CN117836308A - 用于选择特异性结合剂的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种用于选择和鉴定目的靶标的特异性多肽结合剂的新方法。更具体地，该选择方法涉及使用第一结合剂在表面上捕获目的靶标以形成固定化的抗原复合物，选择样品中存在的特异性抗原结合多肽，优选以展示文库形式，并使用与第一结合剂竞争靶标结合位点的第二结合剂洗脱靶蛋白和选择的多肽结合剂。更具体地，本文呈现的选择方法提供了一种有效且高度选择性的中通量至高通量技术，适用于重组抗体文库，包括免疫和无偏或全蛋白组展示文库，其中可以在生理条件下进行选择而不需要纯化的靶蛋白。

Description

用于选择特异性结合剂的手段和方法

技术领域

本公开涉及用于选择和鉴定目的靶标的特异性多肽结合剂的新方法。更具体地，所述选择方法涉及使用第一结合剂捕获表面上的目的靶标以形成固定化抗原复合物，选择样品中存在的特异性抗原结合多肽，优选作为展示文库，并使用竞争第一结合剂的靶结合位点的第二结合剂洗脱靶蛋白和选择性多肽结合剂。更具体地，本文呈现的选择方法提供了适用于重组抗体文库(包括免疫和无偏或全蛋白质组展示文库)的有效且高选择性的中通量至高通量技术，其中可以在生理条件下进行选择而不需要纯化的靶蛋白。

引言

多年来，已经报道了多种展示和选择方法并将其广泛应用为抗体发现技术，提供了从大的集合开始鉴定和分离新的多肽结合剂(主要是单克隆抗体(mAb)、抗体片段等)的手段和方法。单克隆抗体的产生需要杂交瘤细胞系，即通过产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合产生的杂交细胞系。由和Milstein在20世纪70年代开创的杂交瘤技术仍然是抗体命中发现的最先进技术。然而，在组合文库中将抗体基因克隆为单结构域或片段发现了其对于抗体发现的更多和更高通量方法的途径。基因型-表型偶联的原理是由这种发展产生的，因为这种“条形码化”是多达数十亿种不同蛋白质变体的关键，可以通过迭代过程中的高通量鉴定来选择其结合剂。几种展示技术揭示了更快和更有效的选择过程，其与克隆鉴定组合为抗体筛选平台奠定了基础，但尤其是称为噬菌体展示的在丝状噬菌体表面上表达功能性抗体片段，其用于由剑桥的McCafferty和Chiswell、La Jolla的Barbas以及海德堡的Breitling和Dübel体外选择抗体片段。除了噬菌体之外，已经建立了使用非噬菌体展示系统的选择方法，如核糖体和mRNA展示，其非常适合于纯化的抗原，以及酵母展示文库，其通常应用于基于细胞分选的选择方法，甚至哺乳动物展示，其有益于应用类似宿主的治疗开发，尽管要考虑缓慢的生长速率。关于不同方法的最近综述参见例如Valdorf等(2021)。

将重组抗体文库、通用文库、初始(非免疫)或基于免疫的文库应用于靶特异性结合剂的高通量选择。尽管免疫文库旨在用于特异性靶标选择，但所谓的“通用文库”可以细分为天然、合成和半合成方法，从而允许无偏选择新的结合剂(也参见Almagro等，2019)。在从迭代选择轮次获得单个克隆后，使用典型的抗体结合测定(范围从ELISA到免疫沉淀)筛选多肽结合剂的靶结合和生物物理性质。用于选择重组展示文库的从“黄金标准”演变的替代选择方法通常基于定制的需要，如由Lakzaei等(2018)报道的，其公开了用于白喉毒素结合剂的生物淘选方法，使用可溶性抗体捕获，其允许捕获特异性识别天然表位的结合剂，尽管仍然需要酸性洗脱条件，并且没有选择目标特定构象的任何对照。另一个实例涉及阴-阳生物淘选方法，其提供针对粗提物的亲和力选择，从而解决了需要抗原纯化的问题，并且在阳性噬菌体选择之前使用阴性选择(封闭剂)获得特异性(Lim等，2019)。

能够选择具有治疗相关性的Ab的展示技术的应用已经为美国、欧洲或中国医疗当局的大量市场批准的治疗剂奠定了基础。该观察结果支持那些平台技术对于药物发现具有的宝贵影响。此外，在抗体发现中组合展示技术与微流体系统和/或下一代测序已经能够实现功能筛选，例如，从而进一步丰富了用于治疗领域中的高通量选择方法的工具箱和管道。目前应用噬菌体展示的常规方法或替代方案和进一步进化的平台提供了高科技和常用的展示技术，以选择多肽结合剂，特别是从重组抗体文库中选择多肽结合剂，其在药物发现中具有巨大的潜力。然而，仍然存在改进的空间来解决某些技术瓶颈，如用于在天然条件下难以纯化的抗原，用于选择针对靶抗原的构象表位的结合剂，以及以高通量模式应用时提高相对于背景的效率和特异性。

发明概述

本公开内容基于以下发现：NANEX技术方法(如本文进一步描述的)适用于在生理条件下选择和筛选重组抗体文库，而不需要纯化的抗原。

基于纳米抗体的交换色谱(也称为NANEX)提供了基于纳米抗体(Nb)的免疫移置(displacement)纯化方法，其中使用竞争结合靶标上的相同或高度重叠的表位的一对Nb(捕集剂(trapper)，作为捕获剂；以及剥离剂(stripper)，作为洗脱剂)来分析性地纯化该靶蛋白，产生少量与高亲和力Nb(剥离剂)结合的高纯度蛋白质(如先前在PCT/EP2020/087291中所述的)。这种高选择性的一步纯化方法具有不需要浓缩步骤、透析或蛋白水解的优点，并且在蛋白质捕获和洗脱期间可以维持生理条件。此外，在仅一种特异性Nb可用的情况下，在NANEX纯化方法中使用Nb作为抗原结合部分还允许从单一结合剂开始，以经由设计较低亲和力或较快解离的变体(例如突变体)而获得一对。

本申请描述了概念验证，证明了NANEX纯化方法在展示文库选择中的整合提供了一种强大的途径，其改进了选择程序以在温和条件下筛选结合剂，甚至是对于难处理的蛋白质靶标。即使当无偏Nb文库用于选择时，也以非常有效的方式鉴定了特异性高亲和力靶结合剂。基于NANEX的靶蛋白捕集(trapping)允许维持靶标的天然生理条件，释放对纯化的靶标或抗原的需要，因为靶标能够以复杂样品(例如生物样品)提供，并导致新的创新抗体选择方法，其能够从针对完整的靶标蛋白质组而产生的多肽结合剂中钓出有效的结合剂。使用常规选择程序以如此有效的方式是不可能的，并且因此将基于NANEX的淘选或选择方法定位为具有挑战性的靶标或工具生成的药物发现的突破。更具体地，使用这种选择方法，在仅2-3轮选择后，证明了不同抗原的显著稳健富集，并且此外，从全蛋白质组免疫文库中选择时，成功与它们的细胞丰度无关。此外，可以鉴定几个天然蛋白质结合剂家族，即使具有很少的Nb家族成员(其通常在常规选择中3轮后消失)。除了选择可溶性蛋白质靶标的结合剂之外，我们还进一步证明了膜蛋白结合剂筛选的概念证明，并且证明了在本文中针对Nb家族具体示出的新结合剂的稳健分离，其甚至可能在常规选择方法中被忽略。

尽管过去已经在美洲驼中产生了针对多种蛋白质的免疫文库(例如在Li等，2020中针对伊氏锥虫(T.evansi)分泌蛋白质组)，但我们惊奇地发现了使用全蛋白质组Nb文库，NANEX纯化的噬菌体展示选择产生了针对大多数测试靶标的靶标特异性结合剂，从而证明了这种新的选择方法的选择性能力和可靠性。另一个益处是当使用例如内源性GFP标记(tagged)的酵母克隆与GFP特异性NANEX组合时，或使用针对内源性蛋白质表位的捕集剂/剥离剂对时，在整个过程中避免了对纯化抗原的需求，这对于在难以纯化抗原的选择中实施是非常有吸引力的。

因此，这种选择方法具有以下优点：靶纯化和随后的特异性靶结合剂的选择在生理和天然条件下是可能的，同时，获得高度特异性并因此选择性的靶蛋白-多肽结合剂相互作用和/或构象特异性靶蛋白结合剂，所有这些在高通量条件下都是可能的。此外，当应用于标记的靶蛋白时，诸如本文所示的GFP特异性捕集剂/剥离剂，提供了使用单个捕集剂/剥离剂(或捕获剂/移置剂(displacer))对的通用选择平台。

因此，本公开的第一方面涉及从多种结合剂(例如展示文库)中选择特异性结合靶蛋白的蛋白质结合剂的方法，其中NANEX用于在捕获剂(或第一蛋白质结合剂，也称为捕集剂)和靶标之间形成固定化复合物，其呈现给多种潜在结合剂，从而允许选择在与捕获剂不同的结合位点处与所述靶标缔合的蛋白质结合剂。然后使用洗脱剂(或第二蛋白质结合剂，也称为剥离剂)洗脱所述复合物，所述洗脱剂在结合靶标方面胜过捕集剂并以紧密的靶标-剥离剂复合物的方式洗脱与所选结合剂缔合的靶标。这种基于NANEX的选择程序的优点是可以从复杂的天然环境中捕获靶标，同时保留特定/天然构象，而不需要经纯化的靶蛋白，并且相比于、或互补于常规选择程序的是，该选择允许鉴定更多/替代的结合剂。

所述选择方法包括以下步骤：

a)提供固定化的特异性结合靶蛋白的第一蛋白质结合剂和包含所述靶蛋白的样品，用于获得所述靶标与所述第一蛋白质结合剂结合的固定化复合物，

b)向步骤a)的所述固定化复合物中添加包含多种多肽结合剂的溶液，用于允许所述多肽结合剂特异性结合固定的靶蛋白，

c)向步骤b)的所述溶液提供包含第二蛋白质结合剂的溶液，所述第二蛋白质结合剂结合靶蛋白并与第一结合剂竞争所述结合，由此移置(displace)靶蛋白，用于将靶蛋白释放至溶液中，和

d)收集与靶蛋白结合的第二蛋白质结合剂的洗脱液，用于分离与所述靶蛋白结合的多肽结合剂。

进一步的实施方案涉及所述方法，其中第二蛋白质结合剂具有更高的亲和力，或其解离速率常数(k_off值)，相比于第一结合剂的k_off值，更低或相等。另一个实施方案涉及所述方法，其中第二和/或第一蛋白质结合剂包含特异性结合靶蛋白的抗原结合结构域。更具体地，第一和/或第二试剂抗原结合结构域包含免疫球蛋白折叠，其是抗体或活性抗体片段、单结构域抗体、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)、VHH、纳米抗体或抗原结合嵌合蛋白(定义为通过至少两个位点与支架蛋白融合的ISVD，并且所述支架蛋白结构域优选包含HopQ、YgjK或其衍生物，也称为巨抗体(MegaBody))。

本文所述的任何所述方法的进一步的实施方案提供了步骤b)的多种多肽结合剂的应用，所述多肽结合剂以结合剂的展示文库的形式提供，所述展示文库可以更具体地包含重组抗体文库，包括免疫文库或非免疫文库，诸如初始文库，包括(半)合成文库，其表达和展示结合剂，所述结合剂是(单克隆)抗体、单结构域抗体、Fab、ISVD、VHH或纳米抗体，或其任何活性片段。

在另一个具体的实施方案中，如本领域技术人员已知的，使用噬菌体展示进行如本文所述的所述方法。或者，应用特定的设置或文库以使用酵母、核糖体、细菌或哺乳动物展示进行所述方法。

其他具体实施方案旨在富集靶蛋白的特异性多肽结合剂的数量，提供了一种方法，其中以与本领域已知的用于淘选程序的类似方式应用选择多肽结合剂的重复过程，其中步骤a)至d)重复至少一次，优选两次或更多次，其中所述重复过程表示为“x轮”选择。具体地，使用噬菌体展示文库时，在步骤d)中收集的含有噬菌体的洗脱液被重新用于感染大肠杆菌并返回步骤a)。

在另一个实施方案中，如本文所述的方法具体包括具有用于固定靶蛋白的第一蛋白质结合剂的表面，其中所述表面包含基质，所述基质包含珠球，如本文所例示的珠球，诸如磁珠，或者可选地，所述表面由树脂、色谱柱或聚合柱、板设置或微芯片提供。

另一个具体实施方案涉及所述方法，其中靶蛋白存在于步骤a)中样品中，所述样品是复杂的样品，包含组分的混合物，如生物材料、细胞裂解物、提取物、可溶性蛋白质组、某种细胞或组织类型的蛋白质组，或作为蛋白质混合物的一部分的重组靶蛋白。在一个特定的实施方案提供了所述选择方法，其应用免疫原用于获得多个多肽结合剂，其中所述免疫原包含与步骤a)中包含靶蛋白的样品相同的性质和组成。例如，免疫原包含在免疫中应用的细胞裂解物，以产生展示文库，如重组抗体文库，其中这种细胞裂解物也在步骤a)中应用作为包含靶蛋白的样品。

如本文所述的替代方法提供了通用方法，其中第一和第二蛋白质结合剂特异性地结合标签，其中所述标签存在于靶蛋白上，优选作为N-或C-末端异源标签。在一个优选的实施方案中，所述异源标签被GFP特异性结合剂特异性地识别，所述实施方案涉及如本文所述的选择方法，其中所述捕集剂至少包含SEQ ID NO:71的CDR或VHH的序列，并且所述剥离剂至少包含SEQ ID NO:70的CDR或VHH的序列。

本文所述方法的另一个实施方案允许选择多肽结合剂，其以对于靶蛋白直接或间接的方式特异性地结合到将在步骤d)中洗脱的蛋白质复合物。更具体地，对于在不同于捕集剂/剥离剂结合位点的结合位点处识别靶蛋白本身的多肽结合剂，获得与靶标的直接结合，以及，通过结合与靶蛋白融合的标签或结合在步骤a)中共同捕获并(经由靶蛋白)与固定化表面结合的另一种蛋白质或组分的多肽结合剂，可以获得间接结合。因此，所述间接多肽结合剂可以包含特异性地结合和识别作为靶蛋白的相互作用剂或作为靶蛋白的异源融合配偶体/标签的蛋白质或组分的结合剂。

因此，在另一方面，本发明还涉及一种蛋白质复合物，其包含与步骤d)中洗脱的靶蛋白结合的第二蛋白质结合剂，其中所述靶蛋白进一步与至少一种另外的蛋白质结合，并且其中如本文所述的方法导致在所述复合物中存在与所述另外的蛋白质结合的多肽结合剂。

另一个实施方案提供了如本文所述的选择方法，其中平行选择至少两种不同的靶蛋白，目的是通过在步骤a)中提供包含单独或作为融合或交联分子的所述至少两种不同的靶蛋白的样品，并且在步骤a)和c)中分别提供针对这些不同靶蛋白中的每一种的第一和第二蛋白质结合剂。

用于选择对靶蛋白或抗原蛋白特异的多肽结合剂的另一种方法涉及在上述方法的步骤c)中提供混合物的替代方法，并且包括以下步骤：

a)将靶蛋白样品与包含多种多肽结合剂的样品(优选展示文库)混合，和

b)通过向a)的混合物中添加第一蛋白质结合剂获得在表面上固定的复合物，其优选固定在表面上或随后固定，和

c)向步骤b)的所述溶液提供包含第二蛋白质结合剂的溶液，所述第二蛋白质结合剂结合靶蛋白并与第一结合剂竞争所述结合，从而移置靶蛋白，用于将靶蛋白释放至溶液中，和

d)收集与靶蛋白结合的第二蛋白质结合剂的洗脱液，用于分离与所述靶蛋白结合的多肽结合剂。

具体地，所述替代方法可以优选使用经纯化的靶蛋白样品。在这种方法的优选实施方案中，第一和/或第二蛋白结合剂包含纳米抗体。

本发明的最后一个方面涉及如本文提供的任何实施方案中所述的方法用于从免疫文库选择结合剂的用途。或者，如本文提供的任何实施方案中所述的方法用于靶蛋白上的表位分箱或用于分离新的表位结合剂的用途。此外，如本文所述的方法的使用旨在用于蛋白质结合剂的选择中的高通量目的，特别是在抗体和药物发现中。

附图描述

所描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的尺寸可能被夸大并且未按比例绘制。

图1.使用纳米抗体交换色谱(NANEX)从抗体展示文库中选择靶特异性抗体的示意图。

纳米抗体交换色谱的原理可以应用于从展示文库中选择靶特异性结合剂，例如抗体。共价连接到固体支持物(本文中为珠球)的第一纳米抗体(捕集剂)用于固定靶标。然后将固定化的靶标与不同结合剂(例如抗体)的不同库孵育，所述结合剂以在表型(结合行为)和编码基因型之间提供物理联系的方式表达和展示，在这种情况下为噬菌体展示文库。洗涤步骤可任选地用于去除不相关的结合剂或抗体。类似于NANEX并且是本发明特别的，与捕集剂竞争的第二纳米抗体(可溶性剥离剂)随后被用于选择性地洗脱与剥离剂和靶标特异性结合结构域或抗体及其编码基因型缔合的固定靶标。

图2.使用NANEX在GFP上进行第一轮和第二轮选择后富集。

根据实施例1，使用纳米抗体交换色谱(NANEX)从纳米抗体展示文库选择GFP特异性抗体。将GFP捕集剂(CA15816 SEQ ID NO:2)与磁珠偶联，并通过将它们与不同浓度的GFP一起孵育来制备不同的NANEX珠以捕集抗原。未用GFP孵育的捕集剂包被的珠用作阴性对照。与文库孵育后，用GFP特异性剥离剂(CA12760 SEQ ID NO:1)或用胰蛋白酶洗脱噬菌体。进行两轮选择。通过感染大肠杆菌回收来自每次洗脱的输出噬菌体，并根据Pardon等(2014)通过比较这些细胞的连续稀释液来评估富集。

图3.通过生物层干涉法进行GFP特异性纳米抗体的竞争结合分析。

通过OctetRed(Molecular Devices)上的生物层干涉测量法(BLI)分析新发现的GFP特异性纳米抗体的结合性质。链霉亲和素包被的生物传感器用于捕获生物素化的GFP(100nM)。接下来，允许皮摩尔的GFP剥离剂(CA12760，SEQ ID NO:1)与GFP结合直至达到平台期。接下来将这些CA12760饱和的生物传感器分别在含有每种新发现的Nb(如图的图例所示)、补充有CA12760 Nb的溶液中孵育。在室温下，在补充有BSA 0.1％和Tween₂₀0.005％的HEPES25mM pH 7.5、NaCl 150mM中进行测定。除了剥离剂(A中的CA12760)或不相关的Nb(A中的CA8780)外，所有纳米抗体(A中的CA17517、CA17676、CA17518；B中的CA17674、CA17673、CA17519、CA17520、CA17675)引起传感器上的表观质量增加，表明它们结合不与剥离剂的表位相重叠的表位。

图4.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的FBA1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征四种FBAl特异性纳米抗体(40＝对应于SEQ ID NO:3的Nb克隆CA17440，41＝CA17441-SEQ ID NO:4，42＝CA17442-SEQ ID NO:5，43＝CA17443-SEQID NO:6)。将每个FBAl特异性纳米抗体共价连接NHS-琼脂糖珠。将用这些FBA1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的FBA1的工程化酵母菌株(酵母GFP融合物集合引用名：GFP(+)22，G1)的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些单独的珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中，煮沸并在SDS-PAGE上分析(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹(B)显色，以证实GFP标记的FBA1的存在。

图5.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的PDC1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征两种PDC1特异性纳米抗体(51＝对应于SEQ ID NO:7的Nb克隆CA17451，52＝对应于SEQ ID NO:8的CA17452)。将每个PDC1特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些PDC1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的PDC1(酵母GFP融合物集合引用名：GFP(+)12，F8)的工程化酵母菌株的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色(B)，以证实GFP标记的PDC1的存在。

图6.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的SSA1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征六种SSA1特异性纳米抗体(60＝对应于SEQ ID NO:19的Nb克隆CA17560，61＝CA17561-SEQ ID NO:20，62＝CA17562-SEQ ID NO:21，63＝CA17563-SEQ ID NO:22，64＝CA17564-SEQ ID NO:23，65＝CA17565-SEQ ID NO:24)。将每个SSA1特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些SSA1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的SSA1(酵母GFP融合物集合引用名：GFP(+)10，E4)的工程化酵母菌株的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色(B)，以证实GFP标记的SSA1的存在。

图7.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的PGI1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征三种PGI1特异性纳米抗体(55＝对应于SEQ ID NO:15的Nb克隆CA17455，56＝CA17456-SEQ ID NO:16，57＝CA17457-SEQ ID NO:17)。将每个PGI1特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些PGI1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的PGI1(酵母GFP融合物集合引用名：GFP(+)12，H11)的工程化酵母菌株的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹染色(B)，以证实GFP标记的PGI1的存在。

图8.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的SIS1特异性、ALD6特异性、BMH1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征一种SIS1特异性纳米抗体(44＝对应于SEQ ID NO:9的Nb克隆CA17444)、三种ALD6特异性纳米抗体(53＝CA17453-SEQ ID NO:10，54＝CA17454-SEQ ID NO:11，60＝CA17460-SEQ ID NO:12)、两种BMH1特异性纳米抗体(58＝CA17458-SEQID NO:13，59＝CA17459-SEQ ID NO:14)。将每个靶特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些靶标特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的靶标(酵母GFP融合物集合引用名，对于SIS1：GFP(+)22，E5，对于ALD6：GFP(+)15，F1，对于BMH1：GFP(+)27，D5)的工程化酵母菌株的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色(B)，以证实GFP标记的靶标的存在。

图9.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的SXM1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征一种SXM1特异性纳米抗体(30＝对应于SEQ ID NO:18的Nb克隆CA17530)。SXM1特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用该SXM1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的SXM1 GFP(+)04，H9)的工程化酵母菌株的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色(B)，以证实GFP标记的SXM1的存在。

图10.NANEX从酵母裂解物的可溶性级分中捕获并固定PGI1结合剂。

将珠球用PGI1特异性纳米抗体CA17455克隆(SEQ ID NO:15)官能化，以用作捕集剂。接下来将CA17455官能化珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物一起孵育1小时并洗涤。接下来，将这些珠球与相同的PGI1-特异性纳米抗体一起孵育1小时，以洗脱与几种相互作用蛋白(LYS20 Uniprot P48570，TDH3 Uniprot P00359，PNC1 Uniprot P53184)缔合的靶标(PGI1)，如质谱分析所示。

图11.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自GR-LBD抗体文库的GR-LBD特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征五种GR-LBD特异性纳米抗体(97＝对应于SEQ ID NO:35的Nb克隆CA17797，98＝CA17798-SEQ ID NO:36，99＝CA17799-SEQ ID NO:37，00＝CA17800-SEQ ID NO:38，01＝CA17801-SEQ ID NO:39)。将每个GR-LBD特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些GR-LBD特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与HEK293T裂解物(补充有DEX或未补充)一起孵育1小时，所述HEK293T裂解物用含有表达作为GFP标记的蛋白质的全长GR的GFP-GR(全长)基因的pcDNA3.1质粒转染。洗涤后，将这些单独的珠重悬于SDS-PAGE上样染料中，煮沸并在SDS-PAGE上分析(未显示)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GR特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实GFP标记的GR的存在。NC代表阴性对照Nb。GFP＝27kDa；GFP-GR融合物＝117kDa；GR(切割的)＝90kDa。

图12.使用NANEX对94种不同的GFP-POI进行第一轮和第二轮选择后的富集。

根据实施例3，使用NANEX从全蛋白质组抗体展示文库选择POI特异性抗体。将GFP捕集剂(CA15816，对应于SEQ ID NO:2)与磁珠偶联并分配在96个不同的孔中。将NANEX珠与表达GFP-POI的工程化酵母的不同裂解物(表3)一起孵育。几个洗涤步骤后，将噬菌体加入孔中。与文库孵育后，用GFP特异性剥离剂(CA12760，对应于SEQ ID NO:1)洗脱噬菌体。进行两轮选择(A中为R1，B中为R2)。通过感染大肠杆菌回收来自每次洗脱的输出噬菌体，并根据Pardon等(2014)通过比较这些细胞的连续稀释液来评估富集。针对如表3中按时间顺序列出的每个孔来呈现数据(A1-F12，对于94种GFP-靶标中的每一种，在X轴上从左到右，G12和H12，作为X轴上的最后的样品用于对照))。

图13.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的POI特异性纳米抗体。

通过免疫共沉淀测定表征了一种HSP104特异性纳米抗体(04＝CA18504 SEQ IDNO:40)、一种MET6特异性纳米抗体(05＝CA18505 SEQ ID NO:41)、两种SBA1特异性纳米抗体(08＝对应于SEQ ID NO:42的Nb克隆CA18508，09＝CA18509-SEQ ID NO:43)、一种SOD1特异性纳米抗体(10＝CA18510-SEQ ID NO:44)和一种ENO1-特异性纳米抗体(38＝CA17938-SEQ ID NO:45)。将每个POI特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些POI特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与表达作为GFP标记的蛋白质的POI(酵母GFP融合物集合引用名：GFP(+)05、A2(HSP104)；GFP(+)07、D4(MET6)；GFP(+)30、A6(SBA1)；GFP(+)33、F8(SOD1)和GFP(+)17、D12(ENO1))的工程化酵母株的裂解物一起孵育一小时。洗涤后，在SDS-PAGE(未显示)上分析这些珠球，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实GFP标记的POI的存在。

图14.使用PGI1特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自全蛋白质组抗体文库的PGI1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征六种PGI1特异性纳米抗体(91＝对应于SEQ ID NO:46的Nb克隆CA17791，92＝CA17792-SEQ ID NO:47，93＝CA17793-SEQ ID NO:48，94＝CA17794-SEQ ID NO:49，95＝CA17795-SEQ ID NO:50，96＝CA17796-SEQ ID NO:51)。将每个PGI1特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些PGI1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与EBY100裂解物或表达作为GFP标记的蛋白质的PGI1(酵母GFP融合物集合引用名:GFP(+)12，H11)的工程化酵母菌株的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，在SDS-PAGE上分析这些珠(A)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色(B)，以证实GFP标记的PGI1的存在。55＝对应于SEQ ID NO:15的Nb克隆CA17455，用作PGI1的捕集剂/剥离剂，作为阳性对照。

图15.使用rVGLUT1特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自rVGLUT1抗体文库的rVGLUT1特异性纳米抗体。

通过免疫共沉淀测定表征rVGLUT1特异性纳米抗体(25＝Nb克隆CA18425，对应于SEQ ID NO:53)。将rVGLUT1特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用该rVGLUT1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与HEK293T裂解物一起孵育1小时，所述HEK293T裂解物用表达作为cMyc-YFP标记的蛋白质的全长rVGLUT1的质粒转染。洗涤后，将珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中，不煮沸，并在SDS-PAGE上分析(未显示)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用c-Myc特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实c-Myc标记的rVGLUT1的存在。NC代表阴性对照Nb。

图16.使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自突触蛋白质组抗体文库的rVGLUT1特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征了六种rVGLUT1-YFP特异性纳米抗体(24＝对应于SEQID NO:54的Nb克隆CA18024，37＝CA18437-SEQ ID NO:55，38＝CA18438-SEQ ID NO:56，39＝CA18439-SEQ ID NO:57，40＝CA18440-SEQ ID NO:58，41＝CA18441-SEQ ID NO:59)。将每个rVGLUT1-YFP特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些rVGLUT1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与HEK293T裂解物一起孵育1小时，所述HEK293T裂解物用含有表达作为c-myc-YFP标记的蛋白质的全长rVGLUT1基因的质粒转染。洗涤后，将珠子重悬于SDS-PAGE上样染料中，不煮沸，并在SDS-PAGE上分析(未显示)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用c-Myc特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实c-Myc标记的rVGLUT1的存在。NC代表阴性对照Nb。

图17.使用mCherry特异性捕集剂/剥离剂对通过NANEX表征选自GFP-GR抗体文库的GR特异性纳米抗体。

通过共免疫沉淀测定表征了七种GR特异性纳米抗体(98＝Nb克隆CA18498，对应于SEQ ID NO:62，99＝CA18499-SEQ ID NO:63，01＝CA18501-SEQ ID NO:64，02＝CA18502-SEQ ID NO:65，03＝CA18503-SEQ ID NO:66，85＝CA18585-SEQ ID NO:67，86＝CA18586-SEQ ID NO:68)。将每个GR特异性纳米抗体与NHS-琼脂糖珠共价连接。将用这些GR特异性纳米抗体官能化的珠在4℃下在旋转装置上与用pcDNA3.1质粒转染的HEK293T裂解物一起孵育一小时，所述pcDNA3.1质粒含有表达作为mCherry标记的蛋白质的全长GR的mCherry-GR(全长)基因。洗涤后，将这些单独的珠重悬于SDS-PAGE上样染料中，煮沸并在SDS-PAGE上分析(未显示)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GR特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实GR的存在。NC代表阴性对照Nb。

详述

将参考特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限制。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解，根据本发明的任何特定实施方案，不一定可以实现所有方面或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化本文教导的一个优点或一组优点的方式来体现或执行，而不必实现本文可能教导或建议的其他方面或优点。结合附图阅读时，通过参考以下详述，可以最好地理解本发明及其特征和优点。参考下文描述的(一个或多个)实施方案，本发明的方面和优点将变得显而易见并得以阐明。贯穿本说明书对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中不同地方出现的短语“在一个(one)实施方案中”或“在一个(an)实施方案中”不必定全部涉及同一实施方案，但可以全部涉及同一实施方案。类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，本发明的各种特征有时在单个实施方案、附图或其说明书中组合在一起，以便简化本公开并帮助理解各种发明方面中的一个或更多个。然而，该公开方法不应被解释为反映所要求保护的发明需要比每个权利要求中明确记载的特征更多的特征的意图。

定义

在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词的情况下，例如“一个(a)”或“一个(an)”、“该(the)”，这包括该名词的复数，除非另有具体说明。在本说明书和权利要求中使用术语“包括/包含”的情况下，不排除其他元素或步骤。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元素，而不必然用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或示出的其他顺序操作。提供以下术语或定义仅是为了帮助理解本发明。除非本文具体定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域技术人员相同的含义。对于本领域的定义和术语，从业者特别参考Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第4版，Cold Spring Harbor Press,Plainsview，New York(2012)；以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(增刊114)，John Wiley&Sons，New York(2016)。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如分子生物学、生物化学、结构生物学和/或计算生物学)普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中进一步可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。“肽”也可以指衍生自其原始蛋白质的部分氨基酸序列，例如在胰蛋白酶消化后。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语还包括多肽的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化和乙酰化。基于氨基酸序列和修饰，多肽的原子或分子量或重量以(千)道尔顿(kDa)表示。“蛋白质结构域”是蛋白质中确切的功能和/或结构单元。通常，蛋白质结构域负责特定功能或相互作用，有助于蛋白质的整体作用。结构域可以存在于多种生物学背景中，其中可以在具有不同功能的蛋白质中发现类似的结构域。

“分离的”或“纯化的”意指材料基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随的组分。例如，“分离的多肽”或“纯化的多肽”是指已经从在天然存在的状态下位于其旁边的分子(例如多肽结合剂)中纯化出的多肽，或本文鉴定和公开的靶蛋白，其已经从样品或混合物(例如生产宿主)中存在的与所述多肽相邻的分子中除去。分离的蛋白质或肽可以通过氨基酸化学合成产生，或者可以通过重组生产或通过从复杂样品纯化产生。

如本文所用，术语“融合至”，并且在本文中可互换使用为“相连至”、“缀合至”、“连接至”，特别是指“遗传融合”，例如通过重组DNA技术，以及产生稳定共价连接的“化学和/或酶促缀合”，如与靶蛋白共价连接的异源标签。

蛋白质的“一种同源物”、“多种同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且具有与它们所来源的未修饰蛋白质相似的生物学和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。如本文所用的术语“氨基酸同一性”是指序列在比较窗口上在逐个氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来计算，确定在两个序列中出现相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met，在本文中也以单字母代码指示)的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。如本文所用的“取代”或“突变”或“变体”是由于与亲本蛋白质或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同的氨基酸或核苷酸置换而产生的。应当理解，蛋白质或其片段可以具有对蛋白质活性基本上没有影响的保守性氨基酸取代。

术语“野生型”是指从天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变”、“工程化的”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比时，表现出序列中、翻译后修饰和/或功能特性(即，改变的特征)的修饰的基因或基因产物。应注意，可以分离到天然存在的突变体；这些通过它们与野生型基因或基因产物相比具有改变的特征的事实来确定。

术语“结合位点”是指分子或分子复合物的区域，其由于其形状和电荷而有利地与另一种化学实体、化合物、蛋白质、肽、抗体或Nb缔合。对于抗体相关的分子，术语“表位”或“构象表位”在本文中也可互换使用。术语“口袋”包括但不限于裂缝、通道或位点。术语“结合口袋/位点的一部分”或“部分重叠表位”是指少于限定结合口袋、结合位点或表位的所有氨基酸残基。例如，构成结合口袋的一部分的残基的原子坐标对于限定结合口袋的化学环境可以是特异性的，或者可用于设计可以与那些残基相互作用的抑制剂的片段。例如，残基部分可以是在靶蛋白结合中起作用的关键残基，或者可以是空间相关并限定结合口袋的三维区室的残基，或者赋予构象功能的残基。如本文所用，“相邻”或“最小重叠”结合位点分别是指结合氨基酸残基中的“无重叠氨基酸(但与附近的位点结合)”，或最多约30％重叠。如本文所用，“表位”是指多肽的抗原决定簇，其构成靶分子上的结合位点或结合口袋。靶蛋白上的所述表位可以包含至少一个结合结合剂所必需的氨基酸，但在空间构象中优选包含至少3个氨基酸，其对于表位是独特的。通常，表位由至少4、5、6、7个这样的氨基酸组成，并且更通常地，由至少8、9、10个这样的氨基酸组成。确定氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的，并且包括例如X射线晶体学、多维核磁共振、Cryo-EM、氢化氘交换(HDX)-MS以及交联质谱(XL-MS)、表位分箱，或在较低程度上还使用中子散射、X射线自由电子激光(XFEL)或小角度中子散射(SANS)和小角度x-射线散射(SAXS)技术。如本文所用，“构象表位”是指包含呈多肽的折叠三维构象所特有的空间构象的氨基酸的表位。通常，构象表位由在线性序列中不连续但在蛋白质的折叠结构中聚集在一起的氨基酸组成。然而，构象表位也可以由氨基酸的线性序列组成，其采取多肽的折叠3维构象所特有的构象(并且不以变性状态存在)。在蛋白质复合物中，构象表位由在一个或多个多肽的线性序列中不连续的氨基酸组成，所述一个或多个多肽在折叠不同的折叠多肽时聚集在一起并且它们以独特的四级结构结合。类似地，构象表位在此也可以由一个或多个多肽的线性氨基酸序列组成，所述多肽聚集在一起并采用四级结构独特的构象。术语蛋白质的“构象”或“构象状态”通常是指蛋白质在任何时刻可采用的结构范围。本领域技术人员将认识到，构象或构象状态的决定因素包括蛋白质的一级结构，如蛋白质的氨基酸序列(包括修饰的氨基酸)和蛋白质周围的环境中所反映的。蛋白质的构象或构象状态还涉及结构特征，如蛋白质二级结构(例如，α-螺旋、β-折叠等)、三级结构(例如，多肽链的三维折叠)和四级结构(例如，多肽链与其他蛋白质亚基的相互作用)。对多肽链的翻译后和其他修饰，如配体结合、磷酸化、硫酸化、糖基化或疏水基团的连接等，可以影响蛋白质的构象。此外，环境因素，如周围溶液的pH、盐浓度、离子强度和重量摩尔渗透压浓度，以及与其他蛋白质和辅因子的相互作用等，可以影响蛋白质构象。蛋白质的构象状态可以通过针对活性或与另一分子的结合的功能测定或通过物理方法如X射线晶体学、NMR或自旋标记等方法来确定。对于蛋白质构象和构象状态的一般讨论，可参考Cantor和Schimmel,Biophysical Chemistry，第I部分：The Conformation ofBiological.Macromolecules，W.H.Freeman and Company，1980和Creighton，Proteins:Structures and Molecular Properties，W.H.Freeman and Company，1993。

“结合”意指任何直接或间接的相互作用。直接相互作用意味着结合配偶体之间的接触。间接相互作用是指相互作用配偶体在多于两个分子的复合物中相互作用的任何相互作用。相互作用可以是完全间接的，借助于一个或多个桥接分子，或部分间接的，其中配偶体之间仍然存在直接接触，这通过一个或多个分子的另外的相互作用来稳定。如本文所用，术语“特异性结合”是指识别特定靶标但基本上不识别或结合样品中的其他分子的结合结构域。特异性结合并不意味着排他性结合。然而，特异性结合确实意味着蛋白质对其结合剂中的一种或几种具有一定的增加的亲和力或偏好。如本文所用，术语“亲和力”通常是指配体、化学物质、蛋白质或肽与另一种(靶)蛋白质或肽结合的程度，以便使单个蛋白质单体的平衡向由其结合形成的复合物的存在而转变。亲和力通常通过平衡解离常数(K_D)来测量和报告，平衡解离常数用于评估和排列双分子相互作用的强度。抗体与其抗原的结合是可逆的过程，并且结合反应的速率与反应物的浓度成比例。在平衡时，[抗体][抗原]复合物形成的速率等于解离成其组分[抗体]+[抗原]的速率。反应速率常数的测量可用于定义平衡或亲和常数(1/K_D)。简而言之，K_D越小，抗体对其靶标的亲和力越大。反应的两个方向的速率常数被称为：缔合反应速率常数(k_on)，其是用于计算“结合速率”(k_on)的反应的一部分，缔合反应速率常数是用于表征抗体与其靶标结合有多快的常数。反之亦然，解离反应速率常数(k_off)是用于计算“解离速率”(k_off)的反应的一部分，是用于表征抗体与其靶标解离有多快的常数。在如本文所示的测量中，斜率越平坦，解离速率越慢，或抗体结合越强。反之亦然，较陡的下侧表明更快的解离速率和更弱的抗体结合。将通过实验测量的解离和缔合速率(k_off/k_on)的比例用于计算K_D值。本领域技术人员已知几种测定方法来测量缔合和解离速率并计算K_D，因此，考虑到标准误差，其被认为是与所使用的测定无关的值。

如本文可互换使用的“结合剂”或“试剂”涉及能够与另一分子结合的分子，其中所述结合优选是特异性结合，识别限定的结合位点、口袋或表位。结合剂可以具有任何性质或类型，并且不取决于其来源。结合剂可以是化学合成的、天然存在的、重组产生(和纯化)的，以及设计和合成产生的。因此，所述结合剂可以是小分子、化学品、肽、多肽、抗体或其任何衍生物，如肽模拟物、抗体模拟物、活性片段、化学衍生物等。可以通过共价或非共价连接获得结合。

术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子或包含免疫球蛋白(Ig)结构域的分子，其与抗原特异性结合。“抗体”还可以是衍生自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。术语“活性抗体片段”是指任何抗体或抗体样结构的一部分，其本身对抗原决定簇或表位具有高亲和力，并且含有负责这种特异性的一个或多个CDR。非限制性实例包括免疫球蛋白结构域、Fab、F(ab)'2、scFv、重-轻链二聚体、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)、纳米抗体(或VHH抗体)、结构域抗体和单链结构，如完整轻链或完整重链。

如本文所用的术语“抗体片段”和“活性抗体片段”或“功能变体”是指包含免疫球蛋白结构域或抗原结合结构域的蛋白质，所述免疫球蛋白结构域或抗原结合结构域包含特异性结合靶蛋白所需的CDR和/或结构特征。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。术语“免疫球蛋白(Ig)结构域”，或更具体地“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“IVD”)是指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其在本领域和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；和“框架区4”或“FR4”；所述框架区被三个“互补决定区”或“CDR”中断，其在本领域和下文中称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL两者的互补决定区(CDR)将有助于抗原结合位点，即总共6个CDR将参与抗原结合位点形成。鉴于上述定义，常规4链抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知的)或衍生自这种常规4链抗体的Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段(如二硫键连接的Fv或scFv片段)或双抗体(均为本领域已知的)，其通过一对(缔合的)免疫球蛋白结构域(如轻链和重链可变结构域)，即通过与相应抗原的表位共同结合的免疫球蛋白结构域的VH-VL对与抗原的相应表位结合。如本文所用的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)是指根据FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的形式，具有包含4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)的氨基酸序列的蛋白质。本发明的“免疫球蛋白结构域”是指“免疫球蛋白单可变结构域”(缩写为“ISVD”)，等同于术语“单可变结构域”，并且定义其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这将免疫球蛋白单可变结构域区分于“常规”免疫球蛋白或其片段，后者两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域，相互作用以形成抗原结合位点。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDR形成。因此，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元(即，基本上由单个可变结构域组成的功能性抗原结合单元，使得单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元)。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序列(例如，VH-序列)；更具体地，免疫球蛋白单可变结构域可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。例如，免疫球蛋白单可变结构域可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸序列)、“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文所定义，并且包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其中任一个的任何合适的片段。特别地，免疫球蛋白单可变结构域可以是纳米抗体(如本文所定义)或其合适的片段。注：和是Ablynx N.V.的注册商标(aSanofi Company)。对于纳米抗体的一般说明，参考以下进一步的描述，以及本文引用的现有技术，如，例如WO2008/020079中所述。“VHH结构域”，也称为VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初已被描述为“重链抗体”(即，“缺乏轻链的抗体”；Hamers-Casterman等(1993)Nature 363：446-448)的抗原结合免疫球蛋白(Ig)(可变)结构域。已经选择术语“VHH结构域”以将这些可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)和存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)区分开。对于VHH和纳米抗体的进一步的描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302，2001)以及作为一般背景技术提及的以下专利申请：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及更多公开的Ablynx N.V.的专利申请。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地通过在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基”来表征。对于IVD的氨基酸残基的编号，可以应用不同的编号方案。例如，可以根据Honegger，A.和Plückthun，A.(J.Mol.Biol.309，2001)给出的所有重链(VH)和轻链可变结构域(VL)的AHo编号方案进行编号，如应用于来自骆驼科动物的VHH结构域。用于VH结构域的氨基酸残基编号的替代方法(其也可以以类似于VHH结构域的方式应用)是本领域已知的。例如，FR和CDR序列的描绘可以通过使用如在Riechmann，L.和Muyldermans，S.，231(1-2)，J ImmunolMethods.1999的文章中应用于来自骆驼科动物的VHH结构域的Kabat编号系统来完成。应当注意，如本领域中对于V_H结构域和对于VHH结构域所熟知的，每个CDR中的氨基酸残基的总数可以变化并且可以不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可以不被实际序列占据，或实际序列可以含有比Kabat编号允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基的总数通常在110至120的范围内，常常在112至115之间。然而，应当注意，更小和更长的序列也可以适用于本文所述的目的。CDR区的确定也可以根据不同的方法进行，如基于接触分析和结合位点形貌的指定，如MacCallum等(J.Mol.Biol.(1996)262，732-745)所述。或替代性地，CDR的注释可以根据AbM(AbM是Oxford Molecular Ltd.的抗体建模包，如http://www.bioinf.o.g.uk/abs/index.html所述)、Chothia(Chothia和Lesk，1987；Mol Biol.196:901-17)、Kabat(Kabat等，1991；第5版，NIH Publication91-3242)、IMGT(LeFranc，2014；Frontiers inImmunology.5(22)：1-22)，和/或包括aHo、Gelfand和Honegger的可选注释；对于概述，参见，例如，Dondelinger等，2018，Front Immunol9:2278)。所述注释还包括在含有免疫球蛋白结构域的蛋白质中的CDR和框架区(FR)的描绘，并且是本领域技术人员已知的方法和系统，因此本领域技术人员可以将这些注释应用于任何免疫球蛋白序列而没有过度负担。这些注释略有不同，但各自旨在包含参与结合靶标的环的区域。当本文提及CDR时，上述注释中的至少一种是适用的，优选IMGT注释。

VHH或Nb通常被分类在不同的序列家族或甚至超家族中，如在B细胞成熟期间聚类衍生自相同祖细胞的克隆相关序列(Deschaght等2017.Front Immunol.10；8:420)。该分类通常基于Nb的CDR序列，并且其中例如每个Nb家族被定义为具有CDR3区的序列同一性阈值的(克隆)相关序列的簇。在本文定义的单个VHH家族内，CDR3序列因此在氨基酸组成上是相同的或非常相似的，优选地在CDR3序列中具有相同的长度和至少80％的同一性、或至少85％的同一性、或至少90％的同一性，使得相同家族的Nb与相同的结合位点结合，具有相同的效果或功能影响。

如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评估”、“鉴定”、“筛选”和“测定”可互换使用，并且包括定量和定性确定。

详述

本发明涉及一种新的选择方法，用于从多种结合剂中，特别是从蛋白质结合剂文库中鉴定目的蛋白质的特异性多肽结合剂，其中基于NANEX的亲和移置方法首先被整合以通过与偶联至表面的第一蛋白质结合剂结合来分离和固定靶蛋白，其次通过利用NANEX的亲和移置原理概念来洗脱与靶蛋白复合的多肽结合剂。这种整合的选择方法在重组抗体文库筛选中提供了中通量至高通量的方法，并提供了与展示技术的能力互补的高选择性。这种新方法是其在重组抗体文库选择和淘选领域中的第一种方法，并且具有基于NANEX的系统固有的几个优点，如下文阐明最初建立的纳米抗体交换色谱(NANEX)所解释的。此外，这种新方法提供了若干益处和改进，优于使用噬菌体展示的(常规)体外选择方法，其中选择涉及暴露于固定化抗原以允许抗原特异性噬菌体抗体在生物淘选期间结合其靶标，然后回收抗原结合的噬菌体并随后在细菌中感染。大部分体外选择方法依赖于纯化的抗原，并且需要苛刻的条件(高盐、极端pH、蛋白水解)以从固定化靶标洗脱噬菌体。相比之下，基于NANEX的选择允许我们捕集和固定来自天然样品的复合抗原，接下来应用噬菌体文库，并随后以靶标特异性方式剥离抗原结合的噬菌体，所有这些都在完全天然条件下。NANEX还允许我们独特地选择结合不与捕集剂-剥离剂对重叠的表位的Nb。

NANEX亲和移置

纳米抗体交换色谱法(在本文中称为“NANEX”，基于PCT/EP2020/087291中先前描述的方法)涉及通过亲和移置色谱法纯化蛋白质，利用小的抗原结合实体，从而建立有利的动力学环境。特别地，在互补动力学背景下使用以竞争性方式特异性结合靶标上的表位的一对靶标特异性蛋白质结合剂。针对相同靶标的一对结合剂可以涉及竞争性或非重叠结合位点，或者，在非重叠或不同表位处的不同结合位点。通常，亲和移置在限定的剂量和动力学关系内通过结合剂对经由瞬时夹心复合物起作用。然而，在使用具有相同或重叠表位的对的情况下，结合动力学和结合剂的性质影响交叉阻断或移置之间的平衡。在NANEX中，观察到使用构建在免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或更具体地Nb上的抗原结合结构域作为移置剂时，如果第二蛋白质结合剂的解离速率常数(k_off)比第一蛋白质结合剂低，最有效地建立了靶向相同的或很大程度上重叠的且由此竞争性的表位，作为靶蛋白上的捕集剂。此外，纯粹基于它们的竞争性质，可以使用相同的结合剂，如用于结合(或捕集)和洗脱(或剥离)的纳米抗体来纯化靶标，以在洗脱级分中获得(次优的)令人满意的纯化蛋白质产率。当寻找在高通量应用(如本文所述的选择方法)中所期望的、能够完全胜过与靶标结合的捕集剂的结合剂时，将发现使用针对相同表位的常规抗体结合剂(如单克隆抗体)大多阻断任何移置反应，并且宁可使用与相比于捕集剂相邻或最低限度重叠的表位结合的蛋白质结合剂，如抗体，以避免此类被竞争阻断表位。然而，NANEX至少为剥离剂提供第二蛋白质结合剂ISVD，其结合与第一蛋白质结合剂相同、基本上相同或很大程度重叠的表位，并且其中所述第二包含ISVD的蛋白质结合剂具有更低的解离速率常数(k_off)，而通过使用NANEX获得非常有效的第一蛋白质结合剂的移置，使得靶蛋白以高产率和高特异性洗脱。所以，ISVD型抗原结合剂的精简但高度特异性的性质提供了竞争结合模式中有效移置另一种抗原结合蛋白的动力学关系，这优于具有更大抗原结合位点/互补位(由来自6个CDR而不是ISVD的3个CDR的残基组成)的更大的常规抗体。此外，该反应可以在温和的生理条件下发生，并且仍然提供有效的洗脱，因此其完全适合于在本文所述的选择方法中整合，因为来自与靶蛋白结合的多种结合剂的多肽结合剂可以保持在与靶蛋白组成的复合物中，并且与剥离剂-靶标复合物共洗脱。因此，通过将NANEX整合到这种新的选择方法中，本文建立的组合的NANEX-纯化和选择-条件产生了下一代改进的针对多肽结合剂的选择，尤其是在抗体药物发现中。实际上，如本文例示的结果已经清楚地显示了与常规选择淘选方法相比，整合的NANEX选择程序以更有效和更深入的方式提供了稳健和可靠的对展示的多肽结合剂的选择。

如本文可互换使用的“基于ISVD的移置”，或更具体地“纳米抗体交换”或“纳米抗体交换色谱”或“NANEX”，其先前被重点用于直接高纯度蛋白质复合物洗脱的分析性纯化，现在发现其在抗体药物发现和靶标结合剂鉴定方法中的应用。因此，这种新型选择方法的优势在于使用NANEX来呈现靶标，因为基于Nb的捕集剂/剥离剂竞争相同或高度重叠的表位并提供在不同表位不干扰其他结合剂的高亲和力结合剂。这不仅使得发现针对新的或不同的表位的结合剂成为可能，而且还允许发现靶标的某些构象的结合剂(当使用将靶标锁定在特定构象的捕集剂/剥离剂时)。

使用NANEX纯化时，洗脱复合物因此含有剥离剂或移置剂，其具有以下优点：允许应用额外官能化的包含ISVD的第二蛋白质结合剂(称为剥离剂，或在纳米抗体的情况下称为纳米剥离剂)，即它们为洗脱的蛋白质复合物提供了特定功能。这种官能化可以涉及蛋白质复合物的可视化(经由试剂的荧光或标记)或涉及作为伴侣蛋白或衔接蛋白(包括例如但不限于MegaBody)的功能，以及其他实例，以洗脱官能化复合物中的靶标(也参见下文)。此外，在洗脱步骤和再生程序后，亲和基质(其可以是任何类型的表面，如(磁)珠、柱、板中的孔或树脂)很容易用于下一个亲和纯化和/或选择循环，并且可以用于高通量平台，如筛选平台、芯片或微流体设置或装置。

通过使用如本文所述的NANEX或Nanobody交换色谱整合的选择方法，可以预见在几种靶标类别(如难处理的蛋白质或难以纯化的蛋白质)的结合剂的高通量选择中出现飞跃。此外，可以选择具有抗原或靶标的构象选择性识别的蛋白质结合剂的选择，所述蛋白质结合剂通过捕集剂固定在某种构象状态，如稳定构象、活性/无活性构象，更具体地是激动剂、部分激动剂或偏向激动剂构象。或者，在本文所述的该选择方法中提出异源标签(如GFP)的NANEX-捕集剂/剥离剂时，可以开发通用的高通量选择平台，为自动化和高效抗体筛选技术提供进一步的益处。随着这种技术在生物技术中的迅速发展，可以预见的是，本发明将影响新型治疗药物筛选的效率和潜力，以及增加蛋白质组学、基于MS的、结构和其他分析的通量和潜力。

基于NANEX的多肽结合剂的选择

因此，用于选择靶蛋白特异性的多肽结合剂的方法在第一方面涉及包括以下步骤的方法：

a)将固定在表面上并特异性结合靶蛋白的第一蛋白质结合剂与包含靶蛋白的样品混合，用于在表面上获得复合物，

b)向步骤a)的所述复合物提供包含多种多肽结合剂的样品，

c)向步骤b)的混合物中添加包含第二蛋白质结合剂的样品，所述第二蛋白质结合剂与第一结合剂竞争与所述靶蛋白的结合，并且通过特异性结合靶蛋白将第一结合剂从靶蛋白中移置出来，和

d)洗脱与靶蛋白结合的第二蛋白质结合剂，用于分离结合到所述靶蛋白的多肽结合剂。

特征“竞争与靶蛋白的结合”是有效洗脱与多肽结合剂缔合的靶-剥离剂复合物所需的，可以解释为剥离剂竞争相同表位，或者也可以意指以不同的方式(诸如动力学或变构)竞争，因为特别是在Nb领域中，已知与靶的变构相互作用代表结合模式。因此，在一个实施方案中，剥离剂可以通过结合最小重叠或相邻的表位来竞争与靶标的结合，或者替代性地，剥离剂甚至可以通过结合靶标上的变构位点、通过诱导靶标的构象变化来破坏捕集剂和靶标之间的相互作用。可以使用本领域已知的几种方法建立竞争性结合剂，例如但不限于竞争ELISA、alphalisa、Octet测量或生物层干涉测量(BLI)、SPR Biacore、微量热泳(MST)、等等。

因此，竞争性洗脱模式用于从靶标固定的表面洗脱靶标，且因此不涉及关于所选择的多肽结合剂的任何竞争(其理想地在洗脱阶段也与靶标结合)。然而，在如NANEX中使用的这种竞争性洗脱中期望使用至少一种ISVD作为抗原结合第二蛋白质结合剂或剥离剂，因为与例如使用大的常规抗体作为移置剂相比，ISVD或Nb的使用提供了更有利的动力学。

本发明的方法包括第二蛋白质结合剂，其在溶液中，并且在洗脱条件下是可溶的。如本领域技术人员已知的，所述洗脱条件优选涉及生理条件。如本文所用的术语“可溶的”是指蛋白质结合剂处于功能形式的事实，这意味着它能够在其对表位的亲和力的预期范围内特异性地结合其靶标。对于本发明的方法，在步骤a)中固定所述第一蛋白质结合剂，其中它可以经由共价或其他偶联方式固定在表面上。试剂可以偶联至珠球，所述珠球可以是琼脂糖珠或磁珠，或者可以存在于表面或基质上，更具体地填充在亲和柱上，所述亲和柱可以适合于制备以及分析规模，更具体地，所述亲和柱可以是低于1mL数量级的柱体积的微柱，或甚至是亚微摩尔体积，或甚至使用微流体技术提供在芯片上。最优选地，所述第一蛋白质结合剂固定在固体支持物或树脂上。如本文可互换使用的‘树脂’或‘亲和树脂’是用于固定生物分子如ISVD或其他蛋白质结合剂的活化亲和色谱载体。在具体的实施方案中，所述第一蛋白质结合剂包含ISVD，并使用本领域已知的偶联方法与树脂偶联(参见实施例)。如本文呈现的方法是具有如下优势：在步骤d)中洗脱时，使用生理条件。任选地，根据a)中使用的样品类型和选择的持续时间，固定化表面的温和再生步骤可以允许在第二轮中重复使用所述固定化复合物，尽管优选地，更多的选择轮包括重复方法步骤a)至d)，从而确保靶蛋白的完整性和稳定性。

取决于样品的性质，在本发明方法的步骤a)或步骤b)之后，可能需要在中性、或非常温和、或相当苛刻的条件下任选地洗涤固定化表面，或者可能需要重复的洗涤步骤以除去包含靶蛋白的样品中存在的任何未结合的丰富组分，或除去多种多肽结合剂的未结合的剩余部分。

在进一步的实施方案中，如本文所述的所述方法包括第二蛋白质结合剂，与第一蛋白质结合剂的k_off相比，第二蛋白质结合剂的k_off更低。此外，当第一结合剂或捕集剂与第二结合剂相比具有更高的解离速率或更低或相等的亲和力时，所述方法递送最佳结果，并且反之亦然，当第二结合剂与第一结合剂相比具有更低的解离速率和/或相同或更高的表位亲和力时，所述方法递送最佳结果。根据目前的现有技术知识，解离速率常数(或解离速率或k_off)和缔合速率常数(或结合速率或k_on)是相关的，作为K_D＝k_off/k_on，其中K_D定义为解离常数，其与结合剂对其靶标的亲和力负相关，如上文定义中也详细描述的。因此，如果解离常数K_D值(较)低，则亲和力(较)高(如果k_on是相同的)。或者，如果k_on较高，则K_D较低且亲和力较高(如果k_off是相同的)。因此，对于本发明的选择方法，本文所述的蛋白质结合剂对相同、基本上相同或大部分重叠的表位的k_off和/或亲和力(或K_D)相对不同。如本文所述的方法更具体地是指对于靶蛋白的相同、基本上相同或大部分重叠的表位，第二结合剂的k_off低于第一结合剂的k_off，其中“较低”在本文中是指低至少2倍、低5倍、或低10倍、或低至少30倍、或低至少100倍、或低至少200倍、至少300倍、至少400倍、或低至少500倍的值。更优选地，与第一蛋白质结合剂的k_off相比，所述第二结合剂k_off值低至少2倍至低至少10倍、或低至少5倍至低至少20倍、或低至少10倍至低至少30倍、或低至少100倍的范围内。

类似地，第二结合剂对靶蛋白的表位的亲和力可以等于或高于第一结合剂对靶蛋白的表位的亲和力，其中“更高的亲和力”是指与第一蛋白质结合剂的K_D值相比，第二蛋白质结合剂的“K_D值”低至少2倍、或低至少5倍、低10倍、低20倍或低100倍、或在低至少2倍至至少2000倍的范围内的K_D值。在一个优选的实施方案中，如本文所述的纯化方法公开了对于靶蛋白的表位具有1mM至约1纳摩尔的K_D值的第一结合剂并公开了具有1纳摩尔或更低，任选低至1皮摩尔的K_D值的第二蛋白结合剂，任选对所述靶标具有基本上相同的或大部分重叠的表位。更优选地，所述第一结合剂具有在纳摩尔至毫摩尔范围(即10E-9至10E-3)内的K_D值，并且第二结合剂具有在飞摩尔至微摩尔范围(即10E-12至10E-6)内的K_D值，最优选第一结合剂和第二结合剂之间的相对差异为至少2倍。在一个实施方案中，所述第一蛋白质结合剂的K_D值比移置剂的K_D值高至少2倍，这是由k_off值的差异驱动的差异，尤其是移置剂与相同或大部分重叠的表位结合时。

多个多肽结合剂

本文所述的方法从包含“多个多肽或蛋白质结合剂”的样品中选择，所述“多个多肽或蛋白质结合剂”实际上可以是任何类型的蛋白质或肽或多肽，如在最广泛的意义上，作为特异性结合靶蛋白的候选物的蛋白质集合，其中所述“多个多肽结合剂”在最广泛的意义上因此可以例如衍生自细胞提取物、特定组织或信号转导级联或无偏倚的蛋白质组样品。在一个更具体的方面，“多个蛋白质结合剂”作为包含结合剂组库的样品提供，所述结合剂作为从文库表达和/或展示的片段。更具体地，展示文库主要是已知抗体类型的分子。因此，重组抗体文库在具有多个蛋白质结合剂的此类样品的范围内，因为此类抗体文库通常将提供选择用于特异性结合靶蛋白的蛋白质结合剂。

因此，“多个多肽结合剂”可以在结构上由包含结合结构域(潜在地结合靶蛋白)的结合剂提供，并且由蛋白质、肽或肽模拟物提供，更具体地“抗原结合”结构域提供，如存在于许多不同的抗体和抗体样分子中的，如本文所述，例如但不限于抗体或活性抗体片段，如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH结构域的片段、重链抗体(hcAb)、单结构域抗体(sdAb)、微抗体(minibody)、衍生自骆驼重链抗体的可变结构域(VHH或纳米抗体)、衍生自鲨鱼抗体的新抗原受体的可变结构域(VNAR)、包括Alphabody的蛋白质支架、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)、纤连蛋白III型重复、抗运载蛋白(anticalin)、打结蛋白(knottin)、工程化CH2结构域(nanoantibody)，等等。

在一个优选的实施方案中，所述“多个多肽结合剂”因此由包含允许选择表型-基因型偶联的展示文库的样品提供，如本文所述，表型-基因型偶联对于促进抗原特异性抗体或结合剂(含有抗原结合结构域的多肽)的选择是关键的，是用于鉴定治疗命中的抗体展示技术的关键特征。因此，如本文所用的术语“展示文库”提供了允许将表型(抗原结合行为)与多肽结合剂库的基因型物理进行链接的那些重组文库。

此外，本文意图的重组抗体文库的类型包括基于免疫片段(即，偏向于免疫动物或天然免疫或感染的人中存在的某些特异性)或初始片段(不偏向于免疫系统中发现的特异性)的mAb文库。后一种类型的片段可以衍生自非免疫天然或半合成来源。非免疫(或初始)文库衍生自天然的、未免疫的、重排的V基因(例如，来自IgM B细胞池)以减少所有组成成分中的抗原诱导的偏倚，并且是用于分离抗自身抗体的第一个文库-否则难以通过免疫获得。合成抗体文库是完全在体外构建的，使用将完全或定制简并性区域引入一个或多个V基因的CDR中的寡核苷酸。

如本领域已知的，几种展示技术允许在重组抗体文库的选择中使用不同的方法，其中噬菌体展示是主要的技术，在如本文所述的方法中还设想了替代方案，包括酵母、核糖体、细菌和哺乳动物展示。

在一个具体实施方案中，如本文所述的选择方法用于多轮选择，在重复过程中富集文库(如本文所示方法中使用的噬菌体展示文库)中存在的多肽结合剂。具体地，当收集的洗脱液含有展示靶特异性Nb的噬菌体，其与靶-剥离剂复合物结合时，通过收集的洗脱液提供用于再感染大肠杆菌的噬菌体溶液，以便提供用于下一轮的噬菌体。

基于NANEX的选择中的靶蛋白样品和捕集剂/剥离剂对

如前所述，本文所述方法的靶蛋白为所述方法的步骤a)和d)中应用的第一和第二蛋白质结合剂(捕集剂和剥离剂)提供表位，其中所述表位可以是所述靶蛋白上的天然的、天然存在的和/或内源可用的表位。当捕集剂和剥离剂识别存在于步骤a)的样品中的天然或内源性蛋白质时，这将允许从样品捕获靶标以获得固定化的抗原-捕集剂复合物。另一种选择是通过在重组产生的靶蛋白上呈现表位来提供，所述靶蛋白作为纯化或部分纯化的样品提供，本身不需要标签。对于特异性结合未标记的靶蛋白的蛋白质结合剂对(捕集剂/剥离剂)，为了竞争相同的靶标，可以筛选和选择以提供一对竞争结合剂，或者可以设计更高亲和力和更低亲和力的蛋白质结合剂对。实际上，使用与靶标结合的剥离剂或第二蛋白质结合剂的3D结构允许在蛋白质结合剂的结合位点中设计突变，将产生降低的亲和力或更高的k_off，并从而提供相容的捕集剂或第一蛋白质结合剂。此外，一旦序列已知，不需要结构信息的更直接的方法也允许基于单个结合剂来确定所述配对。如实施例中所示，以非限制性方式，对于GFP，用作“靶蛋白”时，基于对不同结合剂的筛选，通过使用BLI对表位作图来分析它们的竞争性质，或替代性地，基于纳摩尔结合剂或剥离剂的序列，还可以进行已知在定义结合动力学中最关键的CDR3区中的丙氨酸突变扫描，，可以鉴定具有较低解离速率常数的新配对，以在NANEX方法中用作捕集剂。以这种方式，以不同k_off或亲和力结合相同表位的蛋白质结合剂对可以简单地通过引入单个或多个突变而获得。

在涉及其中捕集剂和剥离剂包含ISVD的方法的替代实施方案中，“单价”形式可以用作捕集剂，并且“多价”形式可以用作剥离剂，因为与单价形式相比，多价形式以更高的k_off具有更高的亲合力，这也导致更优的洗脱产率和靶蛋白纯度。本文中的术语“单价形式”是指如本文所用的ISVD，其只能识别一种抗原决定簇，而术语“多价”形式是指如本文所用的ISVD，其可以识别多于一种抗原决定簇，例如但不限于二价、三价或四价形式。此外，代替多价剥离剂，还可以设想多互补位或多特异性剥离剂，其中所述剥离剂可以包含与相同抗原决定簇结合的相同结构单元，以及至少一个或多个结构单元结合，所述结构单元结合可以是不同的并且可以结合靶蛋白上的相同或另一个表位，或者，与第一靶蛋白复合的另一个靶蛋白上的表位。

在进一步的实施方案中，如本文所述的方法利用第一和第二蛋白质结合剂(捕集剂和剥离剂)，其中那些结合剂中的至少一种包含如本文所定义的抗原结合结构域，或更具体地包含至少一种抗体、ISVD、VHH、纳米抗体或抗原结合嵌合蛋白(本文中定义为通过至少两个位点与支架蛋白融合的ISVD，并且所述支架蛋白结构域优选包含HopQ、YgjK或其衍生物或变体)。所述抗原结合嵌合蛋白的后一定义实际上也称为巨抗体，其因此可以在本发明的方法中作为第一和/或第二蛋白结合剂应用。如本文所用的术语巨抗体是指Steyaert等人(WO2019/086548A1)中公开的新型融合蛋白，是指包含与支架蛋白连接的抗原结合结构域的融合蛋白，其中所述支架蛋白在所述结构域的表面可接近或暴露的一个或多个氨基酸位点处与所述抗原结合结构域偶联，导致所述抗原结合结构域的拓扑结构的中断。所述抗原结合嵌合蛋白的特征还在于，与未与所述支架蛋白融合的抗原结合结构域相比，其保留其抗原结合功能。本文所述的巨抗体涉及特定的巨抗体或抗原结合嵌合蛋白，其抗原结合结构域包含免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或纳米抗体，其在所述ISVD结构域的可及表面(β转角或环，不包括CDR)与支架蛋白融合或连接，导致所述抗原结合结构域的拓扑结构的中断，并保留其抗原结合功能，即特异性表位识别。在一个具体的实施方案中，所述第二蛋白质结合剂涉及包含通过在连接ISVD的β-链A和B的第一β-转角中插入支架蛋白而与支架蛋白连接的ISVD的巨抗体或抗原结合嵌合蛋白(如根据IMGT命名法定义的，并且如WO2019/086548A1中定义的)。在甚至更具体的实施方案中，本文使用的支架蛋白是HopQ或YgjK支架蛋白，其中支架蛋白的融合中断了ISVD的拓扑结构，但不中断其整体3D结构，也不中断其表位结合特异性。如本文所用的“HopQ”或“HopQ衍生的”支架涉及幽门螺杆菌菌株G27的1型HopQ的粘附素结构域的蛋白质支架(蛋白质数据库：PDB 5LP2)，或其循环排列的蛋白质，也称为ChopQ或c7HopQ(也参见WO2019/086548A1)。如本文所用的“YgjkK”或“YgjK衍生的”支架涉及大肠杆菌K12 YgjK(PDB 3W7S)的蛋白支架，或编码其所述蛋白的循环排列基因，也称为cYgjK(也参见WO2019/086548A1)。

另一个实施方案涉及用于选择的方法，其中如本文所述的步骤a)中的包含靶蛋白的样品提供的靶蛋白具有由第一和第二蛋白结合剂识别的表位存在于巨抗体中的支架蛋白(靶蛋白)上。所述巨抗体可以优选使用衍生自HopQ或YgjK蛋白的支架蛋白构建，因此所述HopQ或YgjK蛋白支架含有与所述方法的蛋白结合剂特异性结合的表位。特异性结合存在于本文公开的或如Steyaert等(WO2019/086548A)中公开的或如其他地方可能描述的巨抗体上的支架蛋白表位的所述蛋白结合剂对具有进一步的优点，即该方法可以应用于从复杂混合物中捕获或清除与巨抗体结合的靶蛋白，或者可以作为通用选择工具应用，类似于其他标记的靶蛋白。

另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中靶蛋白包含标签或异源标签或标记或可检测标记。术语“可检测标记”或“加标记”或“加标签”是指可检测标记或标签，其允许检测、可视化和/或分离、进一步纯化和/或固定目的靶蛋白，或者，存在于剥离剂上时，允许检测、可视化和/或分离、进一步纯化和/或固定本文所述的洗脱复合物或分离或纯化的(多)肽或复合物，并且意在包括本领域已知的用于这些目的的任何标记/标签。在进一步的实施方案中，蛋白质结合剂特异性地结合包含靶蛋白的融合蛋白上存在的标签上的表位。特别优选的是荧光标记或标签(即荧光染料/荧光团)，如荧光蛋白(例如GFP、YFP、RFP等)和荧光染料(例如FITC、TRITC、香豆素和花青)；发光标记或标签，如荧光素酶；和(其他)酶标记(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或葡萄糖氧化酶)。还包括亲和标签，如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多聚(His)(例如6×His或His6)、和增溶标签，硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)和泛素，或小泛素样修饰物(SUMO)或SMT3；色谱标签，如FLAG标签；表位标签，乳V5-标签、myc-标签和HA-标签，或EPEA(CaptureSelect C-标签，US9518084B2)，或此外内含肽-几丁质结合结构域(内含肽-CBD)、基于链霉亲和素/生物素的标签、His-PatchThioFusion(基于硫氧还蛋白)，或HaloTag，或甚至报告子标签，如HRP，或碱性磷酸酶。例如在Kimple等(2015表9.9.1)中提供了许多非限制性实例。还包括任何前述标记或标签的组合。

在进一步的实施方案中，如本文所述的方法可以包括含有待在步骤a)中应用的靶蛋白的样品，其是“复合样品”或蛋白质和/或其他组分的复合混合物。所述样品可以是组分的体外混合物或生物样品，其中术语“生物样品”是指血清、尿液、细胞和组织以及其他体液。“复合混合物”也可以作为裂解物或细胞提取物或含有靶蛋白的组分的任何混合物提供，所述靶蛋白也可以是重组产生的靶蛋白，其任选地掺入复合混合物中(以便在不同条件或特定环境中捕获某些构象)。“复合样品”也可以作为全蛋白质组或可溶性蛋白质组溶液提供，其含有生物体、细胞环境或组织的整个蛋白质库，任选对应于某种信号传导级联、疾病阶段或病症等的蛋白质组。

在一个具体的实施方案中，包含如在方法的步骤a)中提供的靶蛋白的“复合样品”也已经作为免疫原或抗原应用于免疫动物，以获得在所述方法的步骤b)中使用的“多种多肽结合剂”。在这样的方法中，将包含多种多肽结合剂的展示文库(其是较少或部分或无偏倚的)应用于选择，而不是通常仅针对特定(单一)抗原产生的偏倚文库(参见实施例)。

如上所述，如本文所述的方法可以导致复合物的洗脱，所述复合物不仅包含剥离剂以及与选择的多肽结合剂结合的靶蛋白，而且所述复合物可以包含与靶标结合的其他蛋白质，尤其是在步骤a)中从复合样品开始时，其中靶蛋白经由第一蛋白质结合剂与表面的结合因此已经导致靶标+相互作用物与所述表面的结合。在这样的实施方案中，在添加多个蛋白质结合剂时选择蛋白质结合剂因此可以导致鉴定出直接或间接结合靶蛋白的蛋白质结合剂。直接结合意指对靶蛋白存在直接相互作用和特异性，而间接结合在本文中意指所述多肽结合剂结合洗脱的蛋白质复合物的另一组分，如本身已经结合并存在于结合靶蛋白的复合物中的蛋白质(来自步骤a)中使用的复合样品)。因此，在一个具体实施方案中，该方法不仅允许鉴定靶蛋白的多肽结合剂，而且允许鉴定在方法步骤a)中共同固定化的靶蛋白的相互作用物的多肽结合剂。

最后，本领域技术人员应该清楚用于选择多肽结合剂的方法如何以及何时有用，因为可以鉴定充分的效用，作为非限制性实例，用于在药物发现中从重组抗体文库选择特异性结合剂，以及用于表位分箱或鉴定靶标上的新表位，即不同于已知结合剂(如捕集剂和剥离剂)的表位。如本文所设想的，所述选择方法适用于中通量甚至高通量目的。

应当理解，尽管本文已经针对根据本公开的方法、样品和产品讨论了特定实施方案、具体构型以及材料和/或分子，但是可以在形式和细节上进行各种改变或修改而不脱离本发明的范围。提供以下实施例以更好地说明特定实施方案，并且它们不应被视为限制本申请。本申请仅受权利要求的限制。

实施例

引言

本发明基于纳米抗体交换色谱方法(在本文中称为“NANEX”，基于PCT/EP2020/087291中先前描述的方法)的原理，其在本文中应用于从展示文库选择靶特异性结合剂，例如抗体。特别地，第一结合剂(在本文中称为“捕集剂”)，特别是纳米抗体，其连接(优选共价地)固体支持物，用于固定目的抗原或靶标或蛋白质(如本文中可互换使用)。然后将固定的抗原与不同结合剂(例如抗体)的不同库一起孵育，所述结合剂以提供每个结合结构域的表型(结合行为)和编码基因型之间的物理联系的方式表达和展示，例如通过噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或任何其他方法。洗涤步骤可任选地用于去除不相关的结合剂或抗体。类似于NANEX纯化方法，并且是本方法具体的，与捕集剂竞争结合抗原的第二结合剂(在本文中称为“剥离剂”或“移置剂”)，特别是纳米抗体，随后被使用以选择性洗脱与剥离剂和抗原特异性结合结构域或抗体及其编码基因型相缔合的固定化抗原。然后可以扩增结合剂以产生富含抗原特异性的结合剂或抗体的新库，允许重复该循环直到结合剂主导群体并且可以表征为单克隆结合结构域或抗体(图1)。因此，本文提供了一种新型的用于特异性靶蛋白结合剂的选择方法，其首次整合了基于NANEX的免疫移置纯化的原理，以提高选择过程的效率和选择性。

实施例1：NANEX使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和GFP蛋白作为靶标从抗体文库选择新的GFP特异性纳米抗体。

GFP抗体文库的产生。用总共850μg GFP(SEQ ID NO:25)每周免疫美洲驼(llama)一次，共六次，并如(材料和方法)所描述的生成噬菌体展示文库。

新的GFP特异性纳米抗体的发现。为了发现结合非重叠表位(相比于捕集剂/剥离剂对的表位)的新的GFP特异性纳米抗体，我们根据制造商的说明，将具有引用名CA15816的GFP特异性捕集剂(SEQ ID NO:2)固定在磁珠上，其对GFP的亲和力为2.7nM。将这些捕集剂包被的珠球封闭并在使用前用PBS洗涤5次。将0.1nM至100nM范围内的不同浓度的GFP(SEQID NO:25)与这些捕集剂包被的珠球混合以将GFP捕集在NANEX珠上。未与GFP孵育的捕集剂包被的珠球用作阴性对照。与GFP(抗原)孵育后，将所有磁珠常规洗涤3次，并在96孔板中与噬菌体上展示的GFP抗体文库一起孵育。在4℃下孵育2h后，用PBS-Tween常规洗涤珠球12次。为了选择结合不与捕集剂/剥离剂对的那些表位重叠的表位的新的GFP特异性抗体，通过添加竞争性结合与捕集剂表位重叠的表位的高亲和力剥离剂CA12760(SEQ ID NO:1)来选择性地破坏捕集剂和GFP之间的非共价相互作用。因此，将珠球与结合GFP上的相同表位的高亲和力CA12760(GFP特异性剥离剂)一起孵育30min。用这一GFP特异性剥离剂选择性地洗脱具有结合的噬菌体的GFP。接下来扩增噬菌体以产生富含抗体的新库。为了比较，如所述的(Pardon等，2014)，我们用胰蛋白酶从用100nM GFP制备的捕集剂包被的珠球洗脱结合的噬菌体。

对于使用NANEX的第2轮选择，我们遵循相同的策略，使用从捕集剂包被的珠球(在所有珠球上用100nM GFP制得)获得的输出噬菌体。在1或2轮选择后观察到的富集显示在图2中。与NANEX相比，如果通过胰蛋白酶进行洗脱，则在2轮选择后观察到显著更高的背景。选择了八种不同的GFP特异性纳米抗体家族，基于其CDR3序列(Nb克隆CA17517对应于SEQ IDNO:26、CA17518-SEQ ID NO:27、CA17519-SEQ ID NO:28、CA17520-SEQ ID NO:29、CA17673-SEQ ID NO:30、CA17674-SEQ ID NO:31、CA17675-SEQ ID NO:32、CA17676-SEQ ID NO:33)。

表位分析。为了证明与捕集剂/剥离剂的表位相比，新选择的纳米抗体家族结合靶标上的不同表位，我们提出了生物层干涉测量(BLI)结合实验。为此，我们用生物素化的GFP加载到链霉亲和素生物传感器，接下来我们使具有皮摩尔亲和力的GFP-剥离剂CA12760(SEQ ID NO:1)与GFP结合。洗涤后，将负载有GFP-CA12760复合物的该生物传感器与新发现的Nb一起孵育。在每种情况下，我们观察到质量的进一步增加，表明所有这些纳米抗体与另一个表位结合并且不移置CA12760(图3)。

实施例2.NANEX使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和GFP标记的靶蛋白从抗体文库选择新的靶特异性纳米抗体。

捕集剂/剥离剂对，如例如实施例1中引入的GFP特异性对，也可以首先用于从复杂混合物(例如细胞裂解物)中捕获GFP标记的目的蛋白质，并从基质(珠、板等)选择性地洗脱GFP标记的目的蛋白质。在此，我们利用噬菌体展示了通过免疫美洲驼产生的针对人糖皮质激素受体配体结合结构域(GR-LBD)的免疫文库的纳米抗体库。共价连接到固体支持物的GFP特异性捕集剂用于固定GFP标记形式的GR。然后使用KingFisher^TMFlex纯化系统(ThermoScientific)将该固定化抗原GFP-GR与源自免疫动物的纳米抗体展示文库一起孵育。类似于NANEX并且是本发明特别地，与捕集剂竞争的GFP特异性剥离剂随后被使用以选择性地洗脱与噬菌体上展示的LBD特异性纳米抗体缔合的固定化GFP-GR。接下来扩增用这种GFP特异性剥离剂选择性回收的噬菌体以产生富含抗体特异性剥离剂的新库，接下来扩增以产生富含LBD特异性的抗体(特别是本文的Nb)的新库，允许重复该循环直到LBD特异性纳米抗体在群体中占主导地位以被表征为单克隆LBD结合剂。

GR-LBD抗体文库的产生。编码人糖皮质激素受体(GR)的配体结合结构域(LBD，369-777)的构建体用于在地塞米松(Dex)存在下在大肠杆菌的细胞质中表达重组LBD。通过亲和纯化(Ni-NTA)将GR-LBD结构域纯化至均质，作为可溶性蛋白，随后在缓冲液(20mMNaH₂PO₄ pH 8.0、150mM NaCl、10％甘油、1mM DTT和10μM Dex)中透析。在6周的时间段内用总共110μg GR-LBD每周一次免疫美洲驼，并如所描述的(材料和方法)产生噬菌体展示文库。

新的GR-LBD特异性纳米抗体的发现。将编码人糖皮质激素受体(NR3C1)的全长基因引入pCDNA3表达载体中以产生GFP-标记的靶标融合体。使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染剂将这一载体转染到HEK293T细胞中。转染后48h，收获5000万个细胞，用冰冷的PBS缓冲液洗涤，并使用Dounce匀浆器在补充有50μg/ml DNAse I和蛋白酶抑制剂的5ml裂解缓冲液(10mM Hepes pH 7.4，10μM Dex，10％甘油，10μM ZnCl₂，2.5mM MgCl₂，2.5mM DTT，0.5％NP40替代物)中裂解。通过以20,000g离心澄清裂解物。收集含有GFP标记的GR(靶标)的上清液，并在4℃下在96孔深孔块中与20μL磁珠一起孵育1小时，所述磁珠用GFP特异性捕集剂共价官能化以将GFP标记的GR固定在这些珠子上。使用KingFisher flex装置，收集这些珠球并用0.5mL洗涤缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、10μM Dex、10％甘油、10μM ZnCl₂、2.5mMMgCl₂、2.5mM DTT)洗涤，然后将它们在4℃下与展示GR-LBD纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育1h。接下来，用0.5mL洗涤缓冲液洗涤这些珠球9次。接下来，然后使用GFP特异性剥离剂纳米抗体选择性地洗脱与噬菌体上展示的GR特异性纳米抗体缔合的固定化GR。洗脱的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min，不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/mL氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀在LB(补充有100μg/ml氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中重悬，并以甘油储备液形式储存在-80℃下以供以后使用。将未转染HEK293T的裂解物(其不含任何GFP标记的蛋白质)掺入20μg野生型GFP以用作(阴性)对照。

通过使用NANEX技术淘选进行3轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的TG1细胞的十倍连续稀释液，从富集的子文库分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员，并将编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化每种目的纳米抗体(Nb克隆CA17797对应于SEQID NO:35、CA17798-SEQ ID NO:36、CA17799-SEQ ID NO:37、CA17800-SEQ ID NO:38、CA17801-SEQ ID NO:39)。通过将单独的纳米抗体连接在NHS-琼脂糖珠上以用于共免疫沉淀测定来验证GR特异性纳米抗体的特异性。将用这些GR特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与用GFP-GR载体转染的HEK293T细胞的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析。将分离的蛋白质转移至PVDF膜，并用GR特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实GFP标记的GR的存在(图11)。

我们从这一实施例得出结论，基于NANEX的选择方法允许使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和GFP标记的靶蛋白从抗体文库中轻松地选择靶特异性抗体。

实施例3.NANEX使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和GFP标记的靶标从全蛋白质组抗体文库选择新的靶标特异性结合剂。

还可以使用捕集剂/剥离剂对，如例如实施例1中引入的GFP特异性对，首先从基质(珠、板等)上的复杂混合物(例如细胞裂解物)捕获GFP标记的目的蛋白质。类似于NANEX并且是本方法特别地，与捕集剂竞争的第二纳米抗体(剥离剂)随后被使用以选择性地洗脱与抗原特异性结合结构域或抗体及其编码基因型缔合的固定化抗原。

对于实施例3，我们用所有可溶性酵母蛋白(可溶性酵母蛋白质组)免疫美洲驼以产生针对所有可溶性酵母蛋白的免疫应答。将该免疫动物的纳米抗体库展示在噬菌体上以产生全蛋白质组的抗体文库。平行地，使用共价连接到固体支持物的GFP特异性捕集剂来固定GFP标记形式的FBA1(Huh等，2003)。然后使用KingFisher Flex装置将该固定化抗原(GFP-FBA1)与源自免疫动物的纳米抗体展示文库一起孵育。类似于NANEX并且是本发明特别地，与捕集剂竞争的GFP特异性剥离剂随后被使用以选择性地洗脱与噬菌体上展示的FBA1特异性纳米抗体缔合的固定化GFP-FBA1。接下来扩增用这种GFP特异性剥离剂选择性回收的噬菌体以产生新的富含FBA1特异性抗体的库，允许重复这个循环直到FBA1特异性纳米抗体主导群体以被表征为单克隆FBA1结合剂。

全蛋白质组抗体文库的产生。在6周的时间内，用酿酒酵母菌株EBY100(MYA-4941^TM)的总共3mg的所有可溶性酵母蛋白(可溶性蛋白质组)每周一次免疫美洲驼，以产生全蛋白质组抗体文库。为了制备这种可溶性抗原的全蛋白质组混合物，使1升EBY100培养物在YPD培养基中生长并在对数中期(OD600＝0.6)收获。通过离心收集细胞并重悬于补充有50μg/ml DNA酶I和不含EDTA的蛋白酶抑制剂(cOmplete^TMRoche)的PBS中。然后使用弗氏压碎器裂解细胞并以20,000g离心30min。收集含有所有可溶性蛋白的上清液，使用0.22μm过滤器通过注射器过滤，等分并储存在-80℃。通过BCA蛋白质定量(Pierce^TMBCA蛋白质测定试剂盒，23225，ThermoFisher)测定，裂解物中的总蛋白质浓度为1.5mg/mL。免疫后，如(材料和方法)所描述的生成噬菌体展示文库。

新的FBA1特异性纳米抗体的发现。我们使用了NANEX，从表达FBA1(系统名称YKL060C)作为GFP标记的蛋白质(Huh等，2003)的工程化酵母菌株(酵母GFP融合物集合引用名：GFP(+)22，G1)的裂解物中将GFP-FBA1选择性地捕获到捕集剂包被的磁珠上(参见实施例1)。洗涤这些磁珠，与展示全蛋白质组纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育并再次洗涤。接下来，然后使用KingFisher Flex装置将GFP特异性剥离剂纳米抗体用于选择性地洗脱与噬菌体上展示的FBA1特异性纳米抗体缔合的固定化GFP-FBA1。洗脱的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min，不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/ml氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/ml氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并以甘油储液形式储存在-80℃下以供以后使用。将来自参考菌株EBY100(其不含任何GFP标记的蛋白质)的酵母裂解物掺入20μg野生型GFP以用作(阴性)对照。

FBA1特异性纳米抗体的表征。通过使用NANEX技术淘选进行3轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞的十倍连续稀释液，从富集的子文库中分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员。选择了源自四个不同序列家族的四种不同的FBAl特异性纳米抗体，基于其CDR3序列(Nb克隆CA17440对应于SEQ ID NO:3、CA17441-SEQ ID NO:4、CA17442-SEQ ID NO:5和CA17443-SEQ ID NO:6)。将它们的编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化每种目的纳米抗体。通过将单独的纳米抗体连接在NHS-琼脂糖珠上用于共免疫沉淀测定来确认FBA1特异性纳米抗体的特异性。用这些FBA1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与表达天然FBA1的EBY100裂解物或表达GFP标记的蛋白质形式的FBA1的工程化酵母菌株(GFP(+)22，G1)的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(图4)。还将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹染色，以证实GFP标记的FBA1的存在(图4)。对于以这种方式分析的每种FBA1特异性纳米抗体，与EBY100裂解物的共免疫沉淀给出在39kDa处观察到的主要条带，对应于FBA1的预期分子量。此外，与表达GFP标记的蛋白质形式的FBA1的酵母菌株裂解物一起孵育时，在66kDa处观察到主要条带，这与GFP-FBA1的分子量(27kDa+39kDa＝66kDa)一致。用抗GFP抗体进行的蛋白质印迹分析证实66kDa条带含有GFP标签。通过质谱分析相关条带(39kDa和66kDa)进一步确认FBA1的身份。

我们从该实施例得出结论，基于NANEX的选择方法允许从全蛋白质组的抗体文库中容易地选择靶特异性抗体。

实施例4.NANEX用于使用GFP特异性捕集子/剥离剂对和单独的GFP标记的靶标从全蛋白质组抗体文库中平行选择靶标特异性结合剂。

为了证明如本文所述的基于NANEX的选择方法广泛适用于发现针对不同靶标的抗体，我们按照平行方法从全蛋白质组抗体文库中选择了12种不同的可溶性酵母蛋白的特异性结合剂(表1)。因此，选择12种工程化酵母菌株，每种表达另一种GFP标记的目的蛋白(酵母GFP融合物集合，ThermoFisher)。这些蛋白质是根据它们在酿酒酵母中的丰度而选择的，从酵母中最丰富的蛋白质之一，FBA1(YKL060C)，跨越到RIF2(YLR453C)，一种控制端粒长度并且是每个细胞具有少于一千个分子的蛋白质(SGD Project http://www.yeastgenome.org)。

表1：用作可溶性酵母蛋白质组的代表性靶标的12种GFP标记的蛋白质的性质。

标准名称	系统名称	中值丰度(分子/细胞)	酵母GFP融合物集合引用名
				FBA1	YKL060C	737009	GFP(+)22,G1
PDC1	YLR044C	581219	GFP(+)12,F8
				SSA1	YAL005C	255901	GFP(+)10,E4
PGI1	YBR196C	158738	GFP(+)12,H11
				ALD6	YPL061W	135000	GFP(+)15,F1
BMH1	YER177W	65471	GFP(+)27,D5
				ACC1	YNR016C	29049	GFP(+)01,B2
SIS1	YNL007C	28050	GFP(+)22,E5
				SXM1	YDR395W	7202	GFP(+)04,H9
top2	YNL088W	3960	GFP(+)01,H11
				TAM41	YGR046W	1666	GFP(+)20,A8
RIF2	YLR453C	976	GFP(+)20,E1

将实施例1中引入的GFP特异性捕集剂用于在珠球上分别捕获来自相应工程化酵母菌株的细胞裂解物的每种GFP标记的靶标。接下来将这些不同的珠球分别与全蛋白质组抗体文库孵育，并使用GFP特异性剥离剂选择性地洗脱所述不同的与抗原特异性结合结构域或抗体及其编码基因型缔合的GFP标记的目的蛋白。接下来扩增用这种GFP特异性剥离剂回收的噬菌体，以产生富含对每种靶蛋白或目的蛋白(POI)特异性的抗体的新库，允许重复该循环，直到POI特异性的纳米抗体在群体中占主导地位以被表征为单克隆结合剂。

全蛋白质组抗体文库的产生。实施例3中描述的相同文库也用于进行实施例4中描述的实验。

新的POI特异性纳米抗体的发现。与实施例1、2和3类似，我们使用了NANEX，在12个单独的捕集剂包被的磁珠上从表达不同的GFP标记的蛋白质形式的POI(表1)的工程化酵母株(Huh等，2003)的裂解物中选择性地捕获12种不同的GFP-POI。洗涤后，将这些单独的磁珠与展示全蛋白质组的纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育并再次洗涤。对于该实施例特别的是，然后使用GFP特异性剥离剂纳米抗体来选择性地洗脱与噬菌体上展示的POI特异性纳米抗体缔合的固定化GFP-POI。选择性地回收的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min而不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/mL氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/mL氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并作为甘油储备液储存在-80℃下以供以后使用。将来自参考菌株EBY100(其不含任何GFP标记的蛋白质)的酵母裂解物掺入20μg野生型GFP以用作(阴性)对照。

对于本实施例中结合剂的每个靶标选择，如表2中详述的，在通过使用NANEX技术淘选的3轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞的10倍连续稀释液，从富集的子文库分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员。将它们的编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化每种目的纳米抗体。通过在NHS-琼脂糖珠上连接单独的纳米抗体用于共免疫沉淀测定来确认靶特异性纳米抗体的特异性。将用这些靶特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与表达天然靶蛋白的EBY100裂解物或表达GFP标记的蛋白质形式的靶蛋白的工程化酵母菌株(Yeast GFP融合物集合引用名，如表2中所述)的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(如表2中针对每种靶标指定的图中)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实GFP标记的靶标的存在。对于以这种方式分析的每种靶特异性纳米抗体，与EBY100裂解物的共免疫沉淀给出对应于靶蛋白的预期分子量的主要条带。此外，与表达作为GFP标记的蛋白质的靶标的酵母菌株的裂解物一起孵育时，在与GFP-靶标的分子量一致的MW处观察到主要条带。蛋白质印迹抗GFP证实了后一条带含有GFP标签。

表2.用于选择Nb结合剂的酵母蛋白靶标(如实施例4中所述)。

从实施例4，我们得出结论，NANEX允许容易地从全蛋白质组抗体文库中选择针对几种不同靶标的靶标特异性抗体。

实施例5.高通量NANEX使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和单独的GFP标记的靶标用于从全蛋白质组抗体文库中平行选择靶标特异性结合剂。

实施例4描述了使用具有GFP特异性捕集剂/剥离剂对的NANEX从全蛋白质组抗体文库中平行选择针对不同靶标的抗原特异性抗体。在实施例5中，我们按照平行(高通量)方法放大了该方法，用于从全蛋白质组抗体文库中发现94种不同的GFP标记的抗原的抗原特异性结合剂。使用KingFisher仪器(ThermoFisher Scientific)平行进行96种不同的选择，允许大多数步骤自动化。

因此，根据蛋白质的MW和丰度选择94种代表性酵母菌株，每种表达另一种GFP标记的目的蛋白(酵母GFP融合物集合，ThermoFisher)(表3)。将2个阴性对照(不含GFP融合蛋白的酵母和不含酵母裂解物的裂解缓冲液)加入96孔板中。

对于实施例3和4，我们用所有可溶性酵母蛋白(可溶性酵母蛋白质组)免疫美洲驼以产生针对所有可溶性酵母蛋白的免疫应答。将该免疫动物的纳米抗体库展示在噬菌体上以产生全蛋白质组抗体文库。

将实施例1中引入的GFP特异性捕集剂CA15816(SEQ ID NO:2)共价连接固体支持物(磁珠)并分配在96个不同的孔中。每种条件用于在珠球上分别捕获来自相应工程化酵母菌株的细胞裂解物的每种GFP标记的靶标。将捕获的GFP标记的靶标分别与来自实施例3和4的全蛋白质组抗体文库一起孵育，并使用GFP特异性剥离剂CA12760(SEQ ID NO:1)选择性洗脱与抗原特异性结合结构域或抗体及其编码基因型缔合的不同GFP标记的目的蛋白。接下来扩增用该GFP特异性剥离剂选择性回收的噬菌体，以产生富含每种POI特异性的抗体的新库，允许重复该循环，直到POI特异性的纳米抗体占主导地位，待表征为单克隆结合剂的群体。

表3. 94个代表性酵母菌株，每个表达GFP标记的目的蛋白。

关于分子量(MW)和估算的分子/细胞的信息来自SGD数据库(https:// www.yeastgenome.org/)。

全蛋白质组抗体文库的产生。使用实施例3中描述的相同库来进行实施例5中描述的实验。

新的POI特异性纳米抗体的发现。与实施例2至4类似，我们使用NANEX在94种单独的捕集剂包被的磁珠上从表达不同的GFP标记的蛋白质形式的POI(表3)的工程化酵母菌株(Huh等，2003)的裂解物中选择性捕获94种不同的GFP-POI。洗涤后，将这些单独的磁珠与展示全蛋白质组纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育并再次洗涤。对于本发明特别的是，然后使用GFP特异性剥离剂纳米抗体来选择性地洗脱与噬菌体上展示的POI特异性纳米抗体缔合的固定化的GFP-POI。洗脱的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min，不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/mL氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/ml氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并作为甘油储液储存在-80℃下以供以后使用。将来自参考菌株EBY100(其不含任何GFP标记的蛋白质)的酵母裂解物或裂解缓冲液(不含酵母)掺入20μg野生型GFP以用作(阴性)对照。2轮淘选足以观察到几乎所有94种不同POI特异性噬菌体的显著富集(图12)。

对于本实施例中结合剂的每个靶标选择，如表3中详述的，在通过使用NANEX技术淘选的2轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞的10倍连续稀释液，从富集的子文库中分离单个克隆。选择在R2中显示不同富集的10个不同POI，对于每个POI，挑选12个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组为序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员。将它们的编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化每种目的纳米抗体。通过将单独的纳米抗体连接在NHS-琼脂糖珠上以用于共免疫沉淀测定来确认靶标-纳米抗体的特异性。将用这些靶特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与表达GFP标记的蛋白形式的靶蛋白的工程化酵母菌株(Yeast GFP Fusion CollectionReference，如表3所示)的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体(GFP小鼠mAb(GF28R)，MA5-15256，ThermoFisher Scientific)使蛋白质印迹显色，以证实GFP标记的靶标的存在(图13)。

从实施例5，我们得出结论，NANEX允许从全蛋白质组抗体文库以高通量规模平行地容易地选择针对几种不同靶标的靶标特异性抗体。

表4.用于选择和表征Nb结合剂的酵母蛋白质靶标(如实施例5中所述的)。

实施例6.NANEX使用PGI1-特异性捕集剂/剥离剂对和来自粗制酵母细胞裂解物的内源PGI1从全蛋白质组抗体文库选择新的酵母PGI1-特异性结合剂。

实施例1至5使用捕集剂/剥离剂对将作为靶标的GFP或特定GFP标记的靶标固定到基质上，随后洗脱与抗原特异性结合结构域或抗体及其编码基因型缔合的这一靶标。在实施例6中，我们显示捕集剂/剥离剂对可以直接结合不同于GFP的未标记的靶蛋白，用于将其固定到基质上并随后洗脱。

全蛋白质组抗体文库的产生。使用实施例3描述的相同文库进行实施例6中描述的实验。

新的PGI1特异性纳米抗体的发现。与实施例3、4和5类似，我们使用NANEX从酵母裂解物选择性捕获POI。具体地，如之前所述的，将PGI1特异性纳米抗体CA17455(SEQ ID NO：15)固定在磁珠上，用作捕集剂。将这些CA17455包被的珠球在4℃下在旋转装置上与包含内源PGI1靶蛋白的EBY100裂解物或与表达GFP标记的蛋白形式的PGI1(系统名称YBR196C，表1)的工程化酵母菌株(酵母GFP融合物集合引用名GFP(+)12，H11)的裂解物一起孵育1小时(Huh等，2003)。洗涤后，将这些磁珠与展示全蛋白质组纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育并再次洗涤。接下来，然后使用相同的PGI1特异性纳米抗体(在本文中起剥离剂的作用)来选择性洗脱与噬菌体上展示的PGI1特异性纳米抗体缔合的固定的PGI1。选择性回收的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min而不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/ml氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/ml氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并作为甘油储液储存在-80℃下以供以后使用。酵母裂解缓冲液(其不含任何酵母蛋白质)用作(阴性)对照。两轮淘选足以观察到PGI1特异性噬菌体的显著富集。

通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞的十倍连续稀释液，从富集的子文库中分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员。基于其CDR3序列选择源自四个不同序列家族的六种不同的PGI1特异性纳米抗体(对应于SEQ ID NO:46的Nb克隆CA17791、CA17792-SEQ IDNO:47、CA17793-SEQ ID NO:48、CA17794-SEQ ID NO:49、CA17795-SEQ ID NO:50和CA17796-SEQ ID NO:51)。将它们的编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化每种目的纳米抗体。通过在NHS-琼脂糖珠上连接单独的纳米抗体用于共免疫沉淀测定来证实PGI1特异性纳米抗体的特异性。用这些PGI1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与表达天然(未标记的)PGI1的EBY100裂解物或表达GFP标记的蛋白质形式的PGI1的工程化酵母菌株(GFP(+)12，H11)的裂解物一起孵育1小时。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并在SDS-PAGE上分析(图14A)。还将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GFP特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实GFP标记的PGI1的存在(图14B)。对于以这种方式分析的每种PGI1特异性纳米抗体，与EBY100裂解物的免疫共沉淀给出在61kDa处观察到的主要条带，对应于PGI1的预期分子量。此外，与表达GFP标记的蛋白质形式的PGI1的酵母菌株的裂解物一起孵育时，在88kDa处观察到主要条带，这与GFP-PGI1的分子量(27kDa+61kDa＝88kDa)一致。用抗GFP抗体进行的蛋白质印迹分析证实了88kDa条带含有GFP标签。

我们从该实施例得出结论，基于NANEX的选择方法允许使用靶标特异性捕集剂/剥离剂对和天然(未标记的)靶标从全蛋白质组抗体文库中容易地选择靶标特异性抗体，其中天然靶标是内源性表达的，并直接从粗细胞裂解物捕获而无需任何额外的纯化步骤。

此外，我们还发现从酵母裂解物中捕获PGI1然后用剥离剂洗脱，不仅从酵母裂解物中捕获PGI1，而且许多相互作用的蛋白质被共洗脱，并可以被鉴定为PGI1的结合剂，如本文从其细胞背景中捕获的。特别地，如上所述，将PGI1特异性纳米抗体CA17455(SEQ ID NO:15)固定在磁珠上作为捕集剂。将这些CA17455包被的珠球在4℃下在旋转装置上与包含内源性PGI1靶蛋白的EBY100裂解物一起孵育1小时，并洗涤。接下来，将这些包被的珠球与相同的PGI1-特异性纳米抗体(在本文中用作剥离剂)一起孵育1小时以洗脱靶蛋白(PGI1)，其在SDS-PAGE上显示出若干蛋白质条带(图10)，其身份通过质谱分析证实涉及几种PGI1相互作用蛋白(LYS20 UniProt P48570，TDH3 UniProt P00359，PNC1 UniProt P53184)(图10)。这一发现支持该方法允许提供生理环境(包括潜在相互作用配偶体)中的靶蛋白，用于从文库中选择新结合剂。

实施例7.NANEX使用rVGLUT1特异性捕集剂/剥离剂对和来自细胞裂解物的rVGLUT1从抗体文库选择膜蛋白作为靶标的特异性新纳米抗体。

实施例1至6使用了捕集剂/剥离剂对来选择针对目的可溶性蛋白质的结合剂。在此，我们使用了我们的方法从针对膜蛋白，特别是大鼠囊泡谷氨酸转运蛋白1(rVGLUT1，UniProt条目Q62634)产生的免疫文库的噬菌体展示纳米抗体库中选择。在该实施例中，如本文先前所述，将rVGLUT1特异性纳米抗体CA17875(SEQ ID NO:52)固定在磁珠上，以用作膜蛋白rVGLUT1的捕集剂。然后将该固定化抗原与源自免疫动物的纳米抗体展示文库一起孵育。对于本发明特别地，将相同的纳米抗体用作捕集剂，然后用作剥离剂以选择性地洗脱与噬菌体上展示的靶特异性纳米抗体缔合的固定化rVGLUT1。接下来扩增用该rVGLUT1特异性剥离剂选择性回收的噬菌体，以产生富含rVGLUT1特异性的纳米抗体的新库。

rVGLUT1抗体文库的产生。纯化大鼠VGLUT1，并如Schenck等，2017中所述进行美洲驼免疫。免疫后，如所描述(材料和方法)的产生噬菌体展示文库。

新的rVGLUT1特异性纳米抗体的发现。如所公开的(Schenck等，2017)，在HEK293T细胞中产生全长大鼠VGLUT1，并通过在旋转装置上在4℃下孵育1h，在补充有蛋白酶抑制剂的5mL冰冷裂解缓冲液(250mM NaCl，25mM HEPES pH 7.5，10％甘油，2％DDM)中裂解细胞。通过以20,000g离心20min澄清裂解物。收集含有靶标的上清液并在4℃下在旋转装置上与5μL用rVGLUT1特异性纳米抗体CA17875(SEQ ID NO:52)共价官能化的磁珠一起孵育1h，以将rVGLUT1固定在这些珠球上。使用磁铁收集珠球，并用洗涤缓冲液(150mM NaCl、20mM HEPESpH 7.5、10％甘油和0.03％DDM)洗涤，然后将它们在4℃下与展示rVGLUT1纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育1h。接下来，用0.5mL洗涤缓冲液洗涤这些珠球9次。对于本发明特别的是，然后使用相同的rVGLUT1特异性纳米抗体(在本文中起剥离剂的作用)来选择性洗脱与噬菌体上展示的rVGLUT1特异性纳米抗体缔合的固定化rVGLUT1。洗脱的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TGI细胞，并在37℃下孵育30分钟而不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/ml氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/ml氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并作为甘油储液储存在-80℃下以供以后使用。裂解缓冲液(其不含任何靶蛋白)用作(阴性)对照。

通过使用NANEX技术淘选进行2轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的TG1细胞的十倍连续稀释液，从富集的子文库中分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择一个目的序列家族的代表性成员，并将编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化(Nb克隆CA18425对应于SEQ ID NO:53)。rVGLUT1特异性纳米抗体的特异性通过将其连接在NHS-琼脂糖珠上进行共免疫沉淀测定来验证。将用该rVGLUT1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与HEK293T细胞的裂解物一起孵育1小时，所述HEK293T细胞用C-末端标记有Venus-YFP并含有c-Myc标签的rVGLUT1转染(Schenck等，2017)。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并上样到SDS-PAGE。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用c-Myc特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实c-Myc标记的rVGLUT1的存在(对于rVGLUT1-c-Myc-YFP构建体为88kDa，图15)。

从该实施例我们得出结论，基于NANEX的选择方法允许使用特异性捕集剂/剥离剂对和膜靶蛋白从抗体文库选择靶特异性抗体。

实施例8.NANEX使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和YFP标记的靶蛋白从突触蛋白质组抗体文库选择新的rVGLUT1特异性纳米抗体。

实施例1中引入的GFP特异性捕集剂/剥离剂对也可用于捕获黄色荧光蛋白(YFP)标记的靶标。由于引入GFP中以产生YFP蛋白的突变不改变对捕集剂/剥离剂结合而言重要的表位，因此可以用该GFP特异性捕集剂/剥离剂对从复杂混合物(例如细胞裂解物)中有效地纯化YFP标记的蛋白质，并从基质(珠球、平板等)选择性地洗脱YFP标记的目的蛋白。在此，我们通过用富含突触囊泡的小鼠脑提取物免疫美洲驼来噬菌体展示针对突触蛋白质组产生的免疫文库的纳米抗体库，所述突触囊泡含有囊泡谷氨酸转运蛋白1(VGLUT1)以及其他膜蛋白。平行地，使用共价连接固体支持物的GFP特异性捕集剂CA15816(SEQ ID NO:2)来固定C末端Venus-YFP标记形式的大鼠VGLUT1。然后将该固定的抗原(rVGLUT1-YFP)与源自免疫动物的纳米抗体展示文库一起孵育。类似于NANEX并且是本发明特别地，然后使用与捕集剂竞争的GFP特异性剥离剂CA12760(SEQ ID NO:1)来选择性地洗脱与噬菌体上展示的靶特异性纳米抗体缔合的固定化rVGLUT1-YFP。

突触蛋白质组抗体文库的产生。如前所述制备了富含突触囊泡的小鼠脑提取物(Takamori等，2006)。在6周的时间段内每周一次免疫美洲驼，并如(材料和方法)所述的产生噬菌体展示文库。

新的VGLUT1特异性纳米抗体的发现。全长大鼠VGLUT1在HEK293T细胞中作为C末端Venus-YFP标记的蛋白质产生，如所公开的(Schenck等，2017)。通过在4℃下在旋转装置上孵育1h，将细胞在补充有蛋白酶抑制剂的5mL冰冷的裂解缓冲液(250mM NaCl，25mM HEPESpH 7.5，10％甘油，2％DDM)中裂解。通过在20,000g下离心20min澄清裂解物。收集含有靶标的上清液并在4℃下在旋转装置上与5μL用GFP特异性纳米抗体捕集剂CA15816(SEQ ID NO:2)共价官能化的磁珠孵育1h，将YFP标记的rVGLUT1固定在这些珠球上。使用磁铁收集珠球并用洗涤缓冲液(150mM NaCl、20mM HEPES pH 7.5、10％甘油和0.03％DDM)洗涤，然后将它们在4℃下与展示突触蛋白质组纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育1h。接下来，用0.5mL洗涤缓冲液洗涤这些珠球9次。对于该实施例特别的是，然后使用GFP特异性剥离剂纳米抗体CA12760(SEQ NO:1)选择性地洗脱与噬菌体上展示的rVGLUT1特异性纳米抗体缔合的固定化rVGLUT1-YFP。即使使用小鼠脑提取物，来自小鼠和大鼠的VGLUT1在其序列中仅有1个氨基酸不同，因此预期交叉反应性结合剂存在于小鼠衍生的文库中。洗脱的噬菌体用于感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min而不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/ml氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/mL氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并作为甘油储液储存在-80℃下以供以后使用。裂解缓冲液(其不含任何靶蛋白)掺入6μg野生型GFP以用作(阴性)对照。

通过使用NANEX技术淘选进行2轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的TG1细胞的十倍连续稀释液，从富集的子文库中分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员，并将编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化五个目的纳米抗体(Nb克隆CA18024对应于SEQ ID NO:54、CA18437-SEQ ID NO:55、CA18438-SEQ ID NO:56、CA18439-SEQ ID NO:57、CA18440-SEQ ID NO:58和CA18441-SEQ ID NO:59)。rVGLUT1特异性纳米抗体的特异性通过在NHS-琼脂糖珠上连接单独的纳米抗体进行共免疫沉淀测定来验证。将用这些rVGLUT1特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与用rVGLUT1-YFP转染的HEK293T细胞的裂解物一起孵育1小时，所述rVGLUT1-YFP也含有c-Myc标签。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并上样到SDS-PAGE上。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用c-Myc特异性抗体使蛋白质印迹显色，以证实c-Myc标记的rVGLUT1-YFP(88kDa，图16)的存在。

从该实施例我们得出结论，基于NANEX的选择方法允许使用特异性GFP-捕集剂/剥离剂对和YFP-标记的膜蛋白作为靶标从全蛋白质组抗体文库中选择膜蛋白靶标特异性的一组新抗体。

实施例9.NANEX使用mCherry特异性捕集剂/剥离剂对和mCherry标记的靶蛋白从抗体文库中选择新的靶特异性纳米抗体。

实施例1至5和8使用了GFP特异性捕集剂/剥离剂对来捕获GFP、GFP标记的目的蛋白或GFP变体，如YFP，用于基于NANEX的选择。在实施例9中，使用mCherry标签特异性的捕集剂/剥离剂对(Shaner等，2004)从复杂混合物中捕获可溶性目的蛋白并从基质(珠球、平板等)中选择性地洗脱所述目的蛋白。在此，我们噬菌体展示了通过免疫美洲驼产生的免疫文库的纳米抗体库，针对NANEX纯化的、交联的、全长、GFP标记的人糖皮质激素受体(GR)。平行地，使用与固体支持物共价连接的mCherry特异性捕集剂Nb克隆CA16964(SEQ ID NO:60)来固定mCherry标记形式的全长GR。然后将该固定化抗原(mCherry-GR)与源自免疫动物的纳米抗体展示文库一起孵育。与NANEX类似，然后使用与捕集剂Nb竞争的mCherry特异性剥离剂Nb克隆CA17302(SEQ ID NO:61)来选择性地洗脱与噬菌体上展示的GR特异性纳米抗体缔合的固定化mCherry-GR。接下来扩增用该mCherry特异性剥离剂选择性洗脱的噬菌体，以产生富含GR特异性的纳米抗体的新库，允许重复该循环，直到GR特异性的纳米抗体占主导地位，以将群体表征为单克隆GR结合剂。全长GR抗体文库的产生。编码用GFP标记的人糖皮质激素受体(NR3C1)的构建体用于在瞬时转染后在HEK293T细胞中表达重组GFP-GR。转染后48小时，收集细胞并使用Dounce匀浆器在10mM HEPES pH 7.4、10％甘油、20mM钼酸钠、50μg/ml DNase I、10μM ZnCl₂、2.5mM MgCl₂、2.5mM DTT、0.5％NP40替代物和1片Complete EDTA-free蛋白酶抑制剂片剂中裂解。通过使用涉及GFP特异性捕集剂CA15816(SEQ ID NO:2)和剥离剂CA12760(SEQ ID NO:1)对的NANEX纯化，将GFP-GR纯化至均一的可溶性蛋白。将GFP-GR洗脱产物用于在6周的时间段内每周一次免疫美洲驼。免疫后，如(材料和方法)所述的产生噬菌体展示文库。

新的GR特异性纳米抗体的发现。将编码人糖皮质激素受体(NR3C1)的全长基因引入pcDNA3.1表达载体中以产生mCherry标记的靶标融合物。使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染剂将该载体转染到HEK293T细胞中。转染后48小时，收获5000万个细胞，用冰冷的PBS缓冲液洗涤，并使用Dounce匀浆器在补充有50μg/ml DNase I和蛋白酶抑制剂的5mL裂解缓冲液(10mM Hepes pH 7.4、10％甘油、20mM钼酸钠、10μM ZnCl₂、2.5mM MgCl₂、2.5mM DTT、0.5％NP40替代物)中裂解。通过以20,000g离心澄清裂解物。收集含有mCherry标记的GR的上清液，并在4℃下在旋转装置上与5μL用具有引用名CA16964(SEQ ID NO:60)的mCherry特异性捕集剂共价官能化的磁珠一起孵育1h，以将mCherry标记的GR固定在这些珠球上。收集这些珠球并使用KingFisher^TMFlex纯化系统(ThermoScientific)用0.5mL洗涤缓冲液(10mMHEPES pH 7.4、10％甘油、20mM钼酸钠、10μM ZnCl₂、2.5mM DTT、0.05％Tween20)洗涤，然后在4℃下与展示GFP标记的全长GR纳米抗体文库的噬菌体(1,4.10¹⁴个噬菌体)一起孵育1h。接下来，用0.5mL洗涤缓冲液洗涤这些珠球9次。对于本发明特别的是，然后使用mCherry特异性剥离剂纳米抗体CA17302(SEQ ID NO:61)选择性地洗脱与噬菌体上展示的GR特异性纳米抗体缔合的固定化mCherry-GR。使用洗脱的含有缔合噬菌体的mCherry-GR靶蛋白感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，并在37℃下孵育30min而不摇动。接下来，加入LB培养基(补充有100μg/mL氨苄西林和2％wt/vol葡萄糖)，并将培养物在37℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g离心，将细胞沉淀重悬于LB(补充有100μg/mL氨苄西林和20％甘油(vol/vol))中，并作为甘油储液储存在-80℃下以供以后使用。向未转染的HEK293T裂解物(其不含mCherry标记的蛋白质)掺入10μg野生型mCherry(mCherry，大肠杆菌重组蛋白，TP790040，Origene)以用作(阴性)对照。

在通过使用NANEX技术淘选进行三轮选择后，通过在LB中铺板过夜生长的噬菌体感染的TG1细胞的十倍连续稀释液，从富集的子文库中分离单个克隆。挑取96个单独的克隆并在含有补充有100μg/ml氨苄西林的LB的96孔板中生长。将含有纳米抗体编码基因的质粒纯化、测序并分组成序列家族(材料和方法)。选择每个序列家族的代表性成员，并将编码质粒转化到大肠杆菌WK6表达菌株中以表达和纯化七种目的纳米抗体(Nb克隆CA18498对应于SEQ ID NO:62、CA18499-SEQ ID NO:63、CA18501-SEQ ID NO:64、CA18502-SEQ ID NO:65、CA18503-SEQ ID NO:66、CA18585-SEQ ID NO:67、CA18586-SEQ ID NO:68)。通过将单独的纳米抗体连接NHS-琼脂糖珠以用于共免疫沉淀测定来验证GR特异性纳米抗体的特异性。用这些GR特异性纳米抗体官能化的珠球在4℃下在旋转装置上与用mCherry-GR表达载体转染的HEK293T细胞的裂解物一起孵育1h。洗涤后，将这些珠球重悬于SDS-PAGE上样染料中并上样到SDS-PAGE上。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并用GR特异性抗体(GR(G-5)小鼠IgG2bmAb，sc-393232，Santa Cruz Biotechnology)使蛋白质印迹显色，以证实mCherry标记的GR的存在(图17)。

从该实施例我们得出结论，基于NANEX的选择方法允许使用mCherry特异性捕集剂/剥离剂对和mCherry标记的靶蛋白容易地从抗体文库中选择靶特异性抗体。

实施例10.在平板形式中的NANEX使用GFP特异性捕集剂/剥离剂对和GFP蛋白作为靶标从抗体文库选择新的GFP特异性纳米抗体。

在实施例1至9中，使用磁珠(Myone^TM Tosylactivated，ThermoFisher)进行基于NANEX的选择。为了证明如本文所述的基于NANEX的选择方法广泛适用于不同类型的基质，在该实施例中，我们显示了捕集剂/剥离剂对也可用于通过非共价相互作用将特定靶标固定在塑料板的表面上，并且洗脱与抗体的抗原特异性结合结构域及其编码基因型缔合的这一靶标。

GFP抗体文库的产生。实施例1中描述的相同文库也用于进行实施例10中描述的实验。

新的GFP特异性纳米抗体的发现。为了在平板形式中发现新的GFP特异性纳米抗体，与磁珠相比，我们将生物素化的GFP特异性捕集剂引用名CA15816(SEQ ID NO:2)固定在中性抗生物素蛋白包被的平底96孔板(Nunc Immuno Plate F96 Maxisorp，439454，ThermoFisher)上。将这些捕集剂包被的孔用PBS中的4％牛奶封闭，并用PBS洗涤5次，然后加入100μL 100nM GFP(SEQ ID NO:25)。未与GFP一起孵育的捕集剂包被的孔用作阴性对照。在与GFP(抗原)一起孵育后，将所有孔用PBS常规洗涤5次，并与噬菌体上展示的GFP抗体文库一起孵育。在室温下孵育1h 30min后，将平板用PBS-Tween₂₀ 0.05％常规洗涤15次。为了选择新的GFP特异性抗体，通过添加竞争性结合到与捕集剂表位重叠的表位的高亲和力剥离剂CA12760(SEQ ID NO:1)来选择性地破坏捕集剂和GFP之间的非共价相互作用。因此，将孔与结合与GFP上的捕集剂相同表位的高亲和力CA12760(GFP特异性剥离剂)一起孵育30min。

对于使用NANEX第2轮选择，我们遵循相同的策略，使用从第一轮获得的输出噬菌体。基于其CDR3序列鉴定了四个不同的纳米抗体家族。其中，三个最大的家族与实施例1中用生物层干涉测量法(BLI)发现并确认GFP结合的三个家族相同(CA17518-SEQ ID NO:27、CA17520-SEQ ID NO:29、CA17674-SEQ ID NO:31)。

从该实施例我们得出结论，基于NANEX-的选择方法允许使用包被靶标特异性捕集剂纳米抗体的不同类型的基质从抗体文库中容易地选择靶标特异性抗体。

材料和方法

细胞。

EBY100(ATCC*MYA-4941")

基因型：MATa AGA1::GAL1AGA1::URA3 ura352 trp1 leu2delta200his3delta200 pep4::HIS3prbd1.6R can1 GAL

酵母GFP融合物集合(Yeast GFP Fusion Collection)，ThermoFisher，目录号：95702，(Huh等，2003)。

用于克隆和制备噬菌体文库的大肠杆菌TG1(电转感受态细胞；Lucigen，目录号60502-1)。

用于表达纳米抗体的大肠杆菌WK6非抑制菌株(su-)(Zell等，1987)。

HEK 293T(ATCC*293T CRL-3216^TM)

用于蛋白质印迹的单克隆抗体。

抗GFP：小鼠mAb(GF28R)，MA5-15256，ThermoFisher Scientific。

抗-GR:(G-5)小鼠IgG2b mAb，sc-393232，Santa Cruz Biotechnology。

抗c-Myc：小鼠mAb(克隆9E10)，11667203001，Roche。

用于淘选的纳米抗体包被的磁珠。根据制造商的方案，使用包被有GFP特异性的捕集剂纳米抗体(CA15816)的磁珠(MyOne^TM Tosylactivated，ThermoFisher)进行基于NANEX的选择。将2mg纯化的CA15816包被在50mg磁珠(～40μg抗体/mg珠)上，然后将珠球重悬于1mL PBS中。

用于基于NANEX选择的酵母裂解物。使每个选择的酵母克隆在200mL YPB培养基中在30℃下生长72h(以175rpm振摇)。通过以4000rpm离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀称重以归一化所有不同的裂解物。使用酵母裂解试剂Yper(Y-PER^TMPLUS，酵母蛋白质提取剂，ThermoFisher)制备细胞裂解物，将1g细胞沉淀重悬于2.5mL Yper(补充有1mM DTT和不含EDTA的蛋白酶抑制剂)中，并在37℃下孵育1小时。将细胞裂解物以20,000g离心10分钟，收集可溶性级分并储存在-80℃。

阴性对照。使酵母EBY100在200mL YPB培养基中在30℃下生长72h(以175rpm振荡)。通过以4000rpm离心5分钟收集细胞。使用酵母裂解试剂Yper(Y-PER^TMPLUS，酵母蛋白质提取试剂，ThermoFisher)制备细胞裂解物，将1g细胞沉淀重悬于2.5mL Yper(补充有1mMDTT和不含EDTA的蛋白酶抑制剂)中，并在37℃下孵育1小时。将细胞裂解物以20,000g离心10分钟，收集可溶性级分并储存在-80℃。

抗体文库的产生。使用目的抗原、目的蛋白或蛋白质组来免疫美洲驼。免疫后，收集血液样品以克隆具有目标靶标或蛋白质特异性的亲和力成熟的纳米抗体的多样化集合。从未凝固的血液中分离外周血淋巴细胞(PBL)用于纯化总RNA和合成cDNA。该cDNA用作模板以扩增编码重链抗体的可变结构域(Nb)的开放阅读框，并将Nb片段克隆到合适的噬菌体展示载体中，并根据Pardon等，2014制备噬菌体颗粒。

GFP-纳米抗体的选择程序。对新的GFP纳米抗体的淘选或选择主要如所述的(Pardon等，2014)进行，并调整捕获步骤和洗脱步骤。简言之，使用GFP捕集剂包被的珠球，并与0.1nM至100nM范围内的不同浓度的GFP一起孵育。在100μL的总体积中以将GFP捕集在这些NANEX珠上，之后将所有磁珠常规洗涤3次。接下来，将这些珠球在96孔板中与在噬菌体上展示的GFP抗体文库一起孵育。在4℃下孵育2h后，用PBS-Tween常规洗涤珠球12次。为了洗脱GFP特异性噬菌体，将珠球与20μM结合GFP上相同表位的高亲和力CA12760(GFP-剥离剂)在100μL的总体积中孵育30分钟，因为捕集剂或噬菌体用胰蛋白酶(250μg/mL)从珠球非特异性洗脱30min。

使用KinaFisher^TMFlex纯化系统(ThermoScientific)的平行选择程序。对于淘选实验，将300μL CA15816包被的磁珠重悬于2200μL PBS/4％脱脂乳中，并在旋转装置上于4℃封闭过夜。在淘选之前，使用磁体将珠球在PBS中洗涤两次。然后将珠球重悬于480μL PBS中。

将12种不同的酵母裂解物解冻，并将400μL每种裂解物加入96深孔板的孔中。作为每次淘选的阴性对照，用20μg纯化的GFP补充到400μL EBY100菌株的裂解物。向每个孔中加入20μL预封闭的CA15816包被的磁珠。将珠球和裂解物在振荡平台上在4℃下孵育1h30min。

使用KingFisher^TMFlex纯化系统使用96孔板进行下一步选择。收获来自每个孔的磁珠并用500μL PBS-Tween洗涤30s。接下来，将这些珠球与噬菌体上展示的全蛋白质组抗体文库一起孵育1h30，然后用500μL PBS-Tween洗涤9次，每次30s。为了洗脱GFP标记抗原特异性噬菌体，将珠球在100μL的总体积中与20μM结合GFP上的捕集剂相同表位的高亲和力CA12760(GFP-剥离剂)一起孵育30min。

所选纳米抗体结合剂的鉴定。纯化含有纳米抗体编码基因的质粒，然后使用MP57作为测序引物进行测序。将具有相似CDR3序列(相同长度和>80％序列同一性)的纳米抗体分组成序列家族(Pardon等，2014)。众所周知，来自相同序列家族的纳米抗体衍生自相同的B细胞谱系并结合靶标上的相同表位。

用于抗原共免疫沉淀的纳米抗体包被的琼脂糖珠。使用NHS-ActivatedSepharose 4Fast Flow(Cytiva)和纯化的纳米抗体制备了抗原特异性纳米抗体珠球。根据制造商的方案进行珠球上的偶联。将0.5mg纯化的纳米抗体与150μL珠球偶联，然后重悬于0.5mL PBS中。

生物素化。根据制造商的说明书，通过使用Thermo Scientific EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素化试剂盒，将GFP(SEQ ID NO:25)和GFP特异性Nb CA15816(SEQ ID NO:2)分别生物素化用于BLI或NANEX选择。

通过生物层干涉测量法(BLI)对GFP纳米抗体进行表位作图。链霉亲和素包被的生物传感器用于捕获生物素化的GFP(100nM)。通过两个洗涤步骤(在缓冲液中60秒)从生物传感器上洗掉未结合的生物素化GFP。接下来，链霉亲和素包被的具有GFP的生物传感器首先与20nM CA12760(GFP剥离剂)一起孵育400秒，短暂洗涤，然后在20nMCA12760与待测试的不同Nb的预混物中孵育400秒。在OctetRed(Molecular Devices)上分析数据。所有测定在室温下在补充有BSA 0.1％和Tween₂₀ 0.005％的HEPES25mM pH 7.5、NaCl 150mM中进行。

序列表

如SEQ ID NO:1-68中所示的氨基酸序列提供了其中命名的结合剂(除了SEQ IDNO:25)，并在实施例中使用，包括C-末端6×His标签(在本文中也称为His标签)和EPEA标签，如所示的。进一步的实施方案还包括所述氨基酸结合分子的用途，所述氨基酸结合分子分别具有不存在标签的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的VHH序列(例如SEQ ID NO:70和SEQID NO:71)，或者具有替代性标签，替换或附加于所述6xHis和EPEA标签，在N-末端或C-末端连接到氨基酸序列的剩余部分。

>SEQ ID NO:1:CA12760 GFP-剥离剂氨基酸序列(包括C-末端6×His+EPEA标签)

>SEQ ID NO:2:CA15816 T54A/V55A突变GFP-捕集剂氨基酸序列(突变残基为加下 划线的粗体；C-末端6xHis+EPEA)

>SEQ ID NO:3:CA17440 FBA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:4:CA17441 FBA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:5:CA17442 FBA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:6:CA17443 FBA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:7:CA17451 PDC1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:8:CA17452 PDC1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:9:CA17444 SIS1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:10:CA17453 ALD6结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:11:CA17454 ALD6结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:12:CA17460 ALD6结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:13:CA17458 BMH1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:14:CA17459 BMH1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:15:CA17455 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:16:CA17456 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:17:CA17457 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:18:CA17530 SXM1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:19:CA17560 SSA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:20:CA17561 SSA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:21:CA17562 SSA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:22:CA17563 SSA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:23:CA17564 SSA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:24:CA17565 SSA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:25:GFP蛋白

>SEQ ID NO:26:CA17517 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:27:CA17518 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:28:CA17519 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:29:CA17520 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:30:CA17673GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:31:CA17674 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:32:CA17675 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:33:CA17676 GFP结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:34:CA8780无关结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:35:CA17797 GR-LBD结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:36:CA17798 GR-LBD结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:37:CA17799 GR-LBD结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:38:CA17800 GR-LBD结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:39:CA17801 GR-LBD结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:40:CA18504 HSP104结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签

>SEQ ID NO:41:CA18505 MET6结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:42:CA18508 SBA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:43:CA18509 SBA1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:44:CA18510 SOD1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:45:CA17938 ENO1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:46:CA17791 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:47:CA17792 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:48:CA17793 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:49:CA17794 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:50:CA17795 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:51:CA17796 PGI1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:52:CA17875 VGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:53:CA18425 VGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:54:CA18024 VGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:55:CA18437 rVGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:56:CA18438 rVGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:57:CA18439 rVGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:58:CA18440 rVGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:59:CA18441 rVGLUT1结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:60:CA16964 mCherry-捕集剂结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:61:CA17302 mCherry-剥离剂结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:62:CA18498 GR结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:63:CA18499 GR结合剂氨基酸序列(具有His-标签和EPEA-标签)

>SEQ ID NO:64:CA18501 GR结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:65:CA18502 GR结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:66:CA18503 GR结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:67:CA18585 GR结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:68:CA18586 GR结合剂氨基酸序列(具有His标签和EPEA标签)

>SEQ ID NO:69:6×His-EPEA标签

>SEQ ID NO:70:CA12760 GFP-剥离剂VHH氨基酸序列

>SEQ ID NO:71:CA15816 GFP-捕集剂VHH氨基酸序列

参考文献

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序列表

<110> 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所

布鲁塞尔自由大学

<120> 用于选择特异性结合剂的手段和方法

<130> JaSt/NANEX-PANNING/728

<150> EP 21181272.2

<151> 2021-06-23

<150> EP 21181405.8

<151> 2021-06-24

<160> 71

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA12760 GFP-剥离剂氨基酸序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Trp Thr Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Arg Gly Phe Thr Leu Ala Pro Thr Arg Ala Asn Glu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

115 120 125

His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 2

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA15816 T54A/V55A突变GFP-捕集剂氨基酸序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Trp Ala Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Arg Gly Phe Thr Leu Ala Pro Thr Arg Ala Asn Glu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

115 120 125

His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 3

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17440 FBA1结合剂

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ala

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Trp Ser Gly Ala Gly Val Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gln Ala Leu Ser Gln Gly Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu

115 120 125

Ala

<210> 4

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17441 FBA1结合剂氨基酸序列

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Val Thr Glu Gly Val Gly Ala Gly Asn Cys Gly Val Ser Asp

100 105 110

Leu Asp Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 5

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17442 FBA1结合剂氨基酸序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Thr

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ser Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Trp Ser Gly Ala Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gln Gly Leu Asp Gln Arg Asp Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu

115 120 125

Ala

<210> 6

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17443 FBA1结合剂氨基酸序列

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Leu Arg Ile Tyr

20 25 30

Ser Met Gly Trp Ser Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Arg Ala Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Asn Asn Met Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn

85 90 95

Ala Asn Pro Val Tyr Asp Gly Ser Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17451 PDC1结合剂氨基酸序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Val Thr Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Leu Glu Arg Tyr Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 8

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17452 PDC1结合剂氨基酸序列

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Thr Asn Trp Gly Gly Asn Ser Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala His Arg Thr Val Val Gly Lys Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro

115 120 125

Glu Ala

130

<210> 9

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17444 SIS1结合剂氨基酸序列

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Gln Ile Thr Ser Thr Gly Cys Pro Asp Phe Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His

115 120 125

Glu Pro Glu Ala

130

<210> 10

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17453 ALD6结合剂氨基酸序列

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ile Arg Ser

20 25 30

Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala Leu Val Ala Ser

35 40 45

Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ile Leu Glu Met

65 70 75 80

Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Arg

85 90 95

Val Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17454 ALD6结合剂氨基酸序列

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Arg Asn

20 25 30

Tyr Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Lys Thr Gln Ser Gly Ala Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asn Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ile Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Gly Gly Leu Ile Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 12

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17460 ALD6结合剂氨基酸序列

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Thr Asn

20 25 30

Thr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Gly Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His

100 105 110

His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 13

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17458 BMH1结合剂氨基酸序列

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Leu Ser Leu Arg

20 25 30

Arg Val Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val

35 40 45

Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Ile Asn Trp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 14

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17459 BMH1结合剂氨基酸序列

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Arg Leu Asn Phe Gly

20 25 30

Ser Trp Asn Trp Tyr Arg Lys Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Met Gly Pro Ser Thr Gly His Thr His Tyr Gly Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Leu Asn Ala Ala Lys Asp Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Gly Leu Gly Phe Pro Arg Gly Ser Phe Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

115 120 125

His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 15

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17455 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Pro Ser Tyr

20 25 30

Arg Leu Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Lys Ala Gln Tyr Phe Ser Thr Pro Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 16

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17456 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Val Thr Ile Asn

20 25 30

Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ala Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Leu Arg Gly Thr Gly Tyr Asn Tyr Gly Glu Asn Tyr Trp Gly Lys Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu

115 120 125

Ala

<210> 17

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17457 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly His Phe Ser Asn Leu

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Arg Ser Gln Phe Asn Leu Leu Tyr Ser Asn Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Gly Gly Val Ser Asp Trp Arg Gly Ile Met Thr Thr Gly

100 105 110

Ala Arg Leu Ala Arg Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 18

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17530 SXM1结合剂氨基酸序列

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Lys Thr Leu Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Gly Lys Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Trp Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asp Val Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Ala

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Ala Asp Tyr Leu Val Val Ala Gly Lys Pro Gly Tyr Asp Tyr Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His

115 120 125

His Glu Pro Glu Ala

130

<210> 19

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17560 SSA1结合剂氨基酸序列

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Gly Ala Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Ser Ser Gly Val Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Val Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Val Cys

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Ala Ala Arg Leu Gly Val Ser Ser Ser Pro Asn Ser Gln Ile Ser His

100 105 110

Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His

115 120 125

His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 20

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17561 SSA1结合剂氨基酸序列

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Arg Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

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Gly Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asp Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Gly Thr Ile Ala Arg Thr Ala Leu Val Lys Tyr Leu

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His

115 120 125

His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 21

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17562 SSA1结合剂氨基酸序列

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asn

20 25 30

Arg Leu Asn Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Gly Ser Asn Gly Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Glu Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Met Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

100 105 110

His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 22

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17563 SSA1结合剂氨基酸序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ala Leu Thr Pro Tyr

20 25 30

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Arg Thr Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ala Glu Ala Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Gln Glu Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Arg Arg Leu Thr Thr Ser Leu Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 23

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17564 SSA1结合剂氨基酸序列

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Val Gln His Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Ile Val Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Arg Gly Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Gly Ser Arg Leu Leu Glu Gly Ala Pro Arg Asp Ser Arg Gly Tyr Asn

100 105 110

Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His

115 120 125

His His Glu Pro Glu Ala

130

<210> 24

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17565 SSA1结合剂氨基酸序列

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Ser Glu Ser Thr Trp Ala Asp Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Arg Asp Gln Val Pro Trp Pro Thr Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 25

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP蛋白

<400> 25

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50 55 60

Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 26

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17517 GFP纳米抗体氨基酸序列

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asp Thr Val Tyr Ala Ser Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

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Ala Ala Lys Asp Ala Val Gly Tyr Trp Ser Ser Asp Val Tyr Ser Glu

100 105 110

Ala Lys Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 27

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17518 GFP纳米抗体氨基酸序列

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Trp Ala Ala Trp Pro Ser Ile Arg Val Gly Val Gly Val

100 105 110

Pro Ala Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 28

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17519 GFP纳米抗体氨基酸序列

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gln Ile Thr Asn Ser Gly Arg Thr Lys Phe Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Ala Asp Leu Asp Trp Tyr Gly Gly Thr Ala Asn Asn Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 29

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17520 GFP纳米抗体氨基酸序列

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Ile Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ser Ala Val Gly Tyr Tyr His Asp Ser Tyr Ala Ser Arg

100 105 110

Ala Glu Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 30

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17673 GFP结合剂氨基酸序列

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Arg Ala Phe Met Asn Tyr

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Val Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ser Ala Val Gly Tyr Tyr Ser Asp Ile Tyr Asn Ser Arg

100 105 110

Ala Lys Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 31

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17674 GFP结合剂氨基酸序列

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Phe Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asp Thr Val Tyr Ala Ser Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Gly Asn Asp Val Ala Ser Glu

100 105 110

Ala Lys Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 32

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17675 GFP结合剂氨基酸序列

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Val Pro Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Ser Gly Lys Glu Arg Lys Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Arg Ser Asp Gly Glu Thr Val Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Tyr Leu Asn Asn Arg Asn Ser Arg Gly Ser Met Asp Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 33

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17676 GFP结合剂氨基酸序列

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Leu Gly Glu Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Cys Ile Ser Arg Ser Gly Ala Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Trp Thr Val Ile Asp Glu Ile Thr Glu Gln Arg Ser Lys

100 105 110

His Gln Thr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 34

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA8780 irrelevant结合剂氨基酸序列

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Pro Phe Ser Pro Asn Ser

20 25 30

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

35 40 45

Val Met Thr Ile Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Gln Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Val Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Asn Ala

85 90 95

Glu Thr Arg Gly Phe Met His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 35

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17797 GR-LBD结合剂氨基酸序列

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe

35 40 45

Val Ser Ala Ile Arg Trp Asp Thr Ala Leu Lys Tyr Tyr Gly His Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Lys Ala Thr Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Ala Ala Thr Phe Leu Gln Thr Ala Ala Glu Ala Thr Ser

100 105 110

Ala Thr Arg Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 36

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17798 GR-LBD结合剂氨基酸序列

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Phe Phe Thr Arg

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Asp Ser Arg Arg Thr His Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Tyr Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Ala Leu Ile Thr Pro Glu Thr Met Val Glu Pro Leu Ser Ser Glu

100 105 110

Ala Trp Thr Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 37

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17799 GR-LBD结合剂氨基酸序列

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Asn Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Ala Gln Ser Ile Pro Gln Leu Lys Arg Lys Asn Pro His Asp

100 105 110

Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

115 120 125

His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 38

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17800 GR-LBD结合剂氨基酸序列

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Val Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Arg Lys Pro Gly Leu Asp Tyr Glu Phe Val

35 40 45

Ser His Ile Thr Trp Asp Gly Glu Tyr Thr Arg Tyr Ser Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Phe Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Lys Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ala Lys Thr Asn Thr Arg Pro Tyr Tyr Tyr Glu Glu Asn

100 105 110

Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

115 120 125

His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 39

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17801 GR-LBD结合剂氨基酸序列

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Pro Gly Ser Val Arg Ser Asn Ile

20 25 30

Asp Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Gly Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Arg Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

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100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro

115 120 125

Glu Ala

130

<210> 40

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18504 HSP104结合剂氨基酸序列

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ala Phe Asp Ser Ile

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Asn Gly Val Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120

<210> 41

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18505 MET6结合剂氨基酸序列

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Ala Trp Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ser Arg Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Gly Thr Pro Gln Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His

115 120 125

Glu Pro Glu Ala

130

<210> 42

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18508 SBA1结合剂氨基酸序列

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

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Ala Val Ser Thr Ser Ala Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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100 105 110

Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His

115 120 125

His His Glu Pro Glu Ala

130

<210> 43

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18509 SBA1结合剂氨基酸序列

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Arg Met Leu

20 25 30

Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

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Ala Thr Ile Thr Ser Val Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 44

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18510 SOD1结合剂氨基酸序列

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Pro Thr Ala Tyr His Tyr Ser Thr Thr Arg Asp Glu Tyr Asp

100 105 110

Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His

115 120 125

His His Glu Pro Glu Ala

130

<210> 45

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17938 ENO1结合剂氨基酸序列

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Thr Trp

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Ala

35 40 45

Ala Cys Ile Ser Ser Glu Pro Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Glu Phe Val

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Ala Asp Arg Leu Ser Ala Tyr Cys Ser Gly Ser Gly Gly Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 46

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17791 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys

50 55 60

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65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His

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100 105 110

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115 120 125

<210> 47

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17792 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Met Val

35 40 45

Ala Asp Ile Thr Thr Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Ala Asp Phe Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 48

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17793 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Val Ser Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Arg Val Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys His

85 90 95

Ser Arg Phe Ala Tyr Gly Pro Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 49

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17794 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Ala Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Glu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Tyr Ala Asp His Tyr Gly Leu Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu

115 120 125

Ala

<210> 50

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17795 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Phe Phe Asn Ile Asn

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Ala Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Ser

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ser Lys Ile Arg Gln Ala Ser Trp Asn Leu Val Leu Ser Asp His Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His

115 120 125

Glu Pro Glu Ala

130

<210> 51

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17796 PGI1结合剂氨基酸序列

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe His Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His

85 90 95

Ser Gln Tyr Ala Tyr Gly Pro Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 52

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17875 VGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 52

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Val Arg Thr Trp

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Ser Gly Thr Tyr His Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Gln Thr Gly Trp Asn Pro Gly Ser Asp Phe His Arg Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His

115 120 125

Glu Pro Glu Ala

130

<210> 53

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18425 VGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 53

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Thr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Val Ser Trp Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Thr Gly Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Ser Arg Tyr Asn

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His

115 120 125

His His Glu Pro Glu Ala

130

<210> 54

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18024 VGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ala Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Arg Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Ala Gly Ile Arg Gln Ile Arg Val Ser Tyr Glu Gln Asp Tyr Tyr Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 55

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18437 rVGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Leu Gly Asn Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Gly Ala Val Asn Trp Arg Gly Asp Ile Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Glu Thr Thr Gln Pro Met Gly Ile Thr Leu Ser Pro Asn

100 105 110

Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His

115 120 125

His His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 56

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18438 rVGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ala Ile Asn

20 25 30

Lys Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Ile Leu Asp Ser Asp Tyr Gly Glu Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 57

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18439 rVGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Leu Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ile Ile

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala His Ile Ala Thr Val Ser Glu Gly Tyr Ser Arg Pro Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 58

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18440 rVGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser His Ile Asn Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ser Ser Ile Gly Asn Val Trp Ala Pro Ser Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His

115 120 125

Glu Pro Glu Ala

130

<210> 59

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18441 rVGLUT1结合剂氨基酸序列

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Val Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Gly Asp

20 25 30

Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Ser Asn Gly Arg Arg Thr Ile Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Gly Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Asn Ser Arg Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 60

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA16964 mCherry-trapper结合剂氨基酸序列

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Asp Phe Ser Phe Asp

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Leu Arg Ile Gly Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Thr Thr Val His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Ser His Ala Thr Thr Lys Ala Gln Leu Tyr Asp Tyr Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His

115 120 125

His His Glu Pro Glu Ala

130

<210> 61

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA17302 mCherry-stripper结合剂氨基酸序列

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Asp Ile Asp Trp Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Asp Leu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Leu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala His Phe Lys Phe Ile Leu Ala Gln Arg Ile Lys Trp Gly Asp

100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His

115 120 125

His His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 62

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18498 GR结合剂氨基酸序列

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Arg Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Leu Ile Thr Ser Val Asp Arg Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Leu Arg Lys Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 63

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18499 GR结合剂氨基酸序列

<400> 63

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Thr Pro Gly Gly Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Ala Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Asp Gly Ala Val Arg Pro Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 64

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18501 GR结合剂氨基酸序列

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ile Phe Arg

20 25 30

Ser Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ala Thr Ile Thr Ala Gly Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Asn Leu Arg Ser Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu

115 120 125

Pro Glu Ala

130

<210> 65

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18502 GR结合剂氨基酸序列

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Ala Ser Ile Arg

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Phe Thr Ser Ala Gly Ser Ile Asn Tyr Glu Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Leu Gln Gln Tyr Glu Arg His Leu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 66

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18503 GR结合剂氨基酸序列

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Arg Arg Gly Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Lys Ala Asp Arg Pro Gly Trp Gly Ser Glu Trp Glu Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro

115 120 125

Glu Ala

130

<210> 67

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18585 GR结合剂氨基酸序列

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Ile Phe

20 25 30

Asn Asn Tyr His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg

35 40 45

Glu Leu Ala Ala Leu Ile Ser Gly Ile Gly Thr Val Thr Asn Tyr Ala

50 55 60

Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Thr Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Phe Cys Gly Gly Gly Arg Pro Ser Ser Arg Ser Pro Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His

115 120 125

His His His Glu Pro Glu Ala

130 135

<210> 68

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA18586 GR结合剂氨基酸序列

<400> 68

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Asn Leu Tyr Met Gly

20 25 30

Ile Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Arg Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Ser Asn Ser Gly Thr Tyr Ser Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala

115 120 125

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6xHis + EPEA标签

<400> 69

His His His His His His Glu Pro Glu Ala

1 5 10

<210> 70

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA12760 GFP-剥离剂氨基酸序列

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Trp Thr Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Arg Gly Phe Thr Leu Ala Pro Thr Arg Ala Asn Glu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 71

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA15816 GFP-捕集剂氨基酸序列

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Trp Ala Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Arg Gly Phe Thr Leu Ala Pro Thr Arg Ala Asn Glu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Claims (17)

1.一种用于选择多肽结合剂的方法，该方法包括步骤：

a)将固定在表面上并且特异性结合靶蛋白的第一蛋白质结合剂与包含靶蛋白的样品混合，用于在表面上获得复合物，

b)向步骤a)的所述复合物提供包含多种多肽结合剂的样品，

c)向步骤b)的混合物中添加包含第二蛋白质结合剂的样品，所述第二蛋白质结合剂与第一结合剂竞争结合所述靶蛋白，并且其通过特异性结合靶蛋白从靶蛋白移置(displace)第一结合剂，和

d)洗脱结合到靶蛋白的第二蛋白质结合剂，用于分离与所述靶蛋白结合的多肽结合剂。

2.权利要求1的方法，其中第二蛋白质结合剂的解离速率常数(k_off值)与所述第一结合剂的k_off值相比更低或相等。

3.权利要求1或2的方法，其中所述第二和/或第一蛋白质结合剂包含抗原结合结构域。

4.权利要求3的方法，其中所述抗原结合结构域包含免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)、VHH、纳米抗体或抗原结合嵌合蛋白，所述抗原结合嵌合蛋白被定义为通过至少两个位点与支架蛋白融合的ISVD，并且所述支架蛋白结构域优选包含HopQ、YgjK或其衍生物。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中步骤b)中包含多种多肽结合剂的样品包含结合剂的展示文库。

6.权利要求5的方法，其中所述展示文库是结合剂的重组文库和/或免疫文库或(半)合成、非免疫或初始文库，其中所述结合剂包含抗体、单结构域抗体、ISVD、VHH或纳米抗体。

7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述方法使用噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物展示进行，和/或其中在步骤d)之后，重复方法的步骤a)至d)至少一次，优选两次或更多次以富集步骤d中洗脱的多肽结合剂的数量。

8.权利要求1至7任一项的方法，其中所述表面包括(磁)珠、树脂、柱、板或芯片。

9.权利要求1至8任一项的方法，其中a)中包含靶蛋白的所述样品包含复杂混合物，如生物样品、细胞裂解物或蛋白质组样品。

10.权利要求9的方法，其中所述复杂混合物用作免疫原，用于获得多种多肽结合剂或特别是权利要求6的展示文库。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中第一蛋白质结合剂和/或第二蛋白质结合剂特异性结合靶蛋白上存在的异源标签。

12.权利要求10的方法，其中所述标签是GFP或YFP，和/或第一蛋白质结合剂包含SEQID NO:71的CDR，并且第二蛋白质结合剂包含SEQ ID NO:70的CDR。

13.权利要求1至12任一项的方法，其中表面上捕获的靶蛋白是包含至少一种或多种其他蛋白质的蛋白质复合物，和/或多肽结合剂经由结合到所述蛋白质复合物中包含的至少一种或多种蛋白质而结合到所述复合物。

14.权利要求1至13任一项的方法，其中步骤a)和b)由以下步骤代替：

a.将靶蛋白样品与包含多种多肽结合剂的样品，优选展示文库混合，和

b.通过向a)的混合物添加第一蛋白质结合剂获得表面上的固定化复合物，所述第一蛋白质结合剂优选固定在表面上或随后固定。

15.权利要求1至14任一项的方法用于从重组抗体文库中选择结合剂的用途。

16.权利要求1至15任一项的方法用于靶蛋白表位分箱或鉴定靶蛋白上的新表位的用途。

17.权利要求1至15任一项的方法用于高通量选择特异性结合剂的用途。