CN117797262A - 靶向巨噬细胞中的pgam5抑制剂在治疗骨关节炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了靶向巨噬细胞中的PGAM5抑制剂在治疗骨关节炎中的应用。具体地，本发明提供了PGAM5抑制剂的用途，用于制备一种预防和/或治疗骨关节炎的制剂或组合物。本发明的药物可特异性抑制滑膜巨噬细胞中的PGAM5，通过将M1巨噬细胞复极化为M2巨噬细胞，从而减缓或治疗小鼠的骨关节炎。

Description

靶向巨噬细胞中的PGAM5抑制剂在治疗骨关节炎中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地，涉及靶向巨噬细胞中的PGAM5抑制剂在治疗骨关节炎中的应用。

背景技术

骨关节炎(OA)是最常见的关节退行性和年龄相关性疾病并且是以软骨退化、异位为特征骨赘形成、软骨下骨重塑和滑膜炎症。骨关节炎的主要病理之一是慢性和低度炎症，主要由关节损伤和碎屑引起，这会引发OA早期的先天免疫反应，最终导致免疫细胞浸润和滑膜增生。

目前，虽然已经开发了针对关节炎的多种不同治疗药物，然而其治疗效果上有时难以令人满意。

因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗或或缓解骨关节炎的药物。

发明内容

本发明提供了一种可有效缓解或治疗OA的药物或方法。

在本发明的第一方面，提供了一种PGAM5抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于选自下组的一个或多个用途：

(i)促进M0巨噬细胞分化成为M2巨噬细胞；

(ii)使M1巨噬细胞复极化为M2巨噬细胞；

(iii)预防和/或治疗骨关节炎。

在另一优选例中，所述的M0巨噬细胞包括骨髓巨噬细胞(BMDM)。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸(如反义RNA(siRNA))、mRNA、抗体、基因编辑试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因编辑试剂用于特异性敲除或敲低内源的PGAM5基因。

在另一优选例中，所述的基因编辑试剂用于特异性敲除或敲低内源的PGAM5的DNA或mRNA。

在另一优选例中，所述的基因编辑试剂包括Cas蛋白和靶向PGAM5核酸序列的gRNA。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂包括：靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)、LFHP-1c。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂为靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)。

在另一优选例中，所述靶向PGAM5的siRNA的正义链如SEQ ID NO：1所示，反义链如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的制剂包括实验室试剂。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物包含：(a)作为活性成分的PGAM5抑制剂或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，作为活性成分的PGAM5抑制剂以脂质体或纳米颗粒形式存在。

在另一优选例中，所述的脂质体或纳米颗粒为靶向巨噬细胞靶向的。

在另一优选例中，所述的脂质体或纳米颗粒具有靶向巨噬细胞的靶向分子。

在另一优选例中，所述的靶向分子包括甘露糖。

在另一优选例中，所述的脂质体或纳米颗粒含有含氟烷烃改性的聚合物。

在另一优选例中，所述的聚合物是生物相容性的聚合物。

在另一优选例中，所述的含氟烷烃改性的聚合物包括含氟烷烃改性的聚赖氨酸(Poly-L-lysine，PLL)。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为溶液、凝胶、或固体形式(如冻干剂)

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为关节腔内注射剂。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于选自下组一种或多种用途：

(a)减轻滑膜炎症；

(b)诱导软骨合成；

(c)抑制软骨细胞凋亡；

(d)抑制软骨细胞的促炎表型(包括抑制软骨细胞分泌促炎因子，如IL1)。

(e)促进软骨细胞表达胶原蛋白(如Col2A1蛋白)和SOX9。

在另一优选例中，所述的药物被施用于一对象，所述对象具有选自下组的一个或多个分型特征：

(Y1)OA滑膜中，PGAM5的表达显著升高；

(Y2)OA滑膜中，CD206的表达降低

(Y3)巨噬细胞中DVL2蛋白水平正常；

(Y4)巨噬细胞中β-连环蛋白水平正常。

在另一优选例中，所述的“PGAM5的表达显著升高”指：所述对象的OA滑膜中PGAM5的mRNA数量(M1)或蛋白数量(P1)，与正常人滑膜中PGAM5的mRNA数量(M0)或蛋白数量(P0)的比值(即M1/M0或P1/P0)≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在本发明的第二方面，提供了一种靶向巨噬细胞的纳米颗粒，包含：

(a)PGAM5抑制剂；和

(b)靶向载体：甘露糖修饰的含氟聚合物。

在另一优选例中，所述的含氟聚合物为含氟烷烃改性的聚合物。

在另一优选例中，所述的聚合物是生物相容性的聚合物。

在另一优选例中，所述的含氟烷烃改性的聚合物包括含氟烷烃改性的聚赖氨酸(Poly-L-lysine，PLL)。

在另一优选例中，所述甘露糖特异性识别并靶向巨噬细胞。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸(如反义RNA(siRNA))、mRNA、抗体、基因编辑试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂包括：靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)、LFHP-1c。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂为靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)。

在另一优选例中，所述siPGAM5的正义链如SEQ ID NO：1所示，反义链如SEQ IDNO：2所示。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

(a1)作为第一活性成分的PGAM5抑制剂或其药学上可接受的盐；

(a2)任选地作为第二活性成分的预防和/或治疗骨关节炎的其他药物；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组分(a1)为脂质体或纳米颗粒。

在另一优选例中，所述的组分(a1)是靶向巨噬细胞的。

在另一优选例中，所述的组分(a1)为本发明第二方面所述的纳米颗粒。

在另一优选例中，所述组分(a1)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一优选例中，所述PGAM5用于下调(或减少)PGAM5的数量和/或活性。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸(如反义RNA(siRNA))、mRNA、抗体、基因编辑试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂包括：靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)、LFHP-1c。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂为靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)。

在另一优选例中，所述siPGAM5包括正义链和与之互补的反义链，所述siRNA由如下序列组成：正义链如SEQ ID NO：1所示，反义链如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的组分(a2)包括M2巨噬细胞激活剂。

在另一优选例中，所述M2巨噬细胞激活剂选自下组：IL-4、IL-13、糖皮质激素、IL-10和免疫球蛋白复合物/Toll样受体配体、或其组合

在另一优选例中，所述的组分(a2)包括IL-4。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括选自下组的载体：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物为液态组合物。

在另一优选例中，所述组合物为注射制剂。

在另一优选例中，所述组合物或制剂在预防和/或治疗骨关节炎的应用中，可单独使用，或联合使用。

在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它预防和/或治疗骨关节炎的药物联合使用。

在本发明的第四方面，提供了一种活性成分组合，所述活性成分组合包括：

(i)PGAM5抑制剂；和

(ii)M2巨噬细胞激活剂。

在另一优选例中，所述M2巨噬细胞激活剂选自下组：IL-4、IL-13、糖皮质激素、IL-10和免疫球蛋白复合物/Toll样受体配体、或其组合。

在另一优选例中，所述M2巨噬细胞激活剂为IL-4。

在本发明的第五方面，提供了如本发明第二方面所述的纳米颗粒、如本发明第三方面所述的药物组合物、或如本发明第四方面所述的活性成分组合的用途，用于制备一种预防和/或治疗骨关节炎的药物产品。

在另一优选例中，所述药物产品还用于选自下组一种或多种用途：

(i)促进M0骨髓巨噬细胞(BMDM)分化成为M2巨噬细胞；

(ii)使M1巨噬细胞复极化为M2巨噬细胞。

在另一优选例中，所述药物产品还用于选自下组一种或多种用途：

(a)减轻滑膜炎症；

(b)诱导软骨合成；

(c)抑制软骨细胞凋亡；

(d)抑制软骨细胞的促炎表型(包括抑制软骨细胞分泌促炎因子，如IL1)。

(e)促进软骨细胞表达胶原蛋白(如Col2A1蛋白)和SOX9。

在本发明的第六方面，提供了一种体外促进M2巨噬细胞极化的方法，包括步骤：

(a)在PGAM5抑制剂存在下，在M2诱导条件下，培养巨噬细胞，从而促进M2巨噬细胞极化。

在另一优选例中，所述的M2诱导条件是用IL-4进行诱导的条件。

在另一优选例中，在步骤(a)中，培养选自下组的细胞：骨髓巨噬细胞(BMDM)、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞或其组合。

在另一优选例中，在步骤(a)中，被培养的巨噬细胞包括为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述细胞来源于哺乳动物。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括(但不限于)：啮齿动物(如小鼠)、人。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂包括：靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)、LFHP-1c。

在另一优选例中，所述方法为体外方法。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的方法还包括：

(b)对于步骤(a)所获得的富集M2巨噬细胞的细胞群，测定选自下组的因子或通路的水平：

(Z1)STAT6-PPARγ通路的激活水平；

(Z2)mTOR通路的激活水平；

(Z3)DVL2蛋白水平；

(Z4)DVL2和PGAM5的复合物水平；和/或

(Z5)β-连环蛋白的水平。

在本发明的第七方面，提供了一种治疗骨关节炎的方法，包括步骤：将安全有效量的PGAM5抑制剂施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述PGAM5抑制剂包括：靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)、LFHP-1c。

在另一优选例中，所述的对象为人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述对象具有选自下组的一个或多个分型特征：

(Y1)OA滑膜中，PGAM5的表达显著升高；

(Y2)OA滑膜中，CD206的表达降低

(Y3)巨噬细胞中DVL2蛋白水平正常；

(Y4)巨噬细胞中β-连环蛋白水平正常。

在另一优选例中，所述的“PGAM5的表达显著升高”指：所述对象的OA滑膜中PGAM5的mRNA数量(M1)或蛋白数量(P1)，与正常人滑膜中PGAM5的mRNA数量(M0)或蛋白数量(P0)的比值(即M1/M0或P1/P0)≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的研究结果示意图。具体地显示了甘露糖修饰的多氟化物联合siPGAM5可有效靶向敲除滑膜巨噬细胞PGAM5，使其无法对DVL2去磷酸化，维持胞质中β-catenin的稳定性，从而入核启动下游转录，抑制p38/ERK/Akt-mTOR通路从而减少M1极化，激活STAT6-PPARγ通路激活M2极化，减少滑膜炎症，从而缓解骨关节炎进展。

图2显示了与对照组相比，PGAM5的表达在人OA滑膜中的巨噬细胞中增加：(a-b)PGAM5对调节OA滑膜中巨噬细胞的潜在作用；(c)PGAM5的蛋白质和RNA水平在人类OA滑膜中增加；(d)与假手术组相比，DMM模型的小鼠滑膜中PGAM5上调；(e-f)与假手术组相比，OA小鼠滑膜细胞巨噬细胞中PGAM5的表达增加。

图3显示了将PGAM5^FL/FL小鼠与携带lyz2近端启动子介导的Cre重组酶的转基因小鼠杂交，得到了PGAM5 fl/fl-1yz2-Cre(PGAM5-cKO)小鼠，该小鼠特异性地在巨噬细胞中缺失PGAM5，并对8周大的雄性Pgam5-fl/fl和Pgam5-cKO小鼠中进行DMM手术得到各结果：(a-b)与Pgam5 fl/fl小鼠相比，Pgam5 cKO小鼠表现出OA症状减轻，滑膜中M1巨噬细胞减少，M2巨噬细胞增加；(c)将Pgam5-cKO小鼠和Pgam5-fl/fl小鼠的骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)进行RNA-seq，得到KEGG通路分析显示；(d)Pgam5-cKO的腹膜巨噬细胞中M1标记物和M2标记物的水平检测；(e)腹膜巨噬细胞的流式细胞术进行验证；(f-g)M1诱导和M2诱导导致PGAM5水平的变化。

图4显示了从PGAM5-cKO和PGAM5-fl/fl小鼠中分离出BMDM，并诱导M1极化从而得到各检测结果：(a)与PGAM5 fl/fl巨噬细胞相比，BMDM中的PGAM5缺失显著抑制了促炎基因的mRNA水平，包括iNOS、IL1α、IL1β、IL6和IL12；(b)流式细胞术结果显示，M1诱导后，Pgam5cKO BMDM中的CD86+细胞数量显著低于Pgam5 fl/fl BMDM；(c)用LPS加IFN-γ处理的BMDMs上清液的酶联免疫吸附试验(ELISA)也证实PGAM5缺失导致巨噬细胞中促炎细胞因子的分泌减少；(d)M1诱导后，与Pgam5 fl/fl巨噬细胞相比，Pgam5 cKO BMDM中iNOS的蛋白水平显著减少；(e-f)与软骨细胞共培养的结果表明巨噬细胞中PGAM5的缺失减少了软骨细胞的促炎表型；(g)在IL-4刺激后，与Pgam5 fl/fl BMDMs相比，Pgam5 cKO BMDMs表达更多的Arg1、CD206、PPARγ和IL10的mRNA水平；(h)流式细胞术测定显示，M2诱导后，Pgam5 cKO BMDM中CD206+细胞的数量显著高于Pgam5 fl/fl BMDM；(i)M2诱导后，与Pgam5 fl/fl巨噬细胞相比，Pgam5cKO BMDM中CD206的蛋白水平显著增加。

图5显示了(a)利用WB蛋白印迹技术，发现PGAM5通过上调AKT-mTOR通路，p38通路及ERK通路从而激活M1极化；(b-d)利用MHY1485作为mTOR激动剂处理后，M1极化明显增加；(e)剂量0、1、5、和10μM的MHY1485(d)使iNOS、IL1α、IL1β和IL6的mRNA水平在PGAM5型cKO巨噬细胞中逐渐升高，呈剂量依赖性；(f)PGAM5抑制STAT6-PPARγ通路从而减少M2极化；(g-j)利用T0070907抑制PPARγ以及利用AS1517499抑制stat6可以显著降低M2极化。

图6显示了(a)PGAM5可以抑制β-catenin的激活，且减少DVL2的磷酸化水平；(b)将DVL2与PGAM5进行co-IP实验，发现两者间存在相互作用；(c-d)利用ICG001抑制catenin的活性后，M1极化明显增加，M2极化降低；(e)PGAM5 cKO小鼠滑膜中比Pgam5fl/fl小鼠表达更多的β-连环蛋白；(f-i)构建了PGAM5fl/fl,β-cateninfl/fl-lyz2-cre(DKO)小鼠，发现，DKO小鼠比Pgam5 cKO小鼠出现了更明显的OA表型，以及更多的滑膜M1细胞及更少的M2细胞。

图7显示了关节内注射巨噬细胞靶向siPGAM5递送系统缓解OA症状：(a)巨噬细胞靶向纳米颗粒(NP)的制备；(b)用聚合物/siRNA复合物转染24小时后Raw264.7细胞中PGAM5mRNA水平的qPCR分析，siRNA和聚合物的浓度分别为8μg/mL和16μg/mL；(c)注射MFP9-2/siPGAM5(比例尺，50μm)的DMM手术后28天，小鼠软骨和滑膜中CD68(红色)、FAM(绿色)和DAPI(蓝色)的共荧光；(d)DMM手术后每周两次关节注射MFP9-2/siPGAM5干预OA的示意图；(e)DMM手术后28天膝关节藏红花O染色(比例尺，100μm)、MMP13和ACAN的免疫组织化学(比例尺，20μm)以及iNOS(红色)和CD206(绿色)的免疫荧光(比例尺，50μm)的代表性图像(n＝6)，Sham组、DMM不注射组和DMM注射MFP9-2/siNC组作为对照；(f)注射MFP9-2/siNC或MFP9-2/siPGAM5(比例尺，50μm)的DMM手术后28天，小鼠滑膜中CD68(黄色)、FAM(绿色)和PGAM5的共免疫荧光；(g)量化各组中的OARSI评分、MMP13阳性细胞、ACAN阳性细胞的百分比以及iNOS阳性细胞和CD206阳性细胞的数量，定量FAM阳性细胞和CD68阳性细胞的比率以及PGAM5的平均IF强度；数据显示为所示组之间的平均值±s.d.*P＜0.05，***P＜0.01，***P＜0.001，*****P＜0.0001；使用Studentt检验确定P值。SiNC为序列随机的干扰RNA。

图8显示了本发明实施例6中甘露糖修饰多氟化物合成过程。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，经过大量筛选，本发明人首次意外地发现了骨关节炎患者的滑膜中巨噬细胞的PGAM5显著增加，且PGAM5通过AKT-mTOR/

P38/ERK信号通路使得M1巨噬细胞极化增加，并通过STAT6-PPARy信号通路使得M2巨噬细胞极化被抑制。并且，PGAM5通过DVL2的去磷酸化抑制β-连环蛋白以调节巨噬细胞极化。而通过干扰PGAM5的表达或敲除PGAM5可显著减轻骨关节炎。此外，本发明还首次开发基于靶向抑制巨噬细胞中的PGAM5来有效改善骨关节炎的药物和方法。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人构建了甘露糖修饰的含氟聚合物与siPGAM5联合使用的纳米颗粒(NPs)，通过关节腔内注射，从而特异性抑制滑膜巨噬细胞中的PGAM5，通过将M1巨噬细胞复极化为M2巨噬细胞，从而减缓或治疗小鼠的骨关节炎。

此外，本发明的实验还证实，PGAM5抑制剂(如siPGAM5)和M2巨噬细胞激活剂(如IL-4)联合使用时，具有协同作用，可显著提高巨噬细胞的抗炎水平。其效果比单独使用任一活性成分都要好。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。

如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“上调”指与不施用本发明的活性组分相比，某一指标的量提高至1.2倍，优选地，1.5倍、2.0倍或3.0倍。

如本文所用，术语“下调”指与不施用本发明的活性组分相比，某一指标的量降低至0.8倍，优选地，0.5倍或0.3倍。

PGAM5

磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)是一种丝氨酸/苏氨酸，位于线粒体膜中的磷酸酶，它调控线粒体代谢和控制细胞的一系列功能。PGAM5通过去磷酸化Drp1导致线粒体片段化，在程序性细胞坏死中至关重要。

PGAM5还通过募集来调节线粒体自噬，靶向E3泛素连接酶PARKIN或去磷酸化FUNDC1调节线粒体的降解。

PGAM5通过调节线粒体动力学来调节细胞衰老并且还被证明可以增强炎症小体的激活。它在骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中pro-IL-1β的加工中起着关键作用。

然而，PGAM5在OA中调节滑膜巨噬细胞的作用未有报道。

巨噬细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞

巨噬细胞是一类位于外周血、炎症组织中的白细胞，属于免疫细胞中单核细胞类群，主要通过吞噬细菌、死亡细胞或细胞残片参与非特异性免疫调节，巨噬细胞将信号传递给其他淋巴细胞及其他免疫细胞参与特异性免疫调调节。巨噬细胞主要存在于淋巴结、肺泡壁、骨髓、肝脏以及脾脏等组织中。

巨噬细胞根据功能以及炎症分泌水平分为M1型和M2型巨噬细胞两种亚群。M1巨噬细胞主要由LPS及IFNγ激活，分泌IFN-γ、TNF-α等促炎症因子；M2巨噬细胞主要由IL4、IL13、M-CSF等激活，主要分泌IL10等抗炎症因子。

活性成分

如本文所用，“本发明的活性成分”包括第一活性成分和第二活性成分。所述第一活性成分指靶向PGAM5的抑制剂，它们可用于减少或下调PGAM5的活性或数量。应理解，该术语包括单一的化合物、二种或多种化合物构成的组合、或提取物。此外，该术语还包括任何可以下调PGAM5的活性或数量的试剂，包括基因编辑试剂或RNA干扰类试剂。例如靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)。

所述第二活性成分指M2巨噬细胞激活剂(如IL-4)。本发明的研究证实，当IL-4与PGAM5抑制剂(siPGAM5)一起使用时，其对骨关节炎的缓解或治疗效果要显著优于单独使用任一种成分。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：靶向PGAM5的抑制剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“治疗有效剂量”是指药物的任何如下所述的量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用该量的药物时，可促进疾病消退，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能。

本发明药物的“治疗有效剂量”也包括“预防有效剂量”，“预防有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当将该量的药物单独施用或者与另一种治疗剂组合施用于具有发生疾病的风险或者遭受疾病复发的受试者时，可抑制疾病的发生或复发。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳地0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明活性成分可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。在另一优选例中，所述药物组合物还包含一种或多种治疗骨关节炎的药物或制剂。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次发现，抑制PGAM5表达，可以通过促进巨噬细胞转化或者M1巨噬细胞复极化，从而有效促进M2巨噬细胞的生成，从而有效缓解骨关节炎症。

2.本发明涉及并构建了可以靶向滑膜巨噬细胞的纳米颗粒药物，主要活性成分为siPGAM5，可以特异性地靶向滑膜巨噬细胞，并有效减轻OA。

3.本发明首次揭示了滑膜巨噬细胞PGAM5对OA影响的发病机制、通路以及靶点，揭示了β-catenin在骨关节炎局部环境的复杂作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。除非另外说明，试剂、材料和设备为市售获得。，

材料和方法

化合物(市售获得)

T0070907：

MHY1485：

AS1517499：

ICG001：

LFHP-1c

siRNAs(siRNA)

靶向小鼠PGAM5并标记FAM荧光的siRNA购自Sangon Biotech。使用标记有FAM的加扰siRNA作为对照。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)在无血清条件培养基中用siRNA转染Raw264.7细胞进行检查。实验独立重复至少三次。

靶向PGAM5的siRNA序列为：

正义(5′-3′)：(FAM)CUGGAGACGAGUUGACAUTT(SEQ ID NO：1)，

反义(5′-3′)：AUGUCAACUCGUCUUCCAGTT(SEQ ID NO：2)。

其中，SEQ ID No：1和2互补配对形成末端带有突出TT的双链RNA结构。

甘露糖修饰含氟聚合物的合成

甘露糖修饰含氟聚合物的合成路径如图8所示。将ε-PLL(Mw：4224Da)与含氟烷烃环氧化物以不同摩尔比在无水甲醇中混合，并在60℃48小时。粗产物用甲醇和蒸馏水透析，然后冻干，得到含氟聚合物。通过完善的茚三酮测定法测试了每种聚合物上改性的氟烷烃的平均数量。将得到的含氟聚合物与d-吡喃甘露糖基苯基异硫氰酸酯在二甲基亚砜中以摩尔比在室温下反应24h，然后冻干，得到甘露糖修饰的含氟聚合物。对每种聚合物修饰的甘露糖的平均数量进行表征和计算1H-NMR(布鲁克，500MHz)。

实施例1 PGAM5在OA滑膜巨噬细胞中的表达增加

为了研究调节骨关节炎进展的因素，本发明人检查了OA患者和正常对照(股骨骨折患者)的人滑膜，并观察到与对照组相比，诱导型一氧化氮合酶的表达增强(iNOS)，OA滑膜中CD206的表达降低(图2a)。

免疫组化结果显示，PGAM5主要在人OA滑膜中表达(图2a)。PGAM5和CD68的双阳性免疫染色(图2b)表明，PGAM5在OA巨噬细胞中表达上调。

另外，本发明确认在蛋白质和RNA水平上PGAM5在人OA滑膜中增加(图2c)。

为了更好地证实PGAM5在OA中的作用，对8周龄雄性野生型(WT)小鼠进行了内侧半月板不稳定(DMM)手术。收集小鼠膝关节，在DMM手术后28d进行组织学检查。番红O染色和基质的免疫组化金属蛋白酶13(MMP13)和蛋白聚糖(Aggrecan，ACAN))的检测结果表明，DMM组的骨关节炎诱导成功(图2d)。

在DMM模型小鼠中，本发明人也观察到OA滑膜中iNOS增强和CD206表达降低，并且PGAM5在DMM模型的小鼠滑膜中上调(图2d)。

本发明人进一步研究了NCBI中的数据库，并重新分析了小鼠滑膜的单细胞RNA测序，在前交叉韧带断裂(ACLR)诱导的OA模型中进行滑膜单细胞测序，并发现：PGAM5在滑膜巨噬细胞中的表达增加(图2e-f)。针对上述结果的综合分析表明：PGAM5可能是OA滑膜巨噬细胞的潜在调控因素。

实施例2PGAM5通过调节巨噬细胞极化调节小鼠骨关节炎

为了研究巨噬细胞PGAM5在骨关节炎中的作用，本发明人培育了巨噬细胞中PGAM5缺失的小鼠。利用PGAM5^FL/FL小鼠，与具有携带溶菌酶(Lyz2)近端启动子的转基因小鼠-介导的Cre重组酶的小鼠交配，获得的后代特异性地从巨噬细胞中敲除PGAM5。该巨噬细胞中PGAM5缺失的小鼠为PGAM5^FL/FL-lyz2-Cre(PGAM5cKO)小鼠。

随后，对以下两组8周龄的雄性小鼠进行了DMM手术：PGAM5^FL/FL和PGAM5^FL/FL-lyz2-Cre(PGAM5cKO)小鼠(简称为“cKO小鼠”)。

发现，cKO小鼠表现出减轻的OA症状，表现为软骨中番红O染色增强，ACAN表达增加和MMP13表达降低(图3a)。

此外，通过iNOS和CD206的免疫荧光检测，出乎意料地进一步观察到cKO小鼠的滑膜中M1型巨噬细胞极其显著的减少(下降约4倍)，同时M2型巨噬细胞极其显著的增加(图3a-b)，尤其是具有抑炎性能M2型巨噬细胞增加了约10倍以上。

RNA-seq评估PGAM5缺失对巨噬细胞在转录组水平的改变。KEGG通路分析显示，各种巨噬细胞极化相关通路，包括To11样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和精氨酸生物合成，表明PGAM5可能调节巨噬细胞极化(图3c)。

腹膜巨噬细胞中M1标志物iNOS和CD80以及M2标志物精氨酸酶1(Arg1)和CD206的qPCR表示，PGAM5cKO小鼠比PGAM5^FL/FL系列小鼠显示更少促炎表型(图3d)，包括炎症标志物的减少，抗炎标志物合成的增加等。

这些结果进一步通过腹膜巨噬细胞的流式细胞术得到验证，PGAM5型cKO巨噬细胞表现出较少CD86+(M1)和更多CD206+(M2)细胞(图3e)，这提示抑制PGAM5可促使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。

为了进一步研究PGAM5在巨噬细胞极化中的潜在功能，本发明研究了PGAM5在巨噬细胞极化诱导过程中的表达是否发生变化。在M1巨噬细胞极化诱导中，在12和24小时，巨噬细胞中PGAM5 mRNA和蛋白质水平明显下降。然而，在M2巨噬细胞极化诱导过程中，巨噬细胞中PGAM5mRNA和蛋白质水平增加(图3f-g)。

以上结果表明，PGAM5可能参与调节巨噬细胞，进而调节OA。抑制或敲除PGAM5可意外地将M1型巨噬细胞复极化为M2型巨噬细胞，从而显著减轻或缓解OA(图3b)。

实施例3PGAM5增强了骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的M1极化，但抑制了BMDM的M2极化

为了进一步研究PGAM5在巨噬细胞极化中的作用，本发明人从Pgam5cKO和Pgam5fl/fl小鼠中分离BMDM，并通过LPS加IFN-γ在体外诱导它们进入M1极化状态。

与Pgam5fl/fl巨噬细胞相比，BMDMs中PGAM5缺失显著抑制了促炎基因的mRNA水平，包括iNOS、IL1α、IL1β、IL6和IL12(图4a)。

通过流式细胞术测定，M1诱导后，Pgam5 cKO BMDMs中的CD86+细胞数量明显低于Pgam5^fl/^fl BMDM(图4b)。

用LPS加IFN-γ处理的BMDM上清液的酶联免疫吸附测定(ELISA)也证实，PGAM5缺失导致巨噬细胞中促炎细胞因子的分泌减少(图4c)。

此外，M1诱导后，Pgam5 cKOB MDMs的iNOS蛋白水平显著低于Pgam5^fl/^fl巨噬细胞(图4d)。

为了证实PGAM5缺陷巨噬细胞对软骨的影响，在体外诱导M1后，将Pgam5cKO和Pgam5^fl/fl小鼠的BMDM与软骨细胞共培养。软骨细胞中ACAN和MMP3的蛋白水平以及COL2A1和SOX9的mRNA水平表明，巨噬细胞中PGAM5的缺失限制了软骨细胞的促炎表型(图4e-f)。

分离Pgam5cKO和Pgam5^fl/fl小鼠的BMDM(M0巨噬细胞)，并用IL4刺激24小时以诱导M2巨噬细胞。与Pgam5^fl/^flBMDM相比，IL-4刺激后，Pgam5 cKO BMDM表达更多的Arg1、CD206、PPARγ和IL10(mRNA水平)(图4g)。

通过流式细胞术测定，进行M2诱导后，Pgam5 cKO BMDMs中的CD206+细胞数量明显高于Pgam5^fl/flBMDM。

此外，出乎意料的是，PGAM5抑制与IL4联用时，产生明显的协同效应。与Pgam5^{fl/ fl}BMDM组相比，PGAM5抑制与IL4联用协同地提高了M0巨噬细胞对IL4诱导M2型细胞的响应性，从而形成数量大幅增加的M2巨噬细胞，使巨噬细胞的抗炎水平明显提高(图4h)。

M2诱导后，与Pgam5^fl/fl巨噬细胞相比，Pgam5-cKO BMDMs中CD206的蛋白水平显著增加(图4i)。

以上结果表明，Pgam5在体外导致巨噬细胞中M1反应增加和M2反应减少。此外，通过Pgam5抑制手段(如敲除或使用抑制剂)来抑制Pgam5，可在体外导致巨噬细胞中M1反应减少和M2反应增加。

实施例4PGAM5通过AKT-mTOR/P38/ERK信号通路控制M1极化，并通过STAT6-PPARγ信号通路抑制M2极化

在以往的研究中，M1极化的诱导激活了一系列信号通路，例如AKT-mTOR和MAPK信号通路。在本实施例中，进一步研究了PGAM5是否通过特定信号促进M1极化。

用LPS和IFNγ处理，PGAM5cKO小鼠BMDM的p-p38和p-ERK蛋白水平显著降低。这表明，PGAM5激活p38和ERK信号转导途径，从而增强M1极化，而MAPK信号转导已经在以前的研究中证明增加M1极化(图5a)。

此外，p-AKT和p-mTOR在PGAM5 cKO小鼠BMDM中显著降低(图5a)。

为了探索AKT和mTOR在介导PGAM5在巨噬细胞炎症中的可能作用，本发明人采用了特异性mTOR激活剂MHY1485激活mTOR通路。结果表明，激活mTOR增加了PGAM5缺陷巨噬细胞中iNOS、IL1α、IL1β和IL-6的mRNA水平(图5b)。这提示，mTOR参与了PGAM5对M1巨噬细胞极化的调节。

剂量为0、1、5、和10μM的MHY1485，可激活mTOR信号通路(图5d)，并使iNOS、IL1α、IL1β和IL6的mRNA水平在PGAM5型cKO巨噬细胞中逐渐升高，呈剂量依赖性(图5e)。这些结果表明，PGAM5可通过激活mTOR信号通路从而激活M1信号。

本发明人还发现了PGAM5调节STAT6-PPARγ信号通路从而抑制M2极化。

首先，IL4诱导M2极化后，PPARγ和p-STAT6在PGAM5 cKO BMDM中上升(图5f)。这提示，STAT6-PPARγ信号通路可能参与PGAM5介导的M2极化。

接下来，通过特异性抑制剂T0070907抑制PPARγ，以剂量依赖性方式降低CD206的蛋白质水平(图5g)。

此外，T0070907降低了PGAM5型cKO巨噬细胞的M2极化，如Arg1、几丁质酶样3(Ym1)和CD206的mRNA水平显着降低(图5h)。

此外，CD206的蛋白水平也被T0070907显著抑制(图5i)，表明PGAM5通过STAT6-PPARγ信号通路调控M2极化。

为了确定STAT6在PGAM5调节M2极化中的作用，AS1517499作为STAT6特异性抑制被添加到PGAM5 cKO和PGAM5^FL/FL巨噬细胞中。结果，PPARγ和CD206的蛋白表达显著降低，表明STAT6是PPARγ的上游(图5j)。

综上所述，PGAM5可通过STAT6-PPARγ信号通路调节M2极化。

实施例5PGAM5通过DVL2的去磷酸化靶向β-catenin通路来调节巨噬细胞极化。

在本实施例中，在确定了PGAM5调控巨噬细胞极化的相关信号通路的基础上，进一步研究PGAM5调控巨噬细胞极化的的具体靶点。研究表明，PGAM5可抑制人类细胞线粒体膜上的Wnt/β-catenin信号通路。此外，β-连环蛋白信号通路与巨噬细胞活化和极化存在一定相关性。因此，在本实施例中进一步研究，PGAM5是否在巨噬细胞极化和相关靶点中调节β-连环蛋白。

本实施例中，首先研究了PGAM5对巨噬细胞极化中的β-连环蛋白的影响。结果如图6a所示，Pgam5ko导致β-连环蛋白的激活以及DVL2磷酸化水平的上升。

接下来，本发明人检测了PGAM5是否可以直接与DVL2结合。结果表明，PGAM5可以在M1和M2巨噬细胞中与DVL2进行免疫共沉淀(图6b)。这表明，PGAM5和DVL2存在直接蛋白质相互作用。

随后，本发明人研究β-连环蛋白是否参与PGAM5调节的巨噬细胞极化。采用特异性抑制剂ICG-001对β-连环蛋白进行特异性抑制后，p-p38、p-ERK和iNOS的表达呈现增加。ICG-001还降低了p-STAT6、PPARγ和CD206的表达。这表明，β-连环蛋白作为巨噬细胞极化的调节剂发挥作用(图6c-d)。

另外，PGAM5 cKO小鼠滑膜中比Pgam5^fl/fl小鼠表达更多的β-连环蛋白(图6e)。

因此，这些结果表明，PGAM5通过直接靶向DVL2抑制β-连环蛋白，从而调节巨噬细胞极化。

为了验证β-连环蛋白在体内PGAM5介导的巨噬细胞极化中的作用，本发明人通过将β-cateninfl/fl小鼠与Pgam5cKO小鼠杂交，生成了PGAM5和β-catenin在巨噬细胞中均被敲除的小鼠(简称为“DKO小鼠”)。

DMM手术后28d收集DKO和Pgam5cKO雄性小鼠的膝关节进行进一步检查。与Pgam5cKO小鼠相比，DKO小鼠显著加剧了OA症状，如番红O染色(图6f)。与Pgam5cKO小鼠相比，DKO小鼠膝关节中ACAN的表达降低，而MMP13的表达增加。这表明，巨噬细胞中Pgam5受抑制(如敲除)所造成的OA症状缓解，部分地由β-catenin介导的(图6f)。

此外，与Pgam5cKO小鼠相比，DKO小鼠滑膜中的iNOS阳性细胞显著增加，CD206+细胞显著减少(图6f-g)。DKO小鼠的腹膜巨噬细胞显示iNOS和CD80的mRNA水平升高，CD206的mRNA水平降低(图6h)。

此外，腹膜巨噬细胞的流式细胞术也表明，DKO小鼠比Pgam5cKO小鼠表现出更多的促炎表型(图6i)。

综上所述，PGAM5通过抑制β-连环蛋白信号通路调节巨噬细胞极化，从而缓解小鼠OA症状；对β连环蛋白的抑制，则可逆转或减弱Pgam5cKO小鼠OA症状的缓解程度。

实施例6MFP9-2/siPGAM5靶向敲低滑膜巨噬细胞中的PGAM5缓解OA症状

基于PGAM5调控巨噬细胞极化的机制，本实施例中，研究了通过在滑膜巨噬细胞中使PGAM5靶向缺失(或抑制)以治疗早期OA的可行性。

RNA干扰(RNAi)是一种通过特定基因沉默治疗各种疾病的强大技术。然而，siRNA的靶向递送到滑膜巨噬细胞是有挑战性的，由于关节微环境中复杂的滑液成分和细胞外基质的干扰。因此，本发明人开发了一系列用于巨噬细胞靶向siRNA的甘露糖修饰含氟聚合物来通过抑制巨噬细胞PGAM5从而治疗OA。

6.1改性的甘露糖接枝聚合物的制备

ε-PLL与氟代烷烃(F7-F17，图7a)通过胺环氧化物反应，并选择不同的进料比，使PLL改性，获得平均数分别约为10和15个氟代烷烃。通过胺-异氰酸酯反应将所获得的含氟聚合物进一步与甘露糖接枝，获得氟代烷烃改性的甘露糖接枝的聚合物(简称为“改性的甘露糖接枝聚合物”)。

对于制备的改性的甘露糖接枝聚合物，通过¹H NMR计算在每个聚合物上缀合1个甘露糖的平均数。以F9为例，与10个F9配体和15个F9配体缀合的甘露糖接枝聚合物分别被称为MFP9-1和MFP9-2。以MFP9-2为例，它为经氟代烷烃改性的，并且含15个F9配体缀合的甘露糖接枝聚合物。

6.2改性的甘露糖接枝聚合物/siPGAM5型复合物的制备和活性测试

采用上述制备的改性的甘露糖接枝聚合物，分别与靶向siPGAM5的siRNA(siPGAM5)进行混合，从而进行自组装，从而获得改性的甘露糖接枝聚合物/siPGAM5型复合物，并测试其对滑膜巨噬细胞中PGAM5的敲低作用。

结果表明，本发明复合物可使滑膜巨噬细胞中PGAM5表达显著下降。其中，MFP9-2/siPGAM5型复合物表现出最高的基因敲低效率，高于Lipofectamine2000(Lipo)/siPGAM5复合物(图7b)。

此外，以MFP9-2/siPGAM5型复合物为例，在关节内注射后将FAM标记的siRNA(SEQID No：1)有效地转运到CD68+滑膜巨噬细胞而不是软骨细胞中(图7c)，这有利于实现巨噬细胞靶向RNAi。

为了进一步验证基于改性的甘露糖接枝聚合物(如MFP9-2)的siRNA递送系统的OA治疗潜力，在DMM手术建立的OA早期，每周两次将MFP9-2/siPGAM5复合物注射到WT小鼠的关节中，并在DMM手术后28天收集关节。

建立假手术组、未注射的DMM组和注射MFP9-2联合siNC(MFP9-2/siNC)的DMM组作为对照(图7d)。

与DMM组和DMM注射MFP9-2/siNC组相比，关节内注射MFP9-2/siPGAM5大大缓解了OA症状，表现为软骨中Safranin O染色面积增加，MMP 13表达降低，ACAN水平升高(图7d)。

此外，与DMM组和注射MFP9-2/siNC组相比，MFP9-2/siPGAM5处理的滑膜中iNOS阳性细胞数量大大减少，而CD206阳性细胞数量增加(图7e，g)，表明MFP9-2/siPGAM5在OA关节中调节巨噬细胞。

为了进一步证实MFP9-2/siPGAM5的调节功能，本发明人检测了OA症状的缓解是否是MFP9-2/siPGAM5抑制滑膜巨噬细胞中PGAM5的结果。

结果发现，与注射MFP9-2/siNC和FAM相比，注射MFP9-2/siPGAM5大大降低了滑膜CD68阳性巨噬细胞中PGAM5的水平，表现为荧光强度的明显降低(图7f-g)，表明PGAM5在滑膜巨噬细胞中成功靶向和抑制，可以进一步实现更好的OA结果。

为了更好地通过巨噬细胞PGAM5的早期干预治疗OA，通过关节内注射甘露糖修饰的多氟化物联合siPGAM5(MFP9-2/siPGAM5)实现对巨噬细胞PGAM5的特异性抑制，从而显著靶向巨噬细胞并降低巨噬细胞中PGAM5的表达，从而缓解OA症状。

这表明，PGAM5在OA巨噬细胞中的调节作用，并设计了一种功能性靶向治疗，这可能有助于临床上OA的早期和精确免疫干预。

讨论

OA是一种慢性退行性疾病，主要影响全球老年人，对关节结构和功能造成进行性和不可逆的损伤。因此，OA的早期干预一直专注于获得更好的临床结果，这需要识别分子生物标志物并验证早期OA中新型靶向治疗的分子靶点。

在OA滑膜中，M1和M2巨噬细胞在各种病理条件下相互竞争，这对OA的稳态至关重要。M1巨噬细胞在OA滑膜中的积累比M2巨噬细胞多，并进一步加剧了OA，而M2巨噬细胞可诱导软骨合成和抑制软骨细胞凋亡。因此，将M1巨噬细胞复极化为M2巨噬细胞正在成为OA干预的策略。然而，OA中滑膜巨噬细胞极化的机制尚未完全阐明。

研究表明，在OA病理生理学中，滑膜巨噬细胞表现出不同的功能。巨噬细胞表现出不同的表型：M1和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞也称为促炎性巨噬细胞，其特征是产生炎性细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α和iNOS，促进Th1响应。相比之下，M2巨噬细胞通过促进Th2响应增强组织重塑。M2巨噬细胞可被IL-4、IL-13、糖皮质激素、IL-10和免疫球蛋白复合物/Toll样受体配体激活，以甘露糖受体Mrc1(也称为CD206)、CD9和CD36为标记物。它们还产生各种细胞因子，如精氨酸酶(Arg)、IL-10、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)和II型IL-1诱饵受体。

尽管多项研究表明滑膜巨噬细胞极化与OA密切相关，减少滑膜炎和减弱OA进展的巨噬细胞的精确疗法很少被提出。既往研究证明，PGAM5是细胞衰老和死亡的关键调节因子，参与肝炎、急性肾损伤、肺纤维化、帕金森病等多种疾病的发病机制。此外，PGAM5通过激活巨噬细胞炎症小体和促进IL-1β分泌与巨噬细胞调节密切相关。然而，目前尚无相关研究揭示PGAM5在OA及相关靶向治疗中调节滑膜巨噬细胞的功能。

本发明的目标是靶向滑膜巨噬细胞中递送干预PGAM5的siRNA来治疗OA。

当前，很少有研究在OA滑膜中实现巨噬细胞靶向递送siRNA，因为siRNA是一种大的亲水性分子，难以穿透半渗透性细胞膜，导致细胞内递送的效率低。此外，带负电荷的siRNA在细胞质中很容易降解，导致siRNA停留时间短。

因此，本发明构建了甘露糖修饰的含氟聚合物与siPGAM5结合，并通过关节内注射治疗小鼠。氟氟烷修饰的含氟聚合物在基因递送方面有着卓越的进展，因为含氟聚合物的强疏水性确保了siRNA的有效细胞膜渗透和内体逃逸，而通过氟化的阳离子聚合物保护核酸免受酶降解。其过程示意图如图1所示。

因此，本发明检测到FAM修饰的siPGAM5在滑膜巨噬细胞中的稳定驻留长达一周。

此外，由于巨噬细胞表面广泛表达甘露糖受体，含氟聚合物可以很容易地被甘露糖修饰以靶向滑膜巨噬细胞。

令人惊讶的是，本发明发现近100％的滑膜巨噬细胞被靶向，巨噬细胞中的PGAM5通过关节内注射siPGAM5 NPs被抑制，导致M1巨噬细胞复极为M2巨噬细胞，这大大减轻了OA。

此外，由于氮磷比较低，含氟聚合物的细胞毒性小于其他阳离子聚合物，这是一种在临床干预中靶向滑膜巨噬细胞的有前途的治疗方法。

综上所述，PGAM5作为通过去磷酸化DVL2调节骨关节炎巨噬细胞极化的新因子，导致GSK3β活性增加，从而导致β-连环蛋白降解，并抑制β-连环蛋白转位到细胞核中以与下游信号通路的启动子结合，进一步促进M1的增加和M2表型的减少。

具体地，如图1所示，本发明证明了PGAM5直接与DVL2相互作用以控制β-catenin通路。通过Akt-mTOR、p38和ERK信号通路进一步放大M1反应，并通过下调stat6-PPARγ通路抑制M2极化。因此，巨噬细胞靶向siRNA靶向敲低巨噬细胞中的PGAM5可大大缓解小鼠的OA症状。PGAM5在OA中的关键功能可能提供新的临床靶点，相关的巨噬细胞靶向治疗可能为早期OA提供新的精确免疫调节治疗策略。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种PGAM5抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于选自下组的一个或多个用途：

(i)促进M0巨噬细胞分化成为M2巨噬细胞；

(ii)使M1巨噬细胞复极化为M2巨噬细胞；

(iii)预防和/或治疗骨关节炎。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的M0巨噬细胞包括骨髓巨噬细胞(BMDM)。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PGAM5抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸(如反义RNA(siRNA))、mRNA、抗体、基因编辑试剂、或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PGAM5抑制剂包括：靶向PGAM5的siRNA(siPGAM5)、LFHP-1c。

5.一种靶向巨噬细胞的纳米颗粒，其特征在于，包含：

(a)PGAM5抑制剂；和

(b)靶向载体：甘露糖修饰的含氟聚合物。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：

(a1)作为第一活性成分的PGAM5抑制剂或其药学上可接受的盐；

(a2)任选地作为第二活性成分的预防和/或治疗骨关节炎的其他药物；和

(b)药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的组分(a1)为权利要求5所述的纳米颗粒。

8.一种活性成分组合，其特征在于，所述活性成分组合包括：

(i)PGAM5抑制剂；和

(ii)M2巨噬细胞激活剂。

9.如权利要求5所述的纳米颗粒、如权利要求6所述的药物组合物、或如权利要求8所述的活性成分组合的用途，其特征在于，用于制备一种预防和/或治疗骨关节炎的药物产品。

10.一种体外促进M2巨噬细胞极化的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在PGAM5抑制剂存在下，在M2诱导条件下，培养巨噬细胞，从而促进M2巨噬细胞极化。