.5g/L)进行扩种培养。

S12.第一次扩种培养：分别取10mL集胞藻藻液和蛋白核小球藻藻液，分别接种到含有90mL BG11培养基的锥形瓶中，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养2周。

S13.第二次扩种培养：利用鼓泡柱式反应器分别对两种藻进行二次扩大培养，在每个反应器中加入400mL藻液和800mL BG11培养基，连接气泵通入空气(防止微藻沉底，气速1mL/s)，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养至藻液密度不低于0.5g/L，获得高密度藻液。

S14.将15L的集胞藻藻液与15L的蛋白核小球藻藻液加入平板反应器中，加入130L的BG11培养基，在25℃、150rpm和2600lux光强下继续培养一周左右，至藻液密度达到0.5g/L以上，所得混合藻液即为混合种子液。

实施例3微藻混合种子液的制备

微藻种子液的制备方法为：将斜面保藏的集胞藻和蛋白核小球藻分别接种到BG11培养基中进行活化，在20℃、200rpm和2700lux光强下培养约10天，至藻液颜色发生明显变化、藻细胞密度较高时进行扩种培养。取10mL藻液接种到含有90mL BG11培养基的锥形瓶中，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养2周。利用鼓泡柱式反应器分别对两种藻进行二次扩大培养，在每个反应器中加入400mL藻液和800mL BG11培养基，连接气泵通入空气(防止微藻沉底，气速1mL/s)，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养至藻液密度达到0.5g/L以上，获得高密度藻液。将3L的集胞藻藻液与27L的蛋白核小球藻藻液加入平板反应器中，加入130L的BG11培养基，在25℃、150rpm和2600lux光强下继续培养一周左右，至藻液密度达到0.5g/L以上，所得混合藻液即为混合种子液。

实施例4微藻混合种子液的制备

微藻种子液的制备方法为：将斜面保藏的集胞藻和蛋白核小球藻分别接种到BG11培养基中进行活化，在30℃、100rpm和2500lux光强下培养约10天，至藻液颜色发生明显变化、藻细胞密度较高时进行扩种培养。取10mL藻液接种到含有90mL BG11培养基的锥形瓶中，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养2周。利用鼓泡柱式反应器分别对两种藻进行二次扩大培养，在每个反应器中加入400mL藻液和800mL BG11培养基，连接气泵通入空气(防止微藻沉底，气速1mL/s)，在25℃、150rpm和2600lux光强下培养至藻液密度达到0.5g/L以上，获得高密度藻液。将27L的集胞藻藻液与3L的蛋白核小球藻藻液加入平板反应器中，加入130L的BG11培养基，在25℃、150rpm和2600lux光强下继续培养一周左右，至藻液密度达到0.5g/L以上，所得混合藻液即为混合种子液。

实施例5

(一)试验方法

在旋转生物膜反应器(revolving algal biofilm photobioreactor,RAB)的水槽中加入纯水，待膜在纯水中运行24h形成潮湿环境后，排干水槽中纯水，加入实施例2中的混合种子液继续运行进行微藻覆膜生长，混合种子液加入量以没过RAB的膜为准，微藻覆膜生长10d后刮取收集膜上多余的微藻，得到在RAB上形成的集胞藻与蛋白核小球藻的混合藻膜。

将不同浓度的高氨氮废水作为反应器进水，分别通入旋转生物膜反应器(revolving algal biofilm photobioreactor,RAB)与鼓泡式柱式悬浮培养反应器(Bubble Column，BC)中进行处理。设置RAB的水力停留时间(Hydraulic Retention Time，HRT)为1d和3d，BC的HRT设置为3d。RAB以4cm/s速度旋转，每10d分别收集RAB和BC中的微藻进行生物质产率测定。

反应器进水所用高氨氮废水是在无氮BG11培养基(去除氮源，即BG11培养基配方中不添加NaNO₃)中添加铵盐NH₄Cl，通过调整NH₄Cl的添加量调节无氮BG11培养基的氨氮终浓度。高氨氮废水设置4个氨氮终浓度，分别为100mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L。

(二)试验结果

不同NH₄ ⁺-N浓度下集胞藻与蛋白核小球藻的混合藻膜的生长状态如图1所示，从图1可以看出在不同浓度的氨氮废水培养的混合藻膜均生长良好，即使氨氮浓度达到1000mg/L时，其生长也没有明显受到抑制。

不同处理组的微藻生物质产率如图2所示，从图2可知，在RAB中氨氮废水培养的混合藻膜均生长良好，即使氨氮浓度达到1000mg/L时，其生长也没有明显受到抑制，表明集胞藻与蛋白核小球藻在RAB覆膜生长时，不仅能有效地控制体系内的微生物污染，有利于生物膜系统的稳定，还能增强对高氨氮的耐受力。另外水力停留时间为3d的微藻培养系统的生物质产量要显著高于水力停留时间为1d的处理。而在BC中悬浮培养的微藻因受到排水损失和高氨氮的影响，氨氮浓度达到500mg/L时藻细胞已完全死亡。

实施例6

(一)试验方法

参考实施例5试验方法获得在RAB上形成的集胞藻与蛋白核小球藻的混合藻膜。将不同浓度的高氨氮废水作为反应器进水，通入RAB中对高氨氮废水进行连续进出水处理，分别设置RAB的水力停留时间为1d和3d。每天对各处理组反应器出水中氨氮的浓度进行测定，反应器连续运行30d。

反应器进水所用高氨氮废水是在无氮BG11培养基(去除氮源，即BG11培养基配方中不添加NaNO₃)中添加铵盐NH₄Cl，通过调整NH₄Cl的添加量调节无氮BG11培养基的氨氮终浓度。高氨氮废水设置3个氨氮终浓度，分别为250mg/L、500mg/L、1000mg/L。

各处理组出水中氨氮浓度测定结果如图3所示，从图3可以看出在水力停留时间为3d时，集胞藻与蛋白核小球藻的混合藻膜能完全去除250mg/L和500mg/L的氨氮，对1000mg/L氨氮的去除率为84％；当水力停留时间为1d时，混合藻膜对250mg/L、500mg/L和1000mg/L氨氮的去除率分别为96％、94％和80％，去除速率最高达781mg/L-day及5208mg/m²-day。

相比传统使用单一微藻处理废水，利用本发明的集胞藻与蛋白核小球藻形成的混合藻膜进行高氨氮废水的处理明显更具优势。

实施例7三种藻膜处理技术对比

(一)不同藻膜的制备方法

1、蛋白核小球藻单种藻藻膜的制备方法

蛋白核小球藻单种种子液的制备方法参考实施例2，与实施例2的区别在于：不培养集胞藻，单独培养蛋白核小球藻。二次扩种培养后，将30L的蛋白核小球藻藻液加入平板反应器中，加入130L的BG11培养基，获得蛋白核小球藻单种种子液，其余制备参数与条件参考实施例2。

参考实施例5方法制备蛋白核小球藻单种藻藻膜，与实施例5的区别在于：排干水槽中纯水后加入本实施例制备的蛋白核小球藻单种种子液。

2、蛋白核小球藻与颤藻的混合藻膜制备方法

蛋白核小球藻与颤藻的混合种子液制备方法参考实施例2，与实施例2的区别在于：将集胞藻替换为颤藻(Oscillatoria lutea var.contorta)，其余制备参数与条件参考实施例2。

参考实施例5方法制备蛋白核小球藻与颤藻的混合藻膜，与实施例5的区别在于：排干水槽中纯水后加入本实施例制备的蛋白核小球藻与颤藻的混合种子液。

3、蛋白核小球藻与集胞藻的混合藻膜的制备方法同实施例5。

(二)试验方法

分别采用三种藻膜，即蛋白核小球藻单种藻藻膜(Cp)、蛋白核小球藻与颤藻的混合藻膜(Cp+Oc)、蛋白核小球藻与集胞藻的混合藻膜(Cp+Ss)，将不同浓度的高氨氮废水作为反应器进水，通入RAB中对高氨氮废水进行连续进出水处理，设置水力停留时间为3d，在稳定期测定各处理组的平均氨氮去除率，反应器连续运行30d。

反应器进水所用高氨氮废水是在无氮BG11培养基(去除氮源，即BG11培养基配方中不添加NaNO₃)中添加铵盐NH₄Cl，通过调整NH₄Cl的添加量调节无氮BG11培养基的氨氮终浓度。高氨氮废水设置3个氨氮终浓度，分别为250mg/L、500mg/L、1000mg/L。

(三)试验结果

不同藻膜处理不同浓度高氨氮废水时的氨氮去除率结果如图4所示，从图4中可以看出蛋白核小球藻单种藻藻膜、蛋白核和颤藻的混合藻膜对250、500、1000mg/L氨氮的去除率均显著低于蛋白核小球藻与集胞藻的混合藻膜。颤藻和集胞藻虽同属于蓝藻门，但和蛋白核小球藻的共同成膜效果差，几乎不能成膜。相比蛋白核小球藻单种藻以及与其它蓝藻的复合藻膜，蛋白核小球藻与集胞藻的混合藻膜进行高氨氮废水的处理效果存在明显优势。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1. 一种利用混合藻膜处理氨氮废水的方法，其特征在于，将集胞藻Synechocystissp. S1与绿藻的混合种子液加入旋转生物膜反应器中进行覆膜培养形成混合藻膜，然后运行旋转生物膜反应器进行氨氮废水处理，废水处理的水力体停留时间为1~3天；所述集胞藻Synechocystis sp. S1已于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20231999；所述绿藻为蛋白核小球藻；所述氨氮废水为氨氮浓度超过500mg/L的高浓度氨氮废水。

2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，集胞藻S1与绿藻的混合种子液的藻液密度不低于0.5 g/L。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，混合种子液由集胞藻S1的藻液与绿藻的藻液按体积比（1~9）：（1~9）混合培养得到。