CN117815386B

CN117815386B - 一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗及其制备方法和应用

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Publication number: CN117815386B
Application number: CN202410018716.8A
Authority: CN
Inventors: 李圆; 高乐会; 童凡; 何继德
Original assignee: Peking University Third Hospital
Current assignee: Peking University Third Hospital
Priority date: 2024-01-05
Filing date: 2024-01-05
Publication date: 2025-02-14
Anticipated expiration: 2044-01-05
Also published as: CN117815386A

Abstract

本发明公开了属于生物医药技术领域，公开了一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗及其制备方法和应用，通过在甘露糖的纳米颗粒上包被免疫佐剂CpG而获得CpG纳米佐剂，然后以MMP响应凝胶作为递送系统，使CpG纳米佐剂和曲美替尼共同递送，从而实现持续的原位抗原产生、淋巴结引流和APCs呈递，进而激活抗肿瘤免疫反应，具有在制备治疗肿瘤的疫苗药物中的用途，作为免疫治疗的有效癌症疫苗，实现靶向至淋巴结诱导抗肿瘤免疫。

Description

一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及是一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

卵巢癌是导致女性癌症相关死亡的第五大原因，也是最致命的妇科恶性肿瘤。化疗和手术是治疗卵巢癌的主要临床策略。然而，由于以下几个原因，这些疗法对卵巢癌的治疗仍然无效：1）大多数患者确诊时已是晚期，并有广泛转移；2）不良副作用阻碍了许多标准化疗药物的使用；3）患者对化疗的多重耐药性（MDR）越来越强。此外，手术中分散的肿瘤细胞和残留的小肿瘤组织也会促进卵巢癌的转移和复发。因此，迫切需要开发新的治疗策略来抑制卵巢癌的进展、复发和转移。

免疫疗法通过激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而杀死肿瘤细胞，在预防肿瘤复发和转移方面显示出巨大潜力。其中，能够产生特异性抗肿瘤免疫反应的肿瘤疫苗被认为是最重要的免疫治疗策略之一，具有巨大的治疗前景。然而，由于其肿瘤疫苗接种级联过程（包括抗原识别和制备、抗原和佐剂共包被、（淋巴结）靶向递送、DC内化和成熟、抗原呈递和 T细胞活化）效率低下，肿瘤疫苗并未达到预期的临床效果。为了提高肿瘤疫苗的疗效，需要优化疫苗级联过程，特别是抗原制备、疫苗精确靶向和重塑免疫抑制微环境，从而增强T 细胞活化。

充足的肿瘤特异性抗原负荷是肿瘤疫苗激发强烈的抗原特异性抗肿瘤免疫反应的前提。肿瘤抗原主要包括肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）和全细胞肿瘤抗原。由于TAAs在正常细胞和肿瘤细胞表面共同表达，容易产生中心免疫耐受，阻碍了基于TAAs的肿瘤疫苗的疗效和临床应用。TSA的生产过程涉及肿瘤样本的收集、发现和生成，过程复杂、成本高、耗时长。全细胞肿瘤抗原由于具有广谱的肿瘤抗原，不仅可以规避上述两种抗原的缺点，还可以引发更强的抗肿瘤免疫反应，大大降低肿瘤逃逸和复发的几率。然而，传统的全肿瘤抗原（如全细胞裂解液）免疫原性较低，而且在体内会被迅速降解/清除。最近开发的一种更有效的策略是原位诱导全细胞肿瘤抗原，即在体内消融肿瘤并释放肿瘤抗原，以持续激活肿瘤特异性免疫反应。这种策略通常通过放疗、光热疗法、光动力疗法和化疗等治疗手段诱导免疫原性细胞死亡，促使死亡的癌细胞释放旁分泌信号，继而将肿瘤转化为“原位疫苗”，最终增加肿瘤浸润 T 细胞的类型和数量。然而，在大多数情况下，游离抗原很容易被迅速清除，抗原处理和递呈的 APC 也没有被充分激活，因此产生的抗肿瘤免疫反应并不充分。因此，开发能够结合适当佐剂持续提供高免疫原性原位疫苗的有效平台是非常必要的。

现有技术中，公开号为CN114096274A的发明专利公开了一种可与抗癌疗法同时施用或与靶向治疗剂组合使用的免疫治疗构建体，具体包括递送颗粒、至少一种佐剂以及一种或多种引起抗原释放和/或调节免疫抑制肿瘤微环境的治疗剂/化合物，其中，递送颗粒可以是脂质体、基于脂质体的颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒或其混合物；佐剂具有免疫刺激活性，可以是CpG寡核苷酸、含有CpG序列的DNA TLR激动剂、非CpG DNA TLR激动剂、RNA TLR激动剂、铝盐、抗CD40抗体、融合蛋白、细胞因子、小分子TLR激动剂、基于油或表面活性剂的佐剂、脂多糖、植物提取物或其衍生物；治疗剂可以是括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、mRNA、DNA、sgRNA(CRISPR-cas9元件)、寡核苷酸、多核苷酸、肽、蛋白质、化学治疗药物、毒素、抗氧化剂、小分子抑制剂、抗体或放射治疗剂。该专利方法非响应性地可控释放佐剂和抗原，其递送颗粒达到肿瘤部位的量有限。

公开号为CN104284674A的发明专利公开了一种免疫原性PAA多肽或编码免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子的疫苗组合物，该疫苗组合物可用于治疗人类前列腺癌，施用时，可包含一种或多种免疫抑制细胞抑制剂及免疫效应细胞增强剂，其中，免疫抑制细胞抑制剂可选自蛋白激酶抑制剂（如伊马替尼、索拉非尼、阿西替尼等）、CTLA-4抑制剂（如伊匹单抗及曲美目单抗）、TLR激动剂（如CpG寡核苷酸），免疫效应细胞增强剂可以选自CpG24555、CpG10103、CpG7909、CpG1018或CpG1018之TLR激动剂。能够引发针对与该赘生性病症相关之肿瘤相关抗原之免疫反应。该专利方法制备步骤繁杂，疫苗组合物不具有淋巴结靶向性，其免疫原性有限，肿瘤原位并未产生抗原，且未建立原位抗原储库。

发明内容

本发明的目的是提供一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗的制备方法，该方法通过在甘露糖的纳米颗粒上包被免疫佐剂CpG而获得CpG纳米佐剂，然后以MMP响应凝胶作为递送系统，使CpG纳米佐剂和曲美替尼共同递送，从而实现持续的原位抗原产生、淋巴结引流和APCs 呈递，进而激活抗肿瘤免疫反应。为此，本发明还提供了由该制备方法制得的淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗，以及该疫苗在制备治疗肿瘤的疫苗药物中的应用。

本发明通过下述技术方案实现：一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1.制备甘露糖改性的CpG纳米佐剂；

S2.将四臂-马来酰亚胺-聚乙二醇与含硫醇肽反应，获得预聚物溶液；

S3.在预聚物溶液中加入CpG纳米佐剂和曲美替尼，获得肿瘤原位疫苗。

所述步骤S1中，将CpG溶解于PBS中，然后再加入含有甘露糖修饰聚乳酸的有机溶液中，溶解后，经超声处理、除有机溶剂后，得到甘露糖改性的CpG纳米佐剂。

所述CpG与甘露糖修饰聚乳酸的质量比为1∶1000。

所超声处理时，在冰浴中使用超声探头超声2min，功率控制在10～20%，然后将混合液加入到聚乙烯醇溶液中，并在冰浴中超声1～5min，功率控制在10～40%，超声处理完成后，形成乳液。

所述步骤S2中，采用控制四臂-马来酰亚胺-聚乙二醇与含硫醇肽的摩尔比为1∶1.1。

所述步骤S3中，控制预聚物溶液、CpG纳米佐剂、曲美替尼的质量比为135∶4∶1或135∶1∶1。

一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗，采用上述制备方法制得。

一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗在制备治疗肿瘤的疫苗药物中的应用。

所述肿瘤包括卵巢癌。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明提供的肿瘤原位疫苗采用特定的凝胶递送系统作为载体，即采用Mal-arm-PEG与 MMP-2 响应肽的加成反应制得的 MMP响应凝胶，可共同负载多种活性物质，如抗体、肿瘤抗原、细胞因子和佐剂，以共同增强抗肿瘤免疫反应；可保护活性免疫调节剂在体内不被降解，从而提高治疗生物利用度；活性物质的释放行为可响应各种环境刺激，如pH 值、温度、氧化还原和酶，从而实现时空特异性，同时，肿瘤微环境还可特异性地高表达基质金属蛋白酶（MMP）。因此，构建 MMP 响应型智能水凝胶可赋予肿瘤疫苗多种功能，包括ICD 诱导的原位抗原、释放的 NPs 吸附抗原、原位疫苗的靶向递送以及持续的 MMP 响应刺激，进而诱导有效的抗肿瘤免疫反应。

（2）本发明通过制备甘露糖修饰聚乳酸（PLGA）的纳米颗粒，并包被免疫佐剂CpG以激活TLR9，利用甘露糖的修饰可增强抗原呈递细胞（APC）对纳米离子的识别和吸收，然后被运送到淋巴结中，以提高肿瘤原位疫苗基于淋巴结靶向的抗原特异性免疫反应。

（3）本发明采用MMP响应凝胶，使甘露糖修饰的CpG免疫佐剂及曲美替尼的共递送，实现持续的原位抗原产生、淋巴结引流和 APCs 呈递，进而激活抗肿瘤免疫反应。

（4）本发明采用的淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗可极大程度的提高肿瘤疫苗的级联过程，协同PD-1/PD-L1轴抑制，从而抑制卵巢癌的复发和转移。

（5）本发明的生产工艺简单，经实验证明，基于MMP 响应凝胶为递药系统，负载CpG纳米佐剂和曲美替尼组成的肿瘤原位疫苗，能够同时诱导患者特异性免疫反应和对抗免疫耐受，有望成为术后免疫治疗的有效癌症疫苗。

综上所述，本发明采用MMP-2响应凝胶实现共递送化疗药物和淋巴结靶向纳米佐剂，通过ICD诱导原位持续产生肿瘤抗原，并吸附于纳米佐剂形成原位疫苗，可靶向至淋巴结诱导抗肿瘤免疫。

附图说明

图1为CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）的粒径与形貌图。

图2为CpG@Man-P的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为CpG@Man-P吸附蛋白后的粒径变化。

图4为CpG@Man-P的吸附蛋白量。

图5为CpG@Man-P吸附蛋白后的SDS-PAGE条带图。

图6为Tra/CpG@Man-P/Gel的扫描电镜图。

图7为Tra/CpG@Man-P/Gel 的溶胀行为。

图8为Tra/CpG@Man-P/Gel的流变学性能曲线。

图9为Tra/CpG@Man-P/Gel的MMP-2酶响应性降解。

图10为Tra/CpG@Man-P/Gel的MMP-2酶响应性释放。

图11为CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）的细胞毒性（n≥3）。

图12 为Tra的细胞毒性 (n≥3)。

图13为Tra诱导ID8细胞免疫原性死亡（ICD）。

图14为CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）的BMDC体外摄取。

图15为CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）的DC 2.4体外摄取。

图16为CpG@Man-P （40nm，100nm，200nm）诱导BMDC成熟。

图17为CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）诱导DC2.4细胞成熟。

图18为CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）吸附全细胞抗原后诱导T细胞增殖。

图19为不同尺寸的Dir@Man-P和Dir@P凝胶在肿瘤部位和淋巴结的分布情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：（40nm）CpG @Man-P的合成

将10μg的CpG溶解于100μL的PBS中，将溶液加入到溶解有10mg/mL PLGA（L∶A=50∶50，Mw=10kDa）的1mL丙酮-二氯甲烷（1∶1，V/V）中作为有机相，冰浴中，使用超声探头超声2min，功率为20%。将混合液加入到5mL 5% PVA（203）溶液，冰浴中超声5 min，功率为40%，形成乳液。在37℃，通过减压蒸发除去有机溶剂。

实施例2：（100nm）CpG @Man-P的合成

将10μg的CpG溶解于100μL的PBS中，将溶液加入到溶解有10mg/mL PLGA（L∶A=50∶50，Mw=10kDa）1mL的丙酮-二氯甲烷（1∶1，V/V）中作为有机相，冰浴中，使用超声探头超声2min，功率为15%。将混合液加入到5mL 1% PVA（203）溶液，冰浴中超声3min，功率为15%，形成乳液。在37℃，通过减压蒸发除去有机溶剂。

实施例3：（200nm）CpG @Man-P的合成

将10μg的CpG溶解于100μL的PBS中，将溶液加入到溶解有10mg/mL PLGA（L∶A=50∶50，Mw=10kDa）的1 mL丙酮-二氯甲烷（1∶1，V/V）中作为有机相，冰浴中，使用超声探头超声2min，功率为10%。将混合液加入到5mL 1%PVA（203）溶液，冰浴中超声1 min，功率为10%，形成乳液。在37℃，通过减压蒸发除去有机溶剂。

针对实施例1至实施例3制得的不同尺寸的CpG @Man-P进行以下分析：

（一）粒径与形貌表征

将CpG @Man-P（40nm，100nm，200nm）稀释适宜倍数后，对其进行粒径与形貌表征，采用动态激光散射粒度仪对粒径进行测定，获得其粒径分布图，形貌图采用扫描电镜（×200nm）获得，具体参见图1。

由图1可见，CpG @Man-P的纳米粒呈形态规则的类球形，分散均匀，制备的纳米粒粒径分别为36.4 ± 9.2nm、129.8 ± 6.6nm、201.1 ± 9.5nm。

（二）CpG的包封率与载药量考察

采用琼脂糖凝胶电泳法验证Man-P（40nm，100nm，200nm）对药物CPG的搭载情况，并使用紫外吸收分光光度计测定吸光度值，通过CPG的标准曲线计算纳米粒的包封率与载药量。

按照以下公式计算载药量（Drug loading ratio，DL）和包封率（Entrapmentratio，ER）：

DL% = 包封药物的质量/（载体和包封药物的总质量）×100%

ER% = 包封药物的质量/药物总质量×100%

CpG的载药量和包封率考察结果具体参见图2及表1所示。

由图2可见，与游离CpG组相比，CpG@Man-P (40nm、100nm、200nm) 组均未出现明显的迁移条带，表明CpG成功被Man-P纳米粒包载。

表1 CpG@Man-P的CpG载药量与包封率

由表1可见，测得CpG@Man-P (40 nm、100 nm、200nm) 的CpG包封率约为78%，载药量约为0.08%，表明不同粒径纳米粒间的CPG搭载效果无明显差异。

（三）纳米佐剂CpG@Man-P的抗原蛋白吸附能力考察

ID8细胞培养：将ID8细胞用DMEM完全培养基（含10%优质胎牛血清、1%双抗）在含有5%二氧化碳和37℃的恒温培养箱中培养，并每天更换培养基。当细胞在培养皿中生长至约80%时，进行传代操作。操作方法如下：弃去培养基，加入5mL无菌PBS（pH值为7.2），润洗1-2次后弃去润洗液。由于ID8细胞为贴壁细胞，因此需要加入2mL含EDTA的胰蛋白酶溶液于培养箱中消化3min。消化后，在显微镜下观察细胞消化情况，若大部分细胞变圆并脱落，则加入等体积的DMEM完全培养基终止消化。然后收集细胞，在2000rpm条件下离心5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，并进行分皿培养。

ID8细胞总蛋白的提取：将离心管柱及其接收管套管置于冰上预冷。清洗ID8细胞，即将提前预冷的PBS加入培养皿中，微微摇晃，后弃去上清。随后，加入相应体积的RIPA细胞裂解液，反复吹打若干次，将裂解后的细胞转移至预冷的离心管柱套管中，离心（14000-16000rpm，30s），后立即将收集管放置在冰上，并弃去离心管柱。

CpG@Man-P对ID8抗原总蛋白的吸附能力探究：将不同粒径CpG@Man-P纳米粒（40nm，100nm，200nm）与ID8细胞总蛋白提取物进行共同孵育1 h，通过尺寸排阻色谱法分离吸附有抗原蛋白的CpG@Man-P纳米佐剂，即取琼脂糖凝胶CL-4B填充至1×15cm色谱柱内，用PBS（pH 7.4）进行洗脱。

成功分离不同尺寸的纳米粒后，测定蛋白吸附前后CpG@Man-P的粒径变化，具体参见图3。由图3可见，通过DLS法测定吸附抗原后的纳米粒粒径，测得CpG@Man-P（40nm）、CpG@Man-P（100nm）、CpG@Man-P（200nm）的水合粒径分别约为63.18nm、158.45nm、228.41nm，各组纳米粒尺寸均有所增加，验证了粒子对蛋白抗原的成功吸附。

将回收后的CpG@Man-P纳米粒浓缩，用BCA 蛋白定量试剂盒测定回收后纳米粒上的总蛋白含量，具体参见图4。由图4可见，通过BCA蛋白定量法，测得CpG@Man-P（40nm）、CpG@Man-P（100nm）、CpG@Man-P（200nm）的抗原吸附量分别为6.78μg/mg、8.22μg/mg、12.68μg/mg左右，表明CpG@Man-P粒径的增大可能有助于吸附抗原。

取浓度相同的不同粒径的CpG@Man-P纳米粒各100μL，加入25μL蛋白上样缓冲液，充分混合，煮沸，使蛋白质完全变性，置于-80℃冰箱中备用。用市售4%～15%聚丙烯酰胺梯度胶分离吸附在纳米粒上的抗原蛋白，并通过考马斯亮蓝染色，观察吸附于CpG@Man-P纳米粒上的蛋白条带，具体参见图5。由图5可见，与TP组相比，CpG@Man-P（40nm）、CpG@Man-P（100nm）、CpG@Man-P（200nm）具有相似的特征条带，表明CpG@Man-P成功捕获了ID8抗原总蛋白。

实施例4：（40nm）CpG@Man-P/Tra/Gel的合成

将四臂-马来酰亚胺-聚乙二醇（4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal，Mw=20600.8）和含硫醇肽（Ac-CRDGPQGIWGQDRC-NH₂，Mw=1631.75，Mal/SH摩尔比为1∶1.1）溶解到TEA缓冲液中，得到预聚物溶液（其中4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal浓度为5%wt）。将实施例1制备的纳米粒CpG@Man-P（40nm）洗涤、浓缩，备用。依次向1ml预聚物溶液中加入0.4 mg CpG@Man-P纳米粒（或者在其他实施例中采用1.6mg）、0.4 mg 曲美替尼（Tra），涡旋充分混合，于37℃下加热30min，直至凝胶不再流动，得到载药凝胶Tra/CpG@Man-P/Gel（40nm）。

实施例5：（100nm）CpG @Man-P/Tra/Gel的合成

将4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal（同上）和含硫醇肽（同上）溶解到TEA缓冲液中，得到预聚物溶液(其中4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal浓度为5%wt）。将实施例2制备的纳米粒CpG@Man-P（100nm）洗涤、浓缩，备用。按依次向 1ml预聚物溶液中加入0.4 mg CpG@Man-P纳米粒（或者在其他实施例中采用1.6mg）、0.4 mg 曲美替尼（Tra），涡旋充分混合，于37℃下加热30 min，直至凝胶不再流动，得到载药凝胶Tra/CpG@Man-P/Gel（100nm）。

实施例6：（200nm）CpG @Man-P/Tra/Gel的合成

将4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal（同上）和含硫醇肽（同上）溶解到TEA缓冲液中，得到预聚物溶液(其中4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal浓度为5%wt）。将实施例3制备的纳米粒CpG@Man-P（200nm）洗涤、浓缩，备用。依次向1ml预聚物溶液中加入0.4 mg CpG@Man-P纳米粒（或者在其他实施例中采用1.6mg）、0.4 mg 曲美替尼（Tra），于37℃下加热30min，直至凝胶不再流动，得到载药凝胶Tra/CpG@Man-P/Gel（200nm）。

对比例1：Tra/ Gel凝胶的合成

将4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal（同上）和含硫醇肽（同上）溶解到TEA缓冲液中，得到预聚物溶液(其中4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal浓度为5%wt）。将预聚物溶液涡旋混合，向1ml预聚物溶液中加入0.4mg 曲美替尼（Tra），于37℃下加热30min，直至凝胶不再流动，得到Tra/ Gel凝胶。

对比例2：PEG凝胶的合成

将4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal（同上）和含硫醇肽（同上）溶解到TEA缓冲液中，得到预聚物溶液(其中4-arm-PEG₂₀₀₀-Mal浓度为5%wt）。将预聚物溶液涡旋混合，于37℃下加热30 min，直至水凝胶不再流动，得空白PEG凝胶。

针对上述实施例4至实施例6，以及对比例1和对比例2的性能进行以下性能测试：

（一）形貌表征

将实施例4制备得到的载药凝胶Tra/CpG@Man-P/Gel（40nm）冷冻干燥，观察凝胶的体积变化。将冷冻干燥后的凝胶剪裁成约3mm²的小块，通过扫描电子显微镜（Scanningelectron microscope，SEM）成像，观测凝胶内部的孔径结构，具体参见图6（标尺为50μm）。

由图6可见，凝胶呈相互连通的多孔多层网络结构，孔洞大小分布在50-100μm之间。

（二）平衡溶胀度测定

采用重量法测定实施例4至实施例6制备得到的载药凝胶Tra/CpG@Man-P/Gel（40nm，100nm，200nm）以及对比例1制得的Tra/ Gel凝胶的平衡溶胀度（Swelling ratio，SR）。

将一定质量（150mg，m₀）的凝胶浸入37℃的10mL的PBS中。在预定时间，用滤纸除去凝胶表面的游离水后测定凝胶质量（m_t），每个实验进行3个平行样本。

SR可以使用以下公式计算：

SR (%) = (m_t-m₀) / m₀× 100% 。

不同凝胶的平衡溶胀度的测定结果具体参见图7。由图7可见，各组凝胶在15h前均出现快速的膨胀现象，含有CpG@Man-P （100nm）)的凝胶于15h最先达到平衡（或最高）溶胀度，其余三组在约24h达到平衡。Tra/Gel、Tra/CpG@Man-P/Gel（40nm）、Tra/CpG@Man-P/Gel（100nm）、Tra/CpG@Man-P/Gel（200nm）组凝胶的平衡溶胀率分别为228%、304%、246%、280%左右。载有纳米粒的凝胶组别溶胀率普遍高于Tra/Gel组，但载有不同尺寸CpG@Man-P (40nm、100nm、200nm) 的凝胶组间差异并不明显。由此可以证明，包载纳米粒可能会略微提高凝胶的溶胀率，但粒子的尺寸改变未对凝胶的溶胀性质造成显著影响。

（三）流变学性能测试

通过流变学仪器对实施例4至实施例6制备得到的载药凝胶Tra/CpG@Man-P/Gel（40nm，100nm，200nm），对比例1制得的Tra/ Gel凝胶，以及对比例2制得的PEG进行测试。为了研究凝胶的粘弹性能，测量了凝胶样品在不同角频率下的储存模量（G'）、损失模量（G"），并获得凝胶样品的流变学性能曲线。具体参见图8所示。

由图8可见，各组凝胶的G'均远大于G"，表明该水凝胶具有较强的弹性、较弱的黏性，呈类固态特征，制备成功。总体来看，随着频率的增强，样品的G"略有增大，G'则呈现先略微增大后减小的趋势，表明载药凝胶对于应力变化的响应能力较弱。由图可知，各组的损失模量未表现出显著差异。对于储存模量，载有CpG@Man-P （200nm）的凝胶组具有最高的G'值，表明其分子间交联密度更有效，具有更高的力学性能。此外，各组的G'均高于空白凝胶对照组（PEG），亦反映了载药后凝胶的力学性能有所增强。

（四）PEG凝胶的MMP-2酶响应性评价

MMP-2激活：将rhMMP-2用Assay buffer稀释至100μg/mL，于37℃孵育1h备用。

MMP-2响应性评价：将rhMMP-2溶解于PBS缓冲液中，得到不同浓度的缓冲液。将精确质量（m₀）的PEG水凝胶放入不同缓冲介质（PBS、PBS + MMP-2 100ng/mL、PBS + MMP-2200ng/mL、PBS + MMP-2 400ng/mL）中，37℃孵育。5天后，将样品从缓冲液中取出，用蒸馏水冲洗，真空干燥，得到降解后的凝胶质量（m_t）。

凝胶质量损失率计算公式为：

质量损失率（%）=（m_t- m₀）/ m₀× 100%。

对PEG凝胶的MMP-2酶响应降解效果具体参见图9。由图9可见，用不同浓度的MMP-2处理凝胶5天后，100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL组的凝胶质量分别损失了约47%、59%、93%，表明载药凝胶可MMP-2响应性降解。

（五）体外药物释放实验

使用Dil荧光标记CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）：Dil溶液加入到溶解有10mg/mLPLGA（L∶A=50∶50，Mw=10kDa）1mL丙酮-二氯甲烷（1∶1，V/V）作为有机相，将100μL PBS加入到有机相，其余过程同CpG@Man-P的合成方法。制备完成后使用100kDa超率管除去PVA和游离Dil。

制备含有不同Dil荧光标记的粒子和Tra的凝胶（粒子浓度为50mg/Kg，曲美替尼（Tra）的浓度为1Kg/mL）。在MMP-2（200ng/mL）浓度，37℃，pH 6.8下孵育。依次在2h、4h、6h、8h、16h、24h、48 h、72h、96h、120h时间点取出1mL液体，分别在542nm激发，564nm发射下测定粒子的释放量。360nm下测定吸光度计算Tra的释放量。

CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）的MMP-2酶响应性释放量具体参见图10。

由图10可见，含有MMP-2酶的凝胶组中纳米粒（Dil@Man-P，8A）和药物(Tra，8B)的释放明显高于相应对照组，表明制备的凝胶具有MMP-2响应性降解的能力，能够响应性地释放纳米佐剂CpG@Man-P和ICD诱导剂Tra。

进一步的，针对实施例4至实施例6的CPG@Man-P/Tra/Gel进行细胞水平评价。

（一）细胞安全性评价

DC 2.4细胞的培养：DC 2.4细胞用RPMI-1640完全培养基培养于含5% CO₂的37℃恒温培养箱中，每天进行换液。当培养基中细胞长至70%满时，进行传代操作。即弃去培养基，加入5mL无菌PBS（pH值为7.2）润洗，弃去润洗液。DC 2.4细胞为半贴壁细胞，直接加入5mL RPMI-1640完全培养基小心吹打收集细胞，250g离心5min后，弃去上清液，加入RPMI-1640完全培养基将细胞吹匀，分皿培养。

采用MTT法考察不同粒径CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）对于DC细胞的安全性。具体方法如下：

将DC 2.4细胞以3×10³个/孔的浓度接种于96孔板中。12 h后，分别加入浓度为20μg/mL 的40nm、100nm、200nm的CpG@Man-P，于37℃孵育24h，结束后将培养液更换为含0.5mg/mL MTT的1640培养基，于37℃孵育4h后，吸走培养液，每孔加入100μl DMSO溶液，37℃恒温震荡20min后，使用酶标仪检测其在570nm处的紫外吸收值。按照如下公式计算存活率：

测试结果具体参见图11。由图11可见，与CpG@Man-P（40nm）、CpG@Man-P（100 nm）、CpG@Man-P （200nm）共同孵育24小时后，DC 2.4细胞仍然显示出较高的细胞成活率，即使当CpG@Man-P的浓度提高到1mg/mL，细胞存活率仍高达近90%，表明纳米粒对DC2.4细胞无明显杀伤或抑制作用。此外，不同粒径的CpG@Man-P的细胞安全性未表现出明显差异。表明尺寸对于纳米粒的DC细胞毒性无显著影响。

（二）化疗药物曲美替尼（Tra）的细胞毒性评价

采用MTT法考察不同浓度Tra对于ID8细胞的细胞毒性。具体方法如下：

将ID8细胞以3×10³个/孔的浓度接种于96孔板中。12 h后，分别加入浓度为XX的Tra，于37℃孵育24h，结束后将培养液更换为含0.5mg/mL MTT的1640培养基，于37℃孵育4h后，吸走培养液，每孔加入100μl DMSO溶液，37℃恒温震荡20min后，使用酶标仪检测其在570nm处的紫外吸收值，并计算存活率。

测试结果具体参见图12。由图12可见，Tra对于ID8细胞的杀伤作用有浓度依赖性，IC50为20.84μg/mL。

（三）肿瘤细胞免疫原性死亡

将ID8细胞以6×104接种于12孔板中中，于5%CO2，37℃培养24 h。将ID8分别与10μg和20 μg的Tra共孵育24 h。将ID8分别与10 μg和20 μg的Tra共孵育24 h。之后通过流式细胞术观察CRT的表达量。

将ID8细胞以6×104接种于共聚焦皿中，于5%CO2，37℃培养24 h。将ID8分别与10μg和20 μg的Tra共孵育24 h。使用4%多聚甲醛固定孵育后的细胞，并封闭。之后细胞与兔抗小鼠CRT一抗在4℃下孵育过夜。弃去一抗，并用PBS洗涤。加入二抗避光孵育1 h 后，弃去二抗并用PBS洗涤。最后使用DAPI对细胞和进行染色。

将ID8细胞以6×104接种于12孔板中中，于5%CO2，37℃培养24 h。将ID8分别与10μg和20 μg的Tra共孵育24 h。将ID8分别与10 μg和20 μg的Tra共孵育24 h。之后通过ATP试剂盒测定上层培养基中的释放量。

检测结果具体参见图13。由图13可见，用不同剂量的Tra处理ID8，可诱导ID8释放大量的ATP（如图中A所示）；共聚焦（图中B所示）和流式（图中C和D所示）结果表明ID8经Tra处理后会表现出大量钙网蛋白（CRT）暴露于细胞膜表面。这些结果表明，Tra可诱导ID8肿瘤细胞免疫原性死亡，在原位持续产生肿瘤全细胞抗原。

（四）BMDC细胞对纳米佐剂CpG@Man-P的摄取能力评价

BMDC细胞的提取：取成年C57小鼠，于小鼠髋关节上方切下后腿，露出股骨和胫骨，膝关节和踝关节保持不动，尽量除去肌肉和组织，过程中保证骨头的完整性，超净台进行后续操作。在培养皿中注入75%乙醇，将干净的骨头在其中浸泡3-5min以消毒灭菌，清洗所有骨头。用剪刀在尽可能靠近关节处剪去骨头的两端。在注射器中注入PBS，然后将注射器针头分别插入骨头两端，将骨髓冲出至培养皿中，冲洗2-3次，直至骨头完全变白。用移液管吸打骨髓液几次，以分离所有的团块。悬液于1200rpm转速下离心5min，弃去上清，加入2mL红细胞裂解液，重悬细胞，室温孵育5min，随后加入等体积PBS，用70μm网筛过滤，离心弃去上清。PBS清洗1-2次，然后用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁵，加入细胞培养皿中，将培养皿放入含5% CO₂的37℃孵箱中培养，记为第0天；第3天时，向培养皿中加入10mL培养基与20ng/mL GM-CSF，第6、8天半量换液。第10天收集细胞即BMDC。

BMDC细胞的孵育：将BMDC细胞以每孔8×10⁵个细胞接种于12孔板，于37℃、5% CO₂孵育24h。将BMDC分别和浓度为20μg/mL的不同粒径CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm）与未经甘露糖修饰的CpG@P（40nm，100nm，200nm）共孵育4h。将孵育后的细胞与CD11c抗体孵育，区分BMDC。

BMDC表面分子染色用于流式细胞术：用600μl PBS重悬BMDC，离心（2000rpm，5min），重复洗涤数次，加入适量的特异性荧光抗体，4℃避光孵育30min。染色结束后离心（2000rpm，5min），而后用300μl 流式染色缓冲液重悬细胞，进行流式检测。

检测结果具体参见图14。由图14可见，CpG@Man-P组的细胞摄取量均高于CpG@P组，表明甘露糖的修饰赋予了纳米粒DC细胞靶向的能力。此外， CpG@Man-P （200nm）组的BMDC细胞摄取量明显高于其余两组，且BMDC细胞摄取量会随着CpG@Man-P粒径的减小而降低，这可能是由于DC细胞对于较大尺寸的纳米粒具有更高的摄取能力。

（五）DC 2.4细胞对纳米佐剂CpG@Man-P的摄取能力评价

DC 2.4细胞的孵育：将DC 2.4细胞以每孔8×10⁵个细胞接种于共聚焦皿，于37℃，5% CO₂孵育24 h。将DC 2.4分别和浓度为20μg/mL的不同粒径荧光标记CpG@Man-P（40nm、100nm、20 nm）与未经甘露糖修饰的CpG@P（40nm，100nm，200nm）共孵育4h。

共聚焦观察DC 2.4细胞对CpG@Man-P的摄取：使用4%多聚甲醛固定10min。用适量PBS清洗残余的多聚甲醛。使用DAPI（1μg/mL）染色10min，PBS清洗多余染料。之后在共聚焦显微镜观察。

测试结果具体参见图15。由图15可见，CpG@Man-P组的细胞荧光强度高于CpG@P组，表明甘露糖的修饰有效增强了DC对于CpG@Man-P的摄取，展现了粒子的主动靶向能力。同时，CpG@Man-P （200nm）处理组相较于CpG@Man-P (40 nm) 组与CpG@Man-P（100nm）组表现出最高的摄取量，证实DC细胞对于较大尺寸的纳米粒具有更高的摄取能力。

（六）诱导BMDC细胞成熟能力的考查

将BMDC细胞以每孔8×10⁵个细胞接种于12孔板，于37℃，5% CO₂孵育24h。将BMDC与CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm），CpG，LPS，Man-P（40nm，100nm，20 nm）（CpG=2ug/mL，LPS=1ug/mL）共孵育48h。将孵育后的细胞与CD11c，CD86，CD80抗体孵育30min，PBS清洗后通过流式细胞仪测定成熟BMDC细胞。

测试结果具体参见图16。由图16可见，游离CpG和Man-P均能一定程度上诱导BMDC成熟，表现为CD86⁺和CD80⁺细胞比率上升，载有CpG的不同尺寸的Man-P均表现出增强的促DC成熟能力，说明CpG@Man-P纳米佐剂整合了CpG佐剂和Man介导的TLR-4通路，从而诱导BMDC的成熟。

（七）诱导DC细胞成熟能力的考查

将DC2.4.细胞以每孔5×10⁴个细胞接种于12孔板，于37℃，5% CO₂孵育24h。将BMDC与CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm），CpG，LPS，Man-P（40nm，100nm，200nm）（CpG=2ug/mL，LPS=1ug/mL）共孵育48h。将孵育后的细胞与CD11c，CD86，CD80抗体孵育30min，PBS清洗后通过流式细胞仪测定成熟DC2.4.细胞。

测试结果具体参见图17。由图17可见，游离CpG一定程度上诱导DC2.4细胞成熟，表现为CD86⁺和CD80⁺细胞比率上升，载有CpG的不同尺寸的Man-P均表现出增强的促DC成熟能力，说明CpG@Man-P纳米佐剂整合了CpG佐剂和Man介导的TLR-4通路，从而诱导DC的成熟。

进一步的，针对实施例4至实施例6的CPG@Man-P/Tra/Gel进行以下实验。

（一）T细胞激活

处死小鼠，用PBS清洗2遍后剪碎，而后将细胞网筛置于细胞培养皿6孔板之上，之后用5mL注射器推杆研磨至无明显固态组织，加入PBS清洗推杆和筛网。收集细胞悬液用筛网二次过滤。收集细胞悬液，离心，弃上清，加入5mL红细胞裂解液，吹打均匀静置8 min，加入同体积PBS中止裂解；洗涤一次。用CFSE标记T细胞。

将BMDC以每孔5×10⁴个细胞接种于12孔板，于37℃，5% CO₂孵育24h。BMDC与 CpG@Man-P（40nm，100nm，200nm），CpG，（CpG=2ug/mL，LPS=1ug/mL）共孵育48 h。加入各种试剂孵育两天，加入CFBE标记过的脾细胞继续孵育3天。使用与CD8抗体孵育30 min，PBS清洗后通过流式细胞仪观察T细胞增殖情况。

测试结果具体参见图18。由图18可见，全细胞抗原（Protein）和游离佐剂CpG能一定程度上诱导T细胞增殖；CpG@Man-P吸附全细胞抗原后能诱导大量的T细胞增殖，表明纳米佐剂能够吸附抗原形成原位疫苗，诱导强烈的T细胞增殖和免疫反应。

（二）淋巴结靶向——活体成像

DiR溶液加入到溶解有10mg/mL PLGA-Man 或PLGA（L∶A=50∶50，Mw=10KDa）)1mL丙酮-二氯甲烷(1∶1，V/V）作为有机相，将100μL PBS加入到有机相，冰浴中使用超声探头超声2min，功率为10%。将混合液加入到 5mL 1%PVA(203)溶液,冰浴中超声1min，功率为10%，形成乳液。在 37℃，通过减压蒸发除去有机溶剂。使用100KDa超率管除去PVA和游离DiR.（DiR的浓50ug/m）。

实验中使用 8-10周龄。小鼠被剃光，将5×10⁶个ID8细胞在PBS细胞悬液和基质凝胶的50∶50混合物中，皮下注射到右侧皮下注射。一旦肿瘤约为200mm³, 小鼠被随机分为6个治疗组（n = 6）。

向肿瘤部位注射不同尺寸的CpG@Man-P和CpG@P的PEG凝胶 100ul。分别在以下时间点用IVIS系统观察小鼠肿瘤部位的荧光变化，并且随机每组挑出 6 只。分别剖出肿瘤和淋巴结（分别观察凝胶在肿瘤部位的降解情况，和淋巴回流的情况）置于多聚甲醛中，并在IVIS系统下成像。

测试结果具体参见图19。由图19可见，相比于Dir@P，修饰有Man的纳米粒Dir@Man-P在肿瘤中积累更多（如图中A所示），也更多地靶向分布于淋巴结（如图中B和C所示），与此同时，40nm的Dir@Man-P表现出最强的肿瘤滞留和淋巴结靶向分布，得益于小粒径纳米佐剂具有更快速的释放和更好的淋巴结引流。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.制备甘露糖改性的CpG纳米佐剂；

S3.在预聚物溶液中加入CpG纳米佐剂和曲美替尼，获得肿瘤原位疫苗，

所述含硫醇肽为Ac-CRDGPQGIWGQDRC-NH₂；所述肿瘤为卵巢癌。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，将CpG溶解于PBS中，然后再加入含有甘露糖修饰聚乳酸的有机溶液中，溶解后，经超声处理、除有机溶剂后，得到甘露糖改性的CpG纳米佐剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述CpG与甘露糖修饰聚乳酸的质量比为1∶1000。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所超声处理时，在冰浴中使用超声探头超声2min，功率控制在10～20%，然后将混合液加入到聚乙烯醇溶液中，并在冰浴中超声1～5min，功率控制在10～40%，超声处理完成后，形成乳液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，采用控制四臂-马来酰亚胺-聚乙二醇与含硫醇肽的摩尔比为1∶1.1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，控制预聚物溶液、CpG纳米佐剂、曲美替尼的质量比为135∶4∶1或135∶1∶1。

7.一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗，其特征在于：采用权利要求1～6任一项所述的制备方法制得。

8.如权利要求1所述制备方法获得的肿瘤原位疫苗在制备治疗卵巢癌的疫苗药物中的应用。